KR20010052713A - 치료용 및 진단용 도메인 1 ｂ２ｇｐｉ 폴리펩티드 및그것의 사용방법 - Google Patents

치료용 및 진단용 도메인 1 ｂ２ｇｐｉ 폴리펩티드 및그것의 사용방법 Download PDF

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KR20010052713A
KR20010052713A KR1020007013980A KR20007013980A KR20010052713A KR 20010052713 A KR20010052713 A KR 20010052713A KR 1020007013980 A KR1020007013980 A KR 1020007013980A KR 20007013980 A KR20007013980 A KR 20007013980A KR 20010052713 A KR20010052713 A KR 20010052713A
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gpi
polypeptide
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antibody
antibodies
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KR1020007013980A
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마퀴스데이비드엠.
이버슨길버트엠.
빅토리아에드워드제이.
존스데이비드에스.
린닉매튜디.
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와이즈먼 앤드루
라 졸라 파마슈티칼 컴파니
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Abstract

본 발명은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드, 이 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드, 이 폴리펩티드의 유사체, 및 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드와 유사체를 이용하는 방법을 제공한다. β2GPI의 도메인 1은 항-카디오리핀(β2GPI-의존성 항인지질) 항체에 결합하는 것으로 보여져 왔는데, 이것은 혈전증 및 유산과 같은 몇몇의 병리학과 연관된다. 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 샘플내의 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 검출하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 본발명은 이 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 이용하여 내성을 유도하는 방법을 제공한다.

Description

치료용 및 진단용 도메인 1 Ｂ２ＧＰＩ 폴리펩티드 및 그것의 사용방법{THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC DOMAIN 1 B2GPI POLYPEPTIDES AND METHODS OF USING SAME}
＜110＞ MARQUIS, DAVID M.
IVERSON, GILBERT M.
VICTORIA, EDWARD J.
JONES, DAVID S.
LINNIK, MATTHEW D.
＜120＞ THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC DOMAIN 1 B2GPI POLYPEPTIDES AND
METHODS OF USING SAME
＜130＞ 1
＜150＞ US 60/088,656
＜151＞ 1998-06-09
＜150＞ US 60/103,088
＜151＞ 1998-10-05
＜150＞ US 09/328,199
＜151＞ 1999-06-08
＜160＞ 30
＜170＞ KopatentIn 1.71
＜210＞ 1
＜211＞ 978
＜212＞ DNA
＜213＞ Homo sapiens
＜220＞
＜221＞ CDS
＜222＞ (1)..(978)
＜400＞ 1
gga cgg acc tgt ccc aag cca gat gat tta cca ttt tcc aca gtg gtc 48
Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val
1 5 10 15
ccg tta aaa aca ttc tat gag cca gga gaa gag att acg tat tcc tgc 96
Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
20 25 30
aag ccg ggc tat gtg tcc cga gga ggg atg aga aag ttt atc tgc cct 144
Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
35 40 45
ctc aca gga ctg tgg ccc atc aac act ctg aaa tgt aca ccc aga gta 192
Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val
50 55 60
tgt cct ttt gct gga atc tta gaa aat gga gcc gta cgc tat acg act 240
Cys Pro Phe Ala Gly Ile Leu Glu Asn Gly Ala Val Arg Tyr Thr Thr
65 70 75 80
ttt gaa tat ccc aac acg atc agt ttt tct tgt aac act ggg ttt tat 288
Phe Glu Tyr Pro Asn Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Phe Tyr
85 90 95
ctg aat ggc gct gat tct gcc aag tgc act gag gaa gga aaa tgg agc 336
Leu Asn Gly Ala Asp Ser Ala Lys Cys Thr Glu Glu Gly Lys Trp Ser
100 105 110
ccg gag ctt cct gtc tgt gct ccc atc atc tgc cct cca cca tcc ata 384
Pro Glu Leu Pro Val Cys Ala Pro Ile Ile Cys Pro Pro Pro Ser Ile
115 120 125
cct acg ttt gca aca ctt cgt gtt tat aag cca tca gct gga aac aat 432
Pro Thr Phe Ala Thr Leu Arg Val Tyr Lys Pro Ser Ala Gly Asn Asn
130 135 140
tcc ctc tat cgg gac aca gca gtt ttt gaa tgt ttg cca caa cat gcg 480
Ser Leu Tyr Arg Asp Thr Ala Val Phe Glu Cys Leu Pro Gln His Ala
145 150 155 160
atg ttt gga aat gat aca att acc tgc acg aca cat gga aat tgg act 528
Met Phe Gly Asn Asp Thr Ile Thr Cys Thr Thr His Gly Asn Trp Thr
165 170 175
aaa tta cca gaa tgc agg gaa gta aaa tgc cca ttc cca tca aga cca 576
Lys Leu Pro Glu Cys Arg Glu Val Lys Cys Pro Phe Pro Ser Arg Pro
180 185 190
gac aat gga ttt gtg aac tat cct gca aaa cca aca ctt tat tac aag 624
Asp Asn Gly Phe Val Asn Tyr Pro Ala Lys Pro Thr Leu Tyr Tyr Lys
195 200 205
gat aaa gcc aca ttt ggc tgc cat gat gga tat tct ctg gat ggc ccg 672
Asp Lys Ala Thr Phe Gly Cys His Asp Gly Tyr Ser Leu Asp Gly Pro
210 215 220
gaa gaa ata gaa tgt acc aaa ctg gga aac tgg tct gcc atg cca agt 720
Glu Glu Ile Glu Cys Thr Lys Leu Gly Asn Trp Ser Ala Met Pro Ser
225 230 235 240
tgt aaa gca tct tgt aaa tta cct gtg aaa aaa gcc act gtg gtg tac 768
Cys Lys Ala Ser Cys Lys Leu Pro Val Lys Lys Ala Thr Val Val Tyr
245 250 255
caa gga gag aga gta aag att cag gaa aaa ttt aag aat gga atg cta 816
Gln Gly Glu Arg Val Lys Ile Gln Glu Lys Phe Lys Asn Gly Met Leu
260 265 270
cat ggt gat aaa gtt tct ttc ttc tgc aaa aat aag gaa aag aag tgt 864
His Gly Asp Lys Val Ser Phe Phe Cys Lys Asn Lys Glu Lys Lys Cys
275 280 285
agc tat aca gag gat gct cag tgt ata gat ggc act atc gaa gtc ccc 912
Ser Tyr Thr Glu Asp Ala Gln Cys Ile Asp Gly Thr Ile Glu Val Pro
290 295 300
aaa tgc ttc aag gaa cac agt tct ctg gct ttt tgg aaa act gat gca 960
Lys Cys Phe Lys Glu His Ser Ser Leu Ala Phe Trp Lys Thr Asp Ala
305 310 315 320
tcc gat gta aag cca tgc 978
Ser Asp Val Lys Pro Cys
325
＜210＞ 2
＜211＞ 326
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 2
Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val
1 5 10 15
Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
20 25 30
Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
35 40 45
Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Pro Glu Leu Pro Val Cys Ala Pro Ile Ile Cys Pro Pro Pro Ser Ile
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Pro Thr Phe Ala Thr Leu Arg Val Tyr Lys Pro Ser Ala Gly Asn Asn
130 135 140
Ser Leu Tyr Arg Asp Thr Ala Val Phe Glu Cys Leu Pro Gln His Ala
145 150 155 160
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165 170 175
Lys Leu Pro Glu Cys Arg Glu Val Lys Cys Pro Phe Pro Ser Arg Pro
180 185 190
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195 200 205
Asp Lys Ala Thr Phe Gly Cys His Asp Gly Tyr Ser Leu Asp Gly Pro
210 215 220
Glu Glu Ile Glu Cys Thr Lys Leu Gly Asn Trp Ser Ala Met Pro Ser
225 230 235 240
Cys Lys Ala Ser Cys Lys Leu Pro Val Lys Lys Ala Thr Val Val Tyr
245 250 255
Gln Gly Glu Arg Val Lys Ile Gln Glu Lys Phe Lys Asn Gly Met Leu
260 265 270
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275 280 285
Ser Tyr Thr Glu Asp Ala Gln Cys Ile Asp Gly Thr Ile Glu Val Pro
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gga cgg acc tgt ccc aag cca gat gat tta cca ttt tcc aca gtg gtc 48
Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val
1 5 10 15
ccg tta aaa aca ttc tat gag cca gga gaa gag att acg tat tcc tgc 96
Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
20 25 30
aag ccg ggc tat gtg tcc cga gga ggg atg aga aag ttt atc tgc cct 144
Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
35 40 45
ctc aca gga ctg tgg ccc atc aac act ctg aaa tgt aca ccc aga gta 192
Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val
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1 5 10 15
Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
20 25 30
Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
35 40 45
Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val
50 55 60
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＜211＞ 6
＜212＞ PRT
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Cys Thr Pro Arg Val Cys
1 5
＜210＞ 6
＜211＞ 6
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 6
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1 5
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＜211＞ 7
＜212＞ PRT
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Lys Pro Pro Asp Asp Leu Pro
1 5
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＜211＞ 6
＜212＞ PRT
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1 5
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＜211＞ 6
＜212＞ PRT
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Thr Leu Lys Cys Thr Pro
1 5
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＜211＞ 6
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＜220＞
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aaaccacctt aatggtgatg gtgatggtgg ccacatggct ttaca 45
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＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ synthetic construct
＜400＞ 14
gacatactct gggtgtccgt cctgcaatag c 31
＜210＞ 15
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ synthetic construct
＜400＞ 15
tggagggcag atgatccgtc ctgcaatagc 30
＜210＞ 16
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＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
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gaatgggcat tttacttccc gtcctgcaat agc 33
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atggtgatgg tggccacaac ttggcatggc 30
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＜213＞ Artificial Sequence
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atggtgatgg tggccgcatt ctggtaattt ag 32
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＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
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＜211＞ 5
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
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＜400＞ 21
Gly Arg Ile Ile Cys
1 5
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＜211＞ 5
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
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＜400＞ 22
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1 5
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＜220＞
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Gly Arg Ala Ser Cys
1 5
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＜211＞ 5
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acids 242-326 were deleated or amino acids 182-326 were
deleated or amino acids 165-326 were deleated or amino acids
123-326 were deleated from B2GPI (SEQ ID NO:2)
＜400＞ 24
Gly Arg Thr Cys Pro
1 5
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＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ synthetic construct
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ctataaatac ggatcccggg aattcg 26
＜210＞ 26
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＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ synthetic construct
＜400＞ 26
gcagctggcc aactctgggt gtacatttca gagtg 35
＜210＞ 27
＜211＞ 34
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ synthetic construct
＜400＞ 27
gcagctggcc aatgatggga gcacagagag gaag 34
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＜211＞ 63
＜212＞ PRT
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＜400＞ 28
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Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
20 25 30
Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
35 40 45
Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg
50 55 60
＜210＞ 29
＜211＞ 62
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 29
Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val Pro
1 5 10 15
Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys Lys
20 25 30
Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro Leu
35 40 45
Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg
50 55 60
＜210＞ 30
＜211＞ 65
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ synthetic construct
＜400＞ 30
Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val
1 5 10 15
Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys
20 25 30
Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro
35 40 45
Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val
50 55 60
Cys
65
항인지질 (aPL) 항체는 일반적으로 예컨대 전신성 홍반성 낭창 (SLE)과 같은 자기면역 질병뿐만 아니라 일차 항-인지질 증후군 (APS)으로서 혈전증, 재발성 유산 및 혈소판 감소증과 관련된 자기항체를 설명하기 위해 사용되는 용어이다 [Harris et al. (1983) Lancet 2:1211-1214; Lockshin et al. (1985) N. Engl. J. Med. 313:152-156]. APS는 다른 질환, 주로 SLE와 관련된 일차적인, 또는 이차적인 의미일 수 있다 [PHOSPHOLIPID-BINDING ANTIBODIES, Harris et al., eds., CRC Press, Boca Raton, FL, 1991; McNeil et al. ADVANCES IN IMMUNOLOGY, Vol. 49, pp. 193-281, Austen et al., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1991]. aPL 항체는 소위 항카디오리핀 (anticardiolipin, aCL) 자기항체 (하기에서 설명된다)를 포함한다. aPL 항체 (aCL 항체를 포함하여)는 많은 질환에서 검출되지만, 단지 자기면역 질병과 관련하여 발견된 β2GPI-의존성 항인지질 항체만이 인지질 결합 혈청 단백질, β2GPI의 존재를 필요로 한다 [Vaarala et al. (1986) Clin. Immunol. Immunopathol. 41:8-15].
지속성 aPL 항체를 가지고 있는 환자들중 대략 30 %가 트롬빈성 사건으로 고생하고 있다. aPL 항체의 존재로 혈전증, 혈소판 감소증 (TCP), 및 유산중 하나 또는 둘 이상으로 구성되는 임상적인 특징을 가지는 증후군을 나타내는 SLE 의 범주안에 환자들의 그룹을 규정짓게 된다. SLE 전체에서 이러한 증후군의 위험은 약 25 % 정도이다; 이 위험은 aPL 항체가 존재할 때 40 % 까지 증가하고, aPL 항체가 없으면 15 % 까지 감소한다. aPL 항체가 원형질막의 인지질을 향하는 것으로 여겨졌기 때문에, aPL 항체들은 혈소판 또는 내피와 같은 세포의 인지질 막위에서 일어나는 지혈 과정을 간섭함으로써 생체내에서 직접적인 병원성 효과를 나타내는 것으로 가정되었다. APS 에 걸려 있는 환자들에서, aPL (aCL을 포함하여) 항체가 존재하는 유일한 위험 인자인 것으로 여겨진다는 사실은 이들 항체가 직접적인 발병 역할을 한다는 또 하나의 증거이다. 사람 aPL 항체를 가지고 있는 마우스의 수동적인 전달에 의한 APS의 도입은 아직까지는 aPL 항체가 직접적인 발병요인이라는 가장 좋은 증거이다 [Bakimer et al. (1992) J. Clin. Invest. 89:1558-1563; Blank et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:3069-3073]. 평가가 달라지긴 하지만, 모든 발작 환자의 약 15 %에서 aPL 항체가 중요한 기여 인자인 것으로 여겨진다.
이들 항체의 존재와 많은 질환과의 분명한 상관관계는 그것들의 검출 및 측정을 가능하게 한다. 그러나, 임상적 환경에서 aPL 항체의 측정은 여전히 불완전한 기술이며, 따라서 상당한 문제점이 존재한다. 상업적으로 활용할 수 있는 표준 항혈청 기준 세트 (APL Diagnostics, Inc., Louisville, KY)로 다양한 실험실에서 수행된 검정들을 비교하기 위한 표준 곡선의 제작이 가능하다. 그러나, 각각 높게 (80 또는 그 이상), 중간 (20-80), 낮게 (10-20) 또는 정상 (0-10)으로 분류되는 GPL과 MPL의 수준 및 주어진 혈청에 대한 등급인 IgG 및 IgM 항인지질 항체에 대한 측정 단위인 정확한 GPL 및 MPL에 관하여 이들 실험실에서 얻어진 결과들 사이에는 많은 불일치점이 존재한다. 상업적으로 활용되는 키트들은 상업적으로 활용되는 표준에 특정된 값의 측면에서 크게 다르다 [Reber et al. (1995) Thrombosis and Haemostat. 73:444-452].
aPL 자기항체의 항원적 특이성의 정확한 성질에 대해서는 논쟁의 여지가 있으며, 이들 항체에 대해 사용된 명명법을 이끌어내는데 반영된다. 처음에 이들 자기항체는 음이온성 인지질에 대항하여 지시되는 것으로 여겨졌으며, 따라서 그 이름은 "항카디오리핀 항체"였다 [Gharavi et al. (1987) Ann. Rheum. Dis. 46m:1-6]. 그런 다음 β2GPI가 aCL 항체를 포함한 aPL항체의 항원적 특이성 측면에서 중요한 역할을 하는 것으로 드러났다 [Vermylen et al. (1992) J. Lab. Clin. Med. 120:10; McNeil et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4120-4124]. 이러한 관찰 결과들은 이들 항체가 보다 적절하게는 "β2GPI-의존성 항인지질 자기항체" 로 명명된다는 것을 나타내며, 상기 용어는 본 명세에서 사용된다.
