CN103333226B - 一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志物spg04及其elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志物SPG04及其ELISA试剂盒。所述鼻咽癌放疗敏感性多肽标志物SPG04全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所提供的针对多肽标志物SPG04的多抗特异性强，检测特异度为90.9%，灵敏度为93.3%，针对多肽标志物SPG04的检测方法操作步骤简便可控，利于临床检测；可结合酶联检测仪进行高通量、低成本的临床检测。

Description

一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志物SPG04及其ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体地说，涉及一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志物SPG04及其ELISA试剂盒。

背景技术

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）是中国南方常见的恶性肿瘤之一，尤其集中在中国广东省，故又称为“广东瘤（Cantontumor）”。虽然在世界范围内鼻咽癌属罕见肿瘤，在大多数国家的发病率或死亡率均低于1/100000，但在华南地区和东南亚地区的鼻咽癌年发病率高达15～50/100000，且病理组织学常诊断为WHO规定的Ⅱ期或Ⅲ期（参见Feng XP等.经蛋白组学预测鼻咽癌放疗反应性的生物标记的鉴别(Identification of biomarkers for predictingnasopharyngeal carcinoma response to radiotherapy by proteomics),癌症研究(Cancer Res.),2010,70(9):3450-62）。仅中山大学肿瘤防治中心在广州地区确诊的鼻咽癌新发病例就多达2400-2500例/年。鼻咽癌的肿瘤位置深处颅底、颈部和咬肌间隙，十分隐蔽，无法采用常规外科手术对病灶区肿块进行切除。目前，放射治疗已经作为鼻咽癌的首选治疗方案（参见敖帆，廖瑜露.P53、Ki-67、Bcl-2、EGFR与鼻咽癌放射敏感性的相关性研究[J].实用中西医结合临床,2010,10(4):4-5），尤其对于无远处转移的早期鼻咽癌有良好控制作用，同步放化疗也逐渐成为局部晚期鼻咽癌的标准治疗方式（马俊,鼻咽癌治疗的研究进展[J].中山大学学报(医学科学版),2010,31(2):179-185）。

临床治疗发现，即使鼻咽癌患者属于同一分期，采用同样的放射治疗技术和相同的放射治疗剂量，仍然有20%-40%的患者在5年内出现了射野内复发，深入研究发现这主要是因为不同个体肿瘤细胞的放射治疗内在敏感性不同，表现为放射敏感或者放射抗拒（参见叶伟军,闵华庆,曹新平,等.P53蛋白、血管内皮生长因子等生物分子指标与鼻咽癌放射敏感性的关系.癌症,2006,25(9):1168-1172）。导致鼻咽癌治疗失败的主因是远处转移和放射抗拒，对鼻咽癌患者进行单纯的放射治疗，其5年生存率约为50%，治疗率不高的原因之一即放射抗拒（参见夏云飞,钱剑扬,张恩熹,实用鼻咽癌放射治疗学.北京大学医学出版社,北京,2003,211-214）。因此，发掘出特异性好、灵敏度高的生物标志物，并开发出快速、准确、灵敏的相关诊断方法，在鼻咽癌患者接收治疗前对其放疗敏感性进行评价，辅助实施鼻咽癌个体化治疗，已成为研究热点，对提高鼻咽癌放射治疗针对性和有效性，同时减轻患者不必要的痛苦和经济负担，具有重要意义。

目前对于鼻咽癌放疗敏感性的诊断，尚无权威的诊断技术或者统一的评价指标（金标准）。相关文献报道了多种蛋白标志物与鼻咽癌的放疗敏感性相关。如PCNA（增殖细胞核抗原）的高表达鼻咽癌放疗敏感性呈正相关，预测鼻咽癌放疗敏感性时的灵敏度为94%，但特异性不足32%（参见黄东海,田勇泉,邱元正,等.应用PCNA和survivin预测鼻咽癌放疗敏感性的研究[J].同济大学学报(医学版),2006,27(5):39-42），且存在不同报道对不同蛋白候选标志物的结论不一致的现象。蛋白标志物的联合检测在鼻咽癌放疗敏感性中的研究在近些年得到很大的重视，如研究发现14-3-3σ和maspin（乳腺丝抑蛋白）的下调，以及GRP78(78KDa葡萄糖调节蛋白)和Mn-SOD(锰超氧化物歧化酶)的上调对鼻咽癌放射抗拒显著相关（参见Feng XP等,经蛋白组学预测鼻咽癌放疗反应性的生物标记的鉴别(Identification of biomarkers for predicting nasopharyngeal carcinomaresponse to radiotherapy by proteomics).癌症研究(Cancer Res.)2010,70(9):3450-62），具有良好的特异性和灵敏度，但是这四种蛋白标志物的联合检测仍需要依靠免疫组化技术（参见Cho WC等.经血清蛋白组学分析鉴定血清淀粉样蛋白作为一种潜在的有用的监测鼻咽癌复发的生物标志物(Identification of serum amyloid a protein as apotentially useful biomarker to monitor relapse of nasopharyngealcancer by serum proteomic profiling).临床癌症研究(Clin CancerRes.)2004,10(1):43-52），采取病人组织进行检测，检测成本较高，周期较长，很难广泛应用于临床鼻咽癌放疗敏感性的辅助诊断。

