JPH09500010A - 一級アミドを加水分解する触媒抗体およびそのような抗体を誘発する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 式（Ｉ）において，Ｙはポリペプチドであり，Ｒ₁ はＹのＮ末端に結合し，水素，または分岐状もしくは直鎖状，置換もしくは非置換のＣ_1-21アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり，Ｒ₂ は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり，Ｘは（ａ），（ｂ），（ｃ）である化合物が記載されている．このような化合物は，一級アミド結合の形成または加水分解速度を触媒的に増大させる抗体を誘発するハプテンまたは免疫原として有用である．これらの化合物および抗体の使用方法も記載されている．

Description

【発明の詳細な説明】 一級アミドを加水分解する触媒抗体および そのような抗体を誘発する方法 関連出願の引照 特許協力協定に基づいて出願された本国際特許は，1988年５月４日の出願に係 わる米国特許出願一連番号07/190,271号の一部継続出願として1993年４月23日に 出願された米国特許出願一連番号08/052,490号に基づくパリ条約による優先権を 主張し，その一部継続出願である．米国特許出願一連番号08/052,490号はまた， 1991年８月５日付出願の米国特許出願一連番号07/740,501号の一部継続出願とし て1991年10月10日に出願された米国特許出願一連番号07/773,042号の一部継続出 願でもある．米国特許出願一連番号08/052,490号はまた，1988年５月４日付出願 の米国特許出願一連番号07/190,271号の一部継続出願として1991年９月３日に出 願された米国特許出願一連番号07/761,868号の一部継続出願でもある．上述のこ れらの米国特許はすべて，参考として本明細書に導入される． 発明の分野 本発明は，一級アミド結合の類縁体および，たとえば一級アミド結合の加水分 解用触媒抗体を誘導するための上述のような類縁体の使用方法に関する．本発明 はまた一級アミド結合の加水分解または形成を触媒できる触媒抗体に関する． 本発明はさらに，ペプチドおよびタンパク質の一級アミド結合の加水分解を引 き起こす上記触媒抗体の治療剤としての新規な使用方法に関する． 本発明はまた，化学物質の合成における一級アミド結合の加水分解または形成 の触媒としての上記触媒抗体の新規な使用方法に関する． さらにまた，本出願は，抗体ならびに他の生物学的分子を含有するサンプルに おける触媒活性を触媒抗体によって選択またはスクリーニングするための新規な 方法に関する．この場合の選択またはスクリーニング方法は迅速かつ効率的であ り，したがって多数の潜在的触媒抗体のルーチンなスクリーニングを可能にする ものである． 発明の背景 本開示の全文を通して多数の文献が括弧内に引用され，これらの文献の完全な 記述は請求の範囲の欄の前に一覧表として掲げる．他の引用文献はこの開示の本 文中に括弧を付して完全に記述してある．これらの文献は本発明の分野に関する ものであり，これらの文献はそれぞれ参考として本明細書に導入される． 最も頻繁に言及されてきた触媒抗体研究の最終目標の一つは，アミド結合の効 率的かつ特異的な加水分解が可能な抗体の産生である（１〜14）．この目標は， 一部には速度論的に比較的不活性な反応を触媒する抗体の産生に対する科学的挑 戦であり，また一部はタンパク分解性抗体に考えられる極めて広い実用的適用範 囲よるものである． 現在まで，活性化されていないアミドを，補因子による補助によらないで加水 分解する抗体を明確に誘発するハプテンは設計されていない． アミド加水分解抗体の誘発における困難性は，主として，抗体の触媒作用のス クリーニングに伴う難かしさに由来するものである．アミド加水分解の非接触時 の速度［Ｋ_uncat，中性ｐＨにおける半減期は７年のオーダーである（15）］は 典型的なエステル（16），カルボネート（17）または活性化アミド（８，18）の 場合に比較してはるかに遅い．したがって，アミドの加水分解を触媒する抗体の 検出は，はるかに困難である．非接触時の速度（Ｋ_uncat ）が異なる２つの別個 の反応が同一の加速率（Ｋ_cat ／Ｋ_uncat ）を有する２種類の抗体で触媒される 場合，絶対的速度（Ｋ_cat ）で遅い方の抗体を検出することはさらに困難である ．これには２つの主たる理由がある．一つの理由は，反応が遅いほど単位時間あ たりの変換もわずかで，検出系は極めて低レベルの形成された生成物を検出でき るものでなければならないことである．第二の理由は，Ｋ_uncat 値が遅い反応は 通常，速い反応の場合（分または時間）に比べて長期間（日または週）の抗体− 基質インキュベーションを必要とすることである．インキュベーション時間が長 くなると，副生物の出現の可能性や，とくに非中性ｐＨでは抗体が変性すること も考えられ，また痕跡の混入酵素が問題の反応を触媒する可能性もあって，誤っ た結果を導く可能性が生じる． 上述のように，現在まで活性化されていないアミド結合の非補助接触加水分解 を可能にする触媒抗体は産生されていない．論理的に設計された触媒抗体による アミド結合の変換に関するこれまでの論文は，活性化アミドの加水分解（８）， 金属補因子の補助によるアミドの加水分解（20）およびアミド結合の転位（21） に限られている．また，天然に存在するペプチドの自己抗体による加水分解の報 告がある（22）．この最後の例において報告された抗体は設計されたというより 発見されたものであることが指摘できる．本発明者らはここに，不活性化アミド 結合の非補助加水分解が可能な触媒抗体の設計における最初の成功例を記述する ものである． 天然において最も一般的に遭遇するアミド結合はペプチドおよびタンパク質中 に見出される．ペプチドおよびタンパク質中には３つの基本的な種類のアミド結 合が見出される．すなわち，個々のアミノ酸を連結するペプチド結合としての， アスパラギンおよびグルタミンのアミノ酸側鎖中の，および一部のペプチド（す なわちＣ末端カルボキサミド）のＣ末端におけるアミドである．ペプチド結合お よび一級アミド結合（アスパラギン，グルタミンおよびＣ末端アミド）の両種類 のアミド結合の加水分解は，活性化のギブス自由エネルギーが同一かまたは極め て類似している（23〜25）．したがって，それらが同一の加速で触媒されるため には，同量の遷移状態安定化が要求される． 疾病状態に重要なアミド化ペプチドホルモンとしては，カルシトニン（29）， カルシトニン遺伝子関連ペプチド（30，31），ビッグガストリン（32，33），お よびボンベシン様ペプチド［ＢＬＰ，またボンベシン関連ペプチド（ＢＲＰ）ま たはガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）としても知られる］（34，35）がある． カルシトニンレベルの上昇が髄様甲状腺癌，Ｃ細胞過形成，慢性腎不全，膵炎， 電解質および骨疾患，ならびに甲状腺機能亢進症を含めた数種の疾患状態に関連 づけられている（29）．ガストリンの上昇がガストリン産生腫瘍に，ＢＬＰが小 細胞肺癌（ＳＣＬＣ）に関連づけられている（33）．疾患状態におけるこれらの ホルモンの作用を，モノクローナル抗体（抗-ＢＬＰ）（36）中性エンドペプチ ダーゼ24.11（ＢＬＰ加水分解）（37），および合成アンタゴニスト（ＢＬＰ） （38〜41）を用いて中和する実験的処置が進行中である． アミド側鎖を有するアミノ酸（たとえば，アスパラギンおよびグルタミン）を 含有するペプチドおよびタンパク質にも治療との関連が考えられる．遊離アスパ ラギンの側鎖カルボキサミドを加水分解する細菌性アルギナーゼの投与が有効な 抗−白血病剤のあることが明らかにされている（42）． 本出願がその一部継続出願である米国特許出願一連番号第190,271号には，ペ プチド結合の類縁体およびこのようなペプチド結合を加水分解する触媒抗体の誘 発方法が記載されている．そこに記載された類縁体および抗体は二級アミド結合 であるペプチド結合の修飾に向けられたものであるが，本出願は一級アミド結合 の修飾に関するものである． 国際特許出願ＷＯ92/01047（ＰＣＴ／ＧＢ91/01134）の一部継続出願である米 国特許出願一連番号第08/007,684号には，バクテリオファージ上に表示される触 媒抗体の単離および産生ならびにヒト触媒抗体の単離および産生が記載されてい る．これらの両出願の開示は参考として本明細書に導入する． 以上記載した観察に基づき，ペプチドおよびタンパク質における一級アミド結 合を切断できる触媒抗体を誘発するために一級アミドの遷移状態類縁体の開発が 望まれる． 一級アミド結合の加水分解または形成を触媒する触媒抗体を，生存生物体に投 与することにより治療剤として使用することが望まれる．標的ペプチドおよびタ ンパク質の一級アミド結合の修飾は，それらの生理学的機能を期待のように変更 させ，その結果，生存生物体に有益な治療効果を与えることが考えられる． 発明の概要 ここに記載される発明は一級アミド結合を加水分解できる触媒抗体の製造方法 を提供する．このような抗体には選択されたペプチドおよび他の分子に特異的な 一級アミドの加水分解および／または形成を指図することができる．本発明の直 接的な結果は，従来技術に基づいては開発できなかった，公益を有する，多くの 様々な治療用生成物である． 本発明の化合物は驚くべきことに，アミド結合の加水分解（切断）または形成 速度を上昇させる抗体を誘発すること，ならびにこのような触媒抗体は治療的お よび工業的有用性を有することが見出された． すなわち，本発明は，式（Ｉ） （式中，Ｙはポリペプチドであり， Ｒ₁ はＹのＮ末端に結合し，水素，または分岐状もしくは直鎖状，置換もしく は非置換のＣ_1-21アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり， Ｒ₂ は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり， Ｘは である）の化合物を提供する． 本発明はさらに，式（Ｉ）において，ポリペプチドＹはＣ末端カルボキシアミ ドを含有するタンパク質のポリペプチド配列であり，そのＣ末端アミノ酸を除い た配列からなる化合物を提供する． 本発明ではまた，式（Ｉ）においてＲ₁ が，式（Ｉ）の化合物が担体分子と化 学的に反応してそれに結合できるようにポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合し た反応性の残基，たとえば （式中，ｎは1 〜21の整数である）である式（Ｉ）の化合物も意図される． すなわち，本発明においては，式（Ｉ）の化合物が担体分子に結合した免疫原 が意図される． 本発明はまた，式（II） Ｒ-Ｙ-[(ＣＨ₂)_n-Ｘ]_m （II） （式中，Ｒは水素，または分岐状もしくは直鎖状，置換もしくは非置換のＣ_1-21 アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり， Ｙはポリペプチドであり， -(ＣＨ₂)_n - Ｘ基は上記ポリペプチドのアスパラギンまたはグルタミンの側鎖 を置換し， ｎは１または２であり， ｍは１以上の整数であるが，上記ポリペプチド中のアスパラギンまたはグルタ ミンアミノ酸の総数以下であり， Ｘは である）の化合物を提供する． 本発明ではまた，式（II）においてＲ₁ が，式（II）の化合物が担体分子と化 学的に反応してそれに結合できるようにポリペプチドに結合した反応性の残基， たとえば （式中，ｎは1 〜21の整数である）である式（II）の化合物も意図される． すなわち，本発明においては，式（II）の化合物が担体分子に結合した免疫原 が意図される． 本発明はさらに，式（III） （式中，Ｒ₁ は分岐状または直鎖状，置換または非置換のＣ_2-21アルキル，アル キレンもしくはアルキン基であり， Ｒ₂ は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり， Ｘは である）の化合物を提供する． 