β2GPI가 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 결합에서 보조인자로서 작용하였다는 보고는, β2GPI-의존성 항인지질 항체가 β2GPI 자체에 결합할 수 있었다는 몇가지 보고와 함께, 이들 항체에 의해 인지된 항원성 부위의 성질에 대한 것과는 상반되는 설명을 유도하였다. 그러나, β2GPI의 역할은 여전히 불명확한채로 남아 있으며, 여기에 따라 여러 가지 해석이 제시되었다. 일부의 그룹은 β2GPI-의존성 항인지질 항체가 β2GPI와 음이온성 인지질 두가지를 모두 포함하는 복합 항원을 인지한다고 결론지은 반면, 다른 그룹들은 인지질이 없을 때 β2GPI에 β2GPI-의존성 항인지질 항체가 결합하는 것을 관찰하였다 [McNeil et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4120-4124; Galli et al. (1990) Lancet 335:1544; Roubey et al. (1995) J. Immun. 154(2):954-960; Arvieux et al. (1991) J. Immunol. Methods 143:223]. 이들 차이를 설명하기 위하여 많은 설명들이 제공되었다. 갈리 등은 β2GPI-의존성 항인지질 항체가 β2GPI 에 대하여 친화력이 낮은 항체이기 때문에, β2GPI-의존성 항인지질 항체들은 주어진 IgG 분자상에 있는 두가지 결합 부위의 다가의 고체상 항원에 의한 결합을 필요로 한다고 추정하였다 (Galli et al. (1990)). 그들은 또한 특정 조건하에서는, 예를 들어 미소적정 웰의 감마선 조사와 같은 조건하에서는, 충분한 β2GPI가 이들 친화성이 낮은 항체가 결합하는 것을 가능하게 하도록 고정될 수 있다고 주장하였다. 다른 그룹은 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 의해 인지되는 모호한 에피토프가 β2GPI가 감마선 조사된 웰 또는 카디오리핀으로 코팅된 웰 중 어느 하나에 결합될 때 생성된다고 주장하였다 [Matsuura et al. (1994) J. Exp. Med. 179:457].
β2GPI는 항-응고제를 규정하는 여러 가지 성질, 예를 들면 고유의 응고 경로의 접촉 활성화의 억제, 혈소판 프로트롬비나제 활성, 및 ADP-유도된 혈소판 활성화를 나타내는 50 킬로달톤의 혈장 당단백질이다 [Roubey (1996) Arthritis Rheum. 39:1444; Valesinit et al. (1992) Autoimmunity 14:105]. β2GPI의 아미노산 서열은 측정되어 있다 [Lozier et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3640; Steinkasserer et al. (1991) Biochem. J. 277:387]. β2GPI는 다섯 개의 상동성 도메인으로 구성되어 있다. 이것들 중 네 개는 매우 보존된 시스테인, 프롤린 및 트립토판을 함유한 대략 60 개의 아미노산으로 구성되어 있다 [Lozier et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3640; Steinkasserer et al. (1991) Biochem. J. 277:387-391]. 이 단백질의 구조적 모티프는 처음으로 β2GPI에서 설명되었고, 접힘과는 무관한 그것의 길이, 그리고 두 개의 내부 이황화 가교의 형성에 포함된 4 개의 반 (half)-시스테인 잔기; 두 개의 프롤린; 두 개의 페닐알라닌, 티로신 또는 히스티딘 잔기; 두 개의 글리신; 및 하나의 로이신 또는 발린의 상동하는 위치를 가지고 있는 프레임워크를 특징으로 한다. 이들 반복되는 모티프는 그것들의 모양 때문에 셔시 (sushi) 구조로 표시되거나 또는 때로는 짧은 일치 반복으로서 언급되기도 한다 [Reid et al. (1989)Immunol. Today 10:177; Ichinose et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:13411-13414]. 다섯 번째의 도메인은 82 개의 아미노산 잔기와 6 개의 반-시스테인을 함유하고 있다.
β2GPI-의존성 항인지질 항체의 항원성 특이성의 성질을 둘러싼 상기 논의된 논쟁외에, β2GPI에서 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 의해 인지되는 에피토프의 성질 및 위치에 대한 상당히 근거있는 논쟁이 있었다. 그 논쟁은 β2GPI의 인지질-결합 부위가 다섯 번째 도메인안에 위치한다고 제시하였다 [Hunt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2141]. 헌트 등은 또한 β2GPI의 활성 형태와 β2GPI-의존성 항인지질 보조인자 활성이 결핍된 β2GPI의 비활성 형태 사이의 구조적 차이에 대해 보고하였고, β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 잠재적인 에피토프가 β2GPI의 다섯 번째 도메인에 있는 것같다고 결론지었다 [Hunt et al. (1994) J. Immunol. 152:653-659]. 다른 그룹들은 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 항원성 부위를 위치시키기 위한 시도를 하기 위하여 재조합 β2GPI 단백질을 사용하였다. 이들 그룹중 둘은 배큘로바이러스 발현 시스템에서 다양한 도메인이 결실되는 β2GPI 돌연변이 단백질을 제조하였다. 두 그룹은 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 에피토프가 모호하며 도메인 4가 에피토프의 노출시에 우선적으로 포함된다고 결론지었다 [Igarashi et al. (1996) Blood 87:3262-3270; George et al. (1998) J. Immunol. 160:3917-3923]. 다른 그룹은 대장균에서 다양한 도메인이 결실되는 β2GPI 돌연변이 단백질을 발표하였고, 도메인 5가 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 의해 인지되는 에피토프를 함유하고 있다고 결론지었다 [Yang et al. (1998) APLAR J. Rheumatol. 1:96-100].
그러나 여전히 β2GPI-의존성 항인지질 항체-매개 질환에 대한 개선된 검출 시스템과 내성원 (toleragen)에 대한 요구가 심각하다.
본원에서 인용된 모든 참고문헌은 참고에 의하여 완전히 연합되어 있다.
본 발명은 항인지질 항체-관련 병리학, 특히 β2GPI-의존성 항인지질 항체와 관련되어 있는 그러한 병리학들을 진단하고 치료하기 위한 폴리펩티드 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 유사체 (mimetics), 도메인 1 β2GPI 폴리뉴클레오티드, 및 특별히 검출용 및 내성원 (toleragen)으로서 사용하기 위한 폴리펩티드의 사용방법에 관한 것이다.
도 1 은 β2GPI의 뉴클레오티드 (SEQ ID NO:1) 및 아미노산 (SEQ ID NO:2) 서열을 도시한다. 라인 위의 숫자는 아미노산 위치를 가리킨다.
도 2 는 β2GPI의 도메인 1 의 뉴클레오티드 (SEQ ID NO:3) 및 아미노산 (SEQ ID NO:4) 서열을 도시한다. 라인 위의 숫자는 아미노산 위치를 가리킨다.
도 3 은 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 결합시 중심 아미노산을 포함한, β2GPI의 도메인 1의 삼차 구조의 모델을 도시한다.
도 4 는 NUNC 미소적정 플레이트위에서 수행된 경합 억제 ELISA의 결과를 나타내는 그래프도이다. 플레이트는 야생형 β2GPI로 코팅되었다. 항체 (환자 7104 로부터 얻음) 결합은 다양한 돌연변이 β2GPI 단백질과 경합되었다. 기호는 다음과 같은 재조합 β2GPI를 나타낸다:
재조합 단백질 표시: 점선은 없는 도메인을 나타낸다; 숫자는 단백질에 존재하는 도메인을 나타낸다. 예를 들어, "--345"는 도메인 1과 2가 없지만 도메인 3, 4 및 5 는 보유하고 있는 재조합 β2GPI 단백질이다.
도 5 는 다양한 재조합 β2GPI 단백질에 결합하는 토끼 항-β2GPI의 ELISA 분석의 결과를 나타내는 그래프도이다. 니켈 킬레이트로 코팅된 미소적정 웰이 표시된 농도의 다양한 재조합 β2GPI 단백질로 코팅된 후, 그것에 대한 토끼 항-β2GPI 항체의 결합 능력에 대하여 시험되었다. 기호는 다음과 같은 재조합 β2GPI 단백질을 나타낸다:
도 6 은 다양한 재조합 β2GPI 단백질에 대한 항-β2GPI 결합을 ELISA 로 분석한 결과를 나타내는 그래프도이다. 니켈 킬레이트로 코팅된 미소적정 웰이 표시된 농도의 다양한 재조합 β2GPI 단백질로 코팅된 후, 그것에 대한 사람 항-β2GPI 항체 6701 (환자 6701 로부터 얻음)의 결합 능력에 대하여 시험되었다. 재조합 β2GPI에 대한 기호는 도 5 에서와 같다. 추가의 기호는 다음과 같다:
β2GPI 없음, 항체 첨가됨; --- + ---, β2GPI 없음, 항체 없음.
도 7 은 카디오리핀 (CL) 코팅된 미소적정 웰에 첫 번째로 결합된 다양한 재조합 β2GPI 단백질에 결합하는 토끼 항-β2GPI 항체의 결합능력을 측정한 ELISA의 결과를 나타내는 그래프도이다. IMMULON플레이트가 먼저 CL로 코팅된 후 표시된 농도의 재조합 β2GPI 단백질로 충전된다. 재조합 β2GPI에 대한 기호는 도 5 에서와 같다.
도 8 은 CL 코팅된 미소적정 웰에 첫 번째로 결합된 다양한 재조합 β2GPI 단백질에 결합하는 β2GPI-의존성 항인지질 항체 제제 6641 (환자 6641 로부터 얻음)의 결합능력을 측정한 ELISA의 결과를 나타내는 그래프도이다. IMMULON플레이트가 먼저 CL로 코팅된 후 표시된 농도의 재조합 β2GPI 단백질로 충전된다. 재조합 β2GPI에 대한 기호는 도 6 에서와 같다.
도 9 는 다양한 펩티드가 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 결합에서 야생형 β2GPI와 경합하는 능력에 대하여 시험된 경합 억제 ELISA의 결과를 나타내는 그래프도이다. 펩티드에 대한 기호는 다음과 같다:
도 10A 및 10B 는 환자 6626 으로부터 얻은 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 다양한 농도의 도메인 1 폴리펩티드 (도 10A) 및 사량체 포합체 화합물 44 (도 10B)에 대한 외관상 평형 결합가를 나타내는 그래프도이다. 외관상 평형 분해 상수도 또한 도시된다.
도 11A 및 11B 는 환자 6701 으로부터 얻은 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 다양한 농도의 도메인 1 폴리펩티드 (도 11A) 및 사량체 포합체 화합물 44 (도 11B)에 대한 외관상 평형 결합가를 나타내는 그래프도이다.
도 12 는 β2GPI (NUNC 미소적정 플레이트위에 코팅된)가 환자 6501 로부터 얻어진 혈장 및 다양한 양의 사량체 도메인 (―◇―)1, 포합체 화합물 44 (―▼―), 및 화합물 45 (―＊―) 및 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드 (―◆―), 및 환원되고 알킬화된 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드 (―■―)와 반응하는 경합 결합 실험 결과를 나타내는 그래프도이다.
도 13A 및 13B 는 CFA (도 13A)에서 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드-KLH 포합체로 면역된 마우스로부터 얻어진 슬와 림프절 세포 또는 CFA 만으로 (13B) 면역된 마우스로부터 얻어진 슬와 림프절 세포의 용량 반응을 나타내는 그래프도이다. 기호: ―□―, KLH 포합체; ―▼―, KLH에 포합되지 않은 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드; ―■―, KLH; △, PPD.
도 14 는 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드-KLH 포합체로 프라이밍할 때 (10 ㎍, 50 ㎍ 및 100 ㎍)의 (항-β2GPI 항체의 견지에서의) 용량 반응을 나타내는 막대 그래프도이다.
도 15 는 다양한 β2GPI 도메인 돌연변이체를 사용하여 경합 검정함으로써 측정된 바와 같이, β2GPI 도메인 1 폴리펩티드-KLH 포합체에 대해 발생한 마우스 다클론성 항체의 특이성을 나타내는 그래프도이다 (―□, 1----; ―◆―, 환원되고 알킬화된 1----;
도 16 은 정상적인 혈장 및 IgG 뿐만 아니라 다양한 환자 (6501, 6636, 6644, 7011, 7013, 6701, 7001, 6625, 6641)로부터 얻은 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체가 인자 Va 활성에 미치는 효과를 나타내는 막대 그래프도이다.
발명을 수행하기 위한 최선의 형태
본 발명자들은 β2GPI의 도메인 1 이 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합한다 (즉, β2GPI-의존성 항인지질 항체의 에피토프(들)을 함유한다)는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 이런 결합에 대한 결정인자로서 단지 도메인 5 와 4를 설명한 기존 문헌의 견지에서 볼 때 특히 유의할만 하다 [예컨대 George et al. (1998) 및 Yang et al. (1997) 참조]. 본 발명자들은 최소한 100 개의 상이한 β2GPI-의존성 항인지질 항체로부터의 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 β2GPI의 도메인 1 이 결합하는 것을 발견하였는데, 이것은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)이 그로써 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 포함하고 있는 광범위한 집단에 대해 유용할 것이기 때문에, 내성원 맥락에서뿐만 아니라 검출/진단 맥락에서 특히 유의할만하고 중요하다. 나아가, 본 발명자들은 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이하게 결합하는 것으로 보이는 도메인 1 (본원에서 설명된)의 특별한 펩티드들을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이하게 결합하는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 (분리된 도메인 1을 포함하여)를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이하게 결합하는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드들은 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 검출 (진단, 예상, 및/또는 모니터링 맥락에서)에 유용하며, 또한 내성원으로서도 유용하다. 어떤 구체예에서, 특히 내성원 맥락에서, β2GPI 폴리펩티드(들)은 T 세포 에피토프가 없으며 및/또는 플랫폼 분자에 포합된 것과 같이 다가의 형태이다. 본 발명은 또한 β2GPI 폴리펩티드(들)을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 그러한 폴리뉴클레오티드들은 생체외에서든 또는 생체내에서든 β2GPI 폴리펩티드(들)을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 유사체를 제공하는데, 그것은 β2GPI-의존성 항인지질 항체와 인지 (즉 에피토프)를 공유한다. 본 발명은 또한 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들), 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 코드화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 유사체(들)을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 예컨대 검출 또는 내성의 유도 (즉 B 세포 내성의 유도)를 위해서와 같이 사용되는, β2GPI 폴리펩티드(들) 및/또는 유사체(들)을 사용하는 방법을 제공한다.
일반적인 기법
본 발명의 실시에는 다른 언급이 없는 한, 종래의 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 기법들이 사용될 것이며, 그것들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 기법들은 문헌에서 상세하게 설명된다 [예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Sambrook et al. (1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir ＆ C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller ＆ M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)].
정의
"β2GPI 도메인 1 폴리펩티드"는 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합하고 도 2 (SEQ ID NO:4; 도메인 1)에 도시된 연속되는 아미노산을 최소한 5 개 가지고 있는 폴리펩티드이다. β2GPI 도메인 1 폴리펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있는 표준 검정법, 예를 들면 당해 기술분야에서뿐만 아니라 본원에서 기술되어 있는 경합 억제 검정을 사용하여 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이하게 결합하는 것으로 나타날 수 있다. 용어 "β2GPI 도메인 1 폴리펩티드"는 다양한 구체예 (그중 많은 것들이 본원에서 기술된다), 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:4 의 단편; SEQ ID NO:4의 연장, 삽입, 및/또는 결실물; SEQ ID NO:4의 서열 변이체를 포함한다. 그러므로, 용어 "β2GPI 도메인 1 폴리펩티드"는 필수 기능성을 나타내는 도메인 1-기초 분자의 부류를 설명하는 것으로 의도된다. 그로써 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드는 도 2 에 도시된 (SEQ ID NO:4) 연속되는 아미노산을 최소한 5 개 (상기 주지된 바와 같이), 최소한 6 개, 최소한 10 개, 최소한 12 개, 최소한 15 개, 최소한 20 개, 최소한 25 개, 최소한 30 개, 최소한 40 개, 및/또는 최소한 60 개 가질 수 있다. β2GPI 도메인 1 폴리펩티드는 또한 도메인 1 의 상이한 영역들을, 이들 영역이 일괄적으로 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이하게 결합할 수 있을 정도로 포함할 수 있다 (형태적인 에피토프의 제조에서와 같이). 하기에서 논의되는 바와 같이, 어떤 구체예에서는, "β2GPI 도메인 1 폴리펩티드"에 또한 (어떠한) 검출가능한 T 세포 에피토프가 없다. 본 발명의 목적을 위하여, T 세포 에피토프는 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 가지고 있는 개체에서 T 세포를 활성화시킬 수 있는 것으로서 규정된다.
