KR101772045B1 - 표피성장인자 유래의 펩타이드 단편을 포함하는 상처 치료 또는 피부 주름형성 억제용 조성물 - Google Patents
표피성장인자 유래의 펩타이드 단편을 포함하는 상처 치료 또는 피부 주름형성 억제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF)로부터 유래된 펩타이드 단편(peptide fragments 또는 small peptides)을 포함하는 상처 치료용 조성물; 및 피부노화 또는 피부주름 형성 억제용 조성물을 제공한다. 상기 펩타이드는 표피성장인자 수용체를 활성화하고, 피부 각질세포 증식 및 혈관신생을 촉진하는 활성을 갖는다. 따라서, 상기 펩타이드는 상처 치료; 및 피부노화 또는 피부주름 형성 억제에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF)로부터 유래된 펩타이드 단편(peptide fragments 또는 small peptides)을 포함하는 상처 치료용 조성물; 및 피부노화 또는 피부주름 형성 억제용 조성물에 관한 것이다. 상기 펩타이드는 표피성장인자 수용체를 활성화하고, 또한 피부 각질세포 증식 및 혈관신생을 촉진하는 활성을 갖는다.
상처는 창상이라고 칭해지기도 하며, 그 따른 증세로는 통증, 출혈, 기능장애 등이 있다. 상처는 주변 세포, 혈액 유래 세포 및 감각 뉴우런으로부터 분비되는 성장인자, 사이토카인, 신경호르몬, 및 세포 외 기질로 이루어지는 특이한 미세환경(microenvironment)을 창출한다. 상처 미세환경의 일부 인자는 충분히 오랜 기간 지속하여 말초혈액으로 확산된 후, 골수의 줄기세포에 영향을 미쳐 골수 세포의 말초혈액으로의 이동, 상처 부위로의 공급, 및 상처 치유에의 참여를 유발하는 것으로 알려져 있다.
피부의 결합조직이 파괴되지 않고 온전히 그 탄성과 강도를 유지하기 위해서는, 피부에 존재하는 콜라겐 I, III (Type I, III collagens), 엘라스틴(elastin), 파이브로넥틴(fibronectin)과 같은 세포외 기질(ECM: Extracellular matrix) 단백질이 중요하다. 자연 노화 또는 자외선에 대한 만성적인 노출은 ECM 단백질의 손실과 피부조직의 탄성과 강도를 감소시키며, 이러한 현상들은 주름형성과 같은 특징적인 피부 노화와 강하게 연관되어 있다. 기저막 단백질 분해 효소(MMPs: matrix metalloproteinases)는 진피 ECM을 분해하는데 있어서 중요한 효소로 작용한다. 자외선 조사 등과 같은 스트레스 조건하에서 각질형성세포(keratinocytes) 및 진피 섬유아세포에서의 MMPs의 과발현은 ECM 단백질을 분해하는데 기여함으로써, 피부에 주름을 형성하게 된다.
한편, 표피성장인자는 표피성장인자 수용체(EGFR)에 결합하여 다양한 세포의 증식, 분화 및 생존을 조절하는 성장인자 중 하나이다. 특히, 각질세포의 증식과 세포이동을 촉진하여 재상피화에 주요한 역할을 담당함으로써, 상처치료에 탁월한 기능하는 것으로 알려져 있다. EGF는 혈소판, 대식세포, 섬유모세포 등에서 분비되며 각질세포에는 주변분비 형식(paracrine fashion)으로 작용한다. EGF는 케라틴 K6와 K16의 발현을 증가시키며, 세포증식 신호전달과정을 활성화한다. 임상적으로 조직이식부위, 당뇨성 족부괴양과 같은 만성 창상에 외용 표피성장인자를 도포할 경우 상피화가 촉진되어 상처회복 속도가 단축되는 것으로 알려져 있다 (Barrientos S, Stojadinovic O, Golinko M, Brem H, Vinay Tomic-Canic M. 2008. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Rep Reg . 16:585). 표피성장인자 수용체가 활성화되면, VEGF와 HGF와 같은 성장인자의 생성을 유도하여 각질세포와 섬유모세포의 성장을 촉진하며, 또한 섬유모세포에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 생성을 유도함으로써, 피부노화 및/또는 피부주름을 개선한다.