本発明ではさらに，式（III）において，Ｒ₁ が，式（III）の化合物が担体分 子と化学的に反応してそれに結合できるように反応性の残基，たとえば （式中，ｎは1 〜21の整数である）である式（III）の化合物も意図される． すなわち，本発明においては，式（III）の化合物が担体分子に結合した免疫 原が意図される． 本発明はさらに，一級アミド結合の加水分解速度および／または形成速度を上 昇させることができる抗体を意図するものである． 本発明はまた，一級アミド結合の加水分解速度および／または形成速度を上昇 させることができる抗体であって， （ｉ）抗体誘導ドメインの遺伝子ライブラリーの発生 （ii）上記ドメインのコード配列のファージ発現ベクターへの挿入，および （iii） 上記触媒抗体の単離 の工程からなる方法によって製造される抗体を意図するものである． さらに，一級アミド結合の加水分解速度および／または形成速度を上昇させる ことができる抗体であって， （ｉ）加水分解反応の反応試剤，反応中間体または生成物の類縁体からなる組 成物による動物の免疫処置 （ii）上記動物からの抗体産生リンパ球の摘出，および （iii） リンパ球の骨髄腫細胞との融合，およびそれによる抗体産生ハイブリ ドーマ細胞の産生 の工程からなる方法によって製造される抗体が意図される． さらに，一級アミド結合の加水分解速度および／または形成速度を上昇させる ことができる抗体であって， （ｉ）ハプテンに対する抗体の作成 （ii）上記抗体による免疫処置 （iii） 上記抗体に対する基質の添加，および （iv）上記基質の生成物への変換を触媒できる抗体の同定 からなる方法によって得られる抗体が意図される． さらに工程（ｉ）ののちに （ｉ）上記抗体の濃縮，および （ii）上記抗体の精製 を行う上記方法によって得られる抗体が意図される． 本発明はまた，個体または動物に一級アミド結合の加水分解速度および／また は形成速度を上昇させることができる抗体を投与することからなる治療を，それ を必要とする動物または個体に施す方法を意図する．動物または個体は患者であ ってよい． 図面の簡単な説明 以下の本発明の詳細な説明は添付の図面を参照すれば一層よく理解できるもの と考えられる． 図１はハプテンとして使用される分子，ならびに触媒抗体の誘発，スクリーニ ングおよび選択，ならびに特性解明に使用される阻害剤の化学構造を示す． 図２は触媒抗体のスクリーニングおよび選択，ならびに特性解明に使用される 基質として用いられる分子の化学構造を示す． 図３〜13は触媒抗体の誘発，スクリーニングおよび選択，ならびに特性解明に 使用されるハプテン，阻害剤および基質の合成のための反応図である． 図14は触媒および非触媒アミド加水分解に対する緩衝剤濃度の影響を示す． 発明の詳細な説明 明確にするためと便宜上，本発明の説明には以下の定義を使用する． 抗体誘導ドメインの語は，抗体分子に由来する配列に物理的または化学的に関 連するペプチド配列または個々のペプチドの多重配列を意味する．単一鎖抗体お よび単一鎖ドメインは抗体誘導ドメインの意味に包含される． 本出願を通じて，抗体の語は一般的な意味において使用され，抗体誘導ドメイ ンを包含するものである． アミノ酸は，アミノ基，カルボキシル基，水素原子，および「側鎖」と呼ばれ る弁別的な基が結合する四面体炭素原子から構成される．天然に存在するアミノ 酸は生存生物体によって合成され，縮合を介して重合してペプチドおよびタンパ ク質を形成できるアミノ酸である．例としてはアラニン，アルギニン，アスパラ ギン，アスパラギン酸，システイン，グルタミン，グルタミン酸，ヒスチジン， イソロイシン，ロイシン，リジン，メチオニン，フェニルアラニン，プロリン， セリン，スレオニン，トリプトファン，チロシン，バリン，4-ヒドロキシプロリ ン，5-ヒドロキシリジン，ε- Ｎ- メチルリジン，3-メチルヒスチジン，β- ア ラニン，γ- アミノ酪酸，ホモシステイン，ホモセリン，シトルリン，オルニチ ン，カナバリン，ジェンコール酸，およびβ- シアノアラニンがある． タンパク質またはペプチドのＣ末端はアミノ酸の線状ポリマーの末端であり， そこには最後のアミノ酸がそのアミノ基を介するアミド結合によってポリマーに 結合している． タンパク質またはペプチドのＮ末端はアミノ酸の線状ポリマーの末端であり， そこには最後のアミノ酸がそのカルボン酸基を介するアミド結合によりポリマー に結合している． Ｃ末端カルボキシアミドは，ペプチドまたはタンパク質のＣ末端カルボン酸に おいてカルボン酸の- ＯＨが- ＮＨ₂ によって置換されている最終アミノ酸の誘 導体である． 一級アミド結合は，アミド窒素が中性ｐＨにおいては２個の水素原子に共有結 合しているアミド結合である． 本明細書で用いられるペプチドの語は，ジペプチドおよびポリペプチドを包含 する． ハプテンでの免疫処置に用いられる担体分子は高分子量（＞10,000ダルトン） の分子であり，これに小分子（ハプテン）を共有結合させて小分子の生物体に対 する免疫原性を増大させることができる．担体分子の例にはキーホールリンペッ トヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）がある． Ｃ末端カルボキシアミドを含有するペプチドのポリペプチド配列であり，その Ｃ末端アミノ酸を除いた配列とは，最終Ｃ末端アミノ酸が最終ペプチド結合の加 水分解により除去されるかまたはそれが除去されて-ＯＨ基で置換されている正 常にはＣ末端カルボキシアミドを含有するタンパク質またはペプチドのアミノ酸 配列を意味する． 本発明の化合物は，置換または非置換のアルキル，アルケン，またはアルキン 基を含有することができる．「置換」の語は，１個または２個以上の炭素または 水素原子が置換基によって置換されていることを意味する．適当な置換基の例と しては，本発明はこれらに限定されるものではないが，- ＯＨ，アルキル，クロ ロ，フルオロ，ブロモ，ヨード，- ＮＨ₂ ，- ＮＨ（ ＯＨ），- ＮＨ- ＮＨ₂ ，- Ｎ= ＮＨ，- ＮＯ₂ ，- ＯＰ (Ｏ)(ＯＨ)₂，- Ｐ (Ｏ)(ＯＨ)₂，- ＳＯ₃ Ｈ ，- ＳＯ₂ Ｈ，アリール，- ＳＨ，- Ｓ-，- Ｃ（Ｏ）ＯＨ，- Ｃ（ Ｏ）Ｈ，ア ミド基，エステル基，アルケニル，アルキニル，- Ｃ (Ｏ)-，シアノ，エポキシ ド基，および異項環基を挙げることができる． ここに開示される発明は，一級アミド結合の加水分解または形成を触媒できる 触媒抗体の製造を包含する．このような一級アミド結合は天然には，ペプチドお よびタンパク質中に，たとえばアスパラギンおよびグルタミンの側鎖中にそして 時にはカルボキシ末端中に見出される．様々な生理学的機能を有する天然に存在 する多くのペプチドおよびタンパク質が，このような一級アミド結合を含有する ことが知られている．このような一級アミド結合を修飾できる触媒抗体の治療剤 としての投与は，ペプチドの生理学的機能を変化させて，患者に治療的利益を与 える． したがって，非活性化アミド結合の非補助加水分解が可能な触媒抗体の最初に 成功した設計がここに記載される． 本発明の触媒抗体は，一級アミド結合の加水分解または一級アミド結合の形成 のいずれかに使用できる．化学反応はすべて可逆的であるから，反応を一つの方 向に刺激する触媒（たとえば触媒抗体）はまた，その反応を逆方向にも触媒する ことになる．触媒は反応媒体中に包含された場合最終の平衡濃度を変えることは ないが，平衡状態に到達する速度のみを変化させる．それゆえ，触媒抗体（また は他の触媒）が反応を促進する方向（正または逆方向）は，反応試剤および生成 物の濃度ならびに反応条件に依存する．「正」反応を意図された触媒機能として 製造された触媒抗体は，同一反応を「逆」方向にも同等に触媒できる． 本発明はＣ末端アミド結合を加水分解できる抗体を誘発するハプテンの設計に よって例示する．このような活性をもつ抗体は，治療的および工業的適用を有す る．多くのペプチドホルモンが生物学的に活性なカルボキシアミド基によって終 結し（表Ｉ），これらの加水分解は各種疾患の処置に価値がある（26〜28）．ペ プチド中のアスパラギンまたはグルタミン側鎖を加水分解する抗体も多くの他の 治療標的の一つである．さらに以下に述べるように，触媒抗体は治療的価値のあ るアミド化ペプチドの工業的合成に有用である． ＳＣＬＣは，脱アミド化抗体のとくに興味のある治療標的である．現在行われ ている慣用の化学療法基準にもかかわらず，大多数のＳＣＬＣ患者が死亡してい る（34）．ＳＣＬＣには「神経内分泌」的性格を伴うことが明らかにされてきた （34，43，44）．ＳＣＬＣ細胞は多数のＣ末端アミド化ペプチド成長因子ホルモ ン類を放出する．表IIに示すように，ＳＣＬＣ細胞はペプチドホルモン類のみで はなく，それらのホルモンの受容体も産生する（34）．すなわち，ＳＣＬＣ腫瘍 は多分，自己分泌機構によって，それら自身の増殖を促進するものと考えられる （43）．これらのペプチドの１種または２種以上を脱アミド化できる触媒抗体， または好ましくはＳＣＬＣ細胞によって発現される様々なペプチドをそれぞれ脱 アミド化できる様々な触媒抗体を組み合わせて用いれば，治療的価値があるもの と考えられる．このような抗体は，腫瘍結合物質，たとえば腫瘍抗原結合モノク ローナル抗体と接合させることによって腫瘍部位に標的化させれば，格別の有効 性が期待できる． 工業的合成においては，アミド化ペプチドの新しい製造方法の要求がある（46 〜50）．成長ホルモン放出因子（48），カルシトニン（49，50），カルシトニン 遺伝子関連ペプチド（30），およびニューロキニンＡ（51，52）のようなペプチ ドは治療的価値を有し，工業的な触媒合成法は極めて有用である．組み換えラッ トαアミド化酵素（48，49）および酵母カルボキシペプチダーゼ（50）を使用す る方法が検討されている．アミドの加水分解が可能な触媒抗体は工業的にはＣ末 端ペプチドアミドの製造に使用できる．ペプチドの加水分解は熱力学的には可逆 反応であり，したがって逆（合成）方向に進めることもできる．逆反応は無水有 機溶媒または有機／水性溶媒を用いることによって促進される．水中では熱力学 的に不適当な酵素反応を促進するための有機溶媒の使用に関しては多くの文献が ある（53，54）．実際，触媒抗体が有機溶媒中で触媒機能することを示す他の研 究もある（56）．エステル交換反応において触媒抗体を用いるアミド合成が報告 されている（57，58）が，この場合には移送される一級アミンに特異的な結合部 位が必要になる．この方法を用いる一級アミド合成は，極めて小さい分子の水酸 化アンモニウムに特異的な結合部位をもつ抗体を設計する必要があることから， 極めて困難である． 式（Ｉ），（II）および（III）の化合物に対する抗体は任意の形態でたとえ ば経口的，静脈内，皮下，経皮的，腫瘍内等に投与することができる．式（Ｉ） ，（II）および（III）の化合物に対する抗体は任意の適当な担体たとえば食塩 水中に加えて投与できる．これらの製剤は他の処置とともに投与することができ る．たとえば，式（Ｉ），（II）および（III）の化合物に対する抗体は抗生物 質とともに投与することができる．さらに，式（Ｉ），（II）および（III）の 化合物に対する抗体は他の抗体，たとえば式（Ｉ），（II）および（III）の他 の化合物との混合物として投与することができる．すなわち，本発明の抗体は「 カクテル」として投与することができる．このカクテルには，ＩｇＧおよびＩｇ Ｍ両抗体ならびに結合および触媒両抗体を包含させることができる．「抗体」の 語には，抗体の結合もしくは触媒活性フラグメントおよび／または単一鎖抗体お よび抗体の単一鎖フラグメントを包含するものである． さらに，本発明は，式（Ｉ），（II）および（III）の化合物に対する抗体が ， 最終的な使用者によって希釈される濃縮形態または凍結乾燥形態に製剤化可能で あることも意図している．これらの製剤はキットの形態とすることができる．