항체에 "특이적으로 결합하는" 폴리펩티드는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있는 용어이고, 그러한 특이적 결합을 측정하기 위한 방법들 또한 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 분자가 만약 다른 세포 또는 물질과 그러한 것보다 더 빈번하게, 그리고 보다 신속하게 더 긴 기간동안 및/또는 더 큰 친화력으로 특정 세포 또는 물질과 반응하거나 결합한다면 그 분자는 "특이적 결합"을 나타내는 것이라고 말할 수 있다. 만약 항체가 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화력 및 결합력으로, 보다 쉽게, 및/또는 보다 긴 기간동안 표적물에 결합한다면, 항체는 표적에 "특이적으로 결합한다".
"β2GPI-의존성 항인지질 항체"는 β2GPI에 특이적으로 결합하는 어떠한 항체이다. 상기에서 논의된 바와 같이, 임상 기술분야에서 및 문헌에서 사용된 명명법은 이들 항체에 대한 대체 표시, 예컨대 "aPL" 및 "aCL" 항체라는 용어를 사용하며, 이런 용어들은 필수적인 결합 성질이 존재하는 한 용어 "β2GPI-의존성 항인지질 항체"의 정의에 포함된다 (즉, 용어 "aPL" 및 "aCL" 항체는 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 포함한다). 본원에서 제공되는 "항체"의 정의에서 명백하게 표시된 바와 같이, "β2GPI-의존성 항인지질 항체"는 가변 영역, 예컨대 Fab 단편을, β2GPI에 특이하게 결합하는 능력이 보존되는 한, 함유하고 있는 단편을 포함한다. 하기에서 논의되는 바와 같이, 비록 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드가 하나 이상, 바람직하게는 최소한 2, 바람직하게는 최소한 5, 보다 바람직하게는 최소한 10, 보다 더 바람직하게는 최소한 20 개의 상이한 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 결합하는 것이 바람직하여도, 어떠한 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 특이한 결합은 충분하다고 여겨진다.
"항체" (다수의 형태로 상호교환적으로 사용된다)는 표적, 예컨대 폴리펩티드에, 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 최소한 하나의 항원 인지 부위를 통하여 특이하게 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이 용어는 무상 항체뿐만 아니라, 그것의 단편 (Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 그것의 돌연변이체, 융합 단백질, 인간화된 항체, 및 원하는 특이성의 항원 인지 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떠한 다른 변형된 형태를 포함한다.
"무상 β2GPI"는 β2GPI의 완전한 분자의 아미노산 서열을 의미한다 (도 1 및 SEQ ID NO:2에 도시됨). β2GPI의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 또한 문헌 및 GeneBank (승인 번호 X58100)에서 공개적으로 활용될 수 있다.
"융합 폴리펩티드"는 자연에서 발생되는 것과는 상이한 위치에 영역을 포함하고 있는 폴리펩티드이다. 영역들은 정상적으로는 별도의 단백질에 존재할 수 있으며 융합 폴리펩티드에서 모이기도 하고, 또는 정상적으로는 동일한 단백질에 존재하지만 융합 폴리펩티드에서는 새로운 배열로 위치될 수도 있다. 융합 폴리펩티드는 또한 선형 또는 분지형의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 다중 형태로부터 발생할 수도 있다.
"T 세포 에피토프"는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있는 용어로, T 세포에 대한 결합 부위, 보다 구체적으로 설명하면, T 세포(들)을 활성화하는 폴리펩티드 서열 또는 화학적 구조를 의미한다. T 세포 에피토프의 존재를 측정하는 방법들도 또한 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며 본원에서도 설명된다. 시간이 경과함에 따라 T 세포 에피토프의 존재를 검출하기 위한 보다 민감한 검정법이 개발될 수 있으며, T 세포 에피토프의 결핍을 밝히는 것이 사용된 검출 시스템의 타입에 따라 좌우된다는 것이 인지되었다. 본 발명의 목적에 대해, T 세포 에피토프의 "결핍"은 본 출원의 최초 출원일 현재 T 세포 에피토프가 당해 기술분야의 표준 검정법을 사용하여 검출될 수 없다는 것을 의미하는 것으로 받아들여진다. 또한 본 발명의 목적에 대해, "T 세포 에피토프"는 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 가지고 있는 개체에서 T 세포를 자극할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 그것이 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드든 어떠한 길이의 뉴클레오티드의 다중 형태를 의미한다. 이들 용어는 단일-, 이중- 또는 삼중-가닥의 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연의, 화학적으로, 생화학적으로 변형된, 비-자연 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함하고 있는 중합체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 골격은 당과 인산염 기 (전형적으로 RNA 또는 DNA에서 발견되는 것과 같은), 또는 변형된 또는 치환된 당 또는 인산염 기를 포함할 수 있다. 또는 달리, 폴리뉴클레오티드의 골격은 포스포라미데이트와 같은 합성 하위단위체의 중합체를 포함할 수 있고, 그로써 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포라미데이트 (P-NH2) 또는 혼합된 포스포라미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 포스포로티에이트 결합이 포스포디에스테르 결합 대신 사용될 수 있다. 또한, 이중-가닥의 폴리뉴클레오티드가 화학적 합성의 단일한 표준 폴리뉴클레오티드 생성물로부터, 상보하는 가닥을 합성하고 그 가닥들을 적절한 조건하에서 어닐링함으로써, 또는 상보하는 가닥을 적절한 프라이머를 사용하여 DNA 중합효소를 사용하여 생체내에서 합성함으로써 얻어질 수 있다.
다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 실예이다: 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 어떠한 서열의 분리된 DNA, 어떠한 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 바람직한 폴리뉴클레오티드는 DNA 이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "DNA"는 염기 A,T,C, 및 G 뿐만 아니라 그것들의 유사체중 어느 하나, 또는 이들 염기의 변형된 형태, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드, 뉴클레오티드내 변형, 예컨대 전하를 띄지 않는 결합 및 티오에이트, 당 유사체의 사용, 및 변형된 및/또는 대체 골격 구조, 예컨대 폴리아미드를 포함한다.
"자연 발생적인"은 내인성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열, 즉 자연에서 발견되는 것을 의미한다. 이 용어는 대립형질 및 코드화된 단백질의 대립성 형태, 뿐만 아니라 프로세스된 대로의 전 길이의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함한다. 프로세싱은 하나 또는 그 이상의 단계로 발생할 수 있으며, 이들 용어는 모든 단계의 프로세싱을 포함한다. 역으로, "비-자연 발생적인" 서열은 모든 다른 서열, 즉 자연에서 발생하지 않는 것들, 예컨대 재조합 서열을 의미한다.
"숙주 세포"는 벡터(들)에 대한 또는 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질의 통합을 위한 수용체일 수 있거나 또는 수용체인 개별적인 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적인, 우연한, 또는 계획적인 돌연변이 때문에 본질적으로는 원래의 부모 세포와 완전하게 동일하지는 않다 (총 DNA 보충물의 형태 또는 게놈에서). 숙주 세포는 생체내에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 트랜스펙션된 세포를 포함한다.
"형질전환" 또는 "트랜스펙션"은 예를 들어 리포펙션 (lipofection), 형질도입, 감염 또는 일렉트로포레이션과 같은 삽입에 사용된 방법에는 관계없이 숙주 세포안에 외인성 폴리뉴클레오티드가 삽입되는 것을 의미한다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비-통합된 벡터, 예를 들면 플라스미드로서 유지되거나, 또는 달리 숙주 세포 게놈안에 통합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유사체"는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드가 특이하게 결합하는 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이하게 결합하는 생물학적 또는 화학적 화합물을 의미한다. "유사체"는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드와 에피토프, 또는 결합 특이성을 공유한다. 유사체는 요구되는 결합 성질을 나타내는 화학적 물질일 수 있으며, 그로써 예를 들면 단순한 또는 복잡한 유기 또는 무기 분자; 폴리펩티드; 폴리뉴클레오티드; 탄수화물; 지질; 리포다당; 리포단백질, 또는 상기의 것들의 어떠한 조합, 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 폴리뉴클레오티드-함유 폴리펩티드; 글리코실화된 폴리펩티드; 및 당지질일 수 있다. 용어 "유사체"는 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 용어인 "미모토프 (mimotope)"를 포함한다.
"개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 사람이다. 포유류는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 영장류, 마우스 및 래트를 포함한다.
"B 세포 결핍"은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 용어로, 항체를 생성하고 분비하기 위하여 T 세포의 도움을 필요로 하는 그런 B 세포의 무반응성을 의미하며, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 미성숙한 및/또는 성숙한 B 세포의 클론성 결실 및/또는 항체를 생성하지 못하는 B 세포의 무능력을 포함한다.
"내성 유도"는 면역원에 대한 면역 반응의 정도의 감소 및/또는 안정화를 의미한다. "면역 반응"은 체액성 또는 세포성일 수 있으며, 당해 기술분야에 공지되어 있는 표준 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 목적에 대해, 면역 반응은 일반적으로 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 존재에 의해 영향을 받는다. 정량적으로 감소는 (항체 생성의 감소에 의해 측정되는 바) 최소한 약 25 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 50 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 75 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 90 %, 보다 더 바람직하게는 최소한 약 95 %, 가장 바람직하게는 100 %이다. 내성은 항원-특이적이며, 발명의 목적에 대해 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 가지고 있는 그런 개체에 적용되는 것으로 이해된다. "내성 유도"는 또한 항체 수준의 증가 속도의 둔화 및/또는 지연을 포함한다.
"생물학적 샘플"은 개체로부터 얻어진 다양한 샘플 타입을 포함하며 진단 또는 모니터링 검정에 사용될 수 있다. 이 정의는 생물학적 기원의 혈액 및 다른 액체 샘플, 고체 조직 샘플, 예컨대 생검 시편 또는 조직 배양물 또는 그것으로부터 유도된 세포, 및 그것들의 자손을 포함한다. 이 정의는 또한 예컨대 시약으로의 처리, 용해, 또는 특정 성분들, 예를 들면 단백질 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 풍부화에 의한 그것들의 획득 후에 어떠한 방식으로든 조작된 샘플들을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상 샘플을 포함하며, 또한 배양중의 세포, 세포 현탁액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플을 포함한다.
생화학적 반응물중의 어떠한 두 개 또는 그 이상의 성분들 사이에 형성된 "안정한 복합체"는 듀플렉스 또는 복합체의 형성과, 어떠한 임의의 세척 단계 또는 그 사이에 일어날 수 있는 다른 조작을 포함하는 후속되는 검출 사이를 지속시키기 위하여 충분히 길게 지속되는 듀플렉스 또는 복합체를 의미한다.
"분리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 자연에서 그것과 결합되는 물질이 없는 것이다. 실질적으로 없다는 것은 그것과 자연에서 결합되는 물질이 최소한 50 %, 바람직하게는 최소한 70 %, 보다 바람직하게는 최소한 80 %, 보다 더 바람직하게는 최소한 90 % 없다는 것을 의미한다.
폴리뉴클레오티드는 만약 그것의 천연 상태에서 또는 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법들에 의해 조작되었을 때 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 생성하기 위하여 전사 및/또는 번역될 수 있다면 "코드화"된 것으로 불린다. 본 발명의 목적에 대해 및 상보하는 가닥에 대한 시간소모적인 조회를 피하기 위하여, 그러한 폴리뉴클레오티드의 안티-센스 (또는 상보하는) 가닥이 또한 서열을 코드화하는 것으로 말할 수 있다; 즉 폴리펩티드를 "코드화하는" 폴리뉴클레오티드는 종래의 코딩 가닥 및 상보하는 서열 (또는 가닥)을 포함한다.
"유효량"은 (내성원적 맥락에서 사용될 때) 유익한 또는 원하는 임상 결과를 얻기에 충분한 양이다. 유효량은 1 회 또는 더 많은 투여횟수로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적에 대해, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 유효량은 특히 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대하여 내성을 유도하기에 충분한 양이다. 처리의 관점에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 유효량은 β2GPI-의존성 항인지질-관련 질병 상태 (즉, β2GPI-의존성 항인지질 항체가 잠재적인 또는 실제적인 병원학을 가리키는 상태)의 진행을 일시적으로 완화, 경감, 안정화, 역전, 둔화 또는 지연시키기에 충분한 양이다. 효력의 표시제의 검출 및 측정은 일반적으로 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 측정 및/또는 질병 상태와 관련된 임상적인 징후들, 예컨대 동맥성 또는 정맥성 혈전증, 유산, 일시적인 허혈 충격, 뇌혈관 사고, 흑내장 퓨각스 (외안 시력), 자기면역 용혈성 빈혈, 심장 판막 병변, 심근 경색, 혈소판 감소증, 및 편두통 질환을 기초로 한다.
본원에서 사용되는 용어 "결합가 플랫폼 분자"는 불연속수의 폴리펩티드 (본 발명의 경우, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드) 및/또는 유사체(들)의 부착을 허용하는 부위들을 함유하고 있는 비면역원성 분자를 의미한다.
"비면역원성"은, 결합가 플랫폼 분자를 설명하기 위해 사용될 때, 그 자체가 개체에 투여될 때, 결합가 플랫폼 분자가 면역 반응을 유도하지 못하는, 및/또는 충분한 면역 반응을 유도하지 못하는 것을 의미한다. 허용되는 면역 반응의 정도는 결합가 플랫폼 분자가 사용되는 상황에 따라 좌우되며, 실험적으로 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 "약물구 (pharmacophore)"는 항체 표적에 대한 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 결합에 포함된 중심 그룹의 삼차원 배향 및 화학적 성질을 의미한다.
본 발명의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드
본 발명은 도메인 1 β2GPI(들)을 제공한다. 상기에서 기술된 바와 같이, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 (a) 도메인 1을 도시하는, 도 2의 5개(또는 그 이상) 이상의 인접 아미노산(SEQ ID NO:4)을 함유하고; (b) β2GPI-의존성 항인지질 항체(즉, 하나 이상의 β2GPI-의존성 항인지질 항체)에 특이적으로 결합된다. 도메인 1 β2GPI의 삼차원 구조 모델은 도 3에 (nmr에 의해 측정된 바와 같이 HI 인자 sushi 도메인 16의 실제적 구조를 기본으로 하여) 나타나 있으며[참조: Norman et al. (1991) J. Mol. Biol. 219:717; Barlow et al. (1991) Biochem. 30:997], 본원에서 나타난 것을 포함하여, 돌연변이 연구에 의해 측정된 바와 같이, 구조 통일성 및/또는 항체 결합에 포함될 수 있는 잔기가 지시되어 있다. 본 발명의 모든 폴리펩티드 구체예에 대해서, 본 발명의 폴리펩티드는 본래의 비손상 β2GPI을, 또는 다른 미리 분리되고 특성화된 형태의 β2GPI, 예를 들어, 도메인 결실 돌연변이체(즉, 도메인 1,2,3; 도메인 1,2,3,4)를 포함하지 않음을 이해한다.
한 구체예에서, 본 발명은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 함유하는(또는 특정한 구체예에서, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이로 이루어진) 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 포함하며, 단 폴리펩티드는 (a) 비손상 β2GPI(SEQ ID NO:2), (b) 도메인 1, 2 및 3; 또는 (c) 도메인 1, 2, 3 및 4로 이루어지지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명은 도메인 1을 나타내는, 도 2에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO:4)로 이루어진(또는 특정한 구체예에서, 필수적으로 이로 이루어진) 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명자들은 도메인 1을 함유하는 도메인 결실 β2GPI 폴리펩티드만 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합될 수 있으며, 실시예 1에 기술된 바와 같이, 도메인 1만 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 결합될 수 있음을 밝혀냈다. 본 발명을 위해서, β2GPI의 도메인 1은 일반적으로 β2GPI의 대략 아미노산 1 내지 대략 아미노산 64이다(도 1). 대신에, 및 또한 본 발명을 위해서, 도메인 1(및 따라서 본 발명의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드)은 (a) (N 말단으로부터 측정되는 경우) 대략 제1 시스테인 내지 대략 제4 시스테인; (b) 대략 N 말단 내지 대략 제5 시스테인(더욱 정확히는, 제5 시스테인 전에 마지막 아미노산); (c) 대략 제 1 시스테인 내지 대략 제5 시스테인의 범위일 수 있다. 특정한 구체예에서, 추가의 시스테인이 적합한 위치에 첨가되어 포합용 반응기로서 사용될 수 있다. 따라서, (특정한 구체예에서 β2GPI의 제5 시스테인인) 추가의 시스테인은 어떠한 위치에서도, 특히 C 말단 또는 N 말단에서 또는 이들에 근접하여 포함될 수 있다. 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 또한, 다음을 포함할 수 있다(또는 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이로 이루어질 수 있다): (a) SEQ ID NO:4의 아미노산 1 내지 아미노산 59; (b) SEQ ID NO:4의 아미노산 2 내지 아미노산 60; (c) SEQ ID NO:4의 아미노산 2 내지 아미노산 63; (d) SEQ ID NO:1의 아미노산 1 내지 아미노산 66; (e) SEQ ID NO:1의 아미노산 4 내지 아미노산 66; (f) SEQ ID NO:4의 아미노산 1 내지 아미노산 60; (g) SEQ ID NO:1의 아미노산 1 내지 아미노산 66. 본 발명자들은 제5 시스테인을 함유하는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드가 포합에 특히 편리함을 밝혀냈다(다음에서 논의됨). β2GPI의 4개의 제1 시스테인을 함유하는(포함하는) 구체예를 위해서, 일반적으로, 시스테인 사이의 아미노산 서열은 적합한 이황화 가교가 형성되도록 되는 한편, 시스테인에 인접한 아미노산 서열(즉, N 말단 및 C 말단 아미노산)은 (항체에 결합시키는 필수 구조가 보존되는) 서열일 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 표 1에 도시된 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다(SEQ ID NO:5 내지 11). (실시예 3에 기술된) 본 발명자들의 실험은 이들 폴리펩티드가 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합될 수 있음을 입증한다.