본 발명자들은 피부의 각질세포와 섬유모세포에서 발현되는 표피성장인자 수용체를 활성화하는 다양한 작은 펩타이드 단편을 설계하였으며, 놀랍게도 표피성장인자로부터 유래된 특정 펩타이드 단편(peptide fragments 또는 small peptides)이 표피성장인자 수용체를 활성화하고, 각질세포의 증식 및 혈관신생을 촉진함으로써 표피의 재상피화를 촉진할 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 표피성장인자로부터 유래된 특정 펩타이드 단편을 유효성분으로 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 특정 펩타이드 단편을 포함하는 피부노화 억제 또는 피부 주름형성 억제용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1 내지 15의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 유효성분으로서 서열번호 9의 펩타이드를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1 내지 15의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부노화 억제 또는 피부 주름형성 억제용 화장료 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 유효성분으로서 서열번호 9의 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명에 따라 표피성장인자로부터 유래된 특정 펩타이드 단편이 표피성장인자 수용체를 활성화하고, 각질세포의 증식 및 혈관신생을 촉진함으로써 표피의 재상피화를 촉진한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 상기 펩타이드는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물 및 피부노화 억제 또는 피부 주름형성 억제용 화장료 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명에 따른 펩타이드에 의한 표피성장인자 수용체의 활성화를 평가한 결과를 나타낸다.
도 3 및 도 4는 각각 사람 각질세포 HaCaT(도 3) 및 생쥐 섬유모세포 NIH3T3(도 4)에서 본 발명에 따른 펩타이드에 의한 ERK와 Akt의 인산화를 평가한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 펩타이드가 각질세포의 증식에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 펩타이드에 의한 혈관신생 촉진 활성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 3 및 도 4는 각각 사람 각질세포 HaCaT(도 3) 및 생쥐 섬유모세포 NIH3T3(도 4)에서 본 발명에 따른 펩타이드에 의한 ERK와 Akt의 인산화를 평가한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 펩타이드가 각질세포의 증식에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 펩타이드에 의한 혈관신생 촉진 활성을 평가한 결과를 나타낸다.
본 명세서에서, "상처(wound)"라 함은 내재적 및 외부요인에 의해 발생하는 상피조직과 결합조직의 손상을 말하며, 바람직하게는 피부의 손상일 수 있다.
또한, "피부노화(skin aging)"이라 함은 내재적 및 외부요인에 의해 발생하는 피부의 노화를 말하며, 바람직하게는 피부주름 형성을 동반하는 피부 광노화(photoaging)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 피부주름 형성을 동반하는 자외선 자극에 의한 피부 광노화를 포함한다.
또한, "피부 주름(skin wrinkle)"이라 함은 피부상에 형성된 주름(wrinkle formation on skin)을 말한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 15의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 15의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부노화 억제 또는 피부 주름형성 억제용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 표피성장인자로부터 다양한 길이의 단편을 제조하여, 그 활성을 검색하였다. 놀랍게도, 표피성장인자로부터 유래한 펩타이드로서, 3개 또는 4개의 아미노산으로 구성된 짧은 길이를 갖는 특정 펩타이드 단편들이 표피성장인자 수용체를 활성화하고, 각질세포의 증식 및 혈관신생을 촉진함으로써 표피의 재상피화를 촉진한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 상처 치유 및 피부 재생에 대한 우수한 활성을 갖는다. 또한, 자외선과 같은 외부자극에 의해 유발되는 피부염증반응에 동반되는 피부노화의 개선 및/또는 피부주름 형성의 억제를 위한 화장료 조성물에 유용하게 적용될 수 있다. 상기 펩타이드 단편들은 다음 표 1과 같다. 일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 9의 펩타이드일 수 있다.
