JP2003506321A - インビボのβ−アミロイドレベルの免疫学的制御 - Google Patents

インビボのβ−アミロイドレベルの免疫学的制御

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、予め定めたアミド結合でβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を提供する。この抗体は予め定めたアミド結合での加水分解中に、β−アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体に優先的に結合する。提供される特異的抗体は、β-アミロイドの残基39と40、40と41、および41と42の間のアミロイド結合の加水分解を触媒する抗体を含む。本抗体は血液脳バリアーをわたる能力およびβ-アミロイドの加水分解を触媒する能力を特徴とする、べクター化された抗体お提供する。また、脳内のアミロイドレベルを下げるために、循環しているβ-アミロイドのレベルを下げるために、脳内のアミロイド斑の形成を防止するために、そしてアミロイド斑を分解するために、血流中の遊離β−アミロイドを隔絶する方法も提供する。最後に本発明はまた、ポリペプチドの加水分解遷移状態の立体配置を模するスタチン類似体または還元されたペプチド結合類似体を利用するエピトープから成る抗原で動物を免疫感作することにより抗体を生成する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野）発明の背景 アルツハイマー病は、老齢人口のかなりの部分に影響を及ぼす進行性の、そし
て最終的には致命的な痴呆の状態である。解剖による決定的診断は、高密度の老
人性斑が顕著な神経病理学的な脳の創傷の存在による。これらの細胞外沈着は、
新−皮質、海馬および扁桃ならびに髄膜および大脳血管の壁に見いだされる。こ
のような斑の主成分は39〜43残基のβ-アミロイドペプチドである。各斑が、約2
0フェントモル（80ピコモル）のこの４kDaペプチドを含む（Selkoe et al.,J.of Neurochemistry 46:1820(1986)）。アポリポタンパク質Ｅおよび微小管結合タ
ウタンパク質により形成される神経細線維のもつれがアルツハイマー病に関係す
ることが多い。
【０００２】 β-アミロイドは、β-アミロイド前駆体タンパク質と呼ばれる内在性膜タンパ
ク質から、タンパク質溶解的に開裂される。ヒトのこのタンパク質をコードする
遺伝子は、染色体21上に見いだされる（St George-Hyslop et al.,Science 235:
885(1987)、Kang et al.,Nature 325:733(1987)）。多数の培養された細胞およ
び組織（例えば脳、心臓、脾臓、腎臓および筋肉）がこのβ-アミロイド前駆体
タンパク質を発現し、そしてまた見かけ上、正常のプロセッシング経路の一部と
して４kDaのβ-アミロイドフラグメントを培養基に分泌する。
【０００３】 β-アミロイドまたはそれが形成する斑と、アルツハイマー病との間の絶対的
な因果関係を確立することは難しいが、β-アミロイドの病因的役割を支持する
十分な証拠がある。例えばダウン症候群の患者は染色体21の三染色体性により、
β-アミロイド前駆体タンパク質の過剰なコピーを有する（St George-Hyslop et
al.,Science 235:885(1987)、Kang et al.,Nature 325:733(1987)）。彼らは相
そうじて早期発生のアルツハイマー病の神経病状を30〜40歳で発症する。さらに
早期発生の家族性アルツハイマー病は、β-アミロイド配列内またはそれに隣接
して存在するβ-アミロイド前駆体タンパク質遺伝子内の突然変異から生じ得る
（Hardy,J.,Nature Genetics 1:233(1992)）。これらの観察は、脳内の斑として
のβ-アミロイドの沈着がその細胞外濃度の上昇により加速されるという知見と
一致する（Scheuner et al.,Nature Med.2:864(1996)）。β-アミロイドがイン
ビトロおよびインビボの両方で直接的に神経毒性であるという知見（Kowall et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci. 88:7247(1991)）は、斑自体ではなく可溶性の凝集し
たβ-アミロイドが病状を生じる可能性があることを示唆している。
【０００４】 アミロイド斑の形成が結晶化型のメカニズムにより進行し得るという考察が示
された（Jarrett et al.,Cell 73:1055(1993)）。このモデルによれば、斑の核
形成を開始する種は、42または43アミノ酸長のβ-アミロイドである（Ａβ1-43
）。Ａβ1-43またはＡβ1-42により形成される速度を決定する核（rate-determi
ning nucleus）は、ペプチドＡβ1-40またはより短いものをアミロイド沈着へ急
速に成長させる原因である。この核形成現象は、Ａβ1-42が動力学的に安定な過
飽和のＡβ1-40溶液の瞬間的凝集を引き起こす能力によりインビトロで証明され
た。この知見は、Ａβ1-40が核形成ペプチドＡβ1-42またはＡβ1-43の不存在下
では比較的無害であるかもしれないという可能性を導いた。実際には、これらの
長いペプチドレベルの上昇が、家族性アルツハイマー病の患者の血液中では見い
だされた（Scheuner et al.,Nature Med.2:864(1996)）。さらにＡβ1-42または
Ａβ1-43が、多くのアルツハイマー病患者の脳の斑中に沈着する主要な形態とな
ることが分かった（Gravina et al.,J.of Biol.Chem.270:7013(1995)）。
【０００５】 β-アミロイドが果たす中心的役割を考慮すると、体内のこのような分子の様
々なプール間の相互関係を解明することがますます重要になってきた。血液中に
存在する遊離β-アミロイドは、ほとんどが末梢組織中の細胞上に存在するβ-ア
ミロイド前駆体タンパク質のタンパク質溶解的開裂により放出されたペプチドか
ら生じるらしい。同様に、脳および脳脊髄液に見いだされる遊離β-アミロイド
のほとんどが、恐らく脳細胞で発現されたβ-アミロイド前駆体タンパク質のセ
クレターゼ開裂により放出されたペプチドに由来するのであろう。このペプチド
は起源とは無関係に同一であり、そして幾つかの研究結果からこのようなプール
間の相互連絡が示唆されている。発明の要約 本発明の１つの観点は、予め定められたアミド結合においてβ-アミロイドの
加水分解を触媒する抗体である。１つの態様では、抗体は予め定められたアミド
結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似
体に優先的に結合し、そしてまたELISAを使用して検出するために十分な親和性
で自然なβ-アミロイドに結合する。別の観点では、抗体は予め定められたアミ
ド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類
似体に優先的に結合し、そしてELISAを使用して検出するために十分な親和性で
自然なβ-アミロイドには結合しない。生成される抗体は、それらが加水分解す
るアミド結合が特徴である。特異的抗体には、β-アミロイドの残基39と40、40
と41、および41と42の間のアミロイド結合での加水分解を触媒するものを含む。
【０００６】 本発明の別の観点は、血液脳関門をわたる能力および予め定められたアミド結
合においてβ-アミロイドの加水分解を触媒する能力を特徴とする、べクター化
された抗体である。１つの態様では、ベクター化された抗体は二重特異性抗体であ
る。好ましくはベクター化された抗体はトランスフェリンレセプターに対する第
１の特異性および加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態に対する第２の特
異性を有する。特異的なベクター化された抗体は、β-アミロイドの残基39と40、40
と41、および41と42の間のアミロイド結合での加水分解を触媒するものを含む。
【０００７】 本発明の別の観点は、循環中のβ-アミロイドの停留を増加させるために十分
な量で、β-アミロイドに特異的な抗体を動物に静脈内投与することにより、動
物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶する方法である。この方法の治療的応用
には、アルツハイマー病の、またはアルツハイマー病の危険性があると診断され
た患者を処置することを含む。
【０００８】 本発明の別の観点は、内因性β-アミロイドに結合する抗体を生成するために
適切な条件下で、動物に対して内因性のβ-アミロイドに上に存在するエピトー
プを含んで成る抗原で動物を免疫感作することにより、動物の血流中の遊離β-
アミロイドを隔絶する方法である。この方法の治療的応用には、アルツハイマー
病の、またはアルツハイマー病の危険性があると診断された患者を処置すること
を含む。
【０００９】 本発明の別の観点は、動物の循環中のβ-アミロイドの停留を増加させるため
に十分な量で、内因性のβ-アミロイドに特異的な抗体を動物に静脈内投与する
ことにより、動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させる方法である。１つ
の態様では、抗体は予め定められたアミド結合においてβ-アミロイドの加水分
解を触媒する触媒抗体である。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルのい
ずれかでよい。１つの態様では、抗体はβ-アミロイド1-43のＣ-末端上のエピト
ープを特異的に認識する。
【００１０】 本発明の別の観点は、内因性のβ-アミロイドに結合する抗体を生成するため
に適切な条件下で、内因性のβ-アミロイド上に存在するエピトープを含んで成
る抗原で動物を免疫感作することにより、動物の脳内のβ-アミロイドレベルを
低下させる方法である。１つの態様では、抗原は、予め定められたアミド結合に
おける加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体であ
る。好適な態様では、抗原はＡβ10-25を含んで成る。好ましくは生成した抗体
は自然なβ-アミロイドよりも遷移状態類似体に対して高い親和性を有し、そし
て内因性のβ-アミロイドの加水分解を触媒する。
【００１１】 動物の循環しているβ-アミロイドのレベルを低下させるために、β-アミロイ
ドの加水分解を触媒する抗体を利用または生成する同様な方法、および動物の脳
内のアミロイド斑の形成を防止するための方法も本発明により提供される。また
β-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を利用または生成することにより、動
物の脳内に存在するアミロイド斑を分解する方法も提供する。
【００１２】 本発明の別の観点は、動物の脳内のβ-アミロイドレベルの有意な減少を引き
起こすために十分な量で動物にベクター化された二重特異性抗体を静脈内投与す
ることによる、動物の脳内に存在するアミロイド斑を分解する方法である。ベク
ター化された二重特異性抗体は、血液脳関門をわたり細胞輸送することができ、
そして結合すると予め定められたアミド結合で内因性のβ-アミロイドの加水分
解を触媒する能力を有する。好ましくは、ベクター化された二重特異性抗体は、
トランスフェリンレセプターに特異的に結合する。
【００１３】 本発明の別の態様は、加水分解遷移状態に対する抗体を生成するために適当な
条件下で、ポリペプチドの予め定められた加水分解遷移状態の立体配置を模する
スタチン類似体を有するエピトープを含んで成る抗原で動物を免疫感作すること
により、タンパク質またはポリペプチドの加水分解を触媒する抗体を生成する方
法である。この方法は、β-アミロイドに対する触媒的抗体を生成するために使
用することができる。ポリペプチドの加水分解遷移状態の立体配置を模する還元
されたペプチド結合類似体を利用する類似法も提供する。発明の詳細な記述 本発明は動物体内のβ-アミロイドのレベルを制御するための免疫学的に基づ
く方法に関する。本発明はβ-アミロイドに特異的な抗体が生理学的レベルのヒ
ト血清アルブミンの存在下でβ-アミロイドに結合することができるという知見
に基づく。本発明はまた、動物が血流中のβ-アミロイドを隔絶するために十分
な量でβ-アミロイドに特異的な抗体の存在に耐容できるという知見に基づく。
【００１４】 本発明の１つの観点は、動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶する方法に
関する。動物中に存在するβ-アミロイドの可溶性および不溶性形態は、力学的
な平衡にある。可溶性β-アミロイドは血液と脳脊髄液との間を転移すると考え
られている。不溶性のβ-アミロイド凝集物はアミロイド 斑として脳内の可溶性
プールから沈着する。以下の章の実施例に詳細に記載した結果は、β-アミロイ
ドに特異的な抗体の動物への静脈内投与が、末梢の循環からの可溶性β-アミロ
イドの通過を妨げることを示す。これは末梢の循環に限定されているβ-アミロ
イドに特異的な抗体がβ-アミロイドに結合し、そしてβ-アミロイドを循環から
隔絶(sequestering)するために起こる。そのような隔絶は、β-アミロイドに特
異的な抗体の適切な量を動物へ静脈内投与することを介して達成される。隔絶を
生じるために十分な抗体の量は、種々の因子（例えば送達される抗体に特別な特
性、サイズ、代謝および動物の全体的な健康状態）に依存し、そしてその場に応
じて決定される。
【００１５】 投与される抗体はモノクローナル抗体、異なるモノクローナル抗体の混合物、
ポリクローナル抗体、またはそれらの任意の組み合わせ物であることができる。
１つの態様では、抗体はβ-アミロイドのＣ-末端領域に結合する。そのような抗
体は小さく、そしてより害が少ないＡβ1-40とは反対に、量は少ないがより有害
なＡβ1-43に特異的に血流中で結合する。別の態様では、β-アミロイドの種々
の領域に特異性を有する抗体の組み合わせ物を投与する。別の態様では、以下に
詳細に検討するβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を、単独または他の抗-
β-アミロイド抗体と組み合わせて投与する。
【００１６】 抗体を投与される動物は、循環している可溶性β-アミロイドを有する任意の
動物である。１つの態様では、動物はヒトである。ヒトは健康な個体、または上
昇したβ-アミロイドレベルが役割を果たす疾患（例えばアルツハイマー病のよ
うな神経変性的疾患）に罹患しているか、またはその疾患の危険性にあってもよ
い。
【００１７】 本発明の関連する観点は、内因性のβ-アミロイドに対して動物内の免疫応答
を刺激することにより、動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶する方法であ
る。以下の実施例で詳細に記載する結果は、上に記載したβ-アミロイド結合抗
体の投与法と同じ様式で、動物が内因性β-アミロイドに対する抗体を生じる免
疫応答の誘導に耐容でき、そしてそのような抗体の存在が体内のβ-アミロイド
の分布を改変することを示している。この内因性β-アミロイドに対する免疫応
答は、内因性β-アミロイド上に存在するエピトープを含んで成る１以上の抗原
で動物を免疫感作することにより生成される。接種した抗原上に存在するエピト
ープは、β-アミロイド分子の任意の領域に存在するエピトープに対応すること
ができる。好適な態様では、β-アミロイドのＣ-末端領域上に見いだされるエピ
トープを、より小さいＡβ1-40とは反対にＡβ1-43に特異的に結合する抗体を生
成するために使用する。別の態様では、種々のエピトープの組み合わせ物を投与
して、β-アミロイドに対する種々の抗体を生成する。より全身性の免疫応答は
、異なる小さいペプチド抗原の混合物、または完全長の43残基のβ-アミロイド
ペプチドのいずれかを用いて免疫感作することにより生成される。別の態様では
接種に使用する抗原は、以下に詳細に記載するように、β-アミロイド加水分解
に向けた触媒活性を有する抗体を誘導するために、β-アミロイドペプチドの遷
移状態類似体を含む。
【００１８】 抗原の免疫反応性は種々の方法により強化することができるが、その多くには