血清中富含有丰富的多肽成分，传统中被人们认为是“生物垃圾”的血清多肽已变身为“诊断黄金”，血清多肽类标志物所揭示的生物信息对于肿瘤的防治已引起研究人员的极大关注。基于血清多肽，并结合目前常用的临床检测方式对肿瘤早诊和个体化治疗辅助诊断，获得了不错的检测效果。Villanueva等利用血清多肽研究了前列腺癌、乳腺癌以及膀胱癌，寻找到了几十个可作为肿瘤标志物的多肽片段，对样本的预测准确率达到100%。

目前的血清多肽主要用于前列腺癌、乳腺癌以及膀胱癌等的分析，分析主要采用基于抗体亲和分离技术（免疫磁珠、抗体偶联固相载体等）的免疫质谱法，这些体系均存在检测成本昂贵，操作要求较高，不利于推广的缺陷。目前，尚缺乏特异性好、灵敏度高的生物标志物，对鼻咽癌放疗敏感性进行快速、准确、灵敏的相关诊断方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志物SPG04及其ELISA试剂盒，用于鼻咽癌个体化治疗中的放疗敏感性辅助诊断。

本发明提供的多肽标志物SPG04全长序列为：

Gly-Ile-Leu-Ala-Ala-Asp-Glu-Ser-Thr-Gly-Ser-Leu-Ala-Lys。

本发明还提供与上述多肽标志物SPG04发生特异性结合的抗体。所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，所述单克隆抗体制备方法可参照专利CN102539767的方法进行制备。

所述多克隆抗体按照如下步骤制备：

1）采用固相合成法制备合成肽SPG04；

2）采用碳二亚胺偶联法将合成肽SPG04与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）偶联制备免疫原SPG04-BSA；

3）将免疫原SPG04-BSA进行动物免疫，获得免疫血清，通过纯化，获得浓度2.7mg/mL、滴度1:128000的抗合成肽SPG04多克隆抗体。

具体地，包括以下步骤：1）采用优化的碳二亚胺偶联法将合成肽SPG04偶联到载体蛋白BSA（牛血清白蛋白）上制备偶联物SPG04-BSA，联合UV（紫外扫描）和SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）监测偶联物SPG04-BSA；

2）将制备好的偶联物SPG04-BSA作为免疫，结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂免疫新西兰大耳白兔，每次偶联物抗原免疫剂量为1mg，免疫方式为颈背部皮下多点注射；

3）经3次免疫后检测免疫兔静脉血滴度，达到1:10000以上后，对免疫兔进行颈动脉取血收集免疫全血，离心分离后收集兔免疫血清；

4）采用Protein A亲和层析柱对抗合成肽SPG04的兔免疫血清进行纯化，制备抗合成肽SPG04的多克隆抗体，检测多克隆抗体的滴度、特异性、灵敏性等，得到抗血清多肽标志物SPG04抗体。

本发明进一步提供包括上述抗体的ELISA试剂盒。

所述ELISA试剂盒进一步包括包被液、2%OVA、HRP酶标二抗、TMB显色液、2M硫酸和96孔酶联板中的一种或多种。

其中，所述抗体优选地为抗血清多肽标志物SPG04的兔源多克隆抗体，所述HRP酶标二抗为HRP-羊抗兔。

本发明另一方面，提供上述多肽标志物SPG04和上述抗体在制备用于检测鼻咽癌放疗敏感性试剂中的应用。

优选地，所述用于检测鼻咽癌放疗敏感性试剂为包括上述抗体的ELISA试剂盒。

所述ELISA试剂盒进一步包括包被液、2%OVA、HRP酶标二抗、TMB显色液、2M硫酸和96孔酶联板中的一种或多种。

所述ELISA试剂盒检测多肽标志物SPG04的方法包括如下步骤：

1）采集样品；

2）用所述的试剂盒进行检测；

3）分析检测结果。

具体步骤如下：在96孔酶联板中，将临床检测血清与包被液包被过夜，清洗若干次，用20%OVA溶液封闭，清洗若干次，加入抗合成肽SPG04多克隆抗体，适宜温度孵育后，清洗若干次，加入HRP酶标二抗，清洗若干次，用TMB显色液显色，再用2M硫酸终止，450nm检测OD值。

