CN102234632B

CN102234632B - 一种人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体杂交瘤DY01及单克隆抗体

Info

Publication number: CN102234632B
Application number: CN201110110398.0A
Authority: CN
Inventors: 杜红延; 姚小艳; 徐伟文; 李明
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2011-04-29
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2031-04-29
Also published as: CN102234632A

Abstract

本发明公开了一种人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体杂交瘤DY01及单克隆抗体。抗人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体杂交瘤DY01，于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.4334。其产生的单克隆抗体，能特异性的结合重组和天然的人泛素偶联酶UbcH10蛋白，本发明所述的抗体可用于ELISA、western-blot、细胞免疫荧光以及临床组织标本的免疫组织化学染色研究。同时本发明所述抗体可制备成实验室和临床检测人泛素偶联酶UbcH10表达情况的免疫检测试剂。

Description

一种人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体杂交瘤DY01及单克隆抗体

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，具体涉及一种人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体杂交瘤DY01及单克隆抗体。

背景技术

肿瘤的早期诊断对于肿瘤患者的治疗和预后有着非常重要的意义，目前临床常用的肿瘤标志物诸如甲胎蛋白AFP和CEA缺乏足够的检测特异性和灵敏性，因此需要选择更加特异性的检测靶点。

细胞内蛋白质降解主要有两条途径：蛋白酶体途径和溶酶体途径。多数短寿命的蛋白质通过蛋白酶体途径降解。通过蛋白酶体途径降解的蛋白质大部分首先要经过泛素化，然后由蛋白酶体降解。故该途径又称泛素-蛋白酶体途径( ubiquitin proteasome pathway；UPP)。UbcH10属于人类泛素蛋白酶体途径中泛素偶联酶家族成员之一，编码与泛素依赖性蛋白降解有关的蛋白质——人类泛素偶联酶E2C（ubiquitin-conjugating enzyme E2C，UBE2C/UBCH10），又称细胞周期蛋白选择性泛素载体蛋白（cyclin-selective ubiquitin carrier protein），是泛素化途径中细胞周期蛋白降解所必需的。近年来，由于该蛋白在细胞周期的调节、周期蛋白的降解、肿瘤的发生及肿瘤细胞的增殖、恶变、诊断及治疗中的特殊地位而倍受关注。

人类UbcH10基因位于20号染色体，蛋白由179个氨基酸编码而成，分子量在19.6kDa，由于UbcH10在细胞周期的调节、周期蛋白的降解、肿瘤的发生及肿瘤细胞的增殖、恶变、诊断及治疗中的特殊地位而倍受关注。近年来针对不同肿瘤的研究中，越来越多的数据显示UbcH10与肿瘤的关系十分密切，可促进细胞增殖和恶性转化，但UbcH10的特异性致瘤作用及致瘤机制仍需进一步研究。

UbcH10是一种与癌症相关的泛素偶联酶，研究发现其在肺、胃、子宫、乳腺、卵巢、膀胱等原发肿瘤组织中表达上调，且乳腺癌细胞中高表达UbcH10可以促进乳腺癌细胞的增殖，抑制UbcH10的表达可抑制乳腺癌细胞的生长。还有报道称UbcH10的表达与高侵袭性和恶性程度较高的甲状腺癌相关，与卵巢癌的恶性程度也密切相关。同时消化道肿瘤肝癌、食管癌、结肠癌以及结肠癌伴肝转移都与泛素偶联酶UbcH10的高表达有联系，所有的临床和实验室研究均表明泛素偶联酶UbcH10有作为潜在的多种不同肿瘤的临床诊断靶标的可能。因此制备泛素偶联酶UbcH10的单克隆抗体具有十分重要的意义，可以为该蛋白功能的研究奠定基础，同时为其作为肿瘤标志物的可行性提供实验数据支持。

由于人泛素偶联酶UbcH10属于非分泌型表达蛋白，在临床血清标本中含量较低，基本很难检测，通常在组织标本中表达量较高，具有临床检测和验证的价值，目前报道的文献不同肿瘤基本都是从基因水平或组织标本中检测人泛素偶联酶UbcH10表达量升高。由此，制备能用于临床标本免疫组化检测的人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体进行大批量组织标本的验证，可为其作为肿瘤临床诊断靶标的验证提供有力工具。