抗原の免疫原性キャリアーへのカップリングが含まれる。さらに内因性分子また
はそれに含まれるエピトープの免疫原性を特異的に強化するための種々の方法が
、当業者には既知であり、しかも利用可能である。アミロイド抗原をヒトの使用
により適するようにするために、種々の修飾を本明細書に記載するアミロイド抗
原（１つまたは複数）に作成することができる。例えばペプチド（１つまたは複
数）は、適当な抗原性キャリアーに遺伝子操作することができ、またはDNAワク
チンを設計することができる。
【００１９】 循環からβ-アミロイドを隔絶するための上記技法も、脳内のβ-アミロイドレ
ベルを低下させるために有用である。脳内のアミロイド斑の形成は少なくとも部
分的には脳内に存在する遊離β-アミロイドのレベルに依存するので、動物の脳
のβ-アミロイドのレベルを減少させることが、次に脳内のアミロイド斑の形成
を減少させる。したがって上記技法は、動物の脳内のアミロイド斑の形成を防止
するために有用である。これはアミロイド斑発生の危険性があると考えられる動
物に特に応用することができ：この危険性は遺伝的な疾病素質から、または環境
的な要因からもたらされ得る。β-アミロイドに対する抗体の投与、すなわち内
因性抗体を生成するための動物を免疫感作は、そのような動物（例えばアルツハ
イマー病の家系であるヒト、またはこの疾患と診断されたヒト）に対して治療的
に有益となる。
【００２０】 本発明の別の観点は、予め定められたアミド結合においてβ-アミロイドの加
水分解を触媒する能力を特徴とする抗体に関する。実施例の章で詳細に記載する
実験は、β-アミロイドに対するタンパク質溶解的活性を有する様々な抗体の生
成を示す。そのような抗体は動物を、β-アミロイドペプチドの遷移状態類似体
である抗原で免疫感作することにより生成される。遷移状態類似体は、予め定め
られたアミド結合の加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する。触媒
抗体の生成に有用な遷移状態類似体は、限定するわけではないが、スタチン、フ
ェニルアラニンスタチン、ホスホネート、ホスホンアミデートおよび還元された
ペプチド結合遷移状態類似体である。
【００２１】 遷移状態に特有のエピトープに対して生成された抗体は、遷移状態のβ-アミ
ロイドに優先的に結合する。このような抗体の結合は遷移状態を安定化し、これ
は対応するアミド結合の加水分解を導く。加水分解される特定のアミド結合は、
所望する開裂産物に基づき選択される。例えば、完全長のβ-アミロイドのアミ
ロイド斑に凝集することができない２つのペプチドフラグメントへの開裂は、本
明細書に開示する方法において治療的に使用されるだろう。抗体はモノクローナ
ルまたはポリクローナルでよい。幾つかのそのような遷移状態模造物が作成され
、そして示した結合での開裂を触媒するモノクローナル抗体の生成に抗原として
使用される。これらの抗原および生成した抗体は、以下の実施例の章の表８に掲
げる。特異的なアミド結合において取り込まれた遷移状態模造物を有する抗原に
対して生成した抗体は、自然なβ-アミロイド中のこのような結合の自然な加水
分解遷移 状態に結合し、遷移状態を安定化し、そしてその結合における開裂を触
媒するはずである。
【００２２】 少なくとも２つの異なる抗体が上記方法により生成される。１種類目は遷移状
態類似体に優先的に結合し、そしてまた結合を検出するために、実施例の章に詳
細に記載するELISAを使用して自然なβ-アミロイドと検出可能に交差反応する。
２種類目は遷移状態類似体に結合し、そして結合を検出するために、実施例の章
に詳細に記載するELISA手法を使用して自然なβ-アミロイドと検出可能に交差反
応しない。両種類の抗体も、触媒抗体として有力な価値がある。抗-遷移状態抗
体の各結合親和性は、加水分解の触媒でその能力を反映するだろう。抗体がタン
パク質の加水分解を触媒する活性を有するためには、抗体は少なくともタンパク
質の自然な（非遷移）状態に結合する最小能力を保有しなければならないと考え
られる。β-アミロイドに対する重要な結合を保持する（自然なβ-アミロイドと
強力に交差反応する）抗体は、より高い効率のβ-アミロイド結合により、加水
分解をより効率的に触媒するだろう。いったん結合すれば、これらの抗体は加水
分解的開裂のためにタンパク質を遷移状態の立体配置に強制する。あるいは自然
なβ-アミロイドとわずか最小に交差反応する抗体は、自然なβ-アミロイドとの
結合では効率は低いが、加水分解的開裂のために結合したβ-アミロイドを遷移
状態の立体配置により効率よく強制するだろう。本明細書の実施例で提示される
ELISA法により自然なβ-アミロイドへの抗-遷移状態抗体の結合を検出すること
ができないことは、触媒抗体として機能するために十分に自然なβ-アミロイド
に結合できないことを必ずしも反映しているものではないことを指摘するべきで
ある。むしろ検出されないことは単にアッセイの感度限界を反映しているのだろ
う。
【００２３】 自然なβ-アミロイドペプチドの予想される開裂産物に対して実質的な親和性
を有する抗体は生産物阻害を受け、したがって低い代謝回転を表すかもしれない
。そのような望ましくない抗体は、予想される開裂産物のエピトープを含むペプ
チドを使用した２次スクリーニングにより同定することができる（例えばELISA
を介して）。
【００２４】 好適な態様では、抗体はモノクローナルである。モノクローナル抗体は、動物
（例えばマウス、モルモットまたはラット）を、遷移状態類似体抗原で免疫感作
し、そして続いて標準的手法により動物からハルブリドーマを作成することによ
り生産される。所望のモノクローナル抗体を生産するハルブリドーマは、スクリ
ーニングにより同定する。スクリーニング法の１例は、以下の実施例の章に提示
する。別の態様では、抗体はポリクローナルである。ポリクローナル抗体は動物
（例えばウサギ、ニワトリまたはヤギ）を抗原で免疫感作し、そして動物から血
清を得ることにより生産する。所望の結合親和性を有するポリクローナル抗体は
、日常的な実験過程を通して当業者により血清からさらに精製することができる
。
【００２５】 あるいはβ-アミロイドに特異的な触媒抗体は、触媒抗体の生産を誘導するよ
うに設計された抗−イディオタイプワクチンの使用を通して個体で生成すること
ができる。そのようなワクチンはRaso and Paulus（1998年６月22日に出願され
、現在係属中の米国特許出願第09/102,451号明細書、触媒抗体を誘導するための
抗−イディオタイプワクチン（ANTI-IDIOTYPE VACCINES TO ELICIT CATALYTIC A
NTIBODIES)）の開示に記載され、その内容は引用により本明細書に編入する。
【００２６】 本発明の別の観点は、タンパク質溶解活性を有する触媒抗体を誘導するための
スタチンおよび還元されたペプチド結合類似体を使用することである。以下の実
施例の章では、触媒抗体の生産において抗原としてスタチン類似体を使用するた
めの方法を詳細に記載し、そしてまたこのような方法を使用して生成された抗-
遷移-状態抗体の例を掲げる。「スタチル（statyl)」部分は、アマスタチン、ペ
プスタチンおよびベスタチンのような自然に放出されるプロテアーゼ遷移状態イ
ンヒビターに由来する。このような自然に存在するスタチンに基づくインヒビタ
ーは、アミノペプチダーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびHIVプロテアー
ゼの活性を効果的に遮断するために使用され来た。スタチン残基を含有する合成
ペプチドは、触媒抗体の誘導に新たな特徴を提供する。スタチル部分は四面体の
結合構造を有し、その長さは２つのCH2単位により延長され、これは計画的に配
置されたOH基を有し、そして構造は電荷をもたない。さらなるCH2単位の存在に
より、より延長された抗体結合部位を誘導すると予想され、そしてこの延長部位
を有する抗体は、ペプチド基質上にさらなる歪み（strain）を誘導し、加速され
た触媒作用を生成する。さらにこれらのスタチン類似体中の-OH基が、真の遷移
状態の位置および化学によりよく近付けると考えられる。したがってスタチンに
基づく遷移状態類似体は、より多く使用される負に荷電したホスホネート類似体
から得られるものとは有意に異なる種類の抗体を誘導するはずである。
【００２７】 還元されたペプチド結合類似体は、アミノ酸残基間の距離を増すことなく四面
体の立体配置を導入する。この特徴はこれまでに使用された類似体よりも真の遷
移状態の構造により近付けるはずである。正に荷電した２級アミンを自然なポリ
ペプチドのアミド窒素に置き換え、そして抗体結合部位中の近位で完全に負に荷
電した側鎖を誘導するはずである。抗体上のそのような補助的なグルタミンまた
はアスパラギン基は、酸−塩基交換を介してペプチド開裂の抗体が媒介する触媒
を補助するだろう。したがって還元されたペプチド結合に基づく遷移状態類似体
は、より多く使用される負に荷電したホスホネート類似体を使用することから得
られるものとは有意に異なる種類の抗体を誘導するはずである。還元されたペプ
チド結合類似体およびスタチン類似体は、広範なタンパク質またはポリペプチド
に特異的な遷移状態類似体抗原を生成するために使用することができる。これら
の抗原は次に、各触媒抗体を生成するために使用することができる。
【００２８】 上記のβ-アミロイド触媒抗体を投与は、１）動物の血流中の遊離β-アミロイ
ドを隔絶するために、２）動物の脳内のβ-アミロイドレベルを下げるために、
そして３）動物の脳内のアミロイド斑の形成を防止するために、上記の方法で使
用して類似の結果を生じることができる。実施例に提示した実験では、遷移状態
類似体を用いた動物の免疫感作により、免疫応答を生じて遷移状態を認識し、そ
してβ-アミロイドタンパク質の加水分解を触媒する抗体の生成をもたらすこと
が証明される。これは遷移状態類似体がこれらの方法で抗原として使用されて、
内因性のβ-アミロイドを認識し、そして開裂を触媒する抗体の動物中での生成
を誘導できることを示している。
【００２９】 上記の触媒抗体のタンパク質溶解的作用を通して動物中の全体的なβ-アミロ
イドレベルを下げることを含む方法も、本発明により包含される。動物内の循環
中に機能的な触媒抗体が存在すると、選択的な加水分解的開裂により循環中の完
全なβ-アミロイドレベルを下げるだろう。したがって、本発明は動物に上記の
触媒抗体を導入することにより、動物内で循環しているβ-アミロイドのレベル
を下げる方法を提供する。動物への抗体の投与は、好ましくは静脈内投与を介す
る。そのような抗体はモノクローナル、混合モノクローナル、ポリクローナルま
たはそれらの混合物である。抗体の起源は動物中の抗体の半減期に影響を及ぼす
ことができ；関連性が少ない種に由来する抗体は、動物の免疫系により外来であ
るとより認識されるだろう。好ましくは投与する抗体は、半減期を最大にし、そ
して宿主による悪い副反応を最小にするために、動物に親密に関連する種に由来
する。
【００３０】 これに関して、単離された可変領域抗体フラグメントの投与は有益な結果を生
じることができる。
【００３１】 本発明は内因性の触媒抗体を誘導するために、β-アミロイド遷移状態類似体
で動物を免疫感作することにより、動物内に循環しているβ-アミロイドのレベ
ルを低下させる方法も提供する。そのようなワクチンの使用および設計を上に記
載し、そして以下の実施例の章で詳細に説明する。
【００３２】 動物の循環中のβ-アミロイドレベルの減少は、体内のβ-アミロイドの平衡を
置き換え、そして最終的には大量の作用（mass action）を通して動物の脳内に
おけるβ-アミロイドレベルの減少を導くと期待される。これに関して、本発明
は動物に触媒抗体を投与するいずれかにより、または内因性の抗体生成を誘導す
るために遷移状態類似体を投与することによるいずれかで、動物の脳内のβ-ア
ミロイドレベルを減少させる方法を提供する。生じた動物の脳内のβ-アミロイ
ドレベルの低下がアミロイド斑の形成を防止するはずであるので、続いてこのよ
うな手法はまた、動物の脳内に存在するアミロイド斑の形成を防止する方法とし
ても価値がある。またこれらの手法は、脳のより低いβ-アミロイドレベルが斑
の分解（disaggregation)を導くことができる証拠が示されているので、動物の
脳内に存在するアミロイド斑の分解法としての価値を有する。
【００３３】 本発明の別の観点は、脳に抗-β-アミロイド抗体を実際に送達することにより
、脳内のβ-アミロイドの分布を改変させるより直接的な方法を提供する。脳内
のβ-アミロイドレベルを減少させるための、およびアミロイド斑の凝集を防止
するための上記の方法は、血液、組織、脳脊髄液および脳内のβ-アミロイドプ
ール間の交換に依存し、この交換はこれらの異なるプール間の平衡分布の抗体が
媒介する破壊により動かされる（driven）。対照的に、抗-β-アミロイド抗体の
脳への送達は、β-アミロイド凝集に直接影響を及ぼすだろう。以下の実施例に
提示される証拠は、特定の抗-β-アミロイド抗体の結合がインビトロでβ-アミ
ロイドの初期の凝集を阻害し、そしてまたインビトロの形成されたβ-アミロイ
ド複合体を分解することを示す。さらに不溶性ペプチドが低レベルの可溶性β-
アミロイドと平衡にある場合、抗-β-アミロイド結合抗体がこのバランスを崩し
、そして次第に沈殿を溶解する。このような観察は、脳内のβ-アミロイドの存
在がアミロイド斑の形成を直接阻害し、そしてまた可溶性β-アミロイドと斑と
して沈着した線維性β-アミロイドとの間の力学的平衡を破壊することにより、
形成された斑を分解することを示している。さらに高度に活性な触媒抗体が発現
されて、構成成分である凝集したペプチドを加水分解的に開裂することにより、
不溶性β-アミロイド斑を破壊すると期待される。
【００３４】 脳に抗体を送達するための１方法は、血液脳関門をわたって細胞輸送すること
ができるベクター化された抗体を生成することによる。ベクター化された抗体は
、抗体を、循環から体内の予め定めた方向への送達を促進する作用物質に共有結
合させることにより生成する。血液脳関門を横断することができるベクター化分
子の例は、従来技術に見いだされる（Bickel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9
0:2618-2622(1993)；Broadwell et al.,Exp.Neurol.142:47-65(1996)）。これら
の実施例では、抗体を別の分子に連結し、抗体は高分子の送達を促進する作用物
質である。そのような作用物質の１例は、細胞表面から移動させられるレセプタ
ーのような細胞表面成分に向かうようにされた抗体である。血液脳関門を細胞輸
送するための能力を付与する抗体の例は限定するわけではないが、抗-インスリ
ンレセプター抗体、およびまた抗-トランスフェリンレセプター（Saito et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10227-31(1995)；Pardridge et al.,Pharm,Res.12:
807-816(1995)；Broadwell et al.,Exp.Neurol.142:47-65(1996)）を含む。この
第１抗体をβ-アミロイドに結合する抗体に共有結合する。あるいはβ-アミロイ
ド抗体をこのようなレセプターに結合するリガンド（例えばインスリン、トラン
スフェリンまたは低密度リポタンパク質）にカップリングすることは、循環から
脳へ送達するためにベクター化された抗体成分を生成する（Descamps et al.,Am .J.Physiol .270:H1149-H1158(1996)；Duffy et al.,Brain Res.420:32-38(1987)
；Dehouck et al.,J.Cell.Biol.138:877-889(1997)）。
【００３５】 ベクター部分は抗-β-アミロイド抗体に化学的に結合して、それを中枢神経系
へ送達し易くすることができる。あるいは部分を組込み成分として抗体に遺伝的
に操作することができる。このベクター成分は例えば、血液脳関門を作る脳の毛
細管内皮細胞上に存在するレセプターに結合する抗-トランスフェリンレセプタ
ー抗体または抗-インスリンレセプター抗体であることができる（Bickel et al.