キ ットの形態には，本発明に従って投与するための適当な指示書を包含させること もできる． 以下の非限定的実施例は，例示のためのみに掲げられるものであって，発明を 限定するものと解すべきではない． ハプテン，阻害剤および基質化合物の合成および製造 図１および２に記載の化合物の合成は，添付の図3〜13に記載の反応式に従っ て達成された． 一部の合成方法および化合物は特定の立体化学に関して特定されているが，こ れは，異なる立体化学または立体化学的混合物（またはステレオアイソマー混合 物）の方法および化合物を排除する意味ではないことを銘記すべきである． ここでハプテンまたは阻害剤として用いられる図１に記載の化合物は，すべて 一級アミド結合のカルボニル炭素原子の位置における遷移状態の類縁体として四 面体原子を包含する．化合物１〜６はすべて，この四面体原子としてリンを包含 するが，化合物７および８中の四面体幾何学的配置はトリフルオロケトンの水和 によって与えられる．このようなトリフルオロケトンはそれらの水和四面体形態 と平衡状態で存在することが知られている［Begue ら，Tetrahedron，47(1991): 3207-3258］． 含水状態での平衡は著しく右側にあることが知られている．すなわち大部分の 化合物は水和型で存在する．したがって，トリフルオロケトンは，エステルおよ びアミド結合の加水分解に際しては四面体遷移状態として働くことができる． 図１および２に記載の化合物の合成は一般に以下の記述に従って行われる． （±）1-アミノ-2- フェニルエチルホスフィン酸（phosphonous acid）（19， 図３）の合成はE.Baylisら,J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，12(1984):2845-2853の 記載にほぼ従って行われた． ＮＡ-1ハプテンは図４に略述したようにして製造された．（±）1-アミノ-2- フェニルエチルホスフィン酸（19）を，クロロギ酸ベンジルを用いてアミノ保護 して，（±）Ｎ- ＣＢＺ-1- アミノ-2- フェニルエチルホスフィン酸（20）を得 た．化合物20はＮ，Ｏ- ビス（トリメチルシリル）アセトアミドおよびヨウ化メ チルを使用する直接法によって化合物22に変換した．この反応は予測できないも のであることから，別のさらに信頼できる方法が見出された．化合物20をまず， トリメチルシリルジアゾメタンついでメタノールを用いてＯ- メチル化し，次に 水素化ナトリウムおよびヨウ化メチルを用いてＰ- メチル化すると化合物21が得 られた．化合物21を水酸化リチウムで加水分解すると同一の中間体，化合物22（ 図４）が得られた．接触水素化により化合物22からＣＢＺ基を除去し，ついで6- マレイミドカプロン酸対称無水物（24）でアシル化すると最終のＮＡ-1ハプテン （１）が生成した． 6-マレイミドカプロン酸対称無水物（化合物24，図５）は，酢酸の存在下に無 水マレイン酸とε- アミノ-n- カプロン酸の反応により6-マレイミドカプロン酸 化合物23）を得，これをついでジシクロカルボジイミド（ＤＣＣＩ）を用いて化 合物24に変換することによって製造された． （±）1-(Ｎ- ベンジルオキシカルボニル)-アミノ-2- フェニルエチルホスホ ン酸ジフェニルエステル25（図６）の合成は，J.Oleksyszynら，Synthesis(1979 ):985-98に記載された操作に従った．ホスホン酸メチル26（図６）の製造には， Y.Vo-Quangら，Tetrahedron Letters，28(1987):6167-6170の報告を適用した． 接触水素化による化合物26からのＣＢＺ基の除去，ついで6-マレイミドカプロン 酸対称無水物（24）によるアシル化によって最終のＲＴ-2ハプテン（３，ＲＴ-2 ）が得られた． 中間体27を経由するβ−アミノトリフルオロアルコール28（図７）の合成は， B.Imperiali & R.H.Abeles，Tetrahedron Letters，27(1986):135-138に記載の 操作に従った．化合物28を6-マレイミドカプロン酸対称無水物（24）でアシル化 するとアルコール化合物29が得られ，これをデス−マーチン酸化剤で酸化すると 最終のＷＨ-2ハプテン（８）が得られた． ダンシル化ε- アミノ-n- カプロン酸（30，図８）はダンシルクロリドとε- アミノ-n- カプロン酸のカップリングによって製造した．化合物30をＤＣＣＩお よびＮ- ヒドロキシコハク酸イミドで活性化すると，化合物31が得られた．ＢＯ Ｃ- Ｌ- Ｐｈｅ- ＮＨ₂ （32，図８）の製造はShui-Tein Chenら，Synthesis, 1 (1988):37-38に報告された操作に従った．化合物32をトリフルオロ酢酸で脱保護 して化合物33を得て，これをついでトリエチルアミンの存在下に化合物31と反応 させると，最終生成物，化合物９（図８）が得られた． 10（図９）の合成は，32に代えてＢＯＣ- Ｄ- Ｐhe- ＮＨ₂ （34，図９）を用 いた以外は，９の合成（図８）の場合と同じ反応の組み合せに従った．化合物34 は，Shui-Tein Chenら，Synthesis(1988): 37-38の操作によって製造した． （±）1-アミノ-2- フェニルエチルリン酸（19）を最初にその（±）Ｎ- ベン ジルオキシカルボニル誘導体（20，図10）に変換し，ついでE.Baylisら，J．Che m.Soc.Perkin Trans I ，12(1984)：2845-2853に記載されているその（＋） (Ｒ) -および (−)(Ｓ)-α- メチルベンジルアミン塩を再結晶することによって分割 された．酸性にしたのち，化合物20の純粋なエナンチオーマーを図４に示したの と同じ方法によって別個に，化合物22の２つのエナンチオーマーに変換された． 化合物22から接触水素化によってＣＢＺ基を除去し，ついでＮ- アセチル-6- ア ミノ-n- カプロン酸（35）の対称無水物でアシル化すると，ＮＡ-1ハプテンの純 粋なエナンチオーマー（４および５，図10）が生成した． ６（図１）の合成は，6-マレイミドカプロン酸の対称無水物（24）に代えて無 水酢酸を用いた以外は化合物３（図６）の合成の場合と同じ化学工程に従った． 同様に，化合物24に代えて無水酢酸を用いた以外は化合物８（図７）の合成の場 合と同じ化学工程に従った． 式（Ｉ），（II）および（III）の定義内の置換またはアルケンもしくはアル キン化合物の製造は，適当な置換または非置換アルキル，アルケンまたはアルキ ン前駆体化合物がその化学合成において置換される場合を除いて以下に示した． 本技術分野の通常の熟練者であれば，繁雑な実験を行うことなく，本明細書の実 施例および説明に基づいて容易に必要な合成操作を開発できるものである． 例１−ＮＡ-1ハプテン，化合物１の合成および製造 （±）Ｎ- ＣＢＺ-1- アミノ-2- フェニルエチルホスフィン酸（20）の合成 （±）1-アミノ-2- フェニルエチルホスフィン酸（19）（12.95 g，70 mmol） のジオキサン（200 ml）および１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（75ml）中溶液に０ ℃でクロロギ酸ベンジル（20ml）を滴下した．この添加時には同時に１Ｍ水酸化 ナトリウム水溶液（75ml）を滴下して溶液のｐＨを８〜９に維持した．反応混合 物を室温でさらに16時間攪拌し，ついで真空中で半分の容量に濃縮した．ジエチ ルエーテル（２×75ml）で洗浄し，ついで濃塩酸水溶液を加えてｐＨ１の酸性と した．酢酸エチル（３×80ml）で抽出し，有機相を合わせ水（１×20ml）で洗浄 し，無水硫酸マグネシウム上で乾燥し，ろ過し，真空中で蒸発させ，酢酸エチル −軽油から再結晶すると，（±）Ｎ- ＣＢＺ-1- アミノ-2- フェニルエチルホス フィン酸（20）（15.44 g）（融点136-137 ℃）が得られた（Baylis,E.K.,Campb ell,C.D.,Dingwall,J.G.:J.Chem.Soc.Perkin Trans.l．1984，12，2845 では融 点137 ℃と報告されている）． これは分光検査法により以下のように確認された． 化合物21の製造 （±）Ｎ- ＣＢＺ-1- アミノ-2- フェニルエチルホスフィン酸（20）（510 mg， 1.60mmol）をメチレンクロリド（5 ml）およびメタノール（1 ml）中に溶解し， トリメチルシリルジアゾメタンの溶液（ヘキサン中10重量％）を黄色が消えなく なるまで添加した．ついで氷酢酸を黄色が消失するまで添加した．この溶液を真 空中で蒸発乾固した．残留物を乾燥ＴＨＦ（2 ml）に再溶解し，この溶液を０℃ に冷却したＴＨＦ（2 ml）中水素化ナトリウム（37 mg，1.53 mmol）の懸濁液に 加えた．反応混合物を室温で30分間攪拌したのち，ヨードメタン（2.25 mmol ） を加えた．さらに３時間攪拌したのち，飽和塩化アンモニウム溶液（35ml）を加 えて反応を静め，酢酸エチル（75ml）で抽出した．有機相を水（5 ml）で洗浄し ， 無水硫酸ナトリウム上で乾燥し，ろ過し，真空中で濃縮し，シリカゲル上メタノ ール：メチレンクロリド（8 ：92）を用いてクロマトグラフィーに付すと，化合 物21（0.190 g ）が得られた． これは，分光検査法により，以下のようにジアステレオーマーの混合物として 確認された． 化合物22の製造 化合物21（178 mg，0.530 mmol）をジオキサン（0.55ml）と水（0.50ml）に溶 解した．この溶液に２Ｍ水酸化リチウム水溶液（0.55ml）を加え室温で48時間烈 しく攪拌した．水（25ml）を加え，この水溶液を酢酸エチル（１×25ml）で洗浄 し，ついで濃塩酸でｐＨ０の酸性とし，水相を酢酸エチル（２×40ml）で抽出し た．有機抽出液を合わせて無水硫酸ナトリウム上で乾燥し，ろ過し，真空中で蒸 発させ，酢酸エチルから再結晶すると，化合物22（0.153 g ）が得られた（融点 153-154 ℃）． これは分光検査法により以下のように確認された． 化合物１，ＮＡ- １の製造 10％Ｐｄ- Ｃ（30mg）および化合物22（103 mg，0.31mmol）のメタノール（30 ml ）中混合物を水素雰囲気下に室温で，薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で 観察して出発原料が消費されるまで（４時間）攪拌した．触媒をセライトのパッ ドを通してろ過し，メタノール（20ml）および水：メタノール（1 ：９，10ml） で洗浄した．溶媒をすべて合わせて，真空中で蒸発させると固体（40mg）が得ら れた．固体をＤＭＦ（2 ml）に溶解し，6-マレイミドカプロン酸の対称無水物（ 24）（0.20 mmol）のＤＭＦ（2 ml）中溶液を加え，ついでトリエチルアミン（0 .10ml）を加えた．反応混合物を16時間攪拌したのち，１Ｍリン酸カリウム水溶 液，ｐＨ６（2 ml）を加えて反応を停止させた．逆相Ｃ₁₈ｈｐｌｃを用い，生成 物，化合物12（12mg）が純粋に単離された．緩衝液Ａは水，緩衝液Ｂはアセトニ トリル：水（95:5），流速3.5 ml/分，勾配は30分で２〜30％緩衝液Bとした． これは，分光検査法により，以下のように確認された． 例２−ハプテンＲＴ- ２，化合物３の合成および製造 6-マレイミドカプロン酸23の製造 無水マレイン酸（0.05mole）の酢酸（20ml）中溶液をε- アミノ-n- カプロン 酸（0.05mole）の酢酸（50ml）中溶液と混合し，室温で２時間攪拌した．酢酸（ 150 ml）を追加し，反応混合物を18時間還流した．反応混合物を真空下に蒸発さ せて油状物とし，ついでクロロホルム（50ml）を添加した．この溶液を室温に16 時間放置すると，不純物が溶液から沈殿した．沈殿をろ過し，ろ液を集め，真空 下に蒸発させ，シリカゲル上クロロホルム：酢酸（95:5）を用いてクロマトグラ フィーに付すと，6-マレイミドカプロン酸23（8g）が得られた． これは分光検査法により以下のように確認された． 