在本发明一个优选的实施例中，所述方法包括如下步骤：

1）在96孔板中，加入95μL-80μL包被液，再加入5μL-20μL待测血清样品，4℃放置过夜；同时用100μL包被液作为阴性对照；

2）弃包被液，用0.01M、pH7.4的PBST缓冲液200-300μL清洗4-6次，拍干；

3）加入200-300μL的2%OVA，37℃中静置封闭1.5-2小时；

4）弃封闭液，用0.01M、pH7.4的PBST缓冲液200-300μL清洗4-6次，拍干；

5）加入80-120μL抗合成肽SPG04的多抗，37℃孵育0.5-1小时；

6）弃抗体液，用0.01M、pH7.4的PBST缓冲液200-300μL清洗4-6次，拍干；

7）加入80-120μL抗多抗的酶标二抗，37℃孵育0.5-1小时；

8）弃酶标二抗液，用0.01M、pH7.4的PBST缓冲液200-300μL清洗4-6次，拍干；

9）加入80-120μL TMB显色液，37℃避光显色10-15min;

10）加入40-60μL2M硫酸，终止反应，5min内用酶联检测仪测定波长450nm的吸光度值(OD值)。

本发明的有益效果：（1）本发明选取鼻咽癌放疗敏感性相关血清多肽标志物SPG04，制备抗合成肽SPG04的多抗，并应用到63份鼻咽癌血清样本（包含放疗敏感和放疗抗拒）的分析，经检测分析及数据统计，发现该抗合成肽SPG04多抗的检测特异度为90.9%，灵敏度为93.3%，表明该血清多肽标志物能明显区分鼻咽癌放疗敏感与放疗抗拒。由此提供含有该多抗的ELISA试剂盒和检测方法。

（2）本发明所提供的多抗针对多肽标志物SPG04的特异性强；多肽标志物SPG04的检测方法操作步骤简便可控的，利于临床检测；可进行高通量、低成本的酶联检测仪检测。

（3）本发明基于该血清多肽标志物SPG04的ELISA试剂盒能够在实施鼻咽癌个体化治疗体系中，对鼻咽癌患者接收放射治疗前进行放疗敏感性评价，起到辅助诊断的作用，具有明显的实用性。

附图说明

图1为本发明血清多肽标志物的合成肽SPG04标准样品的质谱；

图2A为SPG04-BSAD紫外扫描监测结果，B为SPG04-BSAD的SDS-PAGE电泳监测结果，其中，BSA为牛血清白蛋白；SPG04-BSA为SPG04与BSA的偶联物；

图3为本发明的检测鼻咽癌放疗敏感组与放疗抗拒组的ROC曲线；

图4A为本发明的检测鼻咽癌放疗敏感组的箱式图；B为放疗抗拒组的箱式图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。SPG04合成肽委托上海强耀生物科技有限公司合成。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1碳二亚胺偶联法制备SPG04-BSA偶联物

1）平衡SPG04、BSA、EDC（碳二亚胺）至室温，分别用0.1mol/L，pH6.0的MES生物缓冲液配制成5mg/mL、10mg/mL、10mg/mL；SPG04全长序列为：

Gly-Ile-Leu-Ala-Ala-Asp-Glu-Ser-Thr-Gly-Ser-Leu-Ala-Lys。血清多肽标志物的合成肽SPG04标准样品的质谱如图1所示。

2）将SPG04与BSA各吸取1mg于5mL小玻璃瓶中预先混合，再加到1mg EDC的5mL小玻璃瓶中进行偶联，反应在25℃恒温箱中进行，中速搅拌下偶联12小时；

3）反应结束后，将偶联物置于12-14KDa的透析袋中，用0.02mol/L，pH7.4的PBS透析24小时；

4)收集透析后的SPG04-BSA偶联物，联合UV（紫外扫描）和SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）监测偶联物SPG04-BSA。