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2618-22(1993)；Pardridge et al.,J.Pharmcol.Ex p.Ther. 259:66-70(1991)；Saito et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10227-31(
1995)；Friden et al.,J.Pharmcol.Exp.Ther.278:1491-1498(1996)）。生成した
二機能性抗体は、管の管腔側上の適切なレセプターに結合する（Raso et al.,J. Biol.Chem. 272:27623-27628(1997)：Raso et al.,J.Biol.Chem.272:27618-27622
(1997)：Raso,V.Anal.Biochem.222:297-304(1994)；Raso et al.,Cancer Res. 4
1:2073-2078(1981)；Raso et al.,トキシンに共有的または非共有的に結合した
細胞標的キャリアーとしてのモノクローナル抗体。薬剤のレセプターが媒介する
ターゲッティング（Receptor mediated targeting of drugs)、第82巻で、G.Gre
goriadis,G.Post,J.Senior and A.Trouet、編集。NATOアドバンスト スタディズ
研究所（Advanced Studies Inst.)、ニューヨーク、119-138(1984)）。いった
んレセプターに結合したら、二重特異性抗体の両成分は細胞輸送のプロセスによ
り血液脳関門をわたって進む。脳に入った抗-β-アミロイド抗体は、β-アミロ
イド斑および可溶性β-アミロイドプールの両方と、直接相互反応する。これら
の脳毛細管に濃縮されたタンパク質標的部位を介するベクターが媒介する送達を
使用して、脳内で10-8〜10-7Mの範囲の高分子の濃度が達成できると予想された
（Maness et al.,Life Science 55:1643-1650(1994)；Lerner et al.,Science 2
52:659-667(1991)）。重要なことは、２週間、毎日抗-トランスフェリンレセプ
ター抗体を投与された動物が、放射性シュクロースプローブを使用して血液脳関
門の完全性の損失を示さなかったので、ベクターは安全であるという点である（
Broadwell et al.,Exp.Neurol.142:47-65(1996)）。
【００３６】 実施例は、β-アミロイドに結合するベクター化された二重特異性抗体の生成
を詳細に記載する。二重特異性抗体はトランスフェリンレセプターに結合する第
１の特異性を介して血液脳関門をわたって細胞輸送する。血液脳関門をわたる作
用物質の送達のために、トランスフェリンレセプターに結合する抗体を使用する
ことは、Friden et al.により米国特許第5,182,107号；同第5,154,924号；同第5
,833,988号；および同第5,527,527号明細書に記載されており、その内容は引用
により本明細書に編入する。
【００３７】 以下の実施例の章で提示する実験結果は、生成された二重特異性抗体がそれら
の別々の特異性を保持し、そして静脈内投与された時に血液脳関門をわたって生
きている動物の脳の実質および脳の毛細管に送達されることを示す。
【００３８】 二重特異性試薬を遺伝子操作するために、または２つの異なるハイブリドーマ
クローンを融合することにより二重特異性抗体を細胞内で生産するために、二重
特異性抗体の別の生成法が記載された（Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.9
0:6444-6448(1993)；Milstein et al.,Nature 305:537(1983)；Mallander et al
.,J.Biol.Chem,269:199-206(1994)）。これらの技法により生成されたベクター
化された二重特異性抗体も、本発明の方法に使用することができる。
【００３９】 全抗体を脳に導入することは、抗体が補体を結合し、そして神経細胞の補体が
媒介する溶解を促進すれば有害となるので、より小さいベクター化F(ab')2二重
特異性試薬を生成し、そして使用することが有益となり得る。凝集したβ-アミ
ロイド自体は抗体無しで補体を結合することができ、そして生じた炎症がアルツ
ハイマー病の病状に関与し得ることが示された。同様の効果を有する脳内抗体の
可能性は、抗体のFc領域を排除することにより大きく下げることができる。さら
に、Fab'の半分をカップリングすることは本来のヒンジ領域システインを使用す
るので、外因性の代替連結基が加えられる必要がない。より速く、またはより効
率的に脳に入ることは、より小さいF(ab')2またはFv2試薬が脳内送達に提供する
ことができる別の潜在的な利点を表している。さら２種類のベクター化分子は、
異なる体内分布および血漿半減期特性を有することができる（Spiegelberg et a
l.,J.Exp.Med.121:323(1965)）。
【００４０】 抗-β-アミロイド二重特異性抗体の設計に依存して、それらは脳内で可溶性β
-アミロイドおよびβ-アミロイド沈着を３つの有力なメカニズムにより減少させ
ることができる。可溶性β-アミロイドに強力に結合する抗-β-アミロイド二重
特異性抗体はペプチドを隔絶するだけではなく、中枢神経系からのベクター化分
子の流出により（Kang et al.,J.Pharm.Exp.Ther.269:344-350(1994))、結合し
たβ-アミロイドも脳外に運び、それらを血流中に放出することができる。その
ようなクリアランスメカニズムは、脳から出るβ-アミロイドの連続する循環を
導くだろう。さらに抗体が触媒活性を有する場合、それらは分解により有害なβ
-アミロイドのレベルを直接下げるだろう。触媒抗体は代謝回転を示すので、各
抗体は多くのβ-アミロイド分子を不活性化することができる。すなわちβ-アミ
ロイドの所望する減少を達成するために、脳に送達されなければならないベクタ
ー化された二重特異性抗体はより一層少ない。
【００４１】 効果的にするために、二重特異性抗体の抗-β-アミロイド部位は血液から出て
、そして脳内に進む前に空でなければならない。したがって、動物内の二重特異
性抗体の濃度は血液中を循環しているβ-アミロイドのレベルを越えなければな
らない。既知のβ-アミロイドレベルに基づき行われる循環(Scheuner et al.,Na ture Med. 2:864-870(1996)）および処置した動物において予想される二重特異性
抗体の中程度の範囲の血漿レベルは、脳に入る99.9％の二重特異性抗体が非占有
抗-β-アミロイド結合部位を有することを示した。
【００４２】 抗体を脳に送達する別の方法は、抗-β-アミロイド抗体の動物の脳への直接的
注入を介する。この技法は、血液脳関門を横断する必要無しに脳内のβ-アミロ
イドにこれらの抗体を直ちに接近させる。直接注入は、直接実質に、または脳室
内注入を介して行うことができる（Knof et al.,J.Immunol.161:692-701(199))
。簡単に説明すると、動物に麻酔をかけ、そして定位フレイムに配置する。頭皮
上に正中切開を行い頭蓋を露出し、そして下にある筋膜をかき出す。先端がおよ
そ脳内に位置するように定位に進行する滅菌したステンレス鋼製の皮下チューブ
の長さを受けるために、ドリルで穴をあける。次いでガイドカニューレを頭蓋に
つけ、そして密閉する。カニューレは脳に抗体を多数回注入するために正しい位
置に留まる。モノクローナル抗-β-アミロイドの滅菌した50mg/ml溶液のボーラ
スを、２〜８分間にわたり固定化された動物に注入カニューレを介して注入する
ことができる。
【００４３】 上記の方法の１つを介して動物の脳に触媒抗体を送達することは、脳に存在す
るアミロイド判の分解にも使用することができる。脳へのβ-アミロイド特異的
触媒抗体の送達の利点は２倍である。触媒作用は連続的であり、各抗体が脳内の
多くの標的β-アミロイド分子を不活性化するので、β-アミロイドペプチドはそ
のような抗体により永久的に破壊される。すなわちβ-アミロイドの所望する減
少を 達成するために、中枢神経系に注入しなければならない抗体は一層少ない
。
【００４４】 動物に投与または送達される抗体の量は、動物の脳内のβ-アミロイドレベル
に有意な減少を引き起こすために十分であるべきである。適切な量は種々のパラ
メーター（例えば使用する特定の抗体、動物のサイズおよび代謝、ならびに内因
性β-アミロイドレベル)に依存し、そしてその場に応じて決定されるべきである
。そのような決定は、日常的に実験を行うだけで、平均的な当業者の技術範囲に
ある。
【００４５】 脳のβ-アミロイドレベルを下げ、そしてアミロイド斑を防ぐ、または分解す
ることに関して、さらなる利点が上記方法の１以上の組み合わせを利用すること
により達成することができると期待される。
【００４６】
【実施例】
実施例 第１章：循環中β-アミロイドの停留 β-アミロイドペプチド抗原の合成 43残基のβ-アミロイドペプチド（Ａβ）のアミノ酸配列を図１に掲げる。こ
のβ-アミロイドペプチド上のどの部位が抗体が媒介する治療に最も適するかを
決定するために、Ａβ43-merの３つの重要な領域（アミノ−末端、中央およびカ
ルボキシ−末端）を選択して、エピトープに特異的なワクチンを生成した。これ
らの短縮化されたペプチドは、高度に特異的な抗体応答を誘導するために抗原性
ペプチドとして役立てた。
【００４７】 Ａβのアミノ−末端領域に対するモノクローナル抗体は、Ａβ凝集物を可溶化
する能力があると過去に示された（Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94
(8):4109(1997)；Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1):452(1996)。
Ａβのアミノ−末端領域から成るペプチドは本実験のために同様に設計し（図２
に示し、そして配列番号２に掲げる）、そしてＡβに結合するアミノ−末端特異
的抗体を誘導するために使用した。Cys残基をＡβ配列のＣ−末端に加えて、こ
のペプチドをマレイミド−活性化キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）の
ような抗原性キャリアータンパク質にカップリングするための適当な連結基を提
供した。
【００４８】 Ａβの中央領域を包含するペプチドも合成した（図３に示し、そして配列番号
３に掲げる）。Cys残基をＡβ配列のＮ−末端に配置して、このペプチドをマレ
イミド−活性化KLHのような抗原性キャリアータンパク質にカップリングするた
めのスルフヒドリル連結基を提供した。
【００４９】 Ａβのカルボキシ−末端に対して向けられた免疫応答を誘導するための抗原を
生成するために（Suzuki et al.,Science 264:1336(1994)）、Ｎ−末端にCys残
基を付加したＡβのＮ−末端領域を包含するデカペプチドを合成した（図４に示
し、そして配列番号４に掲げる）。Cys置換はこのペプチドをKLHのような抗原性
キャリアータンパク質にカップリングするためのスルフヒドリル連結基を提供す
るために設計した。ペプチドの抗原性キャリアータンパク質へのカップリング 様々なCysを含むＡβペプチドを、個々にマレイミド−活性化KLHにチオエーテ
ル結合させた。多価Ａβワクチンも、３種のすべてのこのようなペプチドをマレ
イミド−活性化KLHに同時に連結することにより生成した。さらに完全長Ａβ43-
merをグルタルアルデヒドを使用してKLHに連結した。β-アミロイドワクチンを用いて誘導された抗体 正常なBALB/cマウスは、標準的な手順により上記のKLH-連結Ａβワクチンを用
いて免疫感作した。マウスは採血するか、またはハイブリドーマ作成のために脾
臓を摘出するために屠殺した。得られた血清およびモノクローナル抗体は、Ａβ
に対する結合について特性決定した。
【００５０】 表１は、２匹の非免疫感作対照マウスからの血清で希釈した1/100 対 中央領
域Ａβペプチド-KLHワクチンで免疫感作したマウスからの血清で希釈した1/100
および1/1000でのELISA実験からの結果を示す。血清中の抗-KLH抗体の検出を回
避するために、遊離Ａβペプチドをマイクロタイタープレートに直接吸着させた
。
【００５１】
【表１】
【００５２】 この中央領域Ａβペプチドに対して生成された、およびハイブリドーマ融合に
より生成されたモノクローナル抗体は、上記のELISAアッセイを使用して同定し
た。結合アッセイは、同定されたモノクローナル抗-Ａβ抗体が完全長のＡβペ
プチドにも結合するかどうかを決定するために行った。125Ｉ-Ａβ1-43プローブ
は、示したクローンからのハイブリドーマ分泌物とインキューベーションした。
標準的ポリエチレングリコール分離法を使用して、125Ｉ-Ａβ1-43結合抗体を検
出した（表２）。表２に示す結果は、ペプチドフラグメントに対して生成された
抗体が完全長のＡβ1-43にも結合することを示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】 125Ｉ-Ａβ1-40をヒト血漿に加えた時、〜89％がアルブミンに結合することが
報告された（Biere et al.,J.of.Biol.Chem. 271(51):32916(1996))。これは結
合したアルブミンが抗体結合を妨害するという懸念を生じる。アルブミンの結合
が抗体のＡβへの結合を妨害するのかどうかを決定するために、結合アッセイを
血清アルブミンの存在および不存在下で行った。 精製した5A11モノクローナル
抗-Ａβ抗体が125Ｉ-Ａβ1-40に結合する能力は、60mg/mlのヒト血清アルブミン
(HSA)の存在により、たとえこれが抗体濃度よりも500倍モル過剰でも影響を受け
なかった（表３）。これらの結果は、抗体が血中のＡβに結合し、そして隔絶す
る能力が、他の結合タンパク質の存在により弱化されないことを示す。
【００５５】
【表３】
【００５６】モノクローナル抗体の生産 マウスは中央領域Ａβ10-25ペプチド（このペプチド抗原は、以下の章IIでさ
らに検討するフェニルアラニンスタチン遷移状態類似体をアミド結合で有する）
のKLH結合物を用いて免疫感作した。ハイブリドーマの融合を行い、そして生産
されたモノクローナル抗体を分析してワクチンに対する免疫応答の特異性を特性
決定した。融合で生成されたハイブリドーマ上清は、ELISAを使用してスクリー
ニングしてそれらのＡβ1-43ペプチドに対する結合を評価した。
【００５７】 生産されたモノクローナル抗体は、ELISAプレートに直接吸着されたＡβ1-43
ペプチドに結合すると決定された。強力な発色反応が、わずか10μlのハイブリ
ドーマ上清を使用したELISAで得られたが、培地を単独で加えると低いバックグ