本发明与现有的人泛素偶联酶UbcH10抗体相比具有以下的特点和优势：

目前尚未有国产化的人泛素偶联酶UbcH10的抗体，国外有一些公司有可以检测UbcH10的抗体产品，但大多数是多抗产品，像Abnova Corporation公司是鼠源性的多抗，Boston Biochem, Inc.和Millipore公司是兔源性的多抗，Everest Biotech、Novus Biologicals、Raybiotech, Inc.和IMGENEX公司是羊源性的多抗，另外Santa Cruz Biotechnology, Inc.公司还有针对UbcH10两个不同片段的抗体产品，只有Novus Biologicals公司有针对人泛素偶联酶E2C的鼠源性单抗产品，但其免疫原蛋白氨基酸序列为AAH50736包括180个氨基酸，且其单抗亚型为IgG3b1型，只能用于ELISA 和Western。同时，国外抗体的价格通常较昂贵，也限制了该蛋白作为临床靶标验证及其功能的研究。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能用于ELISA、western-blot、免疫荧光以及组织的免疫组化检测的抗人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的检测人泛素偶联酶UbcH10的抗体都是用原核重组表达的人泛素偶联酶UbcH10蛋白作为抗原免疫小鼠获得，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株 DY01，杂交瘤细胞为IgG1阳性，轻链均为κ型。所述抗人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体杂交瘤DY01，于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4334。

本发明中人泛素偶联酶UbcH10的氨基酸序列为AAH16292，如SEQ ID NO：1所示。本发明中人泛素偶联酶UbcH10的基因序列为NM_007019，如SEQ ID NO：2所示。

本发明中UbcH10的全长基因是由肝癌细胞HepG2中由RT-PCR的方法钓取。扩增人泛素偶联酶UbcH10基因的引物序列为：上游引物：5'- GTCGGATCCATGGCTTCCCAAAACCG -3' （SEQ ID NO：3），下游引物：5'- ATTGCGGCCGCTTAGGGCTCCTGGCTGG -3’（SEQ ID NO：4）。上游引入BamH I 内切酶位点，下游引入Not I内切酶位点。原核表达载体选择pET-22b（+）。

所述的保藏号为CGMCC No.4334的杂交瘤细胞株DY01的制备方法是：取血清效价大于1：10⁴的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG-4000进行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用重组表达的人泛素偶联酶UbcH10蛋白包被ELISA板，进行ELISA 筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗人UbcH10单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为DY01。应用此株杂交瘤细胞以1×10⁶/只的量注入石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，并通过Sepharose S-200分子筛脱盐， PBS洗脱，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90%以上。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明以重组人泛素偶联酶UbcH10蛋白包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的阳性，并用此纯化抗体对肝癌细胞HepG2 和SMMC7721进行Western-blot证明该抗体可以识别天然变性的人泛素偶联酶UbcH10蛋白。

本发明将此纯化抗体用于进行肝癌细胞SMMC7721的免疫荧光染色以及肝癌组织的免疫组化染色证明其能识别天然的人泛素偶联酶UbcH10蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为进一步研究人泛素偶联酶UbcH10 的功能和开发人泛素偶联酶UbcH10的临床诊断试剂奠定了基础，为其作为肿瘤临床诊断和治疗靶标的验证提供有力的工具。

本发明的单克隆抗体其免疫原是原核重组表达人泛素偶联酶UbcH10全长蛋白，其氨基酸序列为AAH16292，全长179个氨基酸。与国外现有抗体仅能用于ELISA 和Western检测变性UbcH10蛋白以及价格昂贵等特点相比，本发明的单克隆抗体除了能应用于ELISA 和Western检测变性UbcH10蛋白以外还可以应用于细胞免疫荧光和临床肿瘤组织标本免疫组化研究检测未变性的天然UbcH10蛋白，同时降低了应用成本。国外现有UbcH10抗体大多数都是多克隆抗体，特异性和灵敏度与本发明的UbcH10单克隆抗体相比要低，并且国外现有的单克隆抗体只能与失去了高级结构的变性蛋白结合，而本发明的抗体不仅能与变性蛋白结合，还能与具有高级结构的天然蛋白结合，从而能应用于免疫荧光和免疫组化实验。本发明针对人泛素偶联酶UbcH10全长蛋白制备出的单克隆抗体对检测该蛋白具有较高的特异性和灵敏度，该抗体的应用将为人泛素偶联酶UbcH10功能研究和其作为肿瘤标志物的临床标本验证工作提供支持。

附图说明

图1是本发明单抗DY01亚型鉴定结果；

图2是本发明单抗DY01对肝癌细胞HepG2和SMMC7721免疫印迹的结果以及阴性对照结果，其结合条带的分子量为29kDa附近；

图3是本发明单抗DY01对肝癌细胞SMMC7721免疫荧光染色的结果以及普通光镜下的对照结果（显微镜放大倍数200倍）；

图4是本发明单抗DY01对肝癌组织免疫组织化学染色的结果以及阴性对照结果（显微镜放大倍数100倍）。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1 本发明单克隆抗体的制备和鉴定