化合物24の製造 6-マレイミドカプロン酸23（9.8 mmol）を乾燥メチレンクロリド（10ml）に溶 解し，ＤＣＣＩ（4.10mmol）を加えた．室温で３時間攪拌したのち，反応混合物 をろ過し，ろ液を真空中で蒸発させると化合物24（1.9g）が得られた． ＲＴ−２ハプテン（３）の製造 10％Ｐｄ- Ｃ（10重量％，40mg）およびメチル- Ｎ- ＣＢＺ-1- アミノ-2フェ ニルエチルホスフィン酸（26）（0.43mmol）のメタノール（5 ml）中混合物を水 素雰囲気下に室温で２時間攪拌した．触媒をセライトのパッドを通してろ過し， メタノール：水（1:1，20 ml）で洗浄し，溶媒をすべて合わせて，真空中で蒸発 させると固体（87mg）が得られた．この固体を13 mg の５部分に分割した．各部 分を別個にＤＭＦ（0.2 ml）中化合物（0.12mmol）の溶液，ついでトリエチルア ミン（0.02ml）で処理した．反応混合物を烈しく攪拌し，１Ｍリン酸カリウム水 溶液，ｐＨ5.5 （0.20ml）を加えて反応を停止させた．反応を停止させたのち， 生成物を合わせ，逆相Ｃ₁₈ｈｐｌｃを用い，生成物，化合物ＲＴ−２ハプテン（ ３）（60mg）がそのトリエチルアンモニウム塩として純粋に単離された．緩衝液 Ａは水，緩衝液Ｂはアセトニトリル：水（95:5），流速3.5ml/分，勾配は30分で １〜60％緩衝液Ｂとした．生成物のピークは保持時間19分で溶出した． これは分光検査法により確認された． 例３−ハプテンＷＨ−２，化合物８の合成および製造 化合物29の製造 β- アミノトリフルオロアルコール塩酸塩28（0.082 mmol）を１Ｍリン酸カリ ウム水溶液，ｐＨ６ （1 ml）およびアセトニトリル（2 ml）の混合物中に溶解 した．化合物24（0.164 mmol）を添加し，反応混合物を室温で16時間攪拌した． 混合物を真空中で蒸発させて固体とした．アセトニトリル（2 ml）を加え，上清 を逆相Ｃ₁₈ｈｐｌｃによって精製すると，保持時間16.36 分および16.58 分の２ つのピークとして化合物（29）（20mg）が得られた．緩衝液Ａは25ｍＭ酢酸トリ エチルアンモニウム水溶液，ｐＨ5.5，緩衝液Ｂはアセトニトリル：水（95:5） ，流速3 ml/分，勾配は35分で５〜80％緩衝液Ｂとした． これは分光検査法でジアステレオーマーの混合物として確認された． ＷＨ−２ハプテンの製造 化合物29（0.0485mmol）をジクロロメタン（1 ml）に溶解し，デス−マーチン 酸化剤（0.179 mmol）を加えた．室温で３時間攪拌したのち，反応混合物を真空 中で蒸発させた．水（1 ml）およびアセトニトリル（2 ml）の混合物を加え，遠 心分離後，上清を逆相Ｃ₁₈ｈｐｌｃによって精製すると，保持時間が15.33 分の 単一のピークとしてＷＵ- ハプテン（８）（10mg）が得られた．緩衝液Ａは25ｍ Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム水溶液，ｐＨ5.5 ，緩衝液Ｂはアセトニトリル ：水（95:5），流速3 ml/分，勾配は35分で５〜80％緩衝液Ｂとした． 例４−基質化合物９の合成および製造 ダンシル化ε- アミノ-n- カプロン酸（30）の製造 ε- アミノ-n- カプロン酸（12.7mmol）とトリエチルアミン（70mmol）のメタ ノール（35ml）中溶液にダンシルクロリド（11.48 mmol）を添加した．室温で２ 時間攪拌したのち，反応混合物を真空下に蒸発させた．１Ｍ水酸化ナトリウム水 溶液（100 ml）を加え，混合物をジエチルエーテル（２×75ml）で洗浄した．水 相を濃塩酸でｐＨ２〜３の酸性とし，クロロホルム（２×100 ml）で抽出した． 有機相を合わせ水無水硫酸マグネシウム上で乾燥し，ろ過し，真空中で蒸発させ ると，化合物30（2.6 g ）が得られた． これは分光検査法により確認された． 化合物33の製造 ＢＯＣ- Ｌ- Ｐｈｅ- ＮＨ₂ （32）（1 mmol）をメチレンクロリド（6 ml）に 溶解し，トリフルオロ酢酸（2 ml）を添加した．室温で90分攪拌したのち，反応 混合物を真空下に蒸発させた．メチレンクロリド（1 ml）を加え，この溶液を攪 拌したジエチルエーテル（100 ml）に滴下した．得られた沈殿を集め，さらにジ エチルエーテル（5 ml）で洗浄した．沈殿を真空下に乾燥すると，化合物33（0. 240 g ）が得られた． これは分光検査法により確認された． 化合物９の製造 化合物30（0.65mmol）およびＮ- ヒドロキシスクシンイミド（0.65mmol）メチ レンクロリド（2 ml）に溶解し，ＤＣＣＩ（0.65mmol）を添加した．室温で５時 間攪拌したのち，反応混合物をろ過し，ろ液を濃縮して固体（31）を得た．固体 をＤＭＦ（2 ml）に溶解し，化合物33（0.54mmol），ついでトリエチルアミン （1.30mmol）を添加した．反応混合物を室温で16時間攪拌したのち，混合物を真 空中で蒸発させて固体とした．この固体をメチレンクロリド（2 ml）に溶解し， シリカゲル上，メタノール：メチレンクロリド（5:95）を用いてクロマトグラフ ィーに付すと，化合物９（0.230 g ）が得られた． これは分光検査法により確認された． 例５−阻害剤化合物４および５の合成および製造 10％Ｐｄ- Ｃ（100 mg）および， (＋)(Ｒ)-α- メチルベンジルアミンを用い て分割した化合物22（0.683 mmol）のメタノール（10ml）中混合物を水素雰囲気 下に室温で３時間攪拌した．触媒をセライトのパッドを通してろ過し，メタノー ル（10ml）および水：メタノール（1 ：９，5 ml）で洗浄した．溶媒をすべて合 わせて，真空中で蒸発させると固体が得られた． 別のフラスコ中で，6-アセチル-n- カプロン酸（0.70 g，4.05mmol）をメチレ ンクロリド（25ml）およびのＤＭＦ（3 ml）の混合物中に溶解した．この溶液に ，メチレンクロリド（10ml）中ＤＣＣＩ（0.412 g，2mmol）を加えた．室温で１ 時間攪拌したのち，反応混合物を真空中で小容量（約3 ml）に蒸発させた．この 溶液を上述の固体に移し，トリエチルアミン（0.42 ml，3mmol）を混合物に加え た．反応混合物を室温で３時間攪拌し，ついでこれに水：メタノール（1:2v/v， 20ml）を加え，混合物を真空中で蒸発させた．メタノール（3 ml）を加え，混合 物をろ過し，ろ液を集めた．ろ液を製造用シリカプレート（1 mm厚）上，メタノ ール：メチレンクロリド（20:80）を用いて精製したところ，化合物４ （0.083 g ）が得られた．［α］_D ²⁰−33.8°（ｃ＝0.157,メタノール）． 10％Ｐｄ- Ｃ（100 mg）および，( −)(Ｓ)-α- メチルベンジルアミンを用いて分割した化 合物22（0.683 mmol）のメタノール（10 ml ）中混合物を水素雰囲気下に室温で ３時間攪拌した．触媒をセライトのパッドを通してろ過し，メタノール（10ml） および 水：メタノール（1 ：９，5 ml）で洗浄した．溶媒をすべて合わせて，真空中で 蒸発させると固体が得られた． 別のフラスコ中で，6-アセチル-n- カプロン酸（4.05mmol）をメチレンクロリ ド（25ml）およびのＤＭＦ（3 ml）の混合物中に溶解した．この溶液に，メチレ ンクロリド（10ml）中ＤＣＣＩ（2 mmol）を加えた．室温で１時間攪拌したのち ，反応混合物を真空中で小容量（約3 ml）に蒸発させた．この溶液を上述の固体 およびトリエチルアミン（0.42 ml，3mmol）に移した．反応混合物を室温で３時 間攪拌し，ついでこれに水：メタノール（1:2v/v，20ml）を加え，混合物を真空 中で蒸発させた．メタノール（3 ml）を加え，混合物をろ過し，ろ液を集めた． ろ液を製造用シリカプレート（1 mm厚）上，メタノール：メチレンクロリド（20 ：80）を用いて精製したところ，化合物５（0.083 g ）が得られた．［α］_D ²⁴ ＋33.5°（ｃ＝0.155,メタノール）． 化合物４および５の合成は分光検査法により以下のように確認された． 例６−阻害剤化合物６の合成および製造 阻害剤化合物６の合成は，6-マレイミドカプロン酸対称無水物（24）に代えて 無水酢酸を用いた以外は，ハプテン化合物３，ＲＴ−２の合成の場合と同じ化学 反応順序によった． ６の正しい合成はそのトリエチルアンモニウム塩として分光検査法により確認 された． 例７−阻害剤化合物７の合成および製造 阻害剤化合物７の合成は，6-マレイミドカプロン酸対称無水物（24）に代えて 無水酢酸を用いた以外は，ハプテン化合物８，ＷＨ−２の合成の場合と同じ化学 反応順序によった． ７の正しい合成はそのトリエチルアンモニウム塩として¹ Ｈ- ＮＭＲスペクト ルにより確認された． 例８−基質化合物11〜16の合成および製造 化合物11および12の製造は，Ｎ- ｔ- ＢＯＣ- Ｌ- フェニルアラニンアミド32 ではなく，それぞれＮ- ｔ- ＢＯＣ- Ｌ- フェニルアラニンメチルエステルおよ びＮ- ｔ- ＢＯＣ- Ｄ- フェニルアラニンメチルエステルを用いる以外は，化合 物９（図８）について記載の合成操作によった． 化合物13の製造は，化合物31ではなく無水酢酸を用いた以外は，化合物９につ いての記載と同一の合成操作によった． 化合物14の製造は，Ｎ- ｔ- ＢＯＣ- Ｌ- フェニルアラニンアミド32に代えて Ｎ- ｔ- ＢＯＣ- Ｄ- フェニルアラニンアミドを用い，化合物31ではなく無水酢 酸を用いた以外は，化合物９（図８）についての記載と同一の合成操作によった ． 化合物15の製造は，化合物32に代えてＮ- ｔ- ＢＯＣ- Ｌ- フェニルアラニン メチルエステルを用い，化合物31に代えて無水酢酸を用いる以外は，化合物９に の場合と同じ合成操作によった． 化合物16の製造は，化合物32に代えてＮ- ｔ- ＢＯＣ- Ｄ- フェニルアラニン メチルエステルを用い，化合物31に代えて無水酢酸を用いる以外は，化合物９に の場合と同じ合成操作によった． 例９−他のアミノ酸に相当するハプテンの合成および製造 多くの様々なアミノ酸の脱アミノ化に特異的な触媒抗体の誘発のための遷移状 態類縁体ハプテンの合成に有用な広範囲の様々な1-アミノアルキルホスフィン酸 （たとえば化合物19，図３）はこれまで科学文献に記載されている［たとえば， E.Baylisら，J．Chem.Soc.Perkin Trans I，12(1984)：2845-2853 ］．このよう な1-アミノアルキルホスフィン酸は，天然に存在するアミノ酸それぞれに相当す るハプテンの合成に，中間体として使用できる．図４に記載の19ではなく，これ らの化合物をもちいるこのようなハプテンの合成における続く反応では，他のア ミノ酸のＮＡ−１バージョンが生成する．別法として，E.Baylisらによって明ら かにされているように，塩化水銀または臭素水による1-アミノアルキルホスフィ ン酸の酸化により，相当する1-アミノアルキルホスホン酸が産生する．後者を他 のアミノ酸のＲＴ−２バージョンに変換は，１）クロロギ酸ベンジルエステルを 用いるアミノ保護，２）メタノール中トリメチルシリルジアゾメタンを使用する Ｏ- メチル化，および３）水酸化ナトリウムでの加水分解による他のアミノ酸の メチルホスホン酸バージョン（化合物26の類縁体，図６）の作成の順序によって 行われる．図６に記載の反応経路を続ければ，所望のアミ酸のＲＴ−２ハプテン バージョンが生成する． 他のアミノ酸に相当するハプテンのＷＨ−２バージョンは，図７に記載の方法 により，合成の第一段階で適正なニトロ化合物（所望のアミノ酸の側鎖に相当） を置換させることによって合成される．本発明の技術分野の通常の熟練者は，所 望のアミノ酸類縁体を発生させるための適当なニトロ化合物を容易に製造するこ とが可能である． 例10−ハプテンのペプチド中への導入 本明細書に記載したすべての遷移状態類縁体，すなわち式（Ｉ），（II）およ び（III）の化合物の導入は，本技術分野の通常の熟練者には，繁雑な実験を行 うことなく容易に達成される．