ラウンド色を生じた。これらの結果は抗体が小さいペプチド免疫原に結合するだ
けでなく、完全長のＡβ1-43にも反応性であることを示している。重要なことは
、抗体がマイクロタイタープレートに直接吸着したキャリアーをもたないＡβペ
プチドに結合し、それらが免疫原性キャリアーよりはむしろペプチドに対する特
異性を示したことである。高親和性5A11モノクローナル抗体（表３）は、このハ
イブリドーマ融合から得られた。
【００５８】 第２のマウスは、ＡβのＣ-末端領域を包含するＡβ35-43類似体のKLH結合物
を用いて免疫感作した。マウスに由来する血清は、ELISAウェル上に直接吸着さ
せたＡβ1-43との反応性についてスクリーニングした。このアッセイ結果を表４
に示す。このマウスからの脾臓は次いでハイブリドーマ融合に使用して、その免
疫応答の特異性を特性決定した。重要なことは、Ａβワクチンで免疫感作された
マウスまたは抗-Ａβ腹水-生産マウスのいずれもが、このような誘導された抗体
の幾つかはマウスＡβおよびマウスアミロイド前駆体タンパク質と交差反応する
にもかかわらず、病気を示さなかったことである。
【００５９】
【表４】
【００６０】 上記のように作成されたハイブリドーマクローンに由来するモノクローナル抗
体を、小さいカルボキシ−末端ペプチドＡβ35-43および完全長Ａβ1-43に対す
る結合に関してスクリーニングした。結果を図５に示す。モノクローナル抗体は
、マイクロタイタープレートに直接吸着したこのようなキャリアーを含まない各
Ａβペプチドのカルボキシ−末端部位に結合し、それらの免疫キャリアーよりは
むしろペプチドに対する特異性が確認された。クローンもＡβ1-40を用いて試験
して、この短縮化された40アミノ酸残基のＡβ変異体とは反応しない抗体、すな
わちＡβ1-43のカルボキシ−末端に特異的に結合する抗体を同定した（図５）。
治療的に使用すると、このワクチンはより小さく、そしてより害が少ないＡβ1- 40 ではなく、数は少ないが、より有害な血流中のＡβ1-43種に優先的に結合する
。
【００６１】 別の実験で、マウスをβ-アミロイドの別個の領域を表す３種の異なるKLH−ペ
プチド抗原（図２〜４）のカクテルから成るワクチンで免疫感作した（図１）。
対照マウスはKLH単独で免疫感作した。抗原は、初回注射前に完全フロインドア
ジュバントで乳化し、そして続く注射には不完全フロインドアジュバントで乳化
した。試験はこれらのＡβ-KLH免疫感作マウスに由来する希釈した血清について
行い、特異的な抗-Ａβ抗体の存在について測定した。Ａβ1-16、Ａβ14-25、Ａ
β34-43、Ａβ1-40およびＡβ1-43ペプチドを使用して、抗体の特異性を確認し
た。ペプチドをELISAプレートに直接吸着させた。結果は表５に与える。この結
果は３種ペプチド抗原のカクテルで免疫感作したマウスが、アミノ−末端、中央
領域およびカルボキシ−末端ペプチド、ならびに完全長Ａβ40-merおよび43mer
と反応する抗体を含む血清を生成したことを示す。この抗-Ａβ抗体のスペクト
ルの一貫した存在は、予防接種した動物の末梢循環内のすべての可溶性Ａβとの
結合に大変効果的である。
【００６２】
【表５】
【００６３】非ヒト霊長類におけるワクチン試験 アルツハイマー病のヒト患者についてβ-アミロイドワクチン療法の潜在的重
要性を考慮して、ヒトに適合可能なalumに基づくＡβペプチドワクチン調製物を
非ヒト霊長類で試験した。ヒトに適合可能な抗体生産および安全性試験は、カニ
クイザル（Macaca fascicularis）で実施した。この動物系はこれら霊長類の予
想されるβ-アミロイドのアミノ酸配列がヒトと同一であり、そしてそれらの基
本的な生理学および免疫学系が臨床的状況において遭遇する状況に極めて近いこ
とから、ヒトへの応用と高度に関連している。カニクイザルは毎月予防接種し、
そして血清中の抗-Ａβレベルをモニターするために周期的に採血した。
【００６４】 カニクイザルは、水酸化アルミニウムゲルに吸着させた完全長のβ-アミロイ
ドペプチドを含んで成る最も単純なワクチン調製物の単回注射に対して強い免疫
応答を生じた。そのような初期の抗-β-アミロイド抗体の特異性は、種々のＡβ
ペプチドフラグメントを使用してELISAにより特性決定した（表６）。この分析
はサルが完全長のペプチドに結合し、そしてそのアミノ末端、中央およびカルボ
キシ−末端領域で反応する抗体を生成したことを示した。
【００６５】
【表６】
【００６６】 重要なことは、予防接種したサルが完全に健康であり、そして３カ月間にわた
りそれらの体内で循環していた抗-Ａβ-抗体と適合性があると思われる点である
。すなわち抗-Ａβ-抗体と自然に存在するβ-アミロイド前駆体タンパク質また
は他のウイルス成分との交差反応による明らかな副作用はない。これらの動物は
獣医師により細かく観察され、そして自己免疫疾患、免疫複合体病または予防接
種に対する任意の他の悪性／毒性反応を現さなかった。
【００６７】 実験を続行して、常法のように追加免疫注射を行う。生成した血清は、免疫応
答が強くなり、そして成熟した時に抗体の特異性および親和性パラメーターにつ
いてモニターする。最後に、サルについて完全な検死および組織病理学的検査を
行う。以下に検討する遺伝子操作したＡβワクチンもカニクイザルで評価して、
それらがさらによい免疫原となるかどうかを決定する。正常なマウスにおける125Ｉ-Ａβの分布に及ぼす抗体の影響 循環中の抗-Ａβ抗体は血液脳関門を十分な程度で横断することができないの
で、125Ｉ-Ａβ1-40が脳に到達することを防止するシンク（sink）として作用す
るはずである。この停留効果は、マウスに等量の125Ｉ-Ａβ1-40を単独または我
々の5A11抗-Ａβモノクローナル抗体と注射した４時間後に、マウスの血液レベ
ルを測定することにより証明された（表７）。末梢の循環から出た125Ｉ-Ａβ1- 40 の通過は、特異的な抗-Ａβ抗体を同時に受容した動物において大きく縮小し
た。その知見は、実験動物でＡβに効果的に結合することができる抗体を示すこ
とにより、5A11抗体を用いて（表３）得たインビトロの結果に拡張される。この
抗体で処置した動物が循環中に10倍多い125Ｉ-Ａβ1-40を停留するという観察は
、体内のＡβの平衡分布を、血中の選択的隔絶により劇的に改変できることを示
している。
【００６８】
【表７】
【００６９】遺伝子操作したワクチン 防御レベルの抗-β-アミロイド抗体を誘導するために、ヒトに使用するための
遺伝子操作したβ-アミロイド抗原が現在開発されている。β-アミロイドフラグ
メントは、高度に免疫原性のキャリアー部分を組込んだキメラＡβワクチンに工
作されて、ヒト患者の適切な免疫原性応答を上昇させる。使用に適するキャリア
ー部分は、ジフテリア毒素（DT）およびＢ型肝炎コア抗原（HBcAg）を含む。こ
れらはβ-アミロイドペプチドの強力な送達系を表し、そしてアジュバントとし
てalumを使用した時に優れた、高力価の免疫応答を誘導することが知られている
。
【００７０】 DTはＢ型インフルエンザ(H.influenza)用の複合ワクチンとして使用が認可さ
れており、そしてこの免疫原をＴ-細胞依存的とする。組換え大腸菌（E.coli）
でのDTの発現は高い。１以上の上記β-アミロイドペプチドをDTの触媒ドメイン
のＣ−末端、あるいはDTの結合した膜貫通／レセプター結合ドメインのいずれか
の末端で融合する。生成した融合物は水酸化アルミニウムゲルアジュバントと使
用して有力なワクチンを生成する。
【００７１】 ヘテロロガスなエピトープに対する高力価の抗体が、HBcAg送達系および水酸
化アルミニウムゲルアジュバントを使用して生成された。HBcAgは、Ａβペプチ
ドの融合パートナーとして幾つかの顕著な利点を有する。アミノ酸75と81の間の
免疫優勢な内部部位は、45アミノ酸までのヘテロロガスな配列を収容することが
できる。コアは、高度に免疫原性の大きな27nm粒子に自己集合する。さらにHBcA
gは組換え大腸菌（E.coli）中で高レベルで生産されることができる。
【００７２】 生産された遺伝子操作されたワクチンは、マウスおよび他の関連する動物モデ
ルを使用して、斑を減少または防止することに対する効果を試験する。抗体生産
およびワクチンに関する安全性試験は、カニクイザルで行う。本発明の方法 ペプチド合成 。40merのＡβ1-40、43merのＡβ1-43および３種の小さいＡβペプ
チドＡβ1-16、Ａβ10-25およびＡβ35-43を、標準的な自動化Fmoc化学により合
成した。新しく合成したペプチドはHPLCにより精製し、そしてそれらの組成をマ
ススペクトルおよびアミノ酸分析により確認した。Ａβ43merは、市販のものか
ら得た（バッケム：Bachem、トランス、カリフォルニア州）。β-アミロイドペプチドの免疫原性キャリアーへの連結 。小さいＡβペプチドを
抗原性にするために、KLHキャリアータンパク質に連結した。Cys残基をこれらＡ
βペプチドのＮ−およびＣ−末端に計画的に配置して、それらをマレイミド活性
化キャリアータンパク質へのチオエーテル結合を介してカップリングするための
適当な連結基を提供した。この連結は安定であり、そしてペプチドを定めた方向
に結合する。この連結法により典型的には〜20ペプチド／KLHの付加が得られる
。より長い、完全長のＡβペプチドは、グルタルアルデヒドカップリング法を使
用してキャリアータンパク質に連結した。 β-アミロイド抗原カクテル 。図２〜４に示した３種のＡβペプチドを、それぞ
れKLHに連結した。20μgのこれら各３種の結合物を次いで一緒に混合した。この
混合物を完全フロイントアジュバントで乳化し、そしてマウスにi.p.注射した。
続いて毎月のi.p.追加免疫注射は、不完全フロイントアジュバントで乳化した同
じカクテル混合物を使用した。対照マウスは同様の免疫感作プロトコールを受け
たが、Ａβペプチドとは連結していないKLHを使用した。マウスの免疫感作 。正常なBALB/cマウスは、上記のKLH-連結Ａβワクチンを用い
た標準的手法により免疫感作した。簡単に説明すると、マウスに完全フロイント
アジュバントで乳化した抗原をi.p.注射し、続いて不完全フロイントアジュバン
トで２回目の感作を行った。マウスは採血またはモノクローナル抗体を生産する
ためのハイブリドーマ融合用に脾臓を取り出す３日前に、PBS中の抗原をi.v.に
より追加免疫感作した。
【００７３】 Ａβワクチンで免疫感作したマウスまたは抗-Ａβ腹水−生産マウスのいずれ
も、幾つかの抗体がマウスＡβおよびマウスアミロイド前駆体タンパク質と交差
反応したにもかかわらず、病気の兆候を現さなかった。ELISA 。結合した抗-ペプチド抗体の存在は、ペルオキシダーゼで標識した抗-マ
ウスIgGプローブを使用することにより、続いて発色体基質により明らかにされ
た（Engvall et al.,Immunochemistry 8:871-875(1971)）。結合アッセイ 。Ａβ1-43およびＡβ1-40の両方を125Ｉで放射標識した。ヨウ素
化ペプチドを非標識材料からHPLCにより分離して、本質的に定量的に特異的な活
性を与えた（〜2000Ci/mmol）（Maggio et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. 89:5462(1
992)）。125Ｉ-Ａβ1-43プローブを23℃で１時間、モノクローナル抗-Ａβ抗体
を生産しているハイブリドーマクローンから取ったHy培地とインキューベーショ
ンした。標準的なポリエチレングリコール分離法を使用して、抗体に結合した12 5 Ｉ-Ａβ1-43の量を検出した。霊長類用のβ-アミロイドワクチン 。使用した免疫原は、Ａβタンパク質のアミ
ノ酸１〜41を包含する合成Ａβペプチドであった。このペプチドをHPLCにより精
製し、そして凍結乾燥させ、そして次いで滅菌水に1.5mg/mlの濃度で再懸濁した
。ワクチンは、本明細書ではalumゲルと呼ぶ7.5mlの２％水酸化アルミニウムゲ
ルアジュバント（Alhydrogel、スパーホス バイオセクター(Superfos Biosector
）、デンマーク）を、7.5mlのペプチドと混合することにより調製した。試験で
はすべてのペプチドが25℃で12時間混合した後にalumゲルに吸着したことが示さ
れた。
【００７４】 サルは最初に0.5mlのalum-吸着ペプチドを筋肉内（i.m.)注射することにより
予防接種した。同じワクチン調製物(0.5ml)を用いた２回目の予防接種(追加免疫
感作)は、１カ月後に投与した。続いて同一の毎月の注射（追加免疫感作）を、
実験が終了するまで与える。遺伝子操作したワクチン 。高度に免疫原性のキャリアー部分を使用して、キメラ
Ａβワクチンを構築する。使用した部分は、ジフテリア毒素（DT）およびＢ型肝
炎コア抗原（HBcAg）を含む。HBcAg発現系を使用する（Schodel et al.,Infect. and.Immun. 57:1347-1350)；Schodel et al.,J.of Exper.Med.180:1037-1046(199
4)；Schodel et al.,J.of Virology 66:106-114(1992)；Milich et al.,Annals New York Academy of Sciences :187-201(1993))。HBcAgの触媒ドメインのアミノ
末端は、Ａβ融合タンパク質を培養基中に分泌させるべくシグナル配列を有する
。培養基は、大きなアミコン（Amicon）超遠心デバイスを使用して濃縮し、そし
て濃縮物を大きなSuperdex 75カラムでカラムクロマトグラフィーにかける。溶
解した細胞内から得られた組換え産物は、陰イオン交換体およびサイズ排除FPLC
の組み合わせを使用して細菌タンパク質から分離する。第II章：遷移状態抗原を用いたモノクローナル抗体の誘導 遷移状態ペプチド抗原 異なる型の遷移状態ペプチド抗原を合成して、予め定めたアミド結合位置でＡ
βの遷移状態を優先的に認識（加水分解）する抗体の生成に使用した。
【００７５】 Ａβのカルボシ-末端領域（Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ／Ｓｔａ−Ｖａｌ／Ｓｔａ−Ｉｌｅ／Ｓｔａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ）を包含する一
連のスタチン（Sta）遷移状態類似体を合成した。提案したVal39とVal40、Val40 とIle41、およびIle41とAla42の間の切れ易い（sicissile）ペプチド結合の、「
スタチル」部分（-CHOH-CH2-CO-NH-）への置き換えを設計して、これらの部位の
１つで加水分解的にＡβを開裂する触媒抗体を誘導した（図６）。Cys残基をこ
のようなペプチドのＮ-末端に配置し、マレイミド-活性化キャリアータンパク質
にカップリングするために適当な連結基を提供した。
【００７６】 Ａβの中央領域（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ
−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ／ＰｈＳｔａ−Ｐｈｅ／ＰｈＳｔａ−Ａｌａ
−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−アミド）を包含する一連のフェニルアラニ
ンスタチン（PhSta）遷移状態類似体をこの研究室で合成した。
【００７７】 提案したPhe19とPhe20、およびPhe20とAla21の間の切れ易いペプチド結合の、
スタチル部分（-CHOH-CH2-CO-NH-）への置き換えを設計して、これらの部位で加
水分解的にＡβを開裂する触媒抗体を誘導した（図７）。Cys残基をこのような
ペプチドのＣ-末端に配置し、ペプチドをKLHのような抗原性のマレイミド-活性
化キャリアータンパク質にカップリングするためにスルフヒドリル連結基を提供
した。
【００７８】 自然なＡβペプチドと遷移状態フェニルアラニンスタチンＡβペプチドとの間
の構造的比較（図８）を、画像的ワークステーションを使用して行った。エネル
ギー最小化アルゴリズム（2000の繰り返し)を適用して、最も好ましい立体配置
に各ペプチドを配列した。
【００７９】 Phe19とPhe20との間のペプチド結合(-CO-NH-)を、延長した「スタチル」部分
（-CHOH-CH2-CO-NH-）に置き換え、そしてエネルギー最小化を適用した。この配
置は、自然なＡβ（左）の平面的なペプチド結合（-CO-NH-)と遷移状態ペプチド
（右）の四面体「スタチル」部分（-CHOH-CH2-CO-NH-）との間の差異を示す。
四面体スタチン遷移状態類似体に相補的な抗体結合部位は、Ａβ基質の平面的な
ペプチド結合を遷移状態-様の立体配置に強制する。そのような歪みが、ペプチ
ド配列中のその位置でＡβの開裂を触媒する。
【００８０】 アミド結合の加水分解中に遷移状態を模するために、還元されたペプチド結合
を使用することの可能性も調査した。還元されたペプチド結合の連結は、Ａβ分
子のほとんどいかなる部位にも容易に配置して、還元型のペプチド結合遷移状態
類似体を生成することができる。この類似体も選択した部位でＡβを加水分解的
に開裂する触媒抗体を誘導するために使用することができる。作成した還元型の
ペプチド結合遷移状態Ａβ類似体は、(Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈ
ｅ−ＣＨ2−ＮＨ2 +−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙ
ｓ−アミド)中央領域ペプチドであった；［計算値1,342(M+1)；観察値 1,344]。
【００８１】 自然なＡβペプチドと還元型のペプチド結合遷移状態Ａβ類似体との間の構造
的比較（図９）を、画像的ワークステーションを使用して行った。Phe19とPhe20 との間のペプチド結合(-CO-NH-)を、還元型のペプチド結合（-CH2-NH2 +-）に置
き換え、そしてエネルギー最小化を適用した。示したこの配置は、自然なＡβ（
左）の平面的なペプチド結合（-CO-NH-)と対応する還元型のペプチド結合遷移状
態類似体（右）の四面体部分（-CH2-NH2 +-）との間の差異を示す。エネルギー最
小化アルゴリズム（2000の繰り返し)を適用して、最も好ましい立体配置の各ペ
プチドを配列した。
【００８２】 Ａβのカルボキシ-末端領域のホスホンアミデート遷移状態類似体も合成した
（図１０）。提案したGly38とVal39の間の切れ易いペプチド結合の、ホスホンア
ミデート部分（-PO2 --NH-）への置き換えを設計して、この部位で加水分解的に
Ａβを開裂する触媒抗体を誘導した。N-アセチル-Cys残基をLeu34の位置に配置
して、このペプチドを抗原性のキャリアータンパク質へカップリングするために
適当な連結基を提供した。図１１の構造は、亜鉛ペプチダーゼによるペプチド加
水分解に関する推定上の遷移状態 対 ホスホネートおよびホスホンアミデート模
造物の構造を示す。同様な四面体の遷移状態中間体は、４種類のタンパク質溶解
酵素、セリン−、システイン−、アスパラギン酸−およびメタロ−ペプチダーゼ
の各々を用いた反応により形成されることが知られている。
【００８３】 自然なＡβペプチドと遷移状態のホスホンアミデートＡβペプチドとの間の構
造的比較（図１２）を、画像的ワークステーションを使用して行った。Gly38とV
al39の間のペプチド結合(-CO-NH-)を、ホスホンアミデート結合（-PO2 --NH-）に
置き換え、そしてエネルギーの最小化を適用した。図１２に示した配置は、自然
なＡβ（左）の平面的なペプチド結合（-CO-NH-)と対応する四面体のホスホンア
ミデート結合（-PO2 --NH-）（右）との間の差異を具体的に説明する。
【００８４】 図１２の右側の四面体の遷移状態類似体に相補的な抗体結合部位は、左側のＡ
β基質ペプチドの通常は平面の結合を、遷移状態様の配置に強制する。そのよう
な結合の歪みが、Gly38−Val39連結でＡβペプチドの加水分解的開裂を触媒する
。遷移状態ペプチド抗原を用いた免疫感作 マウスの免疫感作前に、ペプチド抗原を免疫原性キャリアーKLHにカップリン
グした。標準的なプロトコールを使用して、BALB/cマウスは前記の章に記載した
KLHを連結したＡβペプチドで免疫感作した。簡単に説明すると、この手順はフ
ロイントアジュバントで乳化した種々の抗原のi.p.注射、続いて２回目は不完全
アジュバントで乳化して使用した。ハイブリドーマ融合の３日前に、BALB/cマウ
スをi.v.でPBS中の抗原を用いて追加免疫感作した。
【００８５】 ハイブリドーマ融合は、生成したフェニルアラニンスタチン遷移状態抗原の混
合物（図７）、生成したスタチン（Sta)遷移状態Ａβ抗原の混合物（図６）、生
成した還元型ペプチド結合遷移状態Ａβ抗原（Phe19−Phe20間に位置する遷移状
態模造物）、または生成したホスホアミデート遷移状態Ａβ抗原（Gly38−Val39 間に位置する遷移状態模造物）のいずれかを用いて免疫感作したマウスの脾臓を
使用して行った。表８に掲げるモノクローナル抗体は、このようなマウスから生
成された。
【００８６】
【表８】
【００８７】生成した抗体によるＡβ結合の証明 抗-Ａβおよび抗-遷移状態Ａβモノクローナル抗体が、隔絶または開裂される
ように設計された天然のＡβ1-43ペプチドに結合することを示すことは大変重要
であった。このために、Ａβ1-40およびＡβ1-43を125Ｉで標識し、そしてヨウ
素化ペプチドを非標識材料からHPLCにより分離した。プローブを精製した抗-Ａ
β抗体または抗-Ａβ抗体を生産しているハイブリドーマクローンから取った培
地のいずれかとインキューベーションした。抗体に結合した125Ｉ-Ａβ1-43の量
は、ポリエチレングリコール分離法を使用して決定した。実験結果を表３に与え
る。
【００８８】 表３の結果は、精製した5A11モノクローナル抗-Ａβ抗体が高い割合で125Ｉ-
Ａβ1-40に結合する能力を示す。この結合アッセイを使用して、クローンおよび
精製した抗体（表３）のＡβに結合する能力をスクリーニングした。同様の手順
が、種々の非標識Ａβペプチドの相対的結合強さを測定するために、競合的置換
アッセイの基礎としても役立ち得る。（注意：大変効率的な触媒抗体を用いる場
合、インキューベーション時間中にＡβの開裂が起こらないことを確実とするた
めに、この結合アッセイは氷上で行なわなければならない。）このアッセイは、
高い親和性の抗-Ａβ抗体を生産しているクローンを迅速に同定する。
【００８９】 フェニルアラニンスタチン遷移状態Ａβ-KLH抗原を使用して得たハイブリドー
マに由来するモノクローナル抗体をELISAによりスクリーニングして、正常なＡ
β1-43ペプチドおよびフェニルアラニンスタチン遷移状態Ａβペプチドの両方に
対するそれらの結合を評価した。２つの主要なパターンが見いだされた（図１３
）。
【００９０】 １つの群の抗体（図１３の左部分）は、免疫感作した遷移状態ペプチドに結合
し、そして自然なＡβ1-43ペプチドと強力に交差反応した（各々が、ELISAプレ
ートに直接吸着していた）。第２群（右部分）は、フェニルアラニンスタチン遷
移状態Ａβペプチドに高い結合優先性を示し、そして自然なＡβ1-43との反応は
最小であった。
【００９１】 強力な発色反応が、わずか10μlのハイブリドーマ上清を使用してこのELISAに
より得られたが、Hy培地単独またはPBSは低いバックグラウンドを与えた（図１
３）。これらの結果は、競合的なELISAスクリーニングが結合の半定量的測定の
みではあるが、遷移状態に高度に選択的であり、しかも最も反応性のモノクロー
ナル抗体を同定するための手段を提供することを示す。重要なことは、実験はマ
イクロタイタープレートに直接吸着したキャリアーを含まないＡβペプチドを用
いて行ったことであり、キャリアーではなくＡβペプチドに対する抗体の特異性
を示している点である。
【００９２】 これらの知見は、生成した抗-Ａβ遷移状態抗体の幾つかが独特であることを
示している。それらはフェニルアラニンスタチン−および正常−Ａβペプチドの
両方に結合した。しかしそれらの遷移状態の選択的認識、および自然なＡβ1-43 との交差反応は、この結合する相互反応が従来の抗-天然Ａβ抗体とは大変異な
ることを示している。さらにこれらの新規抗体は天然のＡβペプチドを加水分解
的開裂のために遷移状態に似た立体配置に強制することを示す。重要なことは、
このELISAにおいてＡβ1-43と最小の結合しか示さなかった抗体の中には、高度
に感受性のある125Ｉ-Ａβ1-43結合アッセイを使用して自然なペプチドとの交差
反応性を示すものがあるという点である（表３）。
【００９３】 ELISAを行って、抗-スタチン類似体抗体の正常Ａβ1-43ペプチドおよびスタチ
ン遷移状態Ａβペプチドへの結合も調査した（図１４）。この抗体はこれらのキ
ャリアーを含まないＡβペプチド（マイクロタイタープレートに直接吸着した）
上のＣ−末端位置に結合し、それらの抗-ペプチド特異性が確認された。ほとん
どの抗体がスタチンＡβ遷移状態を優先的に認識したが、自然なＡβ1-43と交差
反応した。これはこれらの新規抗体が、天然のＡβペプチドを、そのＣ−末端ア
ミノ酸の加水分解開裂のために遷移状態に似た立体配置に強制することを示す。
そのような開裂はＡβ1-43をＡβ1-40またはＡβ1-39のようなより害が少ない短
いペプチドに転換すると予想される。
【００９４】 クローン11E9はスタチン類似体について最強の選択性(preference)を有し、そ
して最大の触媒活性を有するらしい（図１４）。幾つかのクローンは天然 対 ス
タチン遷移状態Ａβペプチドで、それらの反応性に差異を表さなかった。このク
ローンもＡβ1-40を用いて試験し、この短縮されたＡβの40アミノ酸変異体と反
応しない抗体を同定した（図１４）。治療的に使用する場合、そのような抗体は
小さいく、しかも害が少ないＡβ1-40に対して、血液中のより数が少ないがより
有毒なＡβ1-43種に優先的に結合／開裂するはずである。固相およびTLCのＡβタンパク質溶解アッセイ 固相125Ｉ-標識Ａβアッセイを開発して、特異的タンパク質溶解活性について
抗−遷移状態抗体ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。Ａβのアミノ酸14
〜25を包含するペプチドＣｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−アミド（配
列番号５）を放射標識し、そしてチオール−反応性、ヨードアセチル-Sepharose
ゲルにカップリングして、無関係な連結を作成した。生成物は抗-遷移状態抗体
とインキューベーションし、そして固相マトリックスからの可溶性125Ｉ-ペプチ
ドの進行的放出をアッセイした。125Ｉ-Ａβ-Sepharoseからの放射活性の放出は
、触媒活性を確認するために使用した（図１５）。このアッセイは、このSephar
oseを連結したＡβ基質を迅速に加水分解するために、数種の異なるプロテアー
ゼの能力により確認した。インキューベーション時間に伴い上昇する可溶性125
Ｉ-ペプチドの放出により明らかにされるように、ペプチドは容易にタンパク質
溶解的に開裂されることが可能であった。
【００９５】 図１５に示す結果は、幾つかのクローンの抗体を含有する培体が、この融合ま
たはPBSおよびHy媒質対照からの他のクローンよりも大きな速度で125Ｉ-ペプチ
ドを放出することを示す。大量のこれら抗体を得、精製し、そしてさらに一層早
い開裂速度を達成するためにより高濃度で試験し、そして抗体が通常の酵素的動
力学を使用した触媒様式で作用していることを確認することができる。125Ｉ-ペ
プチドの組成の変化させることにより、この同じ方法を使用して、Ａβの異なる
領域と反応性の抗体をアッセイすることができる。
【００９６】 Ａβの抗体が媒介する開裂についてより明確な証拠を得るために、薄層クロマ
トグラフィーに基づくオートラジオグラフィーアッセイを考案した。選択した抗
-フェニルアラニンスタチンＡβ遷移状態クローンを拡張し、そして腹水生産を
誘導した。異なるモノクローナル抗体は、プロテインＡ-Sepharoseを使用して単
離した。２つの125Ｉ-標識ペプチド、Ａβ1-40およびＡβのアミノ酸9-25を包含
する17merを使用して、ペプチド開裂について試験した。抗体を125Ｉ-ペプチド
に加えてインキューベートし、そして反応混合物をポリアミド薄層シートにスポ
ット添加し、これを次いで異なる溶媒中で展開した。125Ｉ-生成物の移動は、シ
ートを定量的なホスホイメジャー（Phosphoimager)システムを使用して暴露する
ことにより追跡した。生成された異なる標識ペプチドフラグメントの定量は、抗
体のＡβペプチドへの添加が未処理ペプチドと比較してＡβペプチドの有意な分
解を導くことを示した。モノクローナル抗体によるβ-アミロイドの分解(disaggregation) 合成Ａβペプチドの自己−集合は、脳内でアミロイド斑に似た顕微鏡構造を導
くと既に示され（Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4109-12(1997)；
Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:452-5(1996)）、これがチオフラビ
ンＴに暴露すると同じ明るい緑色の蛍光を現す。これらの凝集物は大変安定であ
り、そして通常は溶解するために苛酷な界面活性剤または強酸が必要である。し
かし特定の抗-Ａβモノクローナル抗体の結合がこのペプチドの初期の凝集を効
果的に阻害し、そしてまた形成されたＡβ複合体を分解できることが証明された
（Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4109-12(1997)；Solomon et al.