5）UV和SDS-PAGE监测结果如图2所示：UV结果表明：多肽SPG04与BSA的UV扫描曲线明显不同，BSA的特征吸收波长在280nm处，SPG04的特征吸收在278nm处，偶联抗原SPG04-BSA的UV曲线比BSA整体上移，且在250nm处的峰谷要比BSA明显升高，说明偶联反应改变了BSA的UV特性，验证了多肽成功偶联（UV图）。SDS-PAGE结果显示，偶联物条带呈现弥散型（虚框标识），显著不同于BSA的条带（SDS-PAGE）。紫外和电泳监测结果表明多肽SPG04成功偶联到BSA上。

实施例2抗合成肽SPG04多克隆抗体的制备方法

1）采用偶联物SPG04-BSA作为免疫原，结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂，免疫新西兰大耳白兔；

2）经第3次免疫后3天，检测免疫兔静脉血滴度，滴度在1:10000以上达到取血标准；

3）对免疫兔进行颈动脉取血收集免疫全血，离心分离后收集兔免疫血清；

4）采用Protein A亲和层析柱对抗合成肽SPG04的兔免疫血清进行纯化，制备抗合成肽SPG04的多克隆抗体，检测该多克隆抗体的浓度2.7mg/mL、滴度1:128000，得到抗血清多肽标志物SPG04抗体。说明免疫效果较好，免疫兔血清中含有针对抗合成肽SPG04的特异性抗体。

实施例3多肽标志物SPG04的ELSIA试剂盒的组装

1）包被液：0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液；

2）2%OVA：2g/100mL卵清蛋白；

3）HRP酶标二抗：购自北京康为世纪生物科技公司

4）TMB显色液：A液过氧化氢，B液TMB（四甲基联苯胺）；

5）2M硫酸；

6）96孔酶联板。

实施例4多肽标志物SPG04的ELISA检测方法

样本：临床经放射治疗后确诊的鼻咽癌放疗敏感血清33份，鼻咽癌放疗抗拒血清30份。

检测过程：

1）在96孔板中，加入90μL包被液，再加入10μL待测血清样品，4℃放置过夜；同时用100μL包被液作为阴性对照；

2）弃包被液，用0.01M、pH7.4的PBST缓冲液250μL清洗5次，拍干；

3）加入200-300μL的2%OVA，37℃中静置封闭2小时；

4）弃封闭液，用0.01M、pH7.4的PBST缓冲液250μL清洗5次，拍干；

5）加入100μL抗合成肽SPG04的多抗，37℃孵育1小时；

6）弃抗体液，用0.01M、pH7.4的PBST缓冲液250μL清洗5次，拍干；

7）加入100μL抗多抗的酶标二抗，37℃孵育40min；

8）弃酶标二抗液，用0.01M、pH7.4的PBST缓冲液250μL清洗5次，拍干；

9）加入100μLTMB显色液(A、B液各50μL)，37℃避光显色15min;

10）加入50μL2M硫酸，终止反应，5min内用酶联检测仪测定波长450nm的吸光度值(OD值)。

结果经统计，如图3的ROC曲线显示，本试剂盒的敏感度达到93.3%，特异度达到90%；t检验分析P=4.86544E-11<0.05，说明多肽标志物SPG04能明显区分两组样本；箱式图表明（图4），两组样本被显著分开，其中位数相差显著，两组之间交叉较少。以上分析说明本发明所述的血清多肽标志物SPG04及ELISA检测试剂盒能显著区分鼻咽癌放疗敏感与放疗抗拒组，特异性强，重复性好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志物SPG04，其全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种以权利要求1所述多肽标志物SPG04为抗原、与该多肽发生特异性结合的抗体。

3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体，其按照如下步骤制备：

1)采用固相合成法制备合成肽SPG04；

2)采用碳二亚胺偶联法将合成肽SPG04与载体蛋白牛血清白蛋白偶联制备免疫原SPG04-BSA；

3)将免疫原SPG04-BSA进行动物免疫，获得免疫血清，通过纯化，获得浓度2.7mg/mL、滴度1:128000的抗合成肽SPG04多克隆抗体。

4.一种ELISA试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的抗体。

5.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，进一步包括包被液、2％OVA、HRP酶标二抗、TMB显色液、2M硫酸和96孔酶联板中的一种或多种。

6.根据权利要求5的试剂盒，其特征在于，所述抗体为兔源多克隆抗体，所述HRP酶标二抗为HRP-羊抗兔。

7.权利要求1所述的多肽标志物SPG04、权利要求2或3所述的抗体在制备用于检测鼻咽癌放疗敏感性试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用权利要求2或3所述抗体制备ELISA试剂盒。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述ELISA试剂盒进一步包括包被液、2％OVA、HRP酶标二抗、TMB显色液、2M硫酸和96孔酶联板中的一种或多种。