標準的な方法は科学文献に共通して記述されてい るが，たとえば本発明者らは，J．Jones，The Chemical Synthesis of Peptides ，Clarendon Press：Oxford，1991を参照している． 例11−アミノ酸側鎖に遷移状態類縁体を含有するペプチドの合成および製造 アスパラギン側鎖類縁体 保護ジメチルホスホン酸アスパラギン化合物，すなわち (Ｓ)-3- (ジメチルホ スホノ)-2-[(9-フルオレニル) メトキシカルバモイル] プロピオン酸の合成につ いてはJ.Hutchinsonら（Tet.Lett.，1992，33，7065-7066）に記載されている． この記載は参考として本明細書に導入する．このアスパラギン類縁体は，本技術 分野の通常の熟練者にはよく知られている標準ペプチド合成技術（たとえば J.J ones,The Chemical Synthesis of Peptides，Clarendon Press: Oxford，1991参 照）によってペプチドまたはタンパク質中に導入される．ペプチドを水酸化リチ ウムで処理するとホスホネートから一方の- ＯＭｅ基が加水分解されて，ペプチ ド内のアスパラギンの側鎖におけるＲＴ−２型ハプテンが生成する． 類縁のＮＡ−１ハプテンのバージョンの合成は，J.Hutchinsonら（Tet.Lett., 1992,33,7065-7066 ）に記載の操作に従い，その合成操作における（Ｍｅ₃ Ｓｉ Ｏ）Ｐ (ＯＭｅ)₂に代えてＣＨ₃(Ｍｅ₃ ＳｉＯ) Ｐ（ＯＭｅ）を用いて達成され る．標準技術によってペプチドを導入し，ついで水酸化リチウムで加水分解する と，アスパラギンの側鎖にＮＡ−１をもつペプチドが生成する． アスパラギンの側鎖におけるトリフルオロケトン類縁体の合成は図11に示す． 36の合成は，G．Coppolaらの操作に従って行う（Asymetric Synthesis，209頁， John Wiley；New York,1987 ）．この記載は参考として本明細書に導入する．36 の所望のトリフルオロケトン化合物への変換は，P．Edwards（Tet.Lett.,1992， 33，4279-4282 ）の操作に従って行う．この記載は参考として本明細書に導入す る．すなわち，36を，最初ＣＦ₃ ＺｎＩで処理し，デス−マーチンのパーヨージ ネインで酸化するとトリフルオロケトン誘導体37が生成する．化合物37は，標準 操作を用い，脱保護および標準ペプチド合成技術によりペプチド中に容易に導入 できる（たとえば J.Jones，The Chemical Synthesis of Peptides，Clarendon Press：Oxford，1991参照）． グルタミン側鎖類縁体 グルタミンの側鎖におけるリン類縁体の合成は図12に記載する．ブロモ誘導体 38の合成はG.Coppola ら（Asymetric Synthesis，222頁，John Wiley; New York ,1987）によって報告されている．グルタミンの側鎖におけるＮＡ−１ハプテン バージョンの合成は，38のメチルホスフィン酸ジメチルとのアルブーゾフ反応に よって達成されて39が得られ，一方，ＲＴ−２バージョンはホスフィン酸トリメ チルを用いて合成され，40が得られる．いずれのホスフィン酸誘導体も，Ｐｄ− Ｃを用いて接触水素化によって脱保護してＣＢｚ基を除き，水酸化ナトリウムで メ チルエステル基を除去したのち，標準技術を用いてペプチドおよびタンパク質中 に延長される．リンのメトキシ基の最終的な脱保護はトリメチルシリルブロミド によって行われ，グルタミンの側鎖における所望のハプテンが生成する． グルタミンの側鎖におけるトリフルオロケトン類縁体の合成は図13に示す．ア ルデヒド41の合成は，G．Coppolaら（Asymetric Synthesis，220頁,John Wiley; New York，1987）に報告されている．P．Edwards（Tet.Lett.，1992，33，4279- 4282）によって報告されているように41をＣＦ₃ ＺｎＩ試薬と反応させ，ついで デス−マーチンのパーヨージネインで酸化するとトリフルオロケトン誘導体42が 生成する．開環は水酸化ナトリウムを用いて行い，10％Ｐｄ−Ｃを用いて接触水 素化後に完全に脱保護されたトリフルオロケトンアミノ酸が得られ，グルタミン のトリフルオロケトン類縁体，化合物43が生成する． これらの側鎖類縁体のペプチド中への導入は，本技術分野の通常の熟練者には 容易に実施できる（たとえば J.Jones，The Chemical Synthesis of Peptides， Clarendon Press：Oxford，1991 参照）． 触媒抗体の製造 ハプテン化合物の合成後，適当な担体タンパク質との接合体を調製し，マウス の免疫処置を実施した．免疫処置マウスの脾臓細胞からハイブリドーマを作成し て，ハプテンへの結合をスクリーニングした．ハプテンに結合親和性を示したク ローンを触媒作用の初期スクリーニングならびに二次スクリーニングに付した． 図２の基質における一級アミド結合の加水分解を触媒した抗体の一つからＦab’ フラグメントを調製した． 例12−遷移状態類縁体ハプテン接合体の製造 ＮＡ−１ハプテンをハプテンのリンカーに結合したマレイミド基を介してウシ 血清アルブミン（ＢＳＡ）およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ） に接合させた．これは，リジンのようなＮ末端アミノ基をアミジン連結スルフヒ ドリル基で置換するトラウト試薬（2-イミノチオラン塩酸塩）によりＢＳＡおよ びＫＬＨ担体タンパク質を修飾し，ついで修飾タンパク質をマレイミド−ハプテ ンと混合することによって達成された． さらに詳細に説明すれば，各タンパク質約５mgを１mlの50ｍＭリン酸ナトリウ ム，ｐＨ8.4 に溶解した．ＢＳＡを，１Ｍトリエタノールアミン，ｐＨ8.1 中ト ラウト試薬８mg/ml の溶液0.25 ml と混合した．ＫＬＨは0.5 mlのトラウト試薬 と混合した．ＢＳＡは室温で90分間インキュベートし，ＫＬＨは室温で120 分間 インキュベートした．反応を停止し，修飾されたタンパク質を，0.1 Ｍリン酸緩 衝液，ｐＨ6.5 で平衡化したＰＤ−10カラム（Pharmacia ）上で脱塩によって回 収した．修飾された各タンパク質の小サンプルを遊離チオールのアッセイのため に保存した．ハプテン（5 mg）を0.1 Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ6.5 に溶解し，つい で２つのタンパク質間に分割した．混合物を室温で２時間攪拌し，ついでリン酸 緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）に対して４℃で透析し，２回透析液を交換した． 透析後，修飾タンパク質およびハプテン−タンパク質接合体のタンパク質濃度 を，ＢＳＡをタンパク標準として用いて，微量ビシンコニン酸アッセイにより測 定した．４種すべての修飾タンパク質について遊離チオール濃度を，標準として システインを用い，エルマン試薬で測定した．ハプテンとの接合前には，１モル の修飾ＢＳＡあたり遊離チオール33モルを含有し，ハプテンに接合後には10モル が残存した．接合前には，１モルの修飾ＫＬＨあたり遊離チオール20モルを含有 し，ハプテンに接合後には５モルが残存した．したがって，ハプテンとタンパク 質の比は両タンパク質の分子量を64,000として，ＮＡ-1- ＢＳＡ接合体の場合23 :1，ＮＡ-1- ＫＬＨ接合体の場合15:1と計算された． 例13−免疫処置 11週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ雌性マウスに，20μg のＮＡ-1- ＫＬＨを完全フ ロイントアジュバントに乳化して腹腔内に注射した．不完全フロイントアジュバ ントに乳化した20μg のＮＡ-1- ＫＬＨを４週後にブースター投与した．２回目 の注射後の免疫応答をＥＬＩＳＡによって測定した．ＮＡ-1- ＢＳＡに対する抗 血清のＩｇＧ力価逆数は51,200であった（50％最大光学密度を与える希釈）．マ ウスには７カ月後にＰＢＳ中10μg の抗原をブースター投与した． 例14−ハイブリドーマの製造およびスクリーニング 最後の注射から３日後に１匹のマウスを屠殺し，脾臓をハイブリドーマ作成の ための脾臓細胞の原料とした．融合パートナーとしては，ＳＰ2/0 細胞を使用し た．生育11日後に，ハイブリドーマの上清液についてＮＡ-1- ＢＳＡに対する特 異的抗体をＥＬＩＳＡによりアッセイした．得られた4149のコロニー中，384 の ハイブリドーマが接合体と反応するＩｇＧ抗体を産生した．これらの細胞を膨張 させ，７日後にＮＡ-1- ＢＳＡ，ＢＳＡおよびＫＬＨへの結合を再検定した．71 のハイブリドーマがＮＡ-1- ＢＳＡに結合できる抗体を産生したが，ＢＳＡまた はＫＬＨとは反応しなかった．これらのハイブリドーマをさらに膨張させて凍結 した．これらのハイブリドーマからの上清液を細胞から集めて触媒活性をアッセ イした． 触媒活性をもつ抗体を産生していると思われるハイブリドーマを限界希釈によ ってクローニングした．予め0.5 mlのプリスタン（2,6,10,14-テトラメチルペン タデカン）でプライミングしたＢＡＬＢ／ｃＡｎＮマウス内での腹水産生のため にクローンを膨張させた．各マウスに５×10⁵ 個のハイブリドーマを注射し，腹 水を集めてプールした． 例15−13Ｄ11Ｆab' フラグメントの調製 一級アミドの加水分解を触媒することが示されている触媒抗体，13Ｄ11（5.8m g/ml ）1 mlを１Ｍクエン酸緩衝液，1.5 Ｍ食塩，ｐＨ3.6 ，0.11 ml と混合し た．不溶性ペプシン−アガロース（15 mg; 21 単位/ml 固体）を0.1 Ｍクエン酸 緩衝液，0.15Ｍ食塩，ｐＨ4.2 に再懸濁して洗浄した．抗体とペプシン−アガロ ースを37℃で15時間混合した．３Ｍトリス緩衝液，0.15Ｍ食塩，ｐＨ8.5 により ｐＨを7.5 に調整して反応を停止させた．Superose 12 を予め充填したＨＲ10/3 0カラム上ＦＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィーによって消化の程度をチェック した．一夜のインキュベーションによってすべての抗体はＦab'₂に消化された． Ｆab'₂を，10ｍＭシステインと室温で１時間の段階的還元および30ｍＭヨードア セトアミドと室温で２時間のアルキル化によりＦab’に変換した．Ｆab’フラグ メントを0.1 ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液，0.14Ｍ食塩，ｐＨ7.0 で平衡化した Superose 12 カラム上ゲルろ過によって精製した．すべてのカラム分画について ，ぺルオキシダーゼで標識したＦab’特異的二次抗体を用い，ＥＬＩＳＡでＮＡ -1- ＢＳＡに結合する抗体をアッセイした．ピークＦab’分画をプールし， Centriprep-10濃縮器で濃縮した． 例16−ＷＨ−2およびＲＴ−2接合および抗体発生 ＷＨ−２およびＲＴ−２ハプテンをＢＳＡおよびＫＬＨに，ＮＡ−１の場合と 同様にして接合させた．ＷＨ−２の接合比は，ＷＨ−２：ＢＳＡの場合に38:1， ＷＵ−２：ＫＬＨの場合には11.5:1であった．ＲＴ−２の接合比は，ＲＴ−２： ＢＳＡの場合には22:1，ＲＴ−２：ＫＬＨの場合には8:1 であった．ＮＡ−１と ＫＬＨの場合と同様に，ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫処置して免疫応答を発生させ た．ＮＡ−１について上述したようにハイブリドーマを産生させて選択した． 例17−初期のＮＡ−１抗体触媒選択 ハプテン親和性に基づいて選択された多数の抗体から，可能性ある触媒抗体の サブセットを選択するために，初期スクリーニングプロトコールを使用した．操 作は，ハイブリドーマの上清液中に存在する抗体の触媒活性についてのスクリー ニングを包含する．