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:452-5(1996)）。
【００９７】 放射活性のアッセイを使用して、本実験により生成された種々のモノクローナ
ル抗体が、形成されたＡβ凝集物（125Ｉ標識および非標識の可溶性Ａβペプチ
ドを用いて作成した）を溶解する能力について迅速にスクリーニングした。標識
した凝集物のアリコートをPBS、5A11抗-Ａβ抗体または等量の無関係なマウス抗
体（7D3、抗-ヒトトランスフェリンレセプター)とインキューベーションし、そ
して放出された放射活性のレベルを続いて測定した（表９）。Ａβ-特異的5A11
抗体はＡβ凝集物の80％を可溶化したが、等量の対照抗体はわずかな効果を有す
るだけで、平衡が可溶性Ａβの抗体により媒介される結合により置き換わること
を示唆していた。
【００９８】
【表９】
【００９９】ベクター化された抗-Ａβ／抗-レセプター二重特異性抗体の生成 抗-Ａβ抗体は、抗-Ａβ抗体を脳に送達するためのベクターとして役立つ抗−
トランスフェリンレセプター抗体（抗-TfR）に連結した。7D3マウスモノクロー
ナル抗体を構築物の抗-TfR部分として使用した。7D3はヒトレセプターに特異的
であり、そして正常なヒトの脳組織中の皮質毛細管を選択的に免疫染色する（Re
cht et al.,J.Neurosurg. 72:941-945（1990)）。レセプターへの抗体のアタッ
チメントは、過剰なヒトのトランスフェリンにより遮断されない。この抗体によ
り認識されるエピトープは、したがってレセプター−リガンド結合部位からは離
れている。この7D3抗体および抗-Ａβ抗体を用いて構築された二重特異性抗体は
、アルツハイマー病の患者の治療に有用となると予想される。
【０１００】 アルツハイマー病のマウスモデルにおける実験のために、ラットで生成された
抗-マウストランスフェリンレセプターモノクローナル抗体を得た。この抗体も
リガンド結合に関与しないトランスフェリンレセプターエピトープを認識するよ
うに思われる。したがって抗体はマウス系に使用した時に、細胞増殖には効果を
及ぼさない。
【０１０１】 合成の完了後に、抗-Ａβ／抗-トランスフェリンレセプター二重特異性抗体の
一連の機能アッセイ、精製およびサイズ分析を行った。マウストランスフェリン
レセプターに対するラットモノクローナル抗体に加えて、5A11マウス抗-Ａβモ
ノクローナル抗体から成るベクター化された二重特異性抗体を、トランスフェリ
ンレセプターを持つマウスの細胞に付く能力について試験した。二重特異性抗体
の両成分は、この二重抗体(duplex)をトランスフェリンレセプター陽性マウス細
胞と反応させ、そしてラットIgG-特異的またはマウス-IgG特異的蛍光２次抗体試
薬のいずれかと反応させた時、細胞蛍光測定により細胞膜上に検出された（図１
６）。
【０１０２】 ハイブリッド試薬が125Ｉ-Ａβに結合する能力は、元の抗-Ａβ抗体の能力に
よく対応する（表１０）。
【０１０３】
【表１０】
【０１０４】 これらの結合活性の両方が二重特異性抗体上にあることを確実にするために、
トランスフェリンレセプター陽性細胞をハイブリッド試薬で処理し、非結合材料
を洗い出し、そして次いで結合した抗体を持つ細胞を125Ｉ-Ａβ1-40に暴露した
。非結合Ａβを洗い出した後、細胞に結合した放射活性を、二重特異性抗体を用
いた前処理を除いて同一に調製した対照細胞と比較した。結果を表１１に与え、
そして抗体が同時に細胞膜に付き、そして125Ｉ-Ａβ1-40に結合できることを明
らかに示すことにより、この二重特異性抗体の二重特異性を確認する。
【０１０５】
【表１１】
【０１０６】脳への二重特異性抗体の細胞輸送 新規なベクター化された二重特異性構築物の脳への侵入(entry)をモニターす
ることができるように、ラットモノクローナル抗-マウストランスフェリンレセ
プター抗体を、マウスモノクローナル抗体（アメリカン タイプ カルチャー コ
レクション(ATCC TIB 219)から得た。R17 217.1.3とも呼ばれる（Cell.Immunol. 83:14-25(1984))にカップリングした。二重特異性抗体を125Ｉで標識し、そして
正常なマウスにi.v.注射した。異なる時間の後、マウスを屠殺し、そして血液−
脳バリアーを横断し、そして脳に入った125Ｉ-二重特異性抗体の量を、マウス毛
細管消費法（mouse capillary depletion method）（Friden et al.,J.Pharm.Ex per.Ther. 278:1491-1498(1996)；Triguero et al.,J.Neurochem.54:1882-1888(1
990))により測定した。
【０１０７】 脳の実質または脳の毛細管画分に見いだされたベクター化二重特異性抗体の量
は、脳のホモジネートの分別密度遠心後に測定した。これらの値をi.v.注射後の
時間の関数としてプロットした（図１７）。毛細管からの、そして実質への放射
標識した二重特異性抗体の時間に依存した再分布は、大脳内皮の血液−脳バリア
ーをわたった通過と一致した（Joachim et al.,Nature 341:6239:226-30(1989))
。実質中でのさらにより多くの蓄積は、抗体が斑を持つマウスの大脳斑中のＡβ
に付いた時に起こると期待される。生きているマウスにおける二重特異性抗体の脳分布のモニタリング 生きてマウスにおける脳内のベクター化された二重特異性抗体の侵入および蓄
積を追跡する能力は、斑を持つマウスの脳内処置の開発で大いに援助されるだろ
う。そのような開発はタイム−コース実験を可能とし、そしてマウス間の変異性
の問題を大きく減らすだろう。125Ｉ-標識二重特異性抗体を用いた予備実験は、
イムノシンチグラフィーがこの系で利用できるかどうかを決定するために行った
。第１段階として、放射性標識したベクター化二重特異性抗体（125Ｉ-R17/5A11
）または非−ベクター化対照二重特異性抗体を別個のマウスに投与した。連続的
な脳の画像は、125Ｉ-標識二重特異性抗体プローブをi.v.投与してから１、６、
24および48時間後に累積した。この技法はどのくらい多くのシグナルが脳を通っ
て循環している血管−骨放射活性レベルによるものであるかを決定するには難点
があるが、マウストランスフェリンレセプター反応性二重特異性抗体で処置した
マウス 対 対照の二重特異性抗体を受容したマウスの脳で、有意な識別が記録さ
れた。ベクター化された作用物質を使用した時、脳のレベルは１から６時間の間
に上昇し、そして次いで24から48時間の間に大変低いレベルに低下した。対照で
処置したマウスは１から６時間の間に上昇を示さなかった。脳のレベルが24時間
以降で低下した理由はわからないが、二重特異性抗体プローブの脱ハロゲン化に
より遊離の125Ｉが放出されたのかもしれない。ヨウ素の使用が技術的な問題を
与える場合には、ベクター化された二重特異性抗体に結合した111In（Sheldon e
t al.,Nucl.Med.Biol.18:519-526(1991))または99mTc（Texic et al.,Nucl.Med. Biol. 22:451-457(1995))のような放射性標識を利用する別の方法を、さらなる実
験で利用することができる。この造影法は、異なる物理的特性および改変された
生物分布を持つより小さいベクター化された二重特異性抗体（例えばF(ab')2)が
脳により効率的に浸透すかどうかを決定するために有用となるだろう。ベクターが媒介する脳への輸送のためのF(ab')2ヘテロ二量体 全抗体を脳に導入することは、それらが補体を結合し、そして補体が媒介する
神経細胞の溶解を促進するならば、有害となるだろう。より小さいベクター化F(
ab')2二重特異性試薬の開発は、この問題を回避するものと期待される。凝集し
たＡβ自体が任意の抗体の不存在下で補体を結合し、そして生じた炎症がアルツ
ハイマー病の病状の原因となることが示された。類似の効果を有する脳内抗体の
可能性は、抗体のFc領域を排除することにより大きく減少するだろう。さらにFa
b'の半分のカップリングには本来のヒンジ領域を利用するので、外来の置換連結
基を加える必要はない。
【０１０８】 より速く、またはより効率的な脳内への侵入は、より小さいF(ab')2またはFv2 試薬が脳内送達に提供する別の有力な利点を表す。そのような修飾された二重特
異性試薬は、本明細書に記載する方法により調製し、そして完全なサイズのハイ
ブリッド抗体と、それらの脳への到達における相対的効率、血液−脳バリアーの
横断、およびＡβ斑発生に及ぼす影響を比較することができる。しかし異なった
サイズの抗-トランスフェリンレセプター二重特異性試薬のレセプターが媒介す
る細胞輸送によりトキシンを細胞に送達する能力を比較した時、わずかな差異し
か見いだされなかったことは注目に値するほど重要である（Raso et al.,J.Biol .Chem . 272:27623-27628(1997))。この観察は小さい変動が血液−脳バリアーを
形成する脳の毛細管内皮細胞をわたる細胞輸送に少ししか見られないことを示し
ているかもしれない。しかし少なくとも、２種類のベクター化された分子は異な
る生物分布および血漿半減期特性を有すると期待される（Spiegelberg et al.,J
.Exp.Med.121:323(1965))。発明の方法 抗原の合成 。スタチンおよびフェニルアラニンスタチン遷移状態ペプチドは、自
動化Fmoc化学を使用して合成した。Fmoc−スタチン（Sta）、［N-Fmoc-(3S,4S)-
4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチル-ヘプタン酸］およびFmoc-“フェニルアラニン
スタチン"(PhSta)、［N-Fmoc-(3S,4S)-4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペン
タン酸］は市販されているものを購入した。各ペプチドは純度をHPLCにより検査
し、そしてその組成をマススペクトルおよびアミノ酸分析により確認した。
【０１０９】 ホスホンアミデート−およびホスホネートに基づく遷移状態ペプチドを合成す
るための設計計画および方法は簡単である（Bartlett et al.,Am.Chem.Society
22:4618-4624(1983)；Bartlett et al.,Biochemistry 26:8553-8561(1987))。ペ
プチドのＮ−末端部分（N-アセチル-Cys-Met-Val-Gly）は、標準的な自動化Fmoc
化学を使用して合成した。樹脂から開裂した後、N-アセチルテトラペプチドをピ
リジンジスルフィドで処理して、そのスルフヒドリル基を保護した。Cbz-グリシ
ンホスホン酸モノメチルエステルの酸クロライド（Bartlett et al.,Am.Chem.So ciety 22:4618-4624(1983)；Bartlett et al.,Biochemistry 26:8553-8561(1987
))は、自動化Fmoc化学を使用して合成したVal-Val-Ile-Ala-アミドにカップリン
グした。Ａβの最後のアミノ酸であるThrは、その非保護ヒドロキシル基が持つ
潜在的問題により省略した。生成物であるCbz-Gly-PO2 --NH-Val-Val-Ile-Ala-ア
ミドは、GlyとVal残基との間にホスホンアミデート(メチルエステル)け結合を有
する。次に保護されたN-アセチル-Cys-Met-Val-GlyペプチドがHBUT-活性化ペプ
チド結合によりこの遷移状態ペプチドのアミノ末端に付加できるように、Cbzブ
ロッキング基を水素を使用して除去した。メルカプトエタノールおよびウサギ肝
臓エステラーゼを用いた処理を使用してペプチドを脱ブロッキングした。合成ス
キーム中の各々の重要な成分は、HPLCにより純度を検査し、そしてその組成をマ
ススペクトルおよびアミノ酸分析により確認した。
【０１１０】 還元されたペプチド結合連結は、Ａβ分子の示した部位に配置した。自動化Fm
oc化学を使用してこのペプチドの合成を始めた。次いで前合成したFmocアミノア
ルデヒドを手で加え、そしてイミドを還元した後、自動化合成を再開した(Meyer
et al.,J.Med.Chem.38:3462-3468(1995)）。抗原のキャリアーへのカップリング 。免疫応答を誘導するために、天然および遷
移状態Ａβペプチドを、マレイミド-活性化KLHに標準的手法でカップリングした
（Partis et al.,J.Pro.Chem.2:263-277(1983))。Cys残基を計画的にペプチドの
Ｎ−またはＣ−末端に配置して、それらをチオエーテル結合を介してマレイミド
活性化キャリアータンパク質にカップリングさせるための適当な連結基を提供し
た。この安定な連結は、定めた方向にペプチドを付ける。〜20ペプチド／KLHの
付加が、この加水分解された結合物のアミノ酸分析により決定されたように、遷
移状態アミノ酸含量に基づき得られた（Taso et al.,Anal.Biochem.197:137-142
(1991))。マウスの免疫感作 。標準的なプルトコールを使用して、マウスを前記の章に記載
したKLH-連結Ａβペプチドで免疫感作した。簡単に説明すると、この手法は完全
フロイントアジュバントで、続いて２回目からは不完全フロイントアジュバント
乳化した様々な抗原のi.v.注射を使用した。ハイブリドーマ融合の３日前、BALB
/cマウスをPBS中の抗原で追加免疫感作した。
【０１１１】 〜１カ月後、動物に不完全フロイントアジュバントで乳化した抗原を用いてi.