본 발명의 모든 폴리펩티드 구체예에 대해서, 폴리펩티드(들)은 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합된다. β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 특이적 결합은 당해 분야의 표준 기술, 예를 들어, 경합적 결합 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 미소적정 플레이트는 (재조합체 분자가 필수 결합 특성을 나타내는 한, 천연적이든 재조합체이든간에) β2GPI로 도포되고, 시험 폴리펩티드가 여러 농도로 첨가될 수 있다. 다음에, 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 첨가하여 결합을 발생시킨다. 결합된 항체의 양은 검출 시스템, 예를 들어, 알칼리성 포스페이트 포합된 항-사람 IgG, 또는 방사능에 의해 측정한다. 특이적 결합은 시험 폴리펩티드가 β2GPI에 대한 결합을 경합시키는 능력에 의해 지시된다. 실시예 1 및 3은 경합적 결합을 검출하기 위한 예시적 검정을 제공한다. 특이적 결합은 또한, 당해 분야에 공지되고 실시예 1 및 3에 예시된, 직접 결합 검정에 의해 측정할 수 있다.
본 발명을 위해서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 하나의 β2GPI-의존성 항인지질 항체에만 결합될 필요가 있지만, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드가 하나 이상의 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 결합되는 것이 (예를 들어, 검출에 있어서) 바람직할 수 있음이 이해된다. β2GPI-의존성 항인지질 항체의 공급원은 일반적으로 개체로부터 유래되며, 항체 서열은 개체에서 개체로 변할 수 있다. 또한, β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 특이적 결합은 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 분절 또는 다른 재조합체, 예를 들어, 당해 분야에 공지된, Fab 분절 또는 단일사슬 가변성 영역 구조물(scFv)을 사용하여 입증할 수 있음이 이해된다.
따라서, 특정한 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 하나 이상의 β2GPI-의존성 항인지질 항체(즉, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 50개 이상)에 결합된다. 이들 구체예는 이들 폴리펩티드(들)이 사용되어 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 운반할 수 있는 개체의 넓은 스펙트럼에 걸쳐 검출할 수 있는 바와 같이, 검출에 특히 유용하다.
특정한 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 셔시 구조물을 함유한다. "셔시 도메인"은 당해 분야의 전문가에 의해 이해되며, 일반적으로 (a) 폴리펩티드사슬을 환상 구조물에 감는 특정한 잔기(예: 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 글리신, 류신, 발린 및/또는 히스티딘)를 함유하고; (b) 일반적으로 분자량이 약 5kD이며; (c) β 접힘 구조물을 함유함을 특징으로 한다[참조: Ichmose et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:13411].
또한, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 구조 에피토프(들)을 통해 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 결합될 수 있음을 이해한다. 따라서, 특정한 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 (a) 도 3의 아미노산 55, 56 및 58(ile; asn; leu)(SEQ ID NO:4의 아미노산 55, 56 및 58); (b) 도 3의 아미노산 43 내지 45(arg; lys; phe)(SEQ ID NO:4의 아미노산 43 내지 45); (c) SEQ ID NO:4의 아미노산 40 내지 45(gly; gly; met; arg; lys; phe), 바람직하게는 도 3의 아미노산 38 내지 44(SEQ ID NO:4의 아미노산 38 내지 44); 및/또는 (d) 도 3의 아미노산 19(lys)(SEQ ID NO:4의 아미노산 19), 바람직하게는 (a) 및 (b); 바람직하게는 (a) 및 (c); 바람직하게는 (b) 및 (c); 바람직하게는 (a) 및 (d); 바람직하게는 (b) 및 (d); 바람직하게는 (c) 및 (d); 바람직하게는 (a), (b) 및 (d); 바람직하게는 (a), (c) 및 (d); 바람직하게는 (b), (c) 및 (d); 바람직하게는 (a), (b) 및 (c); 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d)를 포함한다. 본 발명자들은 돌연변이 연구를 통해서 이들 아미노산이 공동으로 또는 개별적으로 결합하기 위해 중요할 수 있음을 밝혀냈다.
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(또는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드)의 크기는 (β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 특이적 결합을 기본으로 하는) 필수 관능성이 부합되는 한, 광범위하게 변할 수 있다. 예를 들어, β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 특이적 결합을 수행하는 데에 필요한 길이는, 예를 들어, 5-머 아미노산 서열만큼 짧다. 본 발명자들의 데이터는 6-머만큼 작은 아미노산 서열이 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합될 수 있음을 나타내었다(실시예 3).
특정한 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 포함하거나 필수적으로 이로 이루어진 폴리펩티드)은 길이가 약 350개의 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 300개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 250개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 200개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 160개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 150개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 125개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 115개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 110개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 100개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 75개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 60개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 50개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 25개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 15개 아미노산 미만이고, 바람직하게는 길이가 약 10개 아미노산 미만이다.
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)은 다른 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(이들 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)이 동일하든지 상이하든지간에) 뿐만 아니라 β2GPI의 다른 도메인과 결합되거나, 포합되고/거나 연결될 수 있음을 이해한다. 따라서, 본 발명은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 중합체 형태를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 중합체 형태는 다수의(즉, 1개 초과) 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 함유한다. 한 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 선형 중합체가 제공된다. 다른 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 분지된 중합체가 제공된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 다수의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들), (b) 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 및 하나 이상의 도메인 1 β2GPI을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 구체예의 예는 (a) 도메인 2; (b) 도메인 3; (c) 도메인 5; (e) 도메인 3, 4 및 5; (f) 도메인 4 및 5와 포합된 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이들 도메인은 당해 분야의 전문가에 의해 이해되며, 일반적으로 (N 말단로부터) 다음과 같다: 도메인 2, 대략 아미노산 65 내지 대략 아미노산 120; 도메인 3, 대략 아미노산 121 내지 대략 아미노산 181; 도메인 4, 대략 아미노산 182 내지 대략 아미노산 244; 도메인 5, 대략 아미노산 245 내지 대략 아미노산 326(C 말단).
다른 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 다중 항원 펩티드(Map)가 제공된다. Map은 방사상으로 분지된 리신 수상 돌기를 갖는 작은 면역학적 불활성 코어를 갖고, 이 위에 다수의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드가 고정될 수 있다(즉, 공유 결합될 수 있다)[참조: Posnett et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:17919-1725; Tam (1989) Meth. Enz. 168:7-15]. 결과는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 대 코어의 높은 몰비를 갖는 거대한 고분자이다. Map은 ELISA와 같은 검정에 유용하고 유효한 항원이며, 또한 다가 제시에, 예를 들어, 내성원에 있어서 유용할 수 있다. Map은 합성하여 제조될 수 있으며, 상업적으로 수득될 수 있다(미국 매사추세츠 홉킨턴 소재의 Quality Controlled Biochemicals, Inc.). 대표적 Map 시스템에서, 코어 매트릭스는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 고정시키기 위한 3가지 수준의 리신 및 8개의 아미노산으로 제조된다. Map은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 고체상 방법, 예를 들어, 문헌에 기술된 방법에 의해 합성될 수 있다[참조: R.B.Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149].
분지된 구조물, 예를 들어, 시클로덱스트린이 사용될 수 있음이 이해된다. 분지된 구조물은 작을 수 있지만, 작을 필요는 없다. 관용성 유도에 있어서, 플랫폼은 T 세포 독립적 항원으로 작용하지 않아야 한다.
또한, 특정한 서열 변이가 반응성을 보존하거나 증진시킬 수 있는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 도입될 수 있음이 이해된다. 따라서, 본 발명은 특성에 중요한 영향을 주지 않는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 대한 변경 뿐만 아니라 증진된 활성을 갖는 변이체를 포함한다. 이들 변이체 및 변경된 서열은 집합적으로 "기능상 동일한 변이체"로서 기록되며, 이는 다른 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 비해서 동일하거나 증진되거나 감소된 결합을 갖고, 이들이 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합되는 능력을 유지하므로, "동일"하다고 기록된다. 폴리펩티드의 변경은 당해 분야에서 일반적으로 수행되므로, 본원에서 상세히 기술할 필요가 없다. 변경된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기가 보존적 치환되거나, 기능적 활성을 상당히 유해하게 변화시키지 않는 아미노산이 하나 이상 결실 또는 추가되거나, 알파-메틸 아미노산 치환물을 포함하여, 화학적 동족체, 비-단백질 천연 아미노산(예: 카나바닌, DL 메티오닌 설폭사이드, 델타-히드록실리신 염산염 및 아미노이소부티르산) 및 비천연 아미노산을 사용하는 폴리펩티드를 포함한다. 서로에 대해 보존성 치환될 수 있는 아미노산 잔기는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다: 글리신/알라닌; 발린/이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신. 이들 폴리펩티드는 또한 글리코실화 및 노닐글리코실화 폴리펩티드 뿐만 아니라 다른 후-번역 변경, 예를 들어, 상이한 당으로의 글리코실화, 아세틸화 및 인산화된 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 치환물은 보존성이며, 즉 치환된 아미노산은 원래의 아미노산과 유사한 화학적 특성을 갖는다. 이러한 보존성 치환물은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예는 상기에 제공되었다.
특정한 아미노산 변이체(예: 치환물)는 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 결합에 동일한 방식으로 또는 동일한 정도로 영향을 주거나 주지 않을 수 있음을 이해한다. 또한, 치환 아미노산(들)의 특성은 결합의 방식 및/또는 정도에 영향을 준다. 예를 들어, 본 발명자들은 43 위치(SEQ ID NO:4의 아미노산 43)에서 아르기닌 잔기에 대한 글리신 잔기의 치환에 의해 특정 환자의 혈청에서 항체에 결합하는 능력을 손실시키는 한편, 다른 것은 변화되지 않으며, 또 다른 것은 결합 능력을 변화시킴을(즉, 중간체). 밝혀냈다. 다른 예로서, 42 위치에서 메티오닌에 대한 리신 또는 트레오닌의 치환은 (본 발명자들이 시험한 환자에서) 결합에 영향을 주지 않는 것으로 나타난다; 그러나 발린이 42 위치에서 메티오닌에 대해 치환되는 경우, 결합은 모든 환자에서 없어지는 것으로 나타난다.
20개의 천연 아미노산 및 이의 호모동족체 및 노르동족체 이외에, 다수의 다른 종류의 알파 아미노산이 본 발명에서 사용될 수 있다. 이들 다른 종류의 예는 d-아미노산, Na-알킬 아미노산, 알파-알킬 아미노산, 시클릭 아미노산, 키메릭 아미노산 및 잡종 아미노산을 포함한다. 이들 비-천연 아미노산은 생물 활성 폴리펩티드를 변경시키는 데에 광범위하게 사용되어 단백질 분해 감소에 대한 내성을 증진시키고/거나 구조상 구속을 부여하여 생물학적 활성을 개선시킨다[참조: Hruby et al. (1990) Biochem. J. 268:249-262; Hruby et al. (1995) Method in Mol. Biol. 35:201-240].
가장 일반적인 Na-알킬 아미노산은 Na-메틸 아미노산, 예를 들어, Na-메틸 시스테인(nC), Na-메틸 글리신(nG), Na-메틸 류신(nL), Na-메틸 리신(nK) 및 Na-메틸 발린(nV)이다. 알파-알킬 아미노산의 예는 알파-메틸 알라닌(mA), 알파-아미노이소부티르산(aiB), 알파-메틸 프롤린(mP), 알파-메틸 류신(mL), 알파-메틸 발린(mV), 알파-메틸-알파-아미노이소부티르산(tv), 디에틸글리신(deG), 이페닐글리신(dpG) 및 디시클로헥실 글리신(dcG)을 포함한다[참조: Balaram (1992) Pure ＆ Appl. Chem. 64:1061-1066; Toniolo et al. (1993) Biopolymers 33:1061-1072; Hinds et al. (1991) Med. Chem. 34:1777-1789].
시클릭 아미노산의 예는 1-아미노-1-시클로프로판 카르복실산(cG), 1-아미노-1-시클로펜탄 카르복실산(Ac5c), 1-아미노-1-시클로헥산 카르복실산 (Ac6c), 아미노인단 카르복실산(ind), 테트라히드로이소퀴놀린 카르복실산(Tic) 및 피페콜린산(Pip)을 포함한다[참조: C. Toniolo (1990) Int'l. J. Peptide Protein Res. 35:287-300; Burgess etl al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:3808-3819]. 키메릭 아미노산의 예는 페니실라민(Pe), 시스테인과 발린, 4R- 및 4S-메르캅토프롤린 (Mpt)의 배합물, 호모시스테인 및 프롤린과 4R- 및 4S-히드록시프롤린(hyP)의 배합물 및 호모세린 및 프롤린의 배합물을 포함한다. 잡종 알파 아미노산의 예는 염기성 아미노산 동족체, 예를 들어, 오르니틴(Or), Nε-메틸 리신(mK), 4-리피딜 알라닌(pyA), 4-피페리디노 알라닌(piA) 및 4-아미노페닐알라닌; 산성 아미노산 동족체, 예를 들어, 시트룰린(Cit) 및 3-히드록시발린; 방향족 아미노산 동족체, 예를 들어, 1-나프틸알라닌(1-Nal), 2-나프틸알라닌(2-Nal), 페닐글리신(pG), 3,3-디페닐알라닌(dpA), 3-(2-티에닐)알라닌(Thi) 및 할로페닐알라닌(예: 2-플루오로에닐알라닌 및 4-클로로페닐알라닌); 소수성 아미노산 동족체, 예를 들어, t-부틸글리신(즉, 3급 류신(tL)), 2-아미노부티르산(Abu), 시클로헥실알라닌(Cy), 4-테트라히드로피라닐알라닌(tpA), 3,3-디시클로헥실 알라닌 (dcA) 및 3,4-데히드로프롤린을 포함한다.
알파-아미노산 이외에, 다른 것(예: 베타 아미노산)이 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 이들 다른 아미노산의 예는 2-아미노벤조산(Abz), β-아미노프로파노산(β-Apr), γ-아미노부티르산(γ-Abu) 및 6-아미노헥사노산(ε-Ahx)을 포함한다. 카르복실산[예: 4-클로로부티르산(By) 및 3-클로로프로피온산(Pp)]이 또한, 시클릭 티오에테르 펩티드의 합성에서 N-말단에 대한 제1 잔기로서 사용되었다.
당해 분야에서 공지된 커플링 기술의 사용을 포함하는 다른 변경 방법은 효소성 수단, 산화성 치환 및 킬레이트화를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 변경은, 예를 들어, 면역검정을 위한 표지의 부착에, 예를 들어, 방사선검정에 대한 방사능 부분의 부착에 사용될 수 있다. 변경된 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)은 당해 분야에 확립된 방법을 사용하여 제조되며, 당해 분야에 공지된 표준 검정을 사용하여 선별할 수 있고, 이들 중의 어떤 것은 본원 및 실시예에 기술되어 있다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 본 발명을 위해서, β2GPI 도메인 1 융합 단백질은 하나 이상의 β2GPI 폴리펩티드 및 본래의 분자에서 결합되지 않은 아미노산 서열, 예를 들어, 다른 영역(예: β2GPI의 다른 도메인)으로부터의 이종 서열 또는 동종 서열을 함유한다. 유용한 이종 서열은 숙주 세포로부터 분비에 제공하거나, 면역학적 반응성을 증진시키거나, 폴리펩티드의 면역검정 지지체 또는 담체로의 커플링을 용이하게 하는 서열을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, β2GPI 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하는 이종 서열과 융합될 수 있다. 이러한 서열의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며, 암호화 에피토프[예: Myc, HA(인플루엔자 바이러스 적혈구응집소로부터 유도됨), His-6 또는 FLAG]를 포함한다. 정제를 용이하게 하는 다른 이종 서열은 글루타티온 S-트랜스페라제(GST), 말토스-결합 단백질(MBP) 또는 면역글로불린의 Fc 단백질과 같은 단백질로부터 유도된다.