培養上清中の抗体は極めて希薄で（通常１〜10μg/ml）不純 である（反応を触媒する偶発的な酵素を含む可能性がある）ことから，前のアッ セイの時よりも抗体が濃縮され精製されると操作の結果は通常，改善される．濃 縮および精製は抗−マウスＩｇＧアフィニティーゲル上での固定化および洗浄に よるのが，迅速で便利である． a）固定化のための上清の調製： 計68のハイブリドーマの上清を乾いた培養体から抽出し，２Ｎ水酸化ナトリウ ムでそれぞれのｐＨを7.0 〜7.5 に調整した．細胞屑を2700 rpmで30分間遠心分 離して除去し上清をポリプロピレン管に傾瀉した．上清の総容量は4.0 〜 13.2m lの間で変動した（平均＝10.8 ml ）．ついで各上清をそれぞれ15-ml のポリプ ロピレン管に４つの等しいアリコートに分割した（４×68＝272 管）．68の上清 ４セットをアフィニティーゲル上に固定化するまで-70℃に凍結した． ｂ）抗体の固定化： 以下の固定化操作を４回行い，各回，上述の68に小分けした上清の４セットの 一つを使用した．抗−マウス免疫グロブリンアフィニティーゲル（Calbiochem， 結合能0.5 〜2.0 mg免疫グロブリン／mlゲル) を各チューブに，ＰＢＳ中50％ス ラリー（140 μl，70 μl のゲル含有）として加えて，得られた懸濁液を室温で 16時間穏やかに混合した．16時間後に，96ウエル付きのMillititer GV フィルタ ープレート（Millipore ）を0.05％Tween-20含有ＰＢＳ中で予め湿潤させ，洗浄 した．アフィニティーゲル懸濁液を遠心分離器中，2500 rpmで15分間回転させ， 大部分の上清を吸引により取出し，各ポリプロピレン管からの残留スラリー（25 0 μl ）はフィルタープレートの別のウエルに移した．残留した上清を全プレー トから吸引により除去し，固定化された抗体を４℃でＰＢＳ／Tween （５×200 μl ），ＰＢＳ（３×200 μl ）および25ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ7.2 （３×20 0 μl ）で洗浄した． c）固定化抗体と基質のインキュベーション 所望のアッセイ数が極めて大きいため（68抗体×８基質×３ｐＨ値＝1632アッ セイ），スクリーニング過程を加速し，固定化抗体を節約するために以下の戦略 を採用した．上述のように，それぞれ68の固定化抗体を含む４個のフィルタープ レートを準備した．必要なアッセイ数を半分に減らすために，４種類の基質それ ぞれのＤおよびＬ異性体を混合し，各基質のＤＬ混合物を一緒に検定した（した がって８個の基質が４つの混合物に減少した）．各プレートは１種類の基質のＤ Ｌ混合物に割り当てたが，異なる３つのｐＨ値，すなわちｐＨ7.0，5.0および9. 0 で３回使用した．ろ過プレートに洗浄抗体を固定化するためには，100 μl の Ｄおよび100 μl のＬ基質を，いずれも25ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ7.0 ，140 ｍ Ｍ食塩，0.01％ナトリウムアジド中200 μＭ保存溶液中に調製して添加した．プ レートは室温で（約22℃）で約24時間（アミドおよびエステルとも）インキュベ ートした．インキュベーション後，基質溶液を吸引し（ビーズは吸引しない）， 下記のようにＴＬＣまたはＨＰＬＣのいずれかで後に分析するまで凍結(−20℃) した．まだ固定化抗体を含有する同じ96ウエルプレートを，25ｍＭのＭＥＳ，ｐ Ｈ5.0 ，140 ｍＭ食塩により，４×200 μl/ウエルで洗浄した．再び200 μＭの ＤおよびＬ両基質100 μl を加え（計200 μl 容量），この場合はｐＨ5.0 の緩 衝液中とした．室温でのインキュベーションは約24時間（アミド基質）または14 時間（エステル基質）行った．基質溶液を吸引し，生成物形成の分析までｐＨ7. 0 で凍結した．最後に，同じ固定化抗体を用いて，操作を25ｍＭトリス，140 ｍ Ｍ食塩中，ｐＨ9.O で反復した．基質混合物を固定化抗体と24時間（アミド）ま たは３時間（エステル）インキュベートし，ついで基質溶液を吸引し，分析まで 凍結した． d）生成物の形成について反応混合物の分析： 反応混合物を，生成物の形成について，ＴＬＣ（ダンシル化された基質）また はＨＰＬＣ（アセチル化された基質）のいずれかによって分析した． ｉ）ＴＬＣ：基質混合物をエッペンドルフ遠沈管中で短時間遠心分離してアフ ィニティービーズの持込みを防止した．サンプルをＴＬＣプレート [ＨＰＴＬＣ シリカゲル60プレコートプレート（E.Merck，Darmstadt）濃縮ゾーン付き] にス ポットし，90％アセトン，８％メタノール，および２％トリエチルアミン（容量 ％）の溶媒系で展開した．風乾したのち，プレートにイソプロパノール中20％エ タノールアミンに浸漬し，再び風乾した．蛍光スポットを暗室で紫外線を照射し て可視化した．生成物の実質的に非触媒形成が，とくにｐＨ9.0 でのエステル基 質の場合に認められる場合があり，陽性の判定は主観的に行われた．陽性の結果 は，ＴＬＣ生成物スポットの強度が，基質を含むが抗体は含まない反応混合物の レーンの生成物スポットより実質的に大きいと判断された結果とした． ii）ＨＰＬＣ：基質混合物をエッペンドルフ遠沈管中で短時間遠心分離してア フィニティービーズＧがＨＰＬＣ系に持込まれることを防止した．分析用の逆相 カラム（Vydac 218TP54 C18 ）を用いて，Waters HPLC 系で基質と生成物を分離 した．被検物質は20分で85％水／15％アセトニトリルから28％水／72％アセトニ トリルの直線勾配を用いて分離した．ＨＰＬＣ溶媒にはすべて0.1 ％のＴＦＡを 含有させた．生成物は，Waters 490多重波長検出器を用い，通常は21 5および／ または260 nmにセットして分光測光法により検出および定量を行った．生成物の ピーク面積は定量的で，実質的に変動した． d）さらにスクリーニングする抗体の選択： 多くの抗体がすくなくとも１種の基質に対して活性の可能性を示した．多数の 実験で活性を示した抗体についてさらに追跡することを決定した．この決定を容 易にするために，表IIIを作成した．抗体は，陽性の総数（表に示した）と，与 えられた種類の反応（たとえばエシテル分解）に対する一貫した陽性結果または 与えられたｐＨに対する一致性の両者によって選択した．さらに検討を継続する ために選択された８種の抗体には星印を付した． 例18−ＮＡ−１抗体の触媒活性の二次スクリーニング 触媒活性についての初期スクリーニングから選択された抗体をさらに検討する ために，初期スクリーニングで確認されたタンパク質を個別に腹水中で増殖させ て精製した．８種の選ばれた細胞系中の２種は残念ながら，さらに試験するため の抗体を産生できなかった（16Ｅ9 および2 Ｅ1 ）．最初次の４種の抗体が調製 されスクリーニングされた．125 ＮＡ-1Ｋ-13 Ｄ11-2Ｆ9 （13Ｄ11），125 ＮＡ -1Ｋ-14 Ａ8-1 Ａ2 （14Ａ8 ），125 ＮＡ-1Ｋ-23 Ｈ5-2 Ｃ7 （23Ｈ5 ），およ び125 ＮＡ-1Ｋ-11 ＤI0-4Ｆ6 （11Ｄ10）である．アッセイは初期スクリーニン グと同じ緩衝系およびｐＨ値で実施したが，抗体は個別に試験し，固定化しない で溶液中に遊離させた． モノクローナル抗体（反応液中13.5〜15.0μＭ）を最初に37℃，ｐＨ7.0 （25 ｍＭのＨＥＰＥＳ，140 ｍＭ食塩，0.01％ナトリウムアジド）において９（500 μＭ），10（500 μＭ），13（1.0 ｍＭ），14（1.0 ｍＭ），15（1.0 ｍＭ）， および16（1.0 ｍＭ）で個別にアッセイした．上述のようにダンシル基質はＴＬ Ｃで，アセチル基質はＨＰＬＣでスクリーニングした．９または10に対しては３ 日後もバックグランド以上の加水分解を示した抗体はなかった．一つの抗体，11 Ｄ10は15および16に対してある程度の活性を示したが，この活性は６によって阻 害されず，この活性は夾雑するエステル分解酵素によることが示唆された．ハプ テン１に極めて類似する化合物６は，ハプテンベースの阻害剤４および５がその 時点で利用できなかったので，使用された．４日後には，13Ｄ11単独が10に対し て活性を示した．９に対して活性を示す抗体はなかった． ４種のＮＡ−１抗体は，４種のアミド基質９，10，13および14に対して，ｐＨ 5.0 ，7.0および8.8 で再スクリーニングした．抗体結合部位濃度は13Ｄ11＝14. 5 μＭ，14Ａ8 ＝14.8μＭ，23Ｈ5 ＝15.0μＭ，および11Ｄ10＝6.8 μＭであっ た．反応は室温で進行させ，生成物の形成は13または16日に測定した．16日後， 13または14に対しては，いずれのｐＨでも，いずれの抗体も活性を示さなかった ．13Ｄ11のみが，10に対してｐＨ8.8 でのみ活性を示した（13日）．９に対して はいずれのｐＨでも活性を示す抗体はなかった（13日）． 抗体13Ｄ11（14.5μＭ）は，63μＭ（ＲＴ−２ハプテン） （ＤＬ混合物）の 不存在下または存在下に，10に対して（名目上500 μＭ）活性を再スクリーニン グされた．活性は３，ＲＴ−２によって約50％阻害されると評価されたが，CHES 緩衝液のトリスへの変更を試みたところ，13Ｄ11による10の加水分解の阻害は見 出されなかった．抗体23Ｈ5 を13Ｄ11とともに再スクリーニングしたが，10に対 する活性は示さなかった． この時点までに，13Ｄ11はプロテインＡおよびＤＥＡＥクロマトグラフィーに よって精製されていた．10に対する活性が夾雑酵素によるものか否かを決定する ために，13Ｄ11をさらにMono Qカラム（Pharmacia ）上ＦＰＬＣによってさらに 精製した．この抗体は６によって阻害可能な10に対する活性を維持していたが， 一部の加水分解は対照中にも認められた．その後の実験では対照の加水分解は見 られず，これが多分，対照の実験室汚染によることを指示している． 13Ｄ11による10加水分解の速度をWatersのＨＰＬＣシステムを用いて定量する 試みは失敗した．単一の生成物ピークに代わりに，多くの小ピークが検出された ．基質10はその貧弱な分子吸光係数（ε₃₂₈ ＝2100Ｍ^-1cm^-1）ではなく，その強 力な蛍光に基づく早期検出のために設計された．それをＨＰＬＣで測定した．多 重ピークの存在は非極性ダンシル基のＨＰＬＣ条件下における異常な挙動による ものと考えられる． 初期のスクリーニングから選択された最後の２つの試験されていなかった抗体 を，腹水で増殖させて，精製し，個別にアッセイした．125 ＮＡ-1Ｋ-11 Ｆ3-1 Ａ8 （11Ｆ3 ），および125 ＮＡ-1Ｋ-13 Ｆ12-2Ｆ3 （13Ｆ12）と命名された抗 体は，ｐＨ5.0 （100 ｍＭ酢酸ナトリウム，140 ｍＭ食塩，0.01％ナトリウムア ジド），ｐＨ7.0 （100 ｍＭのＨＥＰＥＳ，140 ｍＭ食塩，0.01％ナトリウムア ジド），およびｐＨ9.0 （100 ｍＭトリス，140 ｍＭ食塩，0.01％ナトリウムア ジド）においてアッセイした．各抗体をダンシル化基質９，10，11，および12（ ×ｐＨ値＝12アッセイ）でアッセイした．基質初期濃度は200 μＭ，抗体濃度は 18.4μＭ（11Ｆ3 ）および3.4 （13Ｆ12）とした．エステル加水分解アッセイの 結果は，ｐＨ9.0 で３時間後またはｐＨ7.0 で24時間後および５日後には，いず れの抗体もバックグランド以上の活性を示さなかった．ｐＨ5.0 で24時間後には 明白な活性はなかったが，ｐＨ5.0 で５日後には11Ｆ3による12の一部の加水分 解が認められた．いずれの抗体も，ｐＨ5.0 ，7.0 または9.0 で６日後にアミド 10に対して活性を示さなかったが，11Ｆ3 はｐＨ5.0 ，9.0 および多分7.0 で６ 日後に９に対して活性を示した． 13Ｄ11の第二の腹水プレパレーションは精製して10に対する活性を検定した． 