p.追加免疫を与えた。これらの動物からの血清は、ELISAにより抗-ペプチド抗体
について分析した。豊富な抗体生成を示すBALB/cマウスを、抗原を含むi.v.注射
により追加免疫感作し、そして３日後、それらをモノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマクローンの作成に使用した。
【０１１２】 Ａβワクチンで免疫感作したマウスまたは抗-Ａβ腹水生成マウスのいずれも
が、誘導された抗体の中にはマウスＡβおよびマウスアミロイド前駆体タンパク
質と交差反応するものがあるにもかかわらず、病気の兆候を示さなかった。ハイブリドーマの作成I 。ハイブリドーマ融合は、フェニルアラニンスタチン遷
移状態Ａβ-KLH抗原で免疫感作したマウスの脾臓を使用して行った。マウスから
最高力価を持つ脾臓細胞をマウスミエローマNS-1細胞と融合して、標準的な手法
に従いハイブリドーマを樹立した（Koehler et al.,Nature 256:495(1975)；R.H
.Kennett、融合プロトコール。モノクローナル抗体（Fusion Protocol.Monoclon
al Antibodies）、R.H.Kennett、T.J.McKearnおよびK.B.Bechtol編集。プレナム
出版、ニューヨーク。365-367頁。(1980)）。 125Ｉ-Ａβ結合アッセイ 。Ａβ1-40およびＡβ1-43を125Ｉで放射性標識し、そ
して次いでヨウ素化ペプチドを非標識材料からHPLCにより分離して、定量的な特
異的活性を与えた（〜2000Ci/ミリモル）（Maggio et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. 89:5462-5466(1992)）。このプローブを23℃で１時間、精製した抗-Ａβ抗体ま
たは抗-Ａβ抗体を生産しているハイブリドーマクローンから取った培地とイン
キューベーションした。ポリエチレングリコール分離法を使用して、抗体に結合
した125Ｉ-Ａβ1-43の量を検出した。連続希釈を使用することにより、このアッ
セイは異なるハイブリドーマ上清または精製抗体に関する相対的な結合親和性を
提供することができる。固相Ａβタンパク質溶解アッセイ 。固相125Ｉ-標識Ａβアッセイは、抗-遷移状
態抗体ハイブリドーマ上清を特異的なタンパク質溶解活性についてスクリーニン
グするために開発した。Ａβのアミノ酸14〜25を包含するＣｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−アミド ペプチド（配列番号５）を125Ｉで放射性標識し
、そしてヨウ素化したペプチドを次いで非標識材料からHPLCにより分離した。高
度に放射性のＡβペプチドをチオール−反応性のヨードアセチルSepharoseゲル
にカップリングして、無関係な連結を形成した。抗体を標識したＡβに加え、こ
れを次いでpH７、25℃で固相マトリックスから可溶性125Ｉ-ペプチドの進行的放
出についてアッセイした。このアッセイは、このSepharoseを連結したＡβ基質
を迅速に加水分解するために、数種の異なるプロテアーゼの能力により確認した
。可溶性125Ｉ-ペプチドの放出はインキューベーション時間に伴い上昇した。
【０１１３】 Ａβは幾つかの自然に存在するプロテアーゼにより開裂されるが、予備試験で
は高レベルのバックグラウンド加水分解からの妨害が触媒抗体を生産するクロー
ンのハイブリドーマ上清をアッセイした時には問題にならないことが示された。
外因性のプロテアーゼに対してさらに注意しなければならないのは、すべてのハ
イブリドーマ細胞融合および無血清培地中での細胞培養を行うことである。TLCによるＡβタンパク質溶解アッセイ 。薄層クロマトグラフィーに基づくオー
トラジオグラフィーアッセイを使用して、Ａβの抗体が媒介する開裂に関するよ
り明白な証拠を得た。選択した抗-フェニルアラニンスタチンＡβ遷移状態クロ
ーンを拡張し、そして腹水生産を誘導した。異なるモノクローナル抗体は、プロ
テインＡ-Sepharoseを使用して単離した。開裂アッセイは125Ｉ-Ａβ1-40および
Ａβのアミノ酸9-25を包含する125Ｉ-標識した17-merを使用した。２つの125Ｉ-
標識ペプチドの精製したモノクローナル抗体 5A11および6E2への結合は、PEG沈
殿アッセイまたは同時(co)-電気泳動法によるいずれかを使用することにより調
査した。ペプチド開裂は抗体を125Ｉ-ペプチドに加え、インキューベートし、そ
して反応混合物をポリアミド薄層シートにスポット添加することにより試験した
。クロマトグラフを異なる溶媒中(例えば0.5N HCl、0.5N NaOH、またはpH７のリ
ン酸バッファー）で展開し、125Ｉ-生成物の移動はシートを定量的なホスホイメ
ジャー（Phosphoimager)システムを使用して暴露することにより追跡した。選択した抗-Ａβ抗体のスクリーニングおよび単離 。ELISAを使用して最初に抗-
Ａβおよび抗-遷移状態Ａβペプチドモノクローナル抗体をスクリーニングした
。遷移状態ペプチドおよび対応する自然なＡβペプチドの両方が別々のマイクロ
タイタープレートに吸着した。ハイブリドーマ上清は、天然および遷移状態Ａβ
ペプチドの両方への相対的結合が定量できるように、２つのアッセイを使用して
スクリーニングした。拡張およびさらなる実験のために、遷移状態を優先的に認
識したか、または高い親和性でＡβに結合したモノクローナル抗体を生産してい
るクローンを選択した。モノクローナル抗体の増殖および精製 。抗-Ａβ抗体を生産している選択したク
ローンおよび抗-レセプター抗体を生産しているクローンを、別個のプリスタン
−適用マウスに注射した。腹水を集め、そして特異的モノクローナル抗体を単離
した。腹水からの抗体の精製は、プロテインＡカラムを使用して行うか、あるい
は抗体は(NH4)2SO4沈殿、そしてS-300カラムを通して150kDaの免疫グロブリン画
分を得ることにより腹水から単離した。一価のFabフラグメントを調製し、そし
て確立された方法により単離した。それらの純度は還元および非還元条件下でSD
S-PAGEにより評価した。50〜100mgの精製されたモノクローナル抗体が、各々の
腹水を有するマウスから日常的に得られた。Ａβ基質に対する触媒活性のさらなる特性決定 。単離された抗-遷移状態抗体の
加水分解特性を完全に明確にするために、幾つかの大変重要な制御を行うことが
できる。第１に、適当な遷移状態ペプチドを用いて触媒抗体活性を完全に遮断す
る能力を確認した。この非開裂性「インヒビター」は、抗体結合部位により一層
強く結合し、これにより基質が結合または開裂することを妨げるはずである。基
質特異性は、異なるアミノ酸配列を有する偽ペプチドの開裂がないことを示すこ
とによりさらに確立することができる。加水分解の生成物もHPLC、アミノ酸およ
びマススペクトル分析により完全に特性決定できる。遷移状態Ａβには向けられ
ていない対照抗体を試験し、そして触媒作用を生じないことを確認することがで
きる。最後に触媒活性は、抗-遷移状態抗体の精製されたFabフラグメントに存在
することを示すことができる。精製した抗-Ａβ抗体は形成されたＡβ凝集物を溶解する 。（Walker et al.,Soc .Neurosci.Abstr .21:257(1995),Zlokovic,B.V.,Life Science 59:1483-1497(199
6)）。Ａβ沈殿を形成し、そしてインビトロで測定した（Yankner et al.,Scien ce 250:279-282(1990)、Kowall et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.88:7247-7251(1991
))。放射性アッセイを使用して生成された様々なモノクローナル抗体について、
形成されたＡβ凝集物を溶解する能力を迅速にスクリーニングした。125Ｉ-Ａβ
を非標識の可溶性ペプチドに加えた後、凝集物はpH５の溶液に入れるか、または
PBS中で一晩撹拌することにより形成された。標識した凝集物のアリコートをPBS
、5A11抗-Ａβ抗体、または等量の無関係なマウス抗体（7D3、抗-ヒトトランス
フェリンレセプター)のいずれかと１時間、インキューベーションした。遠心後
、沈殿中の放射活性のレベルを測定した。ベクター化された抗-Ａβ／抗-レセプター二重特異性抗体の作成 。抗-Ａβ抗体
を化学的に抗−ヒトトランスフェリンレセプターおよび抗-マウストランスフェ
リンレセプター抗体に、異なる方法によりカップリングさせた（Raso et al.,J. Biol.Chem .272:27623-27628(1997)；Raso et al.,トキシンに共有的または非共
有的に結合した細胞標的キャリアーとしてのモノクローナル抗体。薬剤のレセプ
ターが媒介するターゲッティング（Receptor mediated targeting of drugs)、
第82巻で。G.Gregoriadis,G.Post,J.Senior and A.Trouet,編集。NATOアドバン
スト スタディズ 研究所（Advanced Studies Inst.)、ニューヨーク、119-138(1
984)）。迅速なチオエーテル連結法を使用して、Traut's試薬およびヘテロ二官
能性SMBP試薬を使用した厳密に二重特異性ハイブリッドを形成した。１成分をゆ
るやかにチオール基（SH）に置換した。これらは以下の反応に従い、マレイミド
-置換された（M）第２成分と混合すると容易に反応してチオエーテル連結を形成
する： AbA-SH ＋ AbB-M → AbA-S-AbB 反応混合物のS-300カラムでのゲル濾過により、300kDaで、そしてＡβを結合
する２つの部位に加えて脳毛細管内皮細胞上のトランスフェリンレセプターに付
くための２つの部位を有する精製された二量体を得た。非-標的対照ハイブリッ
ドは、非特異的MOPC抗体を抗-Ａβ抗体に連結することにより形成した。このハ
イブリッド抗体はＡβに結合するが、トランスフェリンレセプターとは反応性で
はなく、血液−脳バリアーを横断しないはずである。
【０１１４】 ２つの異なる抗体型のF(ab')2フラグメントを同様にチオエーテルで連結して
、補体が結合すれば神経毒効果を引き起こすが、補体に結合できないFcを含まな
い試薬を形成することができる。このようなより小さい二重特異性ハイブリッド
（100kDa)は、F(ab')2フラグメントの重鎖を連結する本来のジスルフィドを還元
することにより形成することができる（Raso et al.,J.Immunol. 125:2610-2616
(1980))。生成したチオールを安定化し、そしてエルマン試薬（E)を使用して、
１成分上のこれらの基を活性化する（Brennan et al.,Science 229:81-83(1985)
)。還元されたFab'を、別の特異性を有する活性化Fab'と混合すると、反応： Fab'A-SH + Fab'B-SS-E → Fab'A-SS-Fab'B ＋ E-SH に従い、排他的に二重特異性 F(ab')2ハイブリッドを形成することができる。
S-200カラムでの精製により、Ａβに結合するための１つの部位および脳の毛細
管内皮細胞上の標的エピトープと相互反応するための１つの部位を有するハイブ
リッドを単離する。
【０１１５】 同様の取り組みを使用して、血液−脳バリアーを横断するためにさらに小さい
ジスルフィド連結単鎖Fvヘテロ二重特異性二量体、FvA-SS-FvB(50kDa)を作成す
ることができる。可溶性Fvsはカルボキシル−末端システインを保有するように
構築して、以下の反応に示すジスルフィド交換をし易くし、そして50kDaのヘテ
ロ二量体を排他的に作成することができる： FvA-SH + FvB-SS-E → FvA-SS-FvB ＋ E-SH 全抗体とFab'またはFvに基づく二重特異性試薬のいずれかとの間の平行比較で
は、後者がトランスフェリンレセプターが媒介する経路を介した細胞の取り込み
について、分子基準でより穏やかに効果的であることが示された(Raso et al.,J .Biol.Chem .272:27623-27628(1997))。このようなより小さい構築物は細胞表面
エピトープに対して一価であるので、このような知見は２つの表面レセプターの
架橋結合が細胞の免疫複合体の取り込みには必要であるという懸念をめぐいさる
。二重特異性抗体の二重結合活性の機能的アッセイ 。125Ｉ-Ａβに結合するハイブ
リッド試薬の能力を、元の抗-Ａβ抗体と標準的なPEG結合アッセイにより比較し
た（結合アッセイについては表１０を参照にされたい）。
【０１１６】 適当な二重特異性抗体が、トランスフェリンレセプターを持つヒトまたはマウ
ス細胞に付く能力を、細胞蛍光測定により確認した。二重特異性抗体を、トラン
スフェリンレセプター陽性のヒトまたはマウス細胞と反応させ、そしてラットIg
G-特異的またはマウスIgG-特異的蛍光２次抗体試薬を使用して釣り上げた。 125Ｉ-Ａβを用いたＡβ結合の測定およびポリエチレングリコール分離 。二重特
異性を確実とするために、ハイブリッド試薬の125Ｉ-Ａβのレセプターを持つ細
胞への付着を媒介する能力を試験した。トランスフェリンレセプター陽性細胞を
、ハイブリッド試験を用いて処理し、非結合材料を洗浄し、そして次いでこれら
の細胞を125Ｉ-Ａβ1-40に暴露した。細胞を洗浄し、そして細胞に結合した放射
活性の量を、二重特異性抗体での前処理を除き、同一に調製した対照細胞と比較
した。毛細管消費 。二重特異性抗体を125Ｉで標識し、そして正常マウスにi.v.注射し
た。異なる時間の後、マウスを屠殺し、そして血液−脳バリアーを横断し、そし
て脳に入った125Ｉ-二重特異性抗体の量を、マウス毛細管消費法（Friden et al
.,J.Pharm.Exper.Ther.278:1491-1498(1996)；Triguero et al.,J.Neurochem.54
:1882-1888(1990))により測定した。脳の実質または脳の毛細管画分に見いださ
れたベクター化二重特異性抗体の量は、脳のホモジネートの分別密度遠心後に測
定した。値をi.v.注射後の時間の関数としてプロットした。毛細管から実質への
進行的通過は、血液−脳バリアーをわたった能動的な細胞輸送を示す。イムノシンチグラフィー 。生きてマウスの脳内への放射性標識された二重特異性
抗体の侵入の視覚化が関与する脳内送達法をモニタリングするための非侵襲的方