| 펩타이드명칭 | 서열번호 | 아미노산 서열 |
| SE208 A | 서열번호 1 | VCMY |
| SE208 B | 서열번호 2 | YACN |
| SE208 C | 서열번호 3 | ACNC |
| SE208 D | 서열번호 4 | CNCV |
| SE208 E | 서열번호 5 | NCVV |
| SE208 F | 서열번호 6 | CVVG |
| SE208 G | 서열번호 7 | VVGY |
| SE208 H | 서열번호 8 | VCM |
| SE208 I | 서열번호 9 | YAC |
| SE208 J | 서열번호 10 | ACN |
| SE208 K | 서열번호 11 | CNC |
| SE208 L | 서열번호 12 | NCV |
| SE208 M | 서열번호 13 | CVV |
| SE208 N | 서열번호 14 | VVG |
| SE208 O | 서열번호 15 | VGY |
본 발명의 약학 조성물은 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있으며, 비경구 투여 형태, 바람직하게는 피부 외용제를 포함한 비경구 투여형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥 내 투여 형태의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다. 또한, 통상의 제제학적 방법에 따라 외용액제, 에멀젼, 연고제, 패치 등의 경피투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 다양한 상처를 갖는 환자에게 1일 약 1 내지 2000 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 환자의 연령, 체중 및 증상에 따라 일반적으로 변경될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물 형태일 수 있다. 상기 화장료 조성물은 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 펩타이드를 함유하는 향장 제품, 화장수, 크림, 로오숀 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 펩타이드의 함량은 피부노화 억제, 특히 피부주름 형성 억제 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ∼ 10 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01 ∼ 1 중량%의 함량으로 함유될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
펩타이드의
합성
서열번호 1 내지 15의 펩타이드는 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)를 이용하여 FMOC 고체-상 방법(FMOC solid-phase method)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 분석용 RP 컬럼(Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.
실시예
2.
펩타이드를
포함하는 조성물의 제조
서열번호 1 내지 15의 펩타이드를 PBS에 각각 용해시켜, 1 M의 농도가 되도록 제조하였다. 얻어진 단백질 용액을 하기 시험예에서 사용하였다.
시험예
1. 표피성장인자 수용체의 활성화 평가
본 발명의 펩타이드가 표피성장인자 수용체를 활성화하는지 확인하기 위하여 in situ proximity ligation assay 방법을 사용하였다. 상기 시험은 스웨덴 오링크 바이오사이언스(Olink Bioscience, Sweden)로부터 Duolink In Situ 시약을 구입하여 수행하였다.
12 mm glass가 깔린 24 웰 플레이트에 1 mL의 DMEM 배지를 첨가하고, 4.5 × 104 개의 사람 각질세포주 HaCaT 세포(DKFZ, Heidelberg, Germany)를 도말한 후, 24시간 동안 안정화하였다. 서열번호 1 내지 15의 펩타이드를 무혈청 DMEM 배지에 각각 용해시켜 얻어진 용액을 10 μM이 되도록 첨가하고, 15분 후 4% 포름알데히드로 고정하였다. 대조군은 미처리군을 의미한다. 한 방울의 blocking solution을 각 웰의 세포에 떨어뜨리고, 37℃에서 30 분간 인큐베이션하였다. 표피성장인자 수용체 활성화에 의해 증가하는 Gab1과 Shp2간의 상호작용 정도를 측정하기 위해 항-Gab1 토끼다클론항체(Gab1 Antibody, Cell Signaling Technology, INC., USA)와 항-Shp2 생쥐단클론항체(SH-PTP2(B-1):sc-7384 mouse mAb, Santa Cruz Biothecnology, INC., USA)를 37℃에서 세포에 처리하였다. 30분 후, PLA probe solution으로 처리하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, ligation solution으로 처리하고 30분간 인큐베이션한 다음. amplication solution으로 처리하고 100분간 인큐베이션하였다. 상기와 같이 처리된 세포를 washing buffer로 세척한 후, confocal microscopy를 이용하여 붉은점의 수를 측정하였으며, 그 결과는 도 1 및 도 2와 같다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 4개 아미노산을 갖는 서열번호 1 내지 7의 펩타이드를 처리한 경우, Gab1과 Shp2 간의 상호작용이 대조군에 비하여 약 50∼100 % 정도로 증가하였다. 또한, 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 3개 아미노산을 갖는 서열번호 8 내지 15의 펩타이드를 처리한 경우, Gab1과 Shp2간의 상호작용이 대조군에 비하여 약 30∼170 % 정도로 증가되었다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드가 피부재생에서 주요한 역할을 하는 표피성장인자 수용체를 활성화한다는 것을 나타낸다.
시험예
2.