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 T 세포 에피토프를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 검출하기 위해서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 T 세포 에피토프(들)를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는데, 본 명세서에서 폴리펩티드의 1차 사용은 T 세포 에피토프의 존재와 독립적인, β2GPI-의존성 항인지질 항체를 검출하기 위한 것이기 때문이다. 그러나 내성원에 있어서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드에는 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 갖는 개체에 대해 (어떠한) 검출가능한 T 세포 에피토프(들)이 결핍되어 있기 때문이다. 따라서, 특정한 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 T 세포 에피토프를 함유하지 않는다(즉, 결핍되어 있다)(또한, 따라서 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 T 세포 에피토프를 함유하지 않는다).
T 세포 에피토프의 존재를 검출하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, T 세포 증식(예: 티미딘 혼입)을 검출하는 많은 검정이 사용될 수 있다. T 세포 에피토프의 존재는 또한, 당해 분야에서 익히 공지된 방법에 의해 T 세포-유도된 림포킨의 분비를 측정하여 결정할 수 있다. 배경 위에서 티미딘의 통계학적 유의성 있는 혼입을 유도하지 못하는 폴리펩티드는(즉, 일반적으로 p는 표준 통계학적 방법을 사용하여 0.05 미만) 일반적으로 T 세포 에피토프가 결핍된 것으로 고려되지만, 티미딘 혼입의 정량적 양은 시험되는 폴리펩티드에 따라서 변할 수 있음이 인정된다. 일반적으로, 약 2 내지 3 이하의, 더욱 바람직하게는 약 1 미만의 자극 지수는 T 세포 에피토프의 결핍을 지시한다. T 세포 에피토프의 위치 및 함량은 실험에 의해 측정된다.
내성원에 있어서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 바람직하게는, B 세포의 표면 위에서 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합된다(즉, B 세포 상에서 표면 항체에 결합되며, 여기에서 항체는 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합될 수 있다). 특히 가교결합과 함께 이러한 결합은 트리거 B 세포 무반응으로 고려된다. 정의에 의해 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합될 수 있으므로, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 마찬가지로 B 세포상에서 표면 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 결합될 수 있다고 기대됨을 이해한다.
다음에서(및 상기에서 중합체 형태의 논의에서), 바람직하게는 내성원에서 논의된 바와 같이, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 중합체 형태를 거쳐서 및/또는 적합한 원자가 플랫폼 분자에 포합되어 다가 형태로 존재한다.
본 발명의 폴리펩티드의 제조
본 발명의 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 재조합 방법에 의해(즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드) 또는 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다. 폴리펩티드, 특히 아미노산 약 50개 이하의 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 공업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 폴리펩티드는 고체상 방법을 사용하는 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 제조할 수 있다. 폴리펩티드는 또한, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다.
폴리펩티드는 또한, 재조합 방법을 사용하는, 발현 시스템에 의해 제조할 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 유용성은 비손상(즉, 본래의) 폴리펩티드, 이의 기능상 동일한 분절 또는 재조합 형태를 암호화하는 발현 벡터의 구성을 허용한다. 바람직한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 융합 또는 성숙한 형태든간에 및 분비를 허용하는 단일 서열을 함유하든 함유하지 않든간에, 편리한 숙주에 적합한 발현 벡터로 결찰될 수 있다. 진행생물 및 원핵생물 숙주 시스템이 둘다 사용될 수 있다. 다음에, 폴리펩티드는 용해된 세포 또는 배양 배지로부터 분리되고 이의 예정된 용도에 필요한 정도로 정제된다. 숙주 시스템에서 발현된 폴리펩티드의 정제 또는 분리는 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 비손상 폴리펩티드 또는 이의 분절을 암호화하는 cDNA는 적합한 프로모터에 유효하게 결합되고, 발현 벡터로 삽입되고, 적합한 숙주 세포로 트랜스펙션될 수 있다. 다음에, 숙주 세포를 전사 및 번역이 일어나는 조건하에 배양하고, 바람직한 폴리펩티드를 회수한다. 다른 조절된 전사 또는 번역 단편, 예를 들어, 폴리펩티드를 특이적 세포 구획에 향하게 하는(즉, 분비하기 위해서) 단일 서열을 사용할 수 있다. 원핵생물 숙주 세포의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, E. coli 및 B. subtilis를 포함한다. 진핵생물 숙주 세포의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며, 효모, 조류, 곤충, 식물 및 동물 세포(예: COS7, HeLa, CHO 및 다른 포유류 세포)를 포함한다. 효모 시스템은 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe 및 Pichia pastoris를 포함한다.
예를 들어, Pichia pastoris에서 (예를 들어, SMD 1168 및 SMD 1168H 균주를 사용하여) β2GPI 도메인 1 폴리펩티드를 발현시키기 위해서, β2GPI를 암호화하는 전체 길이 cDNA를 PCR 원형으로서 사용하여 아미노 말단에서 재구성된 Kex2 신호 펩티드 분리 위치를 갖는 도메인 1 유전자 분절을 형성한다. 분절을 발현 벡터 pPICZ알파로 클로닝하고(Invitrogen Corp.), 이는 제한 효소 Xho I 및 Sal I으로 선형화된다. 구성된 유전자는 본래의 도메인 1 신호 펩티드를 효모 알파-인자 신호 펩티드로 대체하고, 카르복시 말단에서 선택된 아미노산에서 종결된다.
발현 시스템을 사용하여 β2GPI 폴리펩티드를 제조하는 경우, 간혹 정제를 용이하게 하는 융합 단백질을 구성하는 것이 바람직하다. 이들 융합 단백질에 대한 성분의 예는 myc, HA, ELISA, His-6, 글루타티온 S-트랜스페라제, 말토스 결합 단백질 또는 면역글로불린의 Fc 부분을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이들 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Redd et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:11193-11197]. 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 바람직하지 않은 아미노산을 융합물, 예를 들어, His-6으로부터 제거할 수 있다. 예를 들어, 카르복시펩티다제 A를 사용하여 카르복시말단 아미노산을 제거할 수 있다. 카르복시펩티다제 A는 아미노산 프롤린 또는 아르기닌에서 중지된다. 정제를 편리하게 하기 위해서, 고체상 카르복시펩티다제 A(Sigma)를 사용할 수 있다.
바람직하게는, 특히 진단 목적으로 사용하는 경우, 폴리펩티드는 다른 세포 성분으로부터 적어도 부분적으로 정제되거나 분리된다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 50% 이상 순수하다. 본 발명에 있어서, 순도는 제제의 전체 단백질 성분의 중량 비율로서 계산한다. 더욱 바람직하게는, 단백질은 50 내지 75% 순수하다. 더욱 많이 정제된 폴리펩티드가 또한 수득될 수 있으며, 본 발명에 의해 포함된다. 임상용으로, 폴리펩티드는 바람직하게는 고도로 정제되어, 약 80% 이상 순수하며, 발열물질 및 다른 오염물질이 유리되어 있다. 단백질 정제 방법은 당해 분야에 공지되어 있으므로, 본원에서 상세히 기술하지 않는다.
특정한 시스템, 특히 특정한 재조합 시스템에서, 여분의(제5) 시스테인 또는 (예를 들어, 폴리펩티드를 플랫폼 분자로 포합시키기 위해서) 감소되는 시스테인을 함유하는 구체예에 대해서, 최초의 생성물은 저분자량 혼합된 이황화물을 포함할 수 있으며, 여기에서 제5(또는 여분의, 반응성) 시스테인은 다른, 비교적 저분자량 부분 또는 부분들에 공유 결합된다. 이들 예에서, 여분의 시스테인의 선택적 감소는 (다른 이황화 결합을 유지하면서) 바람직하다. 이러한 선택적 감소는 고체상 환원제(예: DTT)를 고형 지지체[예: 아크릴아미드(예: 미국 샌디에고 소재의 CalBiochem에 의한 REDUCTACRYL)]상에서 사용하여 수행할 수 있다.
추가로, 여분의 시스테인을 갖는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 제조하도록 고안되고/거나 사용되는 시스템에서(즉, 시스테인은 반응기로서 사용된다), 추가의 아미노산(들)이 서열에서 여분의 시스테인에 후속되도록 폴리펩티드을 제조하여, 합성 및/또는 제조 동안에 시스테인을 보호하는 것이 바람직할 수 있다.
바람직하게는, 특히 폴리펩티드가 (다음에서 논의된) 플랫폼에 포합되는 경우, 화학적 합성이 사용된다. 화학적 합성은 N 또는 C 말단의 변경을 허용하며, 이는 플랫폼 분자로의 포합을 용이하게 한다.
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드, 예를 들어, (이황화 결합을 형성하는) 도메인 1의 4개의 시스테인 이외에, 추가의 시스테인을 갖는 것을 제조하는 경우, 조건은 정확한 이황화 가교 형성을 촉진하도록 선택해야 한다. 예로서, 환원된 폴리펩티드는 6M 구아니디늄 염산염(GnHCl)에 용해시켜 0.5mg/mL의 농도를 수득함으로써 변성시킨다. 접힘은 다음 재변성 완충액에 대해 실온에서 투석하여 수행한다: 0.1M GnHCl, 0.5mM Tris-HCl 및 1mM EDTA, pH 8.5. 정확한 이황화 가교 형성을 보조하기 위해서, 0.3mM 및 3mM의 각각 산화 및 환원된 글루타티온의 혼합물을 첨가한다. 반응 혼합물은 HPLC로 감시하고, 상이한 생성물을 질량 분광분석법에 의해 분석한다. 본 발명자들의 실험에서, 폐환된 지 5시간 후, 분석 HPLC에 의해 약 65%의 전환율을 나타내며, 이중에서 약 50%는 정확한 질량(Mw=7266)을 갖고, 약 15%는 글루타티온 부가물(Mw=7567)로서 존재한다. 다음에, 접힌 단백질 결핍 글루타티온을 역상 HPLC로 정제한다.
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 포합체
본 발명은 또한, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 포합체를 제공한다. 특정한 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)은 담체 또는 표지로 포합될 수 있다. 이러한 결합을 수득하기 위한 다수의 기술은 당해 분야에 공지되어 있으므로, 본원에서 상세히 기술할 필요가 없다. 안전하고 숙주에 유해한 항체의 제조를 자체 유도하지 않는 담체를 사용할 수 있다. 적합한 담체는 일반적으로 크고 느리게 대사되는 고분자, 예를 들어, 단백질; 다당류, 예를 들어, 라텍스 관능화 세파로스, 아가로스, 셀룰로스, 셀룰로스 비드 등; 중합체 아미노산, 예를 들어, 폴리글루탐산, 폴리리신 등; 아미노산 공중합체; 및 불활성 바이러스 입자 또는 감쇄된 세균, 예를 들어, Salmonella이다. 특히 유용한 단백질 기질은 스크럼 알부민, 열쇠구멍 limpet 헤마시아닌, 면역글로불린 분자, 타이로글로불린, 오브알부민, 파상풍 유독소, 및 당해 분야의 전문가에게 익히 공지된 단백질이다.
표지는 당해 분야에 공지되어 있으므로, 본원에 상세히 기술할 필요가 없다. 당해 분야의 전문가에게 공지된 많은 상이한 표지 및 표지 방법이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 종류의 표지의 예는 효소, 방사선동위원소, 형광 화합물, 콜로이드성 금속, 화학발광 화합물 및 생물발광 화합물을 포함한다. 당해 분야의 전문가는 다른 적합한 표지를 알거나 통상적인 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있다. 또한, 이들 표지의 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합은 당해 분야의 전문가에게 일반적인 표준 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(가장 바람직하게는 T 세포 에피토프가 결핍됨)은 비-면역원성 원자가 플랫폼 분자("플랫폼"이라고도 함)에 포합될 수 있으며, 이는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 제시를 증진시킨다[참조: 미국 특허 제5,162,515호, 제5,276,013호 및 제5,552,391호]. 플랫폼은 단백성 또는 비-단백성 물질(즉, 유기물질)일 수 있다. 단백성 플랫폼의 예는 알부민, 감마글로불린, 면역글로불린(IgG) 및 오브알부민을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다[참조: Borel et al. (1990) Immunol. Methods 126:159-168; Dumas et al. (1995) Arch. Dematol. Res. 287:123-128; Borel et al. (1995) Int. Arch. Allergy Immunol. 107:264-267; Borel et al. (1996) Ann. N.Y. Acad. Sci. 778:80-87]. 가장 바람직하게는, 플랫폼은 다가이다(즉, 하나 이상의 결합 또는 연결 부위를 함유한다). 바람직하게는, 다가 플랫폼은 둘 이상의, 더욱 바람직하게는 3개 이상의, 더욱 바람직하게는 5개 이상의, 더욱 바람직하게는 7개 이상의, 더욱 바람직하게는 10개 이상의, 더욱 더 바람직하게는 12개 이상의, 더욱 더 바람직하게는 15개 이상의 연결 부위를 함유한다. 그러나 내성의 유도에 있어서(즉, 플랫폼이 적합한 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드와 함께 사용되어 면역내성을 초래하는 경우), 사용되는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 특성 및 특정한 조건에 따라서, 다수의 연결 부위가 충분할 수 있음이 이해된다. 또한, 플랫폼이 T 세포 의존성 항원이 아님이 이해된다.
바람직한 원자가 플랫폼 분자는 생물학적으로 안정화되며, 즉 이들이 치료 효능을 부여하기에 간혹 수시간 내지 수일 내지 수개월의 생체내 분비 반감기를 나타내고, 바람직하게는 정의된 조성물의 합성 단일사슬로 이루어진다. 이들은 일반적으로 약 200 내지 200,000, 바람직하게는 약 200 내지 약 50,000(또는 이 미만, 예를 들어, 30,000) 범위의 분자량을 갖는다. 본 발명내에서 원자가 플랫폼 분자의 예는 중합체이며(또는 중합체로 이루어진다), 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리-D-리신, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, D-글루탐산 및 D-리신(3:2의 비)이다. 바람직한 중합체는 분자량이 약 200 내지 약 8,000인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 기본으로 한다. 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 포합될 수 있는 다른 분자는 알부민 및 IgG이다.
본 발명에 사용하기에 적합한 다른 바람직한 원자가 플랫폼 분자는 화학적으로 정의된, 비-중합체 원자가 플랫폼 분자(예: 공동 소유의 미국 특허 제5,552,391호에 기술된 것)이다. 앞에서 기술된 더욱 전통적인 플랫폼과 반대로, 이들 플랫폼은 균질(즉, 일정) 분자량(다분산 분자량과 반대로)을 갖는다는 잇점을 갖고, 따라서 "화학적으로 정의"된다. 따라서, 이들 플랫폼을 사용하는 포합체의 집단은 균질한 분자량의 플랫폼을 포함하거나 실질적으로 단분산성인(즉, 좁은 분자량 분포를 갖는) 것으로 이해된다. 플랫폼 분자의 샘플(예: 플랫폼 분자의 조성물 및/또는 집단)의 분자량 분포의 폭의 척도는 샘플의 다분산성이다. 다분산성은 중합체 샘플의 분자량 균질성 또는 불균질성의 척도로서 사용된다. 다분산성은 중량 평균 분자량(Mw)을 수 평균 분자량(Mn)으로 나누어 계산한다. Mw/Mn 값은 완전 단분산 중합체에 대한 단위이다. 다분산성(Mw/Mn)은 당해 분야에서 유용한 방법, 예를 들어, 겔 투과 크로마토그래피에 의해 측정된다. 플랫폼 분자의 샘플의 다분산성(Mw/Mn)은 바람직하게는 2 미만, 더욱 바람직하게는 1.5 미만이거나 1.2미만이거나 1.07 미만이거나 1.02 미만이거나, 예를 들어, 약 1.05 내지 1.5이거나 약 1.05 내지 1.2이다. 대표적 중합체는 일반적으로 2 내지 5이거나, 특정한 경우, 20 이상의 다분산성을 갖는다. 원자가 플랫폼 분자의 낮은 다분산 특성의 잇점은 개선된 생체 적합성 및 생체 유용성을 포함하는데, 이는 분자의 크기가 실질적으로 균질하고, 분자량의 광범위한 변화에 기인하는 생물학적 활성의 변화가 최소화되기 때문이다. 따라서, 낮은 다분산성 분자는 약제학적으로 최적으로 제형화되며, 분석하기에 용이하다. 또한, 샘플에서 분자 집단의 원자가가 조절된다.