法を使用することができる。放射性標識されたベクター化された二重特異性抗体
（125Ｉ-R17/5A11）または非−ベクター化対照二重特異性抗体を別個のマウスに
投与した。連続的な脳の画像は、125Ｉ-標識二重特異性抗体プローブをi.v.投与
してから１、６、24および48時間後に累積した。動物は、ケタミン／キシラジン
麻酔を使用した暴露中に化学的に固定した。この造影法は、循環している抗-Ａ
β抗体がi.v.投与した125Ｉ-Ａβが脳に入ることを防止するかどうかを決定する
ために大変有用となり得る。デジタルシンチグラフィーデータは標準および分析
ソフトウェアで提供された積分関数を使用して定量した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 43残基のβ-アミロイドペプチド(Ａβ)のアミノ酸配列表である（配列番号１
）。
【図２】 β-アミロイドのＮ-末端配列から作成した抗原性ペプチド(Ａβ1-16)のアミノ
酸配列表である（配列番号２）。
【図３】 β-アミロイドの中央領域から作成した抗原性ペプチド(Ａβ10−25)のアミノ
酸配列表である（配列番号３）。
【図４】 β-アミロイドのＣ−末端配列から作成した抗原性ペプチドのアミノ酸配列表
である（配列番号４）(Ａβ35-43)。
【図５】 Ａβ35-43およびＡβ1-43対Ａβ1-40に結合するモノクローナル抗体を比較す
るELISAから得たデータの図表的表示である。
【図６】 ペプチドの異なるスタチン遷移状態類似体を作成するために、スタチル部分と
独立して置き換えたβ-アミロイドＣ-末端配列（配列番号４）から作成したペプ
チド中のアミド結合を示す。
【図７】 ペプチドの異なるフェニルアラニンスタチン遷移状態類似体を作成するために
、スタチル部分と独立して置き換えたβ-アミロイド中央配列（配列番号３）か
ら作成したペプチド中のアミド結合を示す。
【図８】 自然なβ-アミロイドペプチドと遷移状態フェニルアラニンスタチンβ-アミロ
イドペプチド類似体との間の構造的比較である。
【図９】 自然なβ-アミロイドペプチドと還元されたペプチド結合遷移状態β-アミロイ
ドペプチド類似体との間の構造的比較である。
【図１０】 β-アミロイドの自然なＣ−末端領域、およびβ-アミロイドのＣ−末端領域（
Ａβ35-43）のホスホンアミデート遷移状態類似体の式的表示である。
【図１１】 ホスホネートおよびホスホンアミデート模造物と比較した、亜鉛ペプチダーゼ
によるペプチド加水分解に関する推定上の遷移状態を示す。
【図１２】 自然なβ−アミロイドペプチドおよび、ホスホンアミデート結合に置き換えら
れたGly38とVal39との間のペプチド結合を有する遷移状態ホスホンアミデートβ
−アミロイドペプチドの構造的比較である。
【図１３】 生成されたモノクローナル抗体の、遷移状態β−アミロイドペプチド類似体へ
の、正常Ａβ1-43への、そしてフェニルアラニンスタチン遷移状態β−アミロイ
ドペプチドへの結合を評価するELISAからのデータの図式的表示である。
【図１４】 抗体の、スタチン遷移状態β−アミロイドペプチド 対 自然なＡβ1-43および
自然なＡβ1-40への結合を比較するELISAからのデータの図式的表示である。
【図１５】 β-アミロイドの遷移状態類似体に対して生成されたモノクローナル抗体によ
る125Ｉ-Ａβ-sepharoseの開裂を示すデータのグラフである。
【図１６】 二重特異性抗体のレセプター−陽性細胞への付着を定量するデータの図式的表
示である。
【図１７】 ベクター化された二重特異性抗体の脳への細胞輸送を追跡するために設計され
た実験から得たデータの図式的表示である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 33/577 Ｂ

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 予め定められたアミド結合においてβ-アミロイドの加水分
    解を触媒する抗体。
  2. 【請求項２】 β-アミロイドの残基39と40の間のアミド結合の加水分解を
    触媒する請求項１に記載の抗体。
  3. 【請求項３】 β-アミロイドの残基40と41の間のアミド結合の加水分解を
    触媒する請求項１に記載の抗体。
  4. 【請求項４】 β-アミロイドの残基41と42の間のアミド結合の加水分解を
    触媒する請求項１に記載の抗体。
  5. 【請求項５】 予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロ
    イドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体に優先的に結合し、そしてまたELIS
    Aを使用して検出するために十分な親和性で自然なβ-アミロイドにも結合する、
    請求項１に記載の抗体。
  6. 【請求項６】 予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロ
    イドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体に優先的に結合し、そしてELISAを
    使用して検出するために十分な親和性で自然なβ-アミロイドに結合しない、請
    求項１に記載の抗体。
  7. 【請求項７】 血液脳関門をわたる能力および予め定められたアミド結合に
    おけるβ-アミロイドの加水分解を触媒する能力を特徴とする、べクター化され
    た抗体。
  8. 【請求項８】 二重特異性抗体である、請求項７に記載のべクター化された
    抗体。
  9. 【請求項９】 トランスフェリンレセプターに対する第１の特異性および加
    水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態に対する第２の特異性を有する、請求
    項８に記載のベクター化された抗体。
  10. 【請求項１０】 残基39と40の間のβ-アミロイドアミドの加水分解を触媒
    する請求項９に記載のベクター化された抗体。
  11. 【請求項１１】 動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶する方法であっ
    て； ａ）β-アミロイドに特異的な抗体を提供し；そして ｂ）循環中のβ-アミロイドの停留を増加させるために十分な量で抗体を動物に
    静脈内投与する、 工程を含んで成る、上記方法。
  12. 【請求項１２】 動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶する方法であっ
    て； ａ）内因性β-アミロイド上に存在するエピトープを含んで成る抗原を提供し；
    そして ｂ）内因性β-アミロイドに結合する抗体の生成に適切な条件下で、工程ａ）の
    抗原で動物を免疫感作する、 工程を含んで成る、上記方法。
  13. 【請求項１３】 動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させる方法であ
    って； ａ）動物に対して内因性のβ-アミロイドに特異的な抗体を提供し；そして ｂ）動物の循環中のβ-アミロイドの停留を増加させるために十分な量で抗体を
    動物に静脈内投与する、 工程を含んで成る、上記方法。
  14. 【請求項１４】 β-アミロイドに特異的な抗体が、予め定められたアミド
    結合でβ-アミロイドの加水分解を触媒する触媒抗体である、請求項１３に記載
    の方法。
  15. 【請求項１５】 抗体がモノクローナルである請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 抗体がポリクローナルである請求項１３に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 抗体がβ-アミロイド1-43のＣ−末端上のエピトープを特
    異的に認識する、請求項１３に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させる方法であ
    って； ａ）動物に対して内因性のβ-アミロイド上に存在するエピトープを含んで成る
    抗原を提供し；そして ｂ）内因性β-アミロイドに結合する抗体を生成するために適切な条件下で、工
    程ａ）の抗原で動物を免疫感作する、 工程を含んで成る、上記方法。
  19. 【請求項１９】 抗原が、予め定められたアミド結合における加水分解中に
    β-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体である、請求項１８に記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】 抗原が、Ａβ10-25を含んで成る、請求項１８に記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】 生成した抗体が、自然なβ-アミロイドよりも遷移状態類
    似体に対して高い親和性を有する、請求項１９に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 生成した抗体が内因性のβ-アミロイドの加水分解を触媒
    する、請求項１９に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 動物の脳内のβ-アミロイド斑の形成を防止する方法であ
    って； ａ）動物に対して内因性のβ-アミロイド上に存在するエピトープを含んで成る
    抗原を提供し；そして ｂ）内因性β-アミロイドに結合する抗体を生成するために適切な条件下で、工
    程ａ）の抗原で動物を免疫感作する、 工程を含んで成る、上記方法。
  24. 【請求項２４】 抗原が、予め定められたアミド結合における加水分解中に
    β-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体である、請求項２３に記
    載の方法。
  25. 【請求項２５】 動物内の循環しているβ-アミロイドレベルを低下させる
    方法であって； ａ）動物に対して内因性のβ-アミロイドポリペプチドの予め定められた加水分
    解遷移状態の模造物であるエピトープを含んで成る抗原を提供し；そして ｂ）β-アミロイド加水分解遷移状態に対する抗体を生成するために適切な条件
    下で、工程ａ）の抗原で動物を免疫感作する、 工程を含んで成る、上記方法。
  26. 【請求項２６】 動物内の循環しているβ-アミロイドレベルを低下させる
    方法であって； ａ）動物に対して内因性のβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を提供し；
    そして ｂ）抗体を動物に静脈内投与する、 工程を含んで成る、上記方法。
  27. 【請求項２７】 動物の脳内のアミロイド斑の形成を防止する方法であって
    ； ａ）予め定められたアミド結合において、動物により生成されるβ-アミロイド
    の加水分解を触媒する抗体を提供し；そして ｂ）動物の血中のβ-アミロイドレベルにおいて有意な低下を引き起こすために
    十分な量で抗体を動物に投与する、 工程を含んで成る、上記方法。
  28. 【請求項２８】 動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させる方法であ
    って； ａ）予め定められたアミド結合において動物のβ-アミロイドの加水分解を触媒
    する、血液脳関門をわたって細胞輸送することができるベクター化された二重特
    異性抗体を提供し；そして ｂ）抗体を動物に静脈内投与する、 工程を含んで成る、上記方法。
  29. 【請求項２９】 ベクター化された二重特異性抗体がトランスフェリンレセ
    プターに特異的に結合する、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ベクター化された二重特異性抗体が、β-アミロイドの残
    基39と40との間のアミド結合の加水分解を触媒する、請求項２８に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 動物の脳内に存在するアミロイド斑を分解する方法であっ
    て： ａ）予め定められたアミド結合において動物により生成されたβ-アミロイドの
    加水分解を触媒する、血液脳関門をわたって細胞輸送することができるベクター
    化された二重特異性抗体を提供し；そして ｂ）動物の脳内のβ-アミロイドレベルに有意な減少を引き起こすために十分な
    量で抗体を動物に静脈内投与する、 工程を含んで成る、上記方法。
  32. 【請求項３２】 動物の脳内に存在するアミロイド斑を分解する方法であっ
    て： ａ）予め定められたアミド結合において動物により生成されたβ-アミロイドの
    加水分解を触媒する抗体を提供し；そして ｂ）抗体を動物に投与する、 工程を含んで成る、上記方法。
  33. 【請求項３３】 タンパク質またはポリペプチドの加水分解を触媒する抗体
    の生成法であって、 ａ）抗原を提供し、抗原はポリペプチドの予め定められた加水分解遷移状態の立
    体配置を模するスタチン類似体を有するエピトープを含んで成り； ｂ）加水分解遷移状態に対する抗体を生成するために適当な条件下で、抗原で動
    物を免疫感作する、 工程を含んで成る、上記方法。
  34. 【請求項３４】 タンパク質がβ-アミロイドである、請求項３３に記載の
    方法。
  35. 【請求項３５】 タンパク質またはポリペプチドの加水分解を触媒する抗体
    の生成法であって、 ａ）抗原を提供し、抗原はポリペプチドの予め定められた加水分解遷移状態の立
    体配置を模する還元されたペプチド結合類似体を有するエピトープを含んで成り
    ； ｂ）加水分解遷移状態に対する抗体を生成するために適当な条件下で、抗原で動
    物を免疫感作する、 工程を含んで成る、上記方法。
  36. 【請求項３６】 タンパク質がβ-アミロイドである、請求項３５に記載の
    方法。
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