ERK
와
Akt
활성화 평가
본 발명의 펩타이드의 처리에 의하여 각질세포와 섬유모세포에서 표피성장인자 수용체 신호전달경로가 활성화되는지를 평가하기 위하여 서열번호 9의 펩타이드를 무혈청 DMEM 배지에 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 μM 농도로 용해시켜 얻어진 용액(1 ml)로 사람 각질세포 HaCaT(DKFZ, Heidelberg, Germany)과 생쥐 섬유모세포 NIH3T3(ATCC CRL-1658, USA)를 처리하였다. 15분 후, 세포추출물을 대상으로 웨스턴 블롯팅 분석을 실시하여 ERK와 Akt의 인산화의 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 3 및 도 4와 같다. 도 3 및 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, ERK와 Akt의 인산화 정도는 서열번호 9의 펩타이드에 의하여 농도의존적으로 증가하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 각질세포와 섬유모세포에서 발현되는 표피성장인자 수용체를 활성화한다는 것을 확인할 수 있다.
시험예
3. 사람
각질세포주
HaCaT
의 증식 촉진 시험
96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 5X103 개의 HaCaT 세포(DKFZ, Heidelberg, Germany)를 100 μL의 DMEM 배지에 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 서열번호 9의 펩타이드를 무혈청 DMEM 배지에 0.01, 0.1, 또는 1 μM의 농도로 용해시켜 얻어진 용액(100 μL)을 첨가하였다. 대조군은 미처리군을 의미한다. 이 후 24, 48, 72시간 동안 배양하고, 각 웰 당 10 μL의 CCK-8 (Dojindo Laboratories, Japan)으로 2 시간 처리하고, Spectramax plus 190 plate reader(Molecular Devices, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 5와 같다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 9의 펩타이드를 처리한 경우, HaCaT 세포의 증식이 펩타이드의 처리 농도에 따라 농도 의존적으로 증가되었다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드가 각질세포의 증식을 촉진한다는 것을 나타낸다.
시험예
4. 시험관 내(
in
vitro
) 혈관신생 촉진 시험
본 발명에 따른 펩타이드가 혈관신생에 미치는 영향을 하기와 같이 평가하였다. 일반적으로, 혈관의 바닥막 성분과 혈관내피 세포의 상호작용은 신생혈관의 형성과 유지에 중요한 요소이며, 바닥막 성분의 복합체인 매트리겔(Matrigel)을 24-웰 플레이트에 넣으면 중합반응을 일으켜 플러그(plug)를 형성하게 된다. 인간 제정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)을 8 x 104 cells/well의 밀도로 매트리겔이 도포된 24 well 세포배양판에 접종한 후, 서열번호 9의 펩타이드를 무혈청 M199 배지에 1, 10, 또는 100 μM의 농도로 용해시켜 얻어진 용액((1 mL)을 첨가하고 배양하였다. 대조군으로는 펩타이드 용액을 첨가하지 않은 세포배양판에 혈관내피성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF, 10 ng/ml)를 첨가한 것과 첨가하지 않은 것을 사용하였다. 24시간 후 도립현미경하에서 x50 배율로 확대하여 신생혈관 형성여부를 관찰하고 정량화하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 함유한 용액으로 처리한 경우, 혈관신생이 현저하게 촉진되는 것을 알 수 있다.
<110> KNU-INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION
<120> COMPOSITION FOR WOUND-HEALING OR INHIBITING WRINKLE FORMATION ON
SKIN COMPRISING PEPTIDE FRAGMENTS DERIVED FORM EPIDERMAL GROWTH
FACTOR
<130> PN0697
<160> 15
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide fragment
<400> 15
Val Gly Tyr
1
Claims (6)
- 서열번호 2, 3, 9, 및 10의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 서열번호 9의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 서열번호 2, 3, 9, 및 10의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 주름형성 억제용 화장료 조성물.
- 제3항에 있어서, 서열번호 9의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 서열번호 2, 3, 및 10의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드.
- 삭제
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|---|---|---|---|
| KR1020140086825A KR101772045B1 (ko) | 2014-07-10 | 2014-07-10 | 표피성장인자 유래의 펩타이드 단편을 포함하는 상처 치료 또는 피부 주름형성 억제용 조성물 |
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|---|---|---|---|
| KR1020140086825A KR101772045B1 (ko) | 2014-07-10 | 2014-07-10 | 표피성장인자 유래의 펩타이드 단편을 포함하는 상처 치료 또는 피부 주름형성 억제용 조성물 |
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-
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