본 발명에 사용하기에 적합한 바람직한 균질의, 화학적으로 정의된 원자가 플랫폼 분자의 예는 유도체화 2,2'-에틸렌디옥시디에틸아민(EDDA) 및 트리에틸렌 글리콜(TEG)을 포함한다. 바람직한 균질의, 화학적으로 정의된 플랫폼의 다른 예가 다음에 뿐만 아니라 당해 분야에 기술되어 있다. 다른 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)은 알부민, IgG 및/또는 PEG에 포합된다.
추가의 적합한 원자가 플랫폼 분자는 테트라아미노벤젠, 헵타아미노베타시클로덱스트린, 테트라아미노펜타에리트리톨, 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 (Cyclam) 및 1,4,7,10-테트라아자시클로데칸(Cyclen)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일반적으로, 이들 플랫폼은 표준 화학적 합성 기술에 의해 제조된다. PEG는 유도체화되고 다가로 제조되며, 이는 표준 기술을 사용하여 수행된다. 포합체 합성에 적합한 몇가지 물질(예: PEG, 알부민 및 IgG)은 시판된다.
원자가 플랫폼 분자에 대한 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 포합은 일반적으로 폴리펩티드 및 원자가 플랫폼 분자 상에서 하나 이상의 가교결합제 및 작용기를 포함하여, 다수의 방법으로 수행될 수 있다. 플랫폼 및 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)은 적합한 결합기를 갖는다. 결합기는 표준 합성 화학 기술을 사용하여 플랫폼에 첨가한다. 결합기는 표준 고체상 합성 기술 또는 재조합 기술을 사용하여 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 첨가할 수 있다. 재조합 접근법은 결합제를 부착시키기 위해서 후-번역 변경을 필요로 할 수 있으며, 이러한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
예로서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 플랫폼에 커플링하기 위한 부위로서 사용되는 작용기(예: 아미노, 카르복실 또는 설프히드릴기)를 함유하는 아미노산 측쇄 부분을 함유한다. 이러한 작용기를 갖는 잔기는 폴리펩티드가 먼저 이들 기를 함유하지 않는 경우, 폴리펩티드에 첨가할 수 있다. 이러한 잔기는 고체상 합성 기술 또는 재조합 기술에 의해 혼입될 수 있으며, 이들은 둘다 펩티드 합성 분야에 익히 공지되어 있다. 폴리펩티드가 탄수화물 측쇄(들)을 갖는 경우, 관능성 아미노,설프히드릴 및/또는 알데히드기가 통상적인 화학에 의해 여기에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 1급 아미노기는 나트륨 시아노보로하이드라이드의 존재하에 에틸렌디아민과의 반응에 의해 혼입될 수 있고, 설프히드릴은 시스테아민 디사이드로클로라이드를 반응시킨 다음에, 표준 이황화 환원제로 환원시켜 도입할 수 있는 한편, 알데히드기가 페리오데이트 산화 다음에 발생될 수 있다. 유사한 방식으로, 원자가 플랫폼 분자가 또한 유도체화되어 이미 적합한 작용기를 갖지 않는 경우, 작용기를 함유할 수 있다.
폴리펩티드는 또한, 역 단백질 가수분해라 하는 방법에 의해 이의 C 말단에서 특이적으로 변경된 부위일 수 있다. 필수적으로, 역 단백질 가수분해는 단백질 분해 효소를 사용하여 반응이 그 방향으로 유도되는 조건을 사용하여 아미드 결합 형성을 촉매화한다. 폴리펩티드는 역 단백질 가수분해를 사용하여 변경되어 히드라지드 함유 결합제[참조: Rose, K. et al., Bioconjugate Chemistry 1991, 2, 154-159] 또는 아미노옥시 함유 결합제[참조: Rose, K. et al., Bioconjugate Chemistry 1996, 7, 552-556]를 아미드 결합을 거쳐 이의 C 말단에서 부착시켰다. 이러한 변경된 폴리펩티드는 반응하여 알데히드 또는 케톤기를 함유하는 중요한 다른 분자와 히드라존 또는 옥심 결합을 형성할 수 있다. 다른 결합제 이외에, 설프히드릴 결합제와 같은 것은 생각건대 역 단백질 가수분해를 거쳐 부착될 수 있다.
가변성 길이의 친수성 결합제는 원자가 플랫폼 분자에 폴리펩티드(또는 다른 생물활성 분자)를 연결하기에 유용하다. 적합한 결합제는 에틸렌 글리콜의 선형 올리고머 또는 중합체를 포함한다. 이러한 결합제는 화학식 R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2의 결합제(여기에서, n은 0 내지 200이고, m은 1 또는 2이며, R1은 H 또는 보호기(예: 트리틸)이고, R2는 H 또는 알킬 또는 아릴이다), 예를 들어, 4-니트로페닐 에스테르를 포함한다. 이들 결합제는 티오에테르를 거쳐 티올 반응기(예: 할로아실, 말레아미드 등)를 함유하는 분자를 아미드 결합을 거쳐 아미노기를 함유하는 제2 분자에 연결하는 데에 유용하다. 이들 결합제는 부착 순서에 대해 융통성이 있다. 즉, 티오에테르는 먼저 또는 나중에 형성될 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같이, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)은 다수의 적합한 플랫폼에 다수의 방법에 의해 포합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 테트라-브로모아세틸 플랫폼 PIZ/IDA/TEG-β2GPI 도메인 1이 사용된다. 다른 바람직한 구체예는 실시예에 있다.
PIZ/IDA/TEG(PITG) 플랫폼의 유도체는 다음에 나타난 바와 같이 제조될 수 있다.
포합체 구체예의 예로서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)은 N 말단에서 티올 결합제를 사용하여 고체상 펩티드 합성 또는 재조합 방법에 의해 제조된다. 결합제는 시스테인 또는 SH 함유 부분일 수 있다. 다음에, 변경된 폴리펩티드는 적합하게 유도체화된 플랫폼(예: 브로모아세틸 또는 요도아세틸)에 의해 알킬화될 수 있다.
특정한 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 설프히드릴기(티올 또는 SH)를 거쳐, 예를 들어, 시스테인 상에서 포합되어, 포합체에서 티오에테르 결합을 형성한다. 특정한 구체예에서, 이러한 반응성 시스테인은 β2GPI의 제5 시스테인을 포함함에 의해 제공된다(실시예 5).
특정한 구체예에서, 포합체는 옥심 결합을 거쳐 형성된다. 옥심 결합은 예를 들어, 카르보닐기(예: 알데히드 또는 케톤)를 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 상에서, 아미노옥시 반응기(예: 아미노옥시, 아미노옥시아세틸 및 아미노옥시알킬)를 함유하는 플랫폼과 반응시켜 형성할 수 있다. 아미노옥시기는 트리에틸렌 글리콜 또는 헥실 사슬상에 존재할 수 있다; 그러나 탄소, 산소, 질소 또는 황 원자를 포함하는 사슬은 -ONH2에서 종결된다면 충분하다.
이들 포합체를 제조하기 위해서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드는 폴리펩티드 상의 특정한 위치(예: N 말단)에서 알데히드 또는 케톤 부분을 생성하도록 선택적으로 변경된다. 두번째로, 폴리펩티드는 아미노옥시기를 함유하는 다가 플랫폼과 반응하여 플랫폼 및 폴리펩티드 사이에 옥심 결합을 형성한다.
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 N 말단은 아미노 교환 반응에 의해 알데히드 또는 케톤으로 전환될 수 있으며, 이는 당해 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 아미노 교환 반응은 N 말단 탄소-질소 단일 결합을 탄소 산소 이중 결합으로 전환시킨다. N 말단에서 글리신은 반응하여 글리옥실기, 알데히드를 형성한다. 대부분의 다른 아미노산은 반응하여 아미노산 측쇄에 의해 케톤을 형성한다.
N 말단에서 글리옥실기를 생성하는 다른 방법은 N 말단 세린 또는 트레오닌을 나트륨 페리오데이트로 산화시키는 것이다. 이러한 산화에 의해 글리옥실기를 제공하는 N 말단 세린 또는 트레오닌의 히드록실 및 아미노기 사이의 탄소-탄소 결합이 분해된다.
특정한 구체예에서, 아미노옥실아세틸(AOA) 반응기를 함유하는 다가 플랫폼이 제조되어 선택적으로 변경된 폴리펩티드를 플랫폼에 연결할 수 있다. 아미노옥시아세틸(AOA)기는 N-보호된 아미노옥시아세틸기로 아실화시킨 다음에, 보호기를 제거하여 아민기를 함유하는 다가 플랫폼에 편리하게 부착될 수 있다. 그러나 글리옥실 펩티드와 AOA-유도체화된 플랫폼의 반응은 느리게 진행되어, 폴리펩티드 및 플랫폼 사이에 옥심 결합을 형성하는 데에 수일이 경과한다. 실시예 5에는 포합 화합물 44의 합성이 기술되어 있으며, 이는 아미노 교환된 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드를 아미노아세틸화된 사량체 플랫폼에 부착시킨다. 본 발명은 이 포합체를 포함한다.
다른 구체예에서, 아미노옥시 알킬 반응기를 함유하는 플랫폼을 사용할 수 있다. 아미노옥시알킬기는 제1 탄소 상의 아미노옥시기로서 정의되며, 여기에서 제1 탄소는 바람직하게는 전자 구인성기(예: 카르보닐기의 일부인 제2 탄소)에 직접 부착되지 않는다. 본 발명자들은 아미노옥시 알킬기가 케톤 및 알데히드와 더욱 용이하게 반응하여 아미노옥시아세틸기보다는 옥심을 형성함을 관찰했다. 아미노옥시아세틸기는 일반적으로 카르보닐에 인접하지 않은 다른 아미노옥시기(아미노옥시알킬기)보다 덜 반응성인 것으로 나타난다. 아미노옥시아세틸기의 카르보닐은 전자 구인성 효과에 기인하여 반응성을 저하시키는 것으로 고려된다. 이들 플랫폼 및 포합체에 대한 더 많은 정보가 실시예 및 일반적으로 소유된 미국 특허원 제___________호(변리사 서류 번호 25231-2007400)에서 발견된다. 실시예 5에 기술된 포합 화합물 45는 아미노 교환된 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드를 아미노옥시 사량체 플랫폼에 부착시켜 합성한다. 본 발명은 이러한 포합체 뿐만 아니라 AO-기본 합성으로부터 생성되는 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드 옥심 포합체를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(분리된 천연 및 비천연 폴리뉴클레오티드를 포함)를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 제조에 유용하다. 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 제조는 당해 분야의 표준 기술(예: 재조합 클로닝/벡터 발현 및 단백질 정제 방법)을 사용하여 수행할 수 있다. 제조가 생체내에서 일어나는 경우, 적합한 발현 시스템, 예를 들어, 다음에 기술되는 것이 사용된다. (표준 단백질 서열 기술을 사용하여 수득된) 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 지식을 사용하여, 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 고안할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 (필요한 경우) 지놈 또는 cDNA 서열로부터 합성되거나 수득될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기에서 기술된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 이들 벡터는 당해 분야에 익히 공지되어 있으므로(예를 들어, 시험관내에서 사용하기 위한 것, 세균, 포유류, 효모 및 곤충 발현 시스템), 본원에 기술할 필요가 없다[참조: 예를 들어, Gacesa and Ramji, Vectors, John Wiley ＆ Sons (1994)].
본 발명은 또한, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 함유하는(즉, 이로 형질전환되거나 이를 포함하는) 숙주 세포를 포함한다. 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포를 둘다 사용할 수 있다. 원핵생물 숙주는 세균 세포, 예를 들어, E. coli. B. subtilis 및 마이코박테리아를 포함한다. 진핵생물 숙주 중에는 진균(효모 포함), 곤충, 조류, 식물 및 포유류 세포가 있다. 숙주 시스템은 당해 분야에 공지되어 있으므로, 본원에 상세히 기술할 필요가 없다. 본 발명의 숙주 세포는 특히, 상기에서 기술된 폴리뉴클레오티드의 정복제로서 및/또는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 제조에 비히클로서 사용할 수 있다. 이들은 또한, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 생체내 전달하기 위한 비히클로서 사용할 수 있다.
본 발명의 도메인 1 β2GPI 유사체
본 발명은 또한, 도메인 1 β2GPI 유사체(또는 동족체)를 제공하며, 이는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(전체 도메인 1을 포함)가 특이적으로 결합된(즉, 유사체가 β2GPI--의존성 항인지질 항체에 특이적인 에피토프를 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)과 공유하는) β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합된다. 다른 방법을 사용하여, 유사체는 도메인 1에서 에피토프를 모방한다(즉, β2GPI-의존성 항인지질 항체에 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 존재하에 경합적으로 결합된다). 유사체(들)은 상기에서 기술된 바와 같이, 다수의 화학 물질로 될 수 있다. 이의 화학적 특성에 따라서, 본 발명의 유사체는 화학 및 생화학(생물공학을 포함) 분야에서 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이들 유사체는 검출에 및/또는 내성원으로 사용할 수 있다. 내성원으로 사용하는 경우, 유사체(들)에는 검출가능한 T 세포 에피토프가 결핍되어 있다.
본 발명의 유사체는 통상의 기술을 사용하여 동정할 수 있다. 예를 들어, 후보 분자를 선별하여 이들이 (a) β2GPI-의존성 항인지질 항체에 결합되고/거나 (b) T 세포 에피토프가 결핍되어 있는지(즉, T 세포 반응 또는 T 세포 관련 활성을 유도하지 못하는지) 여부를 결정할 수 있다. 이들 활성 중의 하나 또는 둘다의 측정은 당해 분야 및 본원에 공지되어 있다. 후보 폴리펩티드 유사체의 선별은 당해 분야에 공지된 파지 표시 방법(마이크로패닝 포함)을 사용하여 수행할 수 있다(실시예 3 참고). 다음은 이들 기술 중의 몇가지에 대한 요약 설명이다.
많은 검정이 에피토프 라이브러리 스크린으로부터 최상의 에피토프를 동정하기 위해서 여러 정도의 엄격성으로 개발되었다. 검정은 엄격성을 증가시키기 위해서 본원에 기술되어 있다: 바이오패닝 ＜ 마이크로패닝 ＜ 파지-포착 ELISA ＜ 파지 ELISA = 콜로니 블롯 = 펩티드 ELISA.
"바이오패닝"은 친화성-정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체 및 파지 함유 랜덤 펩티드 삽입물을 혼합시킨 다음에, 항체-특이적 회수에 의해 결합된 파지를 포착하는 기술을 언급하는 것이다. 파지는 테트라사이클린-함유 배지에 보급된 다음에 분리되는 E. coli에 대한 테트라사이클린 내성을 부여한다. 바이오패닝의 다수 순회(round)에는 샘플에서 면역특이적 파지의 수가 풍부하다. 파지는 항상 선택된 3 내지 5회 순회의 종결시에 회수되지만, 항체를 선택하기 위한 저 친화성에서 비특이적으로 결합된 유일한 서열을 나타낼 수 있다. 이들 파지를 추가로 평가하는 방법(마이크로패닝)이 필요하다.
마이크로패닝은 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 파지의 상대적 결합 강도에 대한 평가를 제공한다. 마이크로패닝은 3회 순회 이상의 바이오패닝 다음에 수행되며, 바이오패닝 방법에서 사용된 것과 동일한 항체를 사용한다. 방법은 바이오패닝의 최종 순회로부터 파지의 희석 및 50개 이상의 이들 클론을 마이크로패닝에 의해 분석하는 것으로 이루어진다. 마이크로패닝은 각각의 클론을 유사한 밀도로 성장시킨 다음에, 희석 파지를 일정량의 항체로 미리 도포된 미량적정 웰에서 최적의 단일 농도로 희석 파지를 배양하여 수행한다. 파지의 최적 단일 농도는 가장, 마이크로패닝 점수의 가장 넓은 범위(0 내지 4)를 나타낼 것 같은 농도이며, 따라서 클론이 시험되면서 최대의 식별을 허용한다. 이는 점수가 일련의 희석에 의해 수득된 파지의 여러 농도 각각에서 측정된 6개의 임의로 선택된 클론의 마이크로패닝 거동을 근거로 한다. 항체로 배양한 후, 비결합 파지를 세척 제거하고, 결합된 파지의 양은 항체에 대한 파지 삽입의 친화성의 지표로서 사용한다. 결합된 파지의 양은 순한 산으로 용출시킨 다음에, 중화시키고 E. coli로 감염시켜 측정한다. 다음에, 감염된 E. coli의 수는 테트라사이클린을 함유하는 한천 플레이트 상에서 미생물을 배양한 다음에, 각각의 클론에 의해 수득된 콜로니 밀도를 측정하여 정량화한다.