最初はこの新しい抗体プレパレーションを用いてｐＨ9.0 で10の加水分解は認め られなかった．抗体は誤ってＰＢＳ（10.0ｍＭリン酸塩）中に透析されたことが 分かった．リン酸塩による阻害の可能性に対する注意から，ＰＢＳは四面体リン ハプテン基に対して産生される抗体の触媒活性のアッセイには通常回避される． リン酸塩をすべて除去するために，10ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ7.5 ，140 ｍＭ食 塩，0.01％ナトリウムアジドへの透析後，1Ｄ11を再アッセイに付した（トリス 検定緩衝液中ｐＨ9.0 において）．今回は，13Ｄ11を10と７日間インキュベート して，加水分解活性が認められた．この抗体はＤエステル12とも再アッセイに付 した．ｐＨ9.0 で，バックグランド加水分解を越える（比較的速い）活性は見ら れなかった． 例19−抗ＷＨ−２抗体の触媒活性の部分スクリーニング ＷＨ−２ハプテン（２）に対して誘導された抗体の初期スクリーニングは単一 のｐＨ（7.0 ）で，利用できた基質のサブセットのみについて実施した．96ウエ ルフィルタープレートを用いる初期スクリーニングの一般的方法は上述した．計 48のハイブリドーマ上清（各４ml）を一夜４℃で抗−マウス抗体ビーズ （Calbiochem，上述）20μl と振盪した．緩衝液で洗浄後，ビーズをダンシル化 エステル11および12の溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液，ｐＨ7.0 中各約100 μＭ）25μ l で洗浄した．ビーズはついでこの基質混合物50μl と37℃で１時間インキュベ ートした．反応混合物を上述のようにＴＬＣプレート上で分析し，蛍光性のダン シル化生成物の形成を紫外線照射によって検出した．バックグランド生成物の形 成はすべてのレーンで検出されたが，触媒活性は明白ではなかった．ビーズを緩 衝液で洗浄後，第二のスクリーニング（同一のビーズで）を，アミド９（106 μ Ｍ）および10（100 μＭ）（ｐＨ7.0 で総容量50μl ）の混合物について実施し た．37℃で６時間後のＴＬＣ分析では，すべてのレーンで薄いバックグランドを 示したが，いずれの抗体についても触媒活性は認められなかった． 例20−抗ＲＴ−２抗体の触媒活性の部分スクリーニング ＲＴ−２ハプテン（３）に対して誘導された抗体の初期スクリーニングは単一 のｐＨ（7.0 ）で，利用できた基質のサブセットのみについて実施した．96ウエ ルフィルタープレートを用いる初期スクリーニングの一般的方法は上述した．計 11のハイブリドーマ上清（各４ml）を一夜４℃で抗−マウス抗体ビーズ（ヤギ抗 −マウス抗体でコートしたAffi-gelビーズ）20μl と振盪した．混合物を４℃に ２週間保存したのち，ビーズを上述のように96ウエルフィルタープレートに移し ，リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で洗浄した．ＰＢＳはツイーン界面活性剤（３ 回洗浄）およびＭＴＥＮ，ｐＨ7.0 （３回洗浄）を含有する．ＭＴＥＮ緩衝液は 50 ｍＭのＭＥＳ，25ｍＭトリス，25ｍＭエタノールアミン，100 ｍＭ食塩から構成 される． ａ）ダンシル化Ｄエステル：ビーズは２×50μl の18μＭダンシル化Ｄエステ ル12（ＭＴＥＮ緩衝液，ｐＨ7.0 ）で洗浄した．ビーズ（および対照ウエル）を 50μl の18μＭ12と25℃で12時間インキュベートした．５および12時間後，サン プルをウエルから取り出し，カルボン酸生成物の出現をＴＬＣでスクリーニング した．５時間後には生成物は認められず，12時間後には生成物が対照も含めてす べてのレーンに見られた． ｂ）ダンシル化Ｌエステル：Ｄエステルと12時間インキュベートしたのち，ビ ーズをさらに10時間４℃に保存し，ついで基質溶液を真空ろ過によって除去し， ビーズを２×50μl のダンシル化Ｌエステル11（24μＭ）で洗浄した．ビーズお よび対照ウエルを50μl の24μＭ11と25℃で13時間インキュベートした．13時間 後，生成物の形成はＴＬＣで，対照を含めたすべての反応混合物中に認められた ．触媒作用は明瞭でなかった． ｃ）ダンシルＤＬアミド：11と25℃で13時間インキュベートしたのち，ビーズ をろ過し，乾燥し，ＭＴＥＮ，ｐＨ7.0 （３×200 μl ）で洗浄し．アミド加水 分解のスクリーニング用に準備した．ＤおよびＬアミド（９および10）も混合物 をＭＴＥＮ緩衝液（ｐＨ7.0 ）中に調製した．この溶液は２つの可能性のある基 質をそれぞれ50μＭ含有した．ビーズおよび対照ウエルを９／10混合物（２×50 μl ）で洗浄し，50μl の混合物と25℃で15時間インキュベートした．15時間後 ，抗体および対照のすべてのレーンにＴＬＣによりバックグランド生成物が可視 化された．対照の場合より明白な生成物スポットを生じた抗体はなかった． ＲＴ−２抗体には，４種のダンシル化基質９〜12とｐＨ7.0 で活性を示すもの はなかった． 触媒抗体の特性 例21−13Ｄ11触媒抗体の検証および特性 a） 速度論的特性：抗体は，0.01％ｎナトリウムアジドを含むＭＴＥＮ緩衝液 （50ｍＭのＭＥＳ，25ｍＭトリス，25ｍＭエタノールアミン，100 ｍＭ食塩）中 ｐＨ9.0 ，37.0℃でルーチンに検定した（Morrison,J.F．& Ellis,K.J.: Methods Enzymol.,1982,87,405）．この緩衝液のｐＨに対する温度の影響を考慮 した． ダンシル化基質10の加水分解を，溶媒Ａは25ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ6.5 ） - アセトニトリル- メタノール（70:20:10，v/v/v ），溶媒Ｂは25ｍＭ酢酸ナト リウム（ｐＨ6.5 ）- アセトニトリル- メタノール（10:45:45，v/v v ）とした 以外は，上述（例17-d-i）と同様にＨＰＬＣで定量した．溶出は２つの直線勾配 ，０〜50％Ｂ（０〜20分）から50〜100 ％Ｂ（20〜27分），ついで100 ％Ｂ（27 〜32分）とした． 13Ｄ11の2bの加水分解の速度論パラメーターは初期基質濃度（57〜1000μＭ） と速度（一般に６日後）をミカエリス−メントンの式の触媒濃度は無視できる形 式に適用して決定した． Ｖ/[Ｅ_t ] ＝ (Ｋ_cat [Ｓ] ) / ( [Ｓ] ＋[Ｅ_t ] ＋Ｋ_m ) (G.D.Smith ら, Anal.Biochem.,1977,79,643 ) 抗体結合部位濃度は一般的に13μＭであった．記録した速度論パラメーターはす べて，緩衝液触媒基質加水分解によって補正した． ハプテンＫ_i は13Ｄ11の2bの加水分解速度に対する１ｂまたは１ｃの濃度の影 響を定量して決定した．固定した抗体および基質濃度において得られた速度を式 にあてはめると， V _i /V₀＝(2[Ab]−[l] −K _i’＋ {([l]＋K _i ’−2[Ab])² ＋4K_i '2[Ab] }^0.5)/4[Ab] 式中，V _i およびV₀はそれぞれハプテンの存在下および不存在下の速度であり ，２[Ab] は抗体結合部位の総濃度であり，[l] はハプテン濃度であり，K _i ’ ＝K _i /(1 ＋[Ｓ]/K _m であり，K _i は阻害定数である（S.Cha，Biochem.Pharma col.,1975,24,2177）． セルイン試験（M.J.Selwyn，Biochim.Biophys,Acta，1965，105，193）では， ＭＴＥＮ緩衝液，ｐＨ9.0 ，37.0℃，少なくとも６日間で抗体の不活性化は示さ なかった．ｐＨ9.0 における加水分解速度に対する基質濃度の影響の研究は，13 Ｄ11のＫ_cat ＝1.65( ±0.24) ×10^-7sec ^-1，K _m ＝432(±132)μＭであること を示している．一般には反応中の少なくとも１回の基質のターンオーバーが測定 されるが，長期のインキュベーションは13Ｄ11が実際に触媒であることを示して いる． 10には２つのアミド結合があるので，内部アミド結合または両アミド結合の多 少の加水分解が所望の生成物の見掛けの形成速度を変化させることも考えられる ところではある．しかしながら，記載した速度論実験ではわずかな割合の基質が 加水分解に関与したのみであり，所望の生成物のＨＰＬＣピーク面積の二重加水 分解による枯渇は殆どまたは全く起こっていない．実際，別のアミド結合が切断 された証拠はＨＰＬＣによっては認められない． ｂ）ｐＨの研究：速度論的特性から，13Ｄ11触媒による10の加水分解での至適 ｐＨは9.5 であることが分かった（データは示していない）．さらに高いｐＨで は，比較的長い反応時間では（通常３〜８日），13Ｄ11は変性してしまう可能性 がある． c） ハプテン阻害：対照実験で加水分解活性が夾雑したプロテアーゼによるも のではないことが証明された．ハプテンエナンチオーマー４および５の一方のみ が，多分Ｌ異性体が13Ｄ11を阻害したと考えられる（Ｌハプテンは空間的にＤア ミド基質に相当する）．阻害定数Ｋ_i はＨＰＬＣアッセイにより，14.0( ±1.6) μＭと測定された． d） 基質特異性：13Ｄ11の基質特異性は，ダンシル化アミド９および10，ダン シル化エステル11および12，アセチル化アミド13および14，ならびにアセチル化 エステル15および16に対するその活性を調べてより厳格に決定した．13Ｄ11のダ ンシル化またはアセチル化エステル（45μＭ〜1.0 μＭ）でのエステル分解活性 を，ＭＴＥＮ，0.1 ｍＭのＥＤＴＡ，0.1 ｍＭのＰＭＳＦ，0.1 ｍＭナトリウム アジドおよび13Ｄ11（７〜14μＭ）を含有するアッセイ混合物中25℃で試験した ．インキュベーション混合物から４時間毎にアリコートを採取し，分析まで氷中 に保持した．ダンシル化エステルはＴＬＣで分析し，一方アセチル化エステルは ＨＰＬＣ分析に付した．結果は，エステル12，15および16に対してはバックグラ ンド以上の触媒加水分解は存在しなかった．生成物の形成はダンシル化エステル 11で認められたが，この活性ハハプテン５で阻害されなかった．観察されたエス テラーゼ活性は抗体プレパレーション中に夾雑した痕跡の酵素によるものかもし れない． 13Ｄ11のアミダーゼ活性は同様に，上述の一つと同じ緩衝系を用いて，13Ｄ11 （17μＭ）およびアセチル化アミド13または14（0.5 〜1.0 μＭ）の存在下に試 験した．ＨＰＬＣ分析では25℃で３日のインキュベーション後にも生成物の形成 は認められなかった．13Ｄ11がダンシル化アミド９および10を識別する能力を， 加水分解生成物の形成のＴＬＣによる測定によって検討した．上述の緩衝系中ア ミド９または10いずれか150 μＭ，30μＭの13Ｄ11を含有し，ハプテン５（0,5 ｍＭ）添加または添加しない反応サンプルを25℃で５日のインキュベーション後 にアッセイした．分析により，アミド10では強力な蛍光を示す生成物が認められ たのに対し，９では生成物は見られなかった．アミド10に対する13Ｄ11の嗜好性 ならびにそのアミダーゼ活性のリン酸塩に推定されるハプテン５による阻害がさ らに確認された．すなわち，触媒抗体の活性には，免疫処置の間に存在したアル キルリンカーを要求し，既知の天然のタンパク分解酵素とは反対の立体特異性を 有する． ｅ）他の対照実験：13Ｄ11 ＩｇＧ分子の触媒活性の検討における重要な対照 はそのＦab’フラグメントのハプテンおよび基質結合能の維持である．したがっ て13Ｄ11のアミダーゼ活性（そのＩｇＧ分子）および13Ｄ11Ｆab’フラグメント を比較した．反応混合物にはＭＴＥＮ，１ｍＭのＥＤＴＡ，0.1 ｍＭのＰＭＳＦ ,0.01％ナトリウムアジド，150 μＭのダンシル化アミド9 もしくは10，30μＭ の13Ｄ11（ＩｇＧ）またはＦab’を含有させ，ハプテン５（0,5 ｍＭ）添加また は添加しなかった．３日後（８日後に再度）に行ったＴＬＣ分析では，ＩｇＧお よびＦab’の両者とダンシル化アミド10の場合，陽性の結果を示した．