1、单抗DY01的制备

1）重组人泛素偶联酶UbcH10抗原制备

从肝癌细胞HepG2中调取UbcH10基因，构建原核重组表达载体pET22b(+)/UbcH10在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达，利用Ni Sepharose亲和层析纯化柱进行纯化，获得纯度达90%以上的重组人UbcH10蛋白。

2）免疫小鼠

以纯化的重组抗原免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠。

第一次免疫：取重组抗原与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，以每只50μg/500μL的量多点皮下注射BALB/c小鼠；

第二次免疫：隔2周后，取重组抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混匀后，以每只50μg/500μL的量多点皮下注射BALB/c小鼠；

第三次免疫：再隔2周后，取重组抗原与等体积的PBS混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于1:10⁴的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；

弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均使用商品化产品。

3）免疫血清效价测定

采用间接 ELISA法测定免疫血清效价。取50μg重组人泛素偶联酶蛋白溶解于10ml 0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔，4℃过夜。次日，使用PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，使用PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，小鼠于第三次免疫后15天眼眶采血，鼠免疫血清用含1％BSA 10mM PBS以10^-1～10^-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔 37℃ 1h，PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次后，加入1：1000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（Sigma,INC.），100μl/孔37℃1h，同上洗板后，TMB显色，100μl/孔，室温避光10min，加100μl/孔2M H₂SO₂终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。

3）杂交瘤的制备

取血清效价大于1:10⁴的小鼠，融合前3天，取重组抗原与等体积的PBS混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0按1：1的比例混合，500×g室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃ 水浴中，将在37℃ 水浴保温的50%聚乙二醇（PEG，MW4000，Sigma）用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1分钟加入37℃ 预热的无血清1640培养基1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物500×g室温离心5min，弃上清，加入HAT培养液（次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）（HAT，Sigma））轻轻重悬细胞，将细胞分至96孔板中，每孔200μl。培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，更换HT培养液（次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）（HT，Sigma））培养一天，更换1640完全培养基。

4）筛选分泌抗人泛素偶联酶单克隆抗体的杂交瘤细胞

间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100%细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗UbcH10单克隆抗体细胞株，标记为DY01。将克隆化后阳性率达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。

5）腹水的制备和纯化

将DY01杂交瘤细胞株以1×10⁶/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的Balb/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，并通过Sepharose S-200分子筛脱盐， PBS洗脱，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90%以上。

2、本发明单克隆抗体的特性鉴定

1）抗体浓度的测定：经杂交瘤细胞CGMCC No.4334制备的腹水经纯化后获得人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体DY01，分别使用BIO-RAD公司生产的Smart Spec plus核酸蛋白测定仪测定，其浓度分别为0.93mg/ml。

2）抗体亚型鉴定：采用Hbt公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，DY01分泌抗体的亚型均为IgG1型，轻链均为κ链，如图1所示。

3）纯化抗体的效价鉴定：50μg重组UbcH10抗原溶于10ml pH9.6 的0.05M 碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板每孔100μL，4℃过夜。PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，使用PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，每孔加入100μl纯化抗体，37℃孵育1h，PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，37℃孵育1h，PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，每孔加入100μl TMB显色，37℃孵育15min后，加入2M H₂SO₄溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450 nm处检测。

4）抗体的Western blot鉴定：收集肝癌细胞（HepG2和SMMC7721），用1×SDS裂解缓冲液裂解后上样，经12%SDS-PAGE后用Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，pH7.4的Tris-HCl缓冲液（含有0. 1% (V/V) Tween-20）洗膜3次，每次10min，1:800加入经纯化的杂交瘤细胞CGMCC No.4334制备的抗人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体DY01，室温孵育1h后，pH7.4的Tris-HCl缓冲液（含有0. 1% (V/V) Tween-20）洗膜3次，每次10min，加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体（Sigma）为二抗，室温孵育1h，TTBS洗膜3次，用滤纸吸去多余的溶液，平铺于干净的保鲜纸上，加入1.4ml SuperSignal? 系列Western化学发光底物反应液（A:B=1:1），使膜完全浸润于反应液中，迅速取出，用滤纸吸去多余液体，铺于另一张保鲜纸上，用保鲜纸把膜包好，放入X射线摄影暗盒，在暗房中显影。杂交瘤细胞CGMCC No.4334制备的抗UbcH10单克隆抗体DY01均出现单一的特异性条带，结果如图2所示。

5）抗体的免疫荧光鉴定：收集肝癌细胞SMMC7721，铺于玻璃片上生长过夜，PBS洗涤细胞，使用预冷的多聚甲醛固定细胞，分别加入杂交瘤细胞CGMCC No.4334制备的抗UbcH10单克隆抗体DY01（1:500稀释），37℃孵育1h，以PBS为阴性对照。PBS洗片后1:1000加入荧光标记羊抗鼠二抗（Sigma），37℃孵育1h，PBS洗片后，荧光显微镜下观察，经抗UbcH10单克隆抗体DY01染色的细胞均观察到红色荧光，如图3所示。结果证明杂交瘤细胞CGMCC No.4334制备的抗UbcH10单克隆抗体DY01可识别天然的人UbcH10蛋白。