파지-포착 ELISA 시험이 개발되어 중간 수준 검정을 제공함으로써 마이크로패닝 검정의 비교적 낮은 엄격도 및 파지- 또는 펩티드-ELISA 검정의 높은 엄격도 사이의 간격을 메운다. 예비 연구는 특정한 항체 제제가 마이크로패닝함으로써 너무 많은 양의 클론을 제공하지만, 파지-ELISA 또는 펩티드-ELISA에 의해 어떠한 것도 제공하지 않음을 나타낸다. 다음에 기술된 파지-ELISA의 제한 사항은 p-III의 5개 복사만이 각각의 파지 위에 위치하며, 웰 위에 도포된 다수의 파지를 사용해서도, 삽입물의 복사가 거의 나타나지 않으며, 검출은 항체가 삽입물에 매우 높은 친화성을 가짐을 필요로 한다는 것이다. 파지-포착 ELISA를 사용하여, 신호는 수차례 증폭되어, 낮은 친화성, 항체 및 삽입물 사이의 안정한 상호작용의 검출을 용이하게 한다.
파지-포착 ELISA는 다음 단계로 이루어진다. 미량적정 웰을 β2GPI-의존성 항인지질 항체로 도포하고, 파지 클론을 마이크로패닝 검정에서와 같이 첨가한다. 비결합 파지를 세척 제거하고, 결합된 파지의 양은 파지에 결합된 효소-포합된 염소 항혈청을 사용하여 정량화한다. 파지-포착 ELISA를 사용하여 선별된 파지는 많은 aPL 혈청과 반응하여 후속 ELISA 검정에서 강한 신호를 제공한다. 이러한 중간 수준의 감수성은 펩티드 합성 노력에서 더욱 큰 효율을 허용하는데, 마이크로패닝-양의 파지는 파지-포착 ELISA 양수가 거의 아니기 때문이다. 결과로서, 양의 파지-포착 ELISA 파지로부터 합성된 펩티드는 일반적으로 면역반응성이다.
파지-ELISA 선택 방법은 선별 항체에 매우 긴밀한 삽입물의 결합을 필요로 한다. 파지는 미량적정 플레이트의 웰 위에로 직접 도포되고, 선별 항체로 배양된다. 세척하여 비결합 항체를 제거한 후, 항-사람 IgG 알칼리성 포스파타제 포합체를 첨가하여 파지에 결합된 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 결합시킨다. 다음에, β2GPI-의존성 항인지질 항체는 당해 분야에 익히 공지된 방법에 따라서 알칼리성 포스파타제와 반응하는 웰에 비색 기질을 첨가하여 검출한다.
콜로니 블롯 검정은 생물패닝된 파지에 의해 감염된 E. coli의 대량 콜로니 선별을 허용한다. 이 방법은 면역반응성 클론을 동정하기 위한 파지-ELISA에 대한 대안이며, 시험 전에 개별적인 파지 클론의 배양을 필요로 하지 않으면서 상당한 수준의 감수성을 나타낸다. 이 검정에서, 바이오패닝의 1회 순회로부터 파지로 감염된 E. coli를 직경이 큰 니트로셀룰로스(NC) 막 위에 살포하고, 밤새 테트라사이클린을 함유하는 한천 플레이트의 표면 위에서 배양한다[참조: Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982]. 각각의 콜로니가 동일한 서열을 함유하는 파지에 의한 감염으로부터 초래된다. NC 상에서 수차례 복제 이동 블롯은 이러한 NC "마스터"를 사용하여 제조되며, 한천 플레이트의 표면 위에서 성장시킨다. 블롯 위에서 파지-감염된 콜로니의 화학적 및 효소성 분해 후, 파지는 Western 블롯, 즉 염색 또는 면역블롯에 일반적으로 사용되는 기술에 의해 탐침할 수 있다. 차단된 블롯은 선별 aPL 항체로 배양할 수 있다. 세척하여 비결합 항체를 제거한 후, 항-사람 IgG 양고추냉이 퍼옥시다제 포합체를 첨가하여 파지에 결합된 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 결합시킨다. 비색 기질을 첨가하여 추가로 연구하기 위해 클로닝될 수 있는 면역특이적 파지를 나타내는 마스터 플레이트에서 별도의 콜로니를 배치하게 한다.
DNA 서열화하여 상기에서 기술된 검정에서 최상의 반응 파지의 펩티드 삽입 서열을 결정한 후, 상응하는 펩티드는 당해 분야에 익히 공지된 바와 같이 표준 Fmoc 펩티드 화학을 사용하여 제조한다. 펩티드-ELISA 검정하기 위해서, 펩티드는, 예를 들어, 분지된 4가 분자로서 제조할 수 있으며, 즉 각각의 분자는 삽입물의 4회 복사를 갖는다. 이러한 분자는 미량적정 플레이트의 웰을 도포할 수 있으며, 여전히 용액에 노출된 에피토프를 함유함으로써 항체에 의해 결합시킨다. 4가 펩티드는 상기에서 논의된, Map에 사용된 방법과 유사한 제1의 2회 커플링에서 분지점으로서 리신을 혼입하여 합성한다[참조: Posnett et al. (1988)]. 글리신-세린-글리신-세린으로 이루어진 스페이서를 각각의 암 위에 리신 다음에 첨가한 다음에, 파지에서 발견된 골격 아미노산, 카르복실 말단에서 프롤린-글리신 및 아미노 말단에서 알라닌-글리신-프롤린을 포함하여 삽입물을 첨가한다. 이 합성에서 모든 아미노산은 표준 Fmoc 방법을 사용하여 1회에 하나를 첨가한다.
다음에, 이들 펩티드는 미량적정 웰에 펩티드를 도포한 다음에, 이의 반응성을 표준 ELISA형으로 aPL 항체를 사용하여 검정하여 수행되는 ELISA에 의해 검정한다. 수행시에, 펩티드는 일반적으로 원래의 선별 항체에 매우 강하게 결합되고, 다른 β2GPI-의존성 항인지질 항체와 특정한 교차 반응성을 나타낸다. 비-β2GPI-의존성 항인지질 항체의 조절이 포함되어 비특이적 결합 펩티드를 제거한다.
펩티드 경합적 결합 ELISA에 의해 두개의 펩티드가 주어진 개체의 혈청에서 항체의 동일한 집단을 결합시키고 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 친화성을 정량화하는지 여부를 결정한다. 이 검정에서, 많은 단량체 펩티드는 미량적정 플레이트 웰에 도포된 4가 펩티드와 경합한다. 검정을 수행하기 위해서, 평가되는 펩티드는 단량체로서, 즉 4가 펩티드의 합성에 사용되는 리신 측쇄를 사용하지 않으면서, 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성한다. 다음에, 단량체 펩티드를 정제하고 공지된 농도에서 용해시킨다. 미량적정 플레이트의 웰을 공지된 4가 펩티드로 도포하여 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 결합시킨다. 단량체 펩티드의 일련의 희석액을 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 일정한 희석액을 사용하여 배양한다. β2GPI-의존성 항인지질 항체의 희석액은 항체를 4가 펩티드에 대해 적정하고 적정 커브의 하향에 대해 희석액을 선택하여 미리 측정한다. 항체 및 단량체 펩티드를 1시간동안 배양한 후, 항체/펩티드 용액을 미량적정 웰에 첨가하고, 표준 비색 ELISA를 수행한다. 4가 펩티드를 사용하여 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 결합을 감소시키는 각각의 단량체 펩티드의 농도는 각각의 웰에 대해 수득된 비색계 기록을 플롯팅하여 측정한다. 50% 억제 지점은 단량체 펩티드에 대한 상대적 결합 강도의 척도로서 사용한다.
이 검정의 변형은 4가 펩티드 대신에 β2GPI-1/카디오리핀을 사용하여 도포된 미량적정 플레이트를 사용하며, 단량체 펩티드가 β2GPI/CL 상의 에피토프(들)에 대한 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 결합을 차단하는 능력을 시험한다. 이 검정에서, 최적 농도에서 IgG-결실된 사람 혈청은 β2GPI의 공급원으로서 사용된다. 여러 농도에서 단량체 펩티드는 최적 농도의 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 사용하여 4가 펩티드를 플레이트 기질로서 사용하는 검정과 유사한 방법으로 배양한다. (β2GPI/CL) 플레이트에서 β2GPI-의존성 항인지질 항체/펩티드를 배양한 후, 50% 억제에 필요한 항체 결합 및 펩티드 농도는 4가 검정에서와 같이 반-최대 흡수도에서 측정한다.
이 검정의 추가 변형에 의해 단량체 펩티드가 Nunc Maxisorp 미량적정 플레이트의 웰에 직접 도포된 β2GPI에 대한 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 결합을 차단하는 능력을 시험한다. 이 변형에서, 카디오리핀의 사용은 생략되며, 생선 젤라틴 대신에, 사용된 시약 희석제 및 차단제는 탈지유이다.
이 검정의 다른 변형에 의해 다가 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 포합체 내성원 분자 또는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 단량체가 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 혈청 또는 혈장에서 Nunc Maxisorp 미량적정 플레이트의 웰에 직접 도포된 β2GPI에 대한 결합을 차단하는 능력을 시험한다. 검정에서 카디오리핀은 사용되지 않는다. 탈지유 + 세제 Tween-80은 차단 및 시약 희석 용액 둘다에 사용된다.
내성 유도에 바람직한 에피토프는 가능하면 β2GPI-의존성 항인지질 항체와 상호작용할만큼 강하지만, 불필요한 잔기를 함유하지 않는다. 에피토프의 최소 구성을 추론하기 위해서, 각각의 펩티드의 유사체는 (i) 주어진 잔기, 예를 들어, 카르복실 및/또는 아미노 말단에서 골격 잔기가 결실된 채로 제조되거나, (ii) 여기에서, 에피토프 라이브러리 스크린에서 밝혀진 서열과 상이한 아미노산 치환체가 제조되었다. 이들 아미노산 치환체는 자연적 물질, 예를 들어, 류신에 대해 이소류신이거나 비자연적 물질, 예를 들어, 프롤린에 대해 알파 메틸 프롤린일 수 있다. 다음에, 이들 검출 및/또는 치환의 효과는 펩티드-경합 ELISA를 거쳐서 측정된다.
본 발명은 또한, 유사체(들), 유사체(들)을 포함하는 조성물, 유사체(들)을 포함하는 키트 및 폴리펩티드 유사체(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 포합체를 포함한다. 이들 구체예를 제조하고 사용하는 방법은 앞의 절에서 기술되었으며, 제시된 원리 및 기술이 마찬가지로 유사체에 적용된다.
본 발명의 조성물
본 발명은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(상기에서 기술된 모든 폴리펩티드 구체예, 예를 들어, 융합물, 중합체 폴리펩티드 및 포합체를 포함) 뿐만 아니라 도메인 1 β2GPI를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 유사체(들)을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 이들 조성물은 내성 유도로부터 유리하게 될 수 있는 개체에 투여하기에 특히 유용하다. 조성물은 또한, 검출 시스템에서 시약으로서 유용하다.
일반적으로, 내성 유도에 사용하기 위한 본 발명의 조성물은 유효량의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(또는 유사체(들))을 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 부형제 중에 포함하며, 많은 제형으로 존재할 수 있다. 당해 분야에 익히 공지된 바와 같이, 약제학적으로 허용되는 부형제는 약리학적으로 유효한 물질의 투여를 용이하게 하는 비교적 불활성 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 조밀도를 제공하거나 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 삼투몰 농도를 변화시키기 위한 염, 봉입제, 완충제 및 피부 침투 증진제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 부형제 뿐만 아니라 비경구 및 경구 약물 투여용 제형이 문헌에 기술되어 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 19th Ed. Mack Pubilshing (1995)].
일반적으로, 이들 조성물은 주사에 의해 투여하기 위해(예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등) 제형화된다. 따라서, 이들 조성물은 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 비히클(예: 식염수, Ringer액, 덱스트로스 용액 등)과 혼합된다. 일반적으로, 포합체는 실제적, 경험적 고려사항(예: 용해도 및 삼투몰 농도)에 기인하여 제형의 약 0.01 내지 10중량%를 일반적으로 구성한다. 특정한 투여 섭생법, 즉 용량, 타이밍 및 반복은 특정 개체 및 개체의 의학적 병력에 따라 다르다. 일반적으로, 약 1μg 내지 약 100mg 포합체/체중 kg, 바람직하게는 약 100μg 내지 약 10mg/ 체중 kg의 용량이 1주에 제공된다. 경험적 고려사항, 예를 들어, 반감기는 일반적으로 용량 결정의 원인이 된다. 다른 적합한 투여 스케쥴은 매일 또는 1주에 3회 또는 1주에 1회 투여 또는 2주 내지 4주마다 1회 투여 또는 1개월에 1회 투여처럼 빈번하거나 개체 또는 질병 상태에 따라서 덜 빈번한 스케쥴일 수 있다. B 세포 회전 속도에 따라 일반적으로 타이밍된 반복 투여가 체액 무반응의 상태를 수득하고/거나 유지하는 데에 필요할 수 있다. 이러한 반복 투여는 일반적으로, 항체 GPL 점수의 증가가 검출되는 경우, 30일 내지 60일 또는 그 이상마다 약 1μg 내지 약 10mg/체중 kg의 치료를 포함한다. 또는, 조성물의 연속적 서방성 제형이 특정 병변에 처방될 수 있다. 서방성을 수득하기 위한 많은 제형 및 장치가 당해 분야에 공지되어 있다.
다른 제형은 당해 분야에 공지된 적합한 투여 형태를 포함하며, 이는 담체(예: 리포솜)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다[참조: Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859]. 리포솜 제제는 시토펙틴, 다층판 소포 및 단층판 소포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
특정한 구체예에서, 하나 이상의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(또는 유사체(들))은 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 하나 이상의, 둘 이상의, 3개 이상의, 4개 이상의 상이한 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 함유할 수 있다. 이러한 "칵테일"은, 이들이 당해 분야에서 빈번하게 기록된 바와 같이, 더욱 넓은 범위의 개체 집단의 치료에 특히 유용할 수 있다. 이들은 또한, 하나만의(또는 칵테일에 함유된 것보다 적은 수의) 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 사용하는 것보다 더욱 유효하다는 점에서 유용할 수 있다.
조성물은 단독으로 또는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 유효성을 증진시키고/거나 보충하는 데에 사용되는 다른 형태의 제제와 함께 투여될 수 있으며, 이는 항-헬퍼 T 세포 치료를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 치료는 일반적으로 T 세포를 억제하는 제제(예: 스테로이드 또는 사이클로스포린)를 사용한다.
이러한 조성물을 수용하는 적합한 개체는 당해 분야에 공지된 임상적 파라미터, 예를 들어, β2GPI-의존성 항인지질 항체의 GPL 점수의 측정, 특히 질병 상태(들)과 연관된 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 존재의 측정 및/또는 β2GPI-의존성 항인지질-연관된 병변의 증상을 사용하여 확인할 수 있다. 바람직하게는, 개체는 사람이다. β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대해서, 약 10 이상, 바람직하게는 약 20 이상, 더욱 바람직하게는 약 40 이상의 GPL 점수는 이들 조성물의 투여를 처방할 수 있다. 이 점수는 고체상 β2GPI-의존성 항인지질 항체 ELISA(예를 들어, Inova(San Diego); Theratest(Chicago); APL Diagnostics(Louisville))인 현재 공업적으로 이용가능한 검정을 근거로 한다. 또한, 이들 조성물을 투여하기 위해 β2GPI-의존성 항인지질 항체-연관된 장해(즉, 질병)의 가족력을 갖는 개체, 또는 "정상" GPI 점수를 갖는 것으로 고려되지만, 일정 기간에 걸쳐 증가된 GPL 점수를 나타내는 개체가 지시된다.
일반적으로, 이들 조성물의 투여 효능은 상기에서 기술된 임상적 파라미터, 특히 β2GPI-의존성 항인지질 GPL 점수의 변화를 측정하여 조절된다. 그러나 치료받는 상태와 연관된 것으로 고려되거나 나타난 파라미터의 측정이 적합하다.
시약으로서(검출 검정에서와 같이) 사용될 수 있는 조성물에 대해서, 이들 조성물은 일반적으로 검출을 수행하기에 충분한 양의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(즉, 하나 이상의 폴리펩티드)을 포함한다. 이들 양은 실험적으로 용이하게 측정된다. 이들 조성물은 검출을 수행하는 물질(예: 완충제)을 추가로 포함한다. 이들 조성물은 또한, 검출 매트릭스, 예를 들어, 고체상(예를 들어, 면역친화성 컬럼에서)으로 임의로 착화될 수 있다.
β2GPI 도메인 1 폴리펩티드(들)을 포함하는 키트
본 발명은 또한, 하나 이상의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(또는 하나 이상의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) 유사체) 및, 임의로 표준으로서 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 대한 항체를 함유하는(즉, 포함하는) 키트, 바람직하게는 β2GPI-의존성 항인지질 항체 검출용 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 사용하는 진단 및 감시 방법은 진단 연구소, 실험 연구소, 개업자 또는 사적인 개인에 의해 수행될 수 있다. 본 발명에 의해 구체화된 키트는 누군가가 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 대한 항체, 예를 들어, 본원에 기술된 것의 존재에 대한 검정을 수행하게 하고, 따라서 항체를 검출하고/거나 정량화하는 것을 포함한다. 본 발명에 의해 구체화된 키트는 또한, 예를 들어, 탈체 또는 생체내 트랜스펙션된 세포에서 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 대한 항체를 검출하게 하는 키트를 포함한다. 따라서, 본 발명은 항-도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) 항체, 바람직하게는 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 생물학적 샘플에서 검출하고/거나 정량화하기 위한 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 함유하는 키트를 포함한다. 본 발명의 키트는 적합한 포장으로 존재하며, 임의로 방법에 유용한 추가 성분을 제공할 수 있다. 이들 임의 성분은 완충제, 포착제, 현상제, 표지, 반응 표면, 검출 수단, 대조 샘플, 지시 및 설명 정보를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
항체(예: 표지된 항-사람 항체)의 결합을 검출하는 적합한 수단이 , 사람 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 존재를 시험하는 경우, 사용될 수 있으며(또한, 키트에 제공될 수 있으며), 여기에서 표지는 효소, 형광단, 화학발광 물질 방사성 동위원소, 조효소일 수 있다. 일반적으로, 사용된 표지는 효소이다.
β2GPI-의존성 항인지질 항체를 검출하는 이외에, β2GPI 폴리펩티드(들)(또는 하나 이상의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) 유사체)은 응집(응괴)을 검출하기 위한 키트의 성분일 수 있다. 이러한 키트는 혈전증 경로의 매개에 있어서 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 역할(있는 경우)의 검출을 가능하게 한다. 예를 들어, β2GPI-의존성 항인지질 항체는 활성화된 단백질 C에 의해 활성화된 Va 인자의 불활성화를 지연시키거나 조직 인자 응고 경로를 활성화한다. 본 발명자들은 도메인 1 특이적 항-β2GPI 항체가 실시예 11에서 논의된 바와 같이 Va 인자의 불활성화를 지연시킴을 밝혀냈다. 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 유사체(들))은 Va 인자의 불활성화 또는 조직 인자 경로의 활성화에 영향을 주는 다른 메커니즘으로부터 β2GPI-의존성 항인지질 항체-매개된 효과를 식별하는 데에 유용할 수 있다. 또한, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 유사체(들))은 다른 기능적 응고(예: 혈전증) 검정에 유용할 수 있으며, 여기에서 개체로부터 β2GPI-의존성 항인지질 항체 또는 혈청 또는 혈장은 특이적 응고 검정의 결과에 영향을 준다. 예를 들어, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 유사체(들))의 존재가 응고 검정의 결과를 변화시키는 경우(도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 유사체(들))의 부재하에 이러한 검정의 결과와 비교하는 경우), β2GPI-의존성 항인지질 항체가 응괴 경로에 포함된다. 이 정보는 유효한 특수 치료의 분석에 특히 유용하다.
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(및 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 유사체)를 사용하는 방법
본 발명은 또한, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 유사체(들))을 사용하는 방법을 제공하며, 이는 검출 및/또는 치료에 적용가능하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 본 발명의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 유사체(들))을 사용하여 생물학적 샘플에서 적합한 표적을 검출하는 방법을 포함한다. 폴리펩티드를 사용하여 진단(즉, 검출) 시험을 수행하는 방법은 당해 분야에 광범위하게 공지되어 있으며, 통상의 전문기술을 갖는 개업자에게 일반적인 것이다. 일반적으로, 본 발명의 진단(즉, 검출) 방법을 수행하기 위해서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 유사체 중의 하나(일반적으로 조성물로서)가 생물학적 샘플에서 반응하는 표적을 검출하는 시약으로서 제공된다. 표적은 진단 파라미터가 측정되는 개체로부터 적합한 생물학적 샘플을 수득하여 공급된다. 필요한 경우, 표적은 샘플로부터 부분적으로 정제되거나 증폭된 후, 검정을 수행할 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 폴리펩티드(들) 또는 유사체(들)을 사용하여 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 폴리펩티드 폴리뉴클레오티드 및/또는 유사체를 사용하여 내성을 유도하는 방법을 제공한다.
β2GPI-의존성 항인지질 항체의 검출
한 구체예에 있어서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들), 바람직하게는 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합되는 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 이들 방법은, 예를 들어, 개체에서 β2GPI-의존성 항인지질 항체 수준을 진단하고/거나 감시하기 위한 임상적 설정에서 일반적으로 적용가능하다. 이들 방법은 샘플에서 (β2GPI-의존성 항인지질) 항체와 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(즉, 본 발명의 폴리펩티드)를, 항-도메인 1 β2GPI 특이적 항체(예: β2GPI-의존성 항인지질 항체) 및 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) 사이에 안정한 착체를 형성하기에 적합한 조건하에 접촉시키고, 존재하는 경우, 형성된 안정한 착체를 검출함을 포함한다. 본 발명의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)은 이들 방법을 특히 유용하게 만드는데, 이들 항체에 대한 일반적으로 편리하거나 적합한 검정이 아직 개발되지 않았기 때문이다. 다수의 면역검정 방법이 당해 분야에 공지되어 있으므로, 상세히 기술할 필요가 없다. β2GPI-의존성 항인지질 항체를 측정하기에 적합한 샘플은 혈청 또는 혈장(바람직하게는 혈청) 및 표적 조직 용출물을 포함하여, 생물학적 샘플이다. 형성된 착제의 검출은 직접적(예: 착체와 연관된 표지의 양을 측정함에 의해) 또는 간접적(예: 검정 동안에 대체된 표지된 리간드의 양을 측정에서)일 수 있음이 당해 분야에서 익히 이해된다.
개체에서 이러한 항체의 검출에서 본 발명의 폴리펩티드(들) 또는 유사체(들)을 사용하기 위해서, 면역검정을 수행한다. 폴리펩티드(들) 또는 유사체(들)이 시약으로서 제공되며, 항체는 생물학적 샘플에서 표적이다. 예를 들어, 혈청 샘플에 존재하는 사람 IgG 항체 분자는 고체상 단백질 A로 포착한 다음에, 표지된 폴리펩티드 시약으로 덮을 수 있다. 다음에, 항체의 양은 고체상에 부착된 표지에 비례한다. 또는, 폴리펩티드를 발현하는 세포 또는 조직 단면을 항체를 함유하는 시험 샘플로 먼저 덮은 다음에, 표지된 항-면역글로불린과 같은 검출 시약으로 덮을 수 있다. 다음에, 항체의 양은 세포에 부착된 표지에 비례한다. 샘플에서 검출된 항체의 양은 대조 샘플에서 검출된 양과 비교한다.
본 발명의 방법에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 또는 유사체는 적합한 고체상, 예를 들어, 친화성 컬럼 충전재 또는 플라스틱 표면(예: 미량적정 플레이트 또는 계량봉) 위에서 공지된 기술에 의해 일반적으로 고정된다. 적합한 친화성 컬럼 충전재는, 예를 들어, 비드 아가로스 매트릭스, 폴리아크릴아미드, 유리, 셀룰로스 또는 가교결합된 덱스트란을 포함한다. 적합한 플라스틱 표면은 폴리메타크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리테레프탈레이트, 에틸렌 글리콜, 폴리에스테르, 폴리프로필렌 등을 포함한다. 일반적으로, 표준 미량적정 플레이트를 사용할 수 있다. 또는, 고체상은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 또는 유사체가 혼입되는 겔 또는 매트릭스 형태로 존재할 수 있다.
추가로 예시하기 위해서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(예: β2GPI-의존성 항인지질 항체)에 특이적으로 결합된 항체를 잠재적으로 함유하는 시험 샘플을 비제한 소정량의, 일반적으로 검출가능하게 표지된(예: 방사성 동위원소 또는 효소를 사용) 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)과 혼합할 수 있다. 액체상 검정에서, 미반응 시약은 분리 기술(예: 여과 또는 크로마토그래피)에 의해 제거한다. 이들 면역검정 기술에서, 착체와 연관된 표지의 양은 샘플에 존재하는 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 양과 양으로 상관된다. 유사한 검정이 고안될 수 있으며, 여기에서 시험 샘플 중의 β2GPI-의존성 항인지질 항체는 제한된 양의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 결합하기 위해 표지된 항체와 경합한다. 여기에서, 표지의 양은 샘플 중의 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 양에 음으로 상관된다.
특정한 구체예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플 또는 조직 용출물이고, 조직 샘플과 연관된 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 양은, 예를 들어, 경합적 결합 검정에 의해 측정한다. 이들 방법은 그러한 상황에서 특히 유용할 수 있으며, 여기에서 특정한 조직이 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 존재 및/또는 양에 대해 시험되고/거나 감시된다. 이러한 종류의 검정은, 예를 들어, 특정한 질병(또는 질병의 위험)이 (혈전증 또는 응괴 장해의 특정한 형태와 같이) 지시될 수 있는지 여부를 지시할 수 있다. 이러한 검정은 또한, 진단 및/또는 감시하기 위해서 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 국재를 더욱 정확하고 민감하게 측정하는 데에 유용할 수 있다. 추가로, β2GPI-의존성 항인지질에 대한 국재 정보는 또한, 적합한 치료 선택에 대한 적응을 임상의에게 제공할 수 있다.
이들 검출 방법은 많은 임상적 상황에서 적용가능함을 이해한다. 예를 들어, 검출을 사용하여 β2GPI-의존성 항인지질-연관된 상태 또는 장해(이는 다시 병변과 연관된 항체를 구분할 수 있는 것으로부터 발생할 수 있으며, 이들은 병변과 연관되어 있지 않다)를 발현시킬 위험이 있는 개체를 확인할 수 있다. 검출은 또한, 사용되어 (상기에서 기술된 조성물의 투여와 같은) 치료를 감시할 수 있다. 검출은 또한, 병원성 항체를 비-병원성 항체와 구분하는 것을 보조할 수 있다. 검출은 또한, 임상의가 최상의 치료 선택 및/또는 예후를 결정하는 것을 보조할 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같이, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 유사체(들))은 또한, 응고 검정, 특히 β2GPI-의존성 항인지질 항체가 특정 응고 검정의 결과를 변경시킬 수 있는 검정에서 진단 성분으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 유사체(들))의 존재가 응고 검정의 결과를 변화시키는 경우(도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 유사체(들))의 부재하에 이러한 검정의 결과와 비교하는 경우), β2GPI-의존성 항인지질 항체가 응괴 경로에 포함된다. 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 유사체(들))은 β2GPI-의존성 항인지질 항체-매개된 효과를 응고에서 다른 메커니즘(예: 혈전증)과 구별하는 데에 유용할 수 있으므로, 본 발명은 (a) 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 유사체(들))을 사용하는, 개체로부터 적합한 생물학적 샘플을 사용하여 응고 검정을 수행하고; (b) 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(및/또는 유사체(들))을 사용하지 않는, 개체로부터 적합한 생물학적 샘플을 사용하여 응고 검정을 수행하고; (c) (a) 및 (b)의 결과를 비교함을 특징으로 하여, 응고(예: 혈전증)에서 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 관여(매개)를 검출하는 방법을 포함하며, 여기에서 결과의 차이는 응고에서 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 관여를 지시한다. 이들 방법은 또한, 사용되어 응고에서 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 매개에 의해 환자의 상태 뿐만 아니라 최초 검출을 감시할 수 있다. 이들 방법은 또한, β2GPI-의존성 항인지질 항체를 포함하는(즉, 이에 의해 매개된) 응고 비정상을 지시하거나 검출한다.
이들 방법을 위해서, 혈장 또는 혈청을 사용할 수 있다. 또는, 당해 분야에서 표준 방법을 사용하여 분리된 IgG 분획을 사용한다. 응고 검출 시스템의 예가 실시예 11에 제공되어 있다. 특정한 구체예에서, 활성화된 V(Va) 인자 수준은, 일반적으로 응괴되는 시간을 측정함으로써 측정한다. 응고를 검출하는 검정, 장치 및 키트는 당해 분야에 공지되어 있으며, 시판된다.
β2GPI-의존성 항인지질 항체의 정제
본 발명은 또한, β2GPI-의존성 항인지질 항체와 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) 또는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 유사체를, 안정한 항원-항체 착체의 형성을 허용하는 조건하에 접촉시키고, 존재하는 경우, 형성된 착체를 수득함을 특징으로 하여, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(예: β2GPI-의존성 항인지질 항체)에 특이적으로 결합된 항체를 정제하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) 또는 유사체(들)을 친화성 컬럼 정제하기 위해서 친화성 매트릭스에 커플링시킨다. 이러한 방법은 당해 분야에서 일반적이므로, 본원에 상세히 기술할 필요가 없다. 실시예 1에는 또한, β2GPI-의존성 항인지질 항체의 친화성 정제가 기술되어 있다.
내성을 유도하는 방법
또한, 본 발명에는 개체에게 모두 검출가능한 T 세포 에피토프가 결핍되어 있는, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(또는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 포함하는 폴리펩티드) 또는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)의 유사체 유효량을 투여함을 특징으로 하여, 내성을 유도하는(즉, 내성원성 상태) 방법이 포함된다. 바람직하게는, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)(또는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 포함하는 폴리펩티드 또는 유사체(들))은 또한, 상기에서 기술된 바와 같이 적합한 플랫폼 분자에 포합된다. 본 발명을 위해서, 내성 유도를 거쳐 감소되는(및/또는 제거되고, 안정화되거/거나 증가 속도가 감소되는) 면역 반응은 β2GPI에 대한 면역 반응임이 이해된다. 따라서, 유도된 내성은 항원 특이적이며, 여기에서 항원은 β2GPI이고, 내성은 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 갖는다고(적어도 본 발명의 폴리펩티드(들) 및/또는 유사체(들)을 투여하기 전에) 측정된 개체에서 수득된다.
본 발명의 적합한 폴리펩티드(즉, T 세포 에피토프가 결핍되어 있는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) 또는 유사체(들))는 단독으로 또는 바람직한 활성/목적을 촉진하는 다른 제제와 함께 사용할 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 많은 폴리펩티드는 또한, 서로와의 많은 배합물로 사용할 수 있다. 많은 제형 및 투여 수단이 상기에서 논의되었다.
내성이 유도되는지 여부의 결정은 당해 분야에서 공지된 수단에 의해 수행할 수 있다. 일반적으로, 내성은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 대한 면역 반응을 측정하여 측정한다. 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 대한 면역 반응은, 예를 들어, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) 또는 유사체(들)에 결합되는 항체의 수준을 측정함을 포함하여, 표준 검정을 사용하여 측정할 수 있다; 시토킨 생성을 측정한 후, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)로 면역시키고; 본 발명의 β2GPI 폴리펩티드(들) 또는 유사체(들)을 투여한 후, 이러한 투여를 수용하는 개체(즉, β2GPI-의존성 항인지질 항체를 갖는 개체)로부터 T 세포를 사용하여 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 대한 T 세포 반응의 시험관내 분석을 수행하고, 이는 예를 들어, 항원-제시 세포의 환경에서 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)로 제시되는 경우, T 세포의 증식을 측정하는 표준 검정3H-티미딘 흡수, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 제시하는 세포의 세포독성 T 세포에 의한 사멸을 측정하는 표준51Cr 방출 검정 등을 포함한다.
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되며, 본 발명을 제한하지는 않는다.
본 발명은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드, 이들 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 유사체, 조성물, 및 이들 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