両分子に よって示されたアミダーゼ活性はリン酸塩ハプテン５によって阻害された．Ｆab ’フラグメントのエステラーゼ活性も，100 μＭのエステル11または12，ならび に７μＭの13Ｄ11（Ｆab’）を含む上記緩衝系で検討した．アリコートを様々な 時点で採取してＴＬＣで分析した．ダンシル化エステル11および12の加水分解（ バックグランド以上）は観察されなかった．抗体溶液中の夾雑酵素はＦab’フラ グメントの精製時に除去されたのかもしれない． 同等に活性の13Ｄ11が２つの異なる腹水のバッチから精製された．13Ｄ11の徹 底的な精製を行った．脂質抽出および硫酸アンモニウム沈殿ついでプロテインＡ ，ＤＥＡＥ，Mono Qおよび最後にAlkyl Superose（Pharmacia，Piscataway,NJ） 上カラムクロマトグラフィーの標準操作を用いてモノクローナル抗体を腹水から 精製した．最後に，既知のプロテアーゼの９つの共通の阻害剤を，抗体触媒反応 に対するそれらの効果が完全に消失するのに十分な濃度で試験した．アミド分解 活性は，ＰＭＳＦ，ＥＤＴＡ，アプロチニン，アンチパイン，ロイペプチンおよ びホスホラミドンによって本質的に影響されなかった．亜鉛アミノペプチダーゼ 阻害剤ベスタチン，アスパラギンプロテアーゼ阻害剤ペプスタチン，およびシス テインプロテアーゼの非可逆性阻害剤，Ｅ-64 では部分的な阻害が見られた．抗 体結合部位との非特異的相互作用によるものと思われる． f） 緩衝液の影響：正常なアッセイ条件下に，抗体の不存在下，10の緩徐な分 解が観察された．10（100 μＭ）を様々な希釈度のアッセイ緩衝液中でインキュ ベーションしたところ，バックグランド加水分解の速度は緩衝液の濃度に直線的 に依存し，緩衝液の濃度が０に近づくと実質的に消失した（図14，下の線）．こ れは，バックグランド加水分解が，ｐＨ9.0 および37.0℃における10の固有の不 安定性というよりも緩衝液の溶質にほぼ完全に依存することを指示あしている． 緩衝液の加水分解性は抗体の触媒作用には影響を与えなかった．抗体（13μＭ） と基質（100 μＭ）をある範囲の緩衝液の希釈度で反応させて得られた緩衝液希 釈度対生成物形成のプロットは，基質単独の場合と平行な直線を与えた（図14， 上の線）．緩衝液が基質の加水分解を触媒できるが，抗体の触媒作用には影響し ないという観察は抗体触媒の機構における律速段階は求核試薬またはプロトンド ナーとして働く緩衝液によっては加速できないことを示している． 10の加水分解の緩衝液濃度に対する直線的依存性のさらに厳格な研究が，緩衝 液の０濃度における非触媒加水分解速度を決定するために実施された．一定の基 質濃度（100 μＭ）を７つの異なる一連の緩衝液希釈度中でインキュベートし， 9.0 日後に形成された生成物の量を測定した．速度の０緩衝液濃度への線状外挿 法では（データは示していない）ｐＨ9.0 および37.0℃において，非触媒速度， 1.25（±0.23）×10 ⁹sec ^-1が得られ，13Ｄ11の触媒性の加速（Ｋ_cat ／Ｋ_{unca t} ）は132 であることを示した．一級アミド10の半減期は溶液中で遊離の 場合の17年から，抗体13Ｄ11に結合した場合，42日に低下する．相当するメチル エステル16の非触媒速度は同様に，ｐＨ9.0 および37℃において，1.06(±0.06) ×10^-5sec ^-1と測定された．10と16の間の非触媒加水分解速度の測定値の差はも っともらしく，酢酸メチル（J.M.Kovachら，J.Am.Chem.Soc.,1980,102,1991）と アセトアミド（J.Packerら，J.Chem.Soc.,1955,2601 ）の塩基加水分解速度のｐ Ｈ9.0および37℃に外挿された値の予測された差とよく一致する． 一級アミドと典型的なペプチド結合に見出される二級アミドの加水分解のため の活性化のギブスの自由エネルギーは類似しているが，構造反応性相関は，一級 アミドが内部ペプチド結合よりも立体的理由である程度反応性が高いと思われる （H.Morawetz & P.S.Otali：J.Am.Chem.Soc.1963，85，463 ）．10のＫ_uncat の 本発明者らの実験的測定値は以前の推定値およびｐＨ7.0 および25℃におけるペ プチド結合の加水分解の測定値（D.Kahn & W.C.Still，J.Am.Chem.Soc.,1988,11 0,7529）に近似した加水分解速度である． アミド分解触媒抗体の治療的使用 例22−治療用アミド分解触媒抗体の特異的組織標的化 ａ）二特異性分子の製造：一級アミドを加水分解できる触媒抗体は，組織標的 たとえば腫瘍に特異的に向けられた場合に，さらに効果が増強されることが考え られる．このような触媒抗体は，腫瘍のような組織によって生成されまたは消費 されその分解が疾患状態の処置に有効性をもたらす一級アミドを分解することに なる．一部の治療的に重要なアミドは発明の背景の項に記載した．抗体がその組 織標的に特異的に結合できる分子，たとえば，その抗原，腫瘍関連抗原を認識す るモノクローナル抗体に接合させる．接合はよく知られた多くの化学架橋剤のい ずれかにより，また標的化剤がタンパク質である場合にはＤＮＡ技術によって行 われる．後者の戦略の場合，触媒抗体（またはそのフラグメント）および標的化 剤（たとえば抗腫瘍抗体）を単一の融合タンパク質として発現させる．化学架橋 剤および融合タンパク質の発生方法は多く知られていて，本技術分野の熟練者に は繁雑な実験を行うことなく実行できる．アルギナーゼ活性を有する触媒抗体を 白血病の処置に使用するような場合には，抗体を治療的有効性のために特定の部 位に向ける必要はない． ｂ）治療用二特異性分子の投与：組織標的化分子たとえば抗腫瘍抗体および治 療標的からの一級アミド希有合を加水分解できる触媒抗体からなる二特異性分子 は，その分子が破壊されないような方法で（たとえば，静脈内注射は経口投与よ り好ましい）患者に投与される．投与量および投与頻度は，とくに他の因子，疾 患の性質，疾患の重症度，患者の体重，年齢および状態によって決定される．投 与量および投与頻度はとくに繁雑な実験をしないでも，本技術分野の熟練者には 決定できるものである． 以上，本発明の好ましい実施態様を詳細に説明したが，本発明は特許請求の範 囲によって定義される．上記の説明中に掲げられた特定の細部には本発明の精神 および範囲から逸脱することなく多くの改変が可能なことは自明であり，これら の記載によって本発明は限定されるものではないことを理解すべきである．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 207/327 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 5/04 Ｃ０７Ｋ 5/04 8517−4Ｈ 7/04 7/04 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マーチン，マーク ティー. アメリカ合衆国 20878 メリーランド州 ゲイサースバーグ，プレイリー ローズ レーン ９ (72)発明者 ホング，ウオンピョ アメリカ合衆国 19707 デラウェア州ホ ッケシン，フォックスビュー サークル 16

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式 （式中，Ｙはポリペプチドであり， Ｒ₁ はＹのＮ末端に結合し，水素，または分岐状もしくは直鎖状，置換もしく は非置換のＣ_1-21アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり， Ｒ₂ は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり， Ｘは である）の化合物 ２．ポリペプチドは１〜20個の天然に存在するアミノ酸から構成される「請求 項１」の化合物 ３．ポリペプチドはＣ末端カルボキサミドを含有するタンパク質のポリペプチ ド配列から構成されるがＣ末端アミノ酸は除かれている配列である「請求項１」 の化合物 ４．側鎖はフェニルアラニンの側鎖である「請求項１」の化合物 ５．Ｒ₁ は （式中，ｎは1 〜21の整数である）である「請求項１」の化合物 ６．Ｒ₁ が担体分子に結合している「請求項１」の化合物からなる免疫原 ７．式 Ｒ-Ｙ-[(ＣＨ₂)_n-Ｘ]_m (II) （式中，Ｒは水素，または分岐状もしくは直鎖状，置換もしくは非置換のＣ_1-21 アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり， Ｙはポリペプチドであり， -(ＣＨ₂)_n - Ｘ基は上記ポリペプチドのアスパラギンまたはグルタミンの側鎖 を置換し， ｎは１または２であり， ｍは１以上の整数であるが，上記ポリペプチド中のアスパラギンおよびグルタ ミンアミノ酸の総数以下であり， Ｘは である）の化合物 ８．ｍは１である「請求項７」の化合物 ９．ポリペプチドは１〜20個の天然に存在するアミノ酸から構成される「請求 項７」の化合物 １０．Ｒ₁ は （式中，ｎは1 〜21の整数である）である「請求項７」の化合物 １１．Ｒ₁ が担体分子に結合している「請求項７」の化合物からなる免疫原 １２．式 （式中，Ｒ₁ は分岐状もしくは直鎖状，置換もしくは非置換のＣ_1-21アルキル， アルキレンもしくはアルキン基であり， Ｒ₂ は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり， Ｘは である）の化合物 １３．Ｒ₁ は （式中，ｎは1 〜21の整数である）である「請求項１２」の化合物 １４．側鎖はフェニルアラニンの側鎖である「請求項１２または１３」の化合 物 １５．Ｒ₁ が担体分子に結合している「請求項１２」の化合物からなる免疫原 １６．一級アミド結合の加水分解速度を増大できる抗体 １７．一級アミド結合の形成速度を増大できる抗体 １８．抗体は （ｉ）抗体誘導ドメインの遺伝子ライブラリーの発生， （ii）上記ドメインのコード配列のファージ発現ベクターへの挿入，および （iii） 上記触媒抗体の単離， の工程からなる方法によって製造される「請求項１６または１７」の抗体 １９．抗体は （ｉ）加水分解反応の反応試剤，反応中間体または生成物の類縁体からなる組 成物による動物の免疫処置， （ii）上記動物からの抗体産生リンパ球の摘出，ならびに （iii） リンパ球の骨髄腫細胞との融合およびそれによる抗体産生ハイブリド ーマ細胞の製造 の工程からなる方法によって製造される「請求項１６または１７」の抗体 ２０．一級アミド結合はポリペプチド中に含有されている「請求項１６または １７」の抗体 ２１．一級アミド結合はＣ−末端カルボキサミド中に含有されている「請求項 １６または１７」の抗体 ２２．一級アミド結合はアルギニンまたはグルタミンの側鎖中に含有されてい る「請求項１６または１７」の抗体 ２３．一級アミド結合はカルシトニン中に含有されている「請求項１６または １７」の抗体 ２４．一級アミド結合はカルシトニン遺伝子関連ペプチド中に含有されている 「請求項１６または１７」の抗体 ２５．一級アミド結合はビッグガストリン中に含有されている「請求項１６ま たは１７」の抗体 ２６．一級アミド結合はボンベスチン様ペプチド中に含有されている「請求項 １６または１７」の抗体 ２７．（ｉ）ハプテンに対する抗体の作成 （ii）上記抗体の固定化 （iii） 上記抗体に対する基質の添加，および （iv）上記基質の生成物への変換を触媒できる抗体の同定 からなる方法によって得られる，一級アミド結合の加水分解または形成の速度を 増大できる抗体 ２８．方法は工程（ｉ）ののちに （ｉ）上記抗体の濃縮，および （ii）上記抗体の精製 を行う「請求項２７」の抗体 ２９．一級アミド結合の加水分解速度を増大できる抗体を個体に投与すること からなるこのような治療を必要とする個体の治療方法 ３０．一級アミド結合の形成速度を増大できる抗体を個体に投与することから なるこのような治療を必要とする個体の治療方法