6）抗体的免疫组化鉴定：从南方医院收集石蜡包埋的肝癌组织，利用纯化后的杂交瘤细胞CGMCC No.4334制备的抗UbcH10单克隆抗体DY01（1:500稀释）进行免疫组化染色，使用福建迈新公司的免疫组化试剂盒，染色方法参照迈新试剂盒说明书，DAB显色，阴性对照组以PBS代替一抗，结果发现经抗UbcH10单克隆抗体DY01染色的组织标本上在细胞质中均发现棕色颗粒，如图4所示。肝癌细胞的免疫组化染色结果证明杂交瘤细胞CGMCC No.4334制备的抗UbcH10单克隆抗体DY01可识别天然的人UbcH10蛋白。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体杂交瘤DY01及单克隆抗体

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 179

<212> PRT

<213> 人体

<400> 1

Met Ala Ser Gln Asn Arg Asp Pro Ala Ala Thr Ser Val Ala Ala Ala

1 5 10 15

Arg Lys Gly Ala Glu Pro Ser Gly Gly Ala Ala Arg Gly Pro Val Gly

20 25 30

Lys Arg Leu Gln Gln Glu Leu Met Thr Leu Met Met Ser Gly Asp Lys

35 40 45

Gly Ile Ser Ala Phe Pro Glu Ser Asp Asn Leu Phe Lys Trp Val Gly

50 55 60

Thr Ile His Gly Ala Ala Gly Thr Val Tyr Glu Asp Leu Arg Tyr Lys

65 70 75 80

Leu Ser Leu Glu Phe Pro Ser Gly Tyr Pro Tyr Asn Ala Pro Thr Val

85 90 95

Lys Phe Leu Thr Pro Cys Tyr His Pro Asn Val Asp Thr Gln Gly Asn

100 105 110

Ile Cys Leu Asp Ile Leu Lys Glu Lys Trp Ser Ala Leu Tyr Asp Val

115 120 125

Arg Thr Ile Leu Leu Ser Ile Gln Ser Leu Leu Gly Glu Pro Asn Ile

130 135 140

Asp Ser Pro Leu Asn Thr His Ala Ala Glu Leu Trp Lys Asn Pro Thr

145 150 155 160

Ala Phe Lys Lys Tyr Leu Gln Glu Thr Tyr Ser Lys Gln Val Thr Ser

165 170 175

Gln Glu Pro

<210> 2

<211> 823

<212> DNA

<213> 人体

<400> 2

aaacgcgggc gggcgggccc gcagtcctgc agttgcagtc gtgttctccg agttcctgtc 60

tctctgccaa cgccgcccgg atggcttccc aaaaccgcga cccagccgcc actagcgtcg 120

ccgccgcccg taaaggagct gagccgagcg ggggcgccgc ccggggtccg gtgggcaaaa 180

ggctacagca ggagctgatg accctcatga tgtctggcga taaagggatt tctgccttcc 240

ctgaatcaga caaccttttc aaatgggtag ggaccatcca tggagcagct ggaacagtat 300

atgaagacct gaggtataag ctctcgctag agttccccag tggctaccct tacaatgcgc 360

ccacagtgaa gttcctcacg ccctgctatc accccaacgt ggacacccag ggtaacatat 420

gcctggacat cctgaaggaa aagtggtctg ccctgtatga tgtcaggacc attctgctct 480

ccatccagag ccttctagga gaacccaaca ttgatagtcc cttgaacaca catgctgccg 540

agctctggaa aaaccccaca gcttttaaga agtacctgca agaaacctac tcaaagcagg 600

tcaccagcca ggagccctga cccaggctgc ccagcctgtc cttgtgtcgt ctttttaatt 660

tttccttaga tggtctgtcc tttttgtgat ttctgtatag gactctttat cttgagctgt 720

ggtatttttg ttttgttttt gtcttttaaa ttaagcctcg gttgagccct tgtatattaa 780

ataaatgcat ttttgtcctt ttttagacaa aaaaaaaaaa aaa 823

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcggatcca tggcttccca aaaccg 26

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attgcggccg cttagggctc ctggctgg 28

Claims

1.一种抗人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体杂交瘤DY01，于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4334。

2.一种抗人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体DY01，其特征是由权利要求1所述杂交瘤DY01分泌所得。

3.一种检测人泛素偶联酶UbcH10表达情况的免疫检测试剂，其特征是含有权利要求2所述抗人泛素偶联酶UbcH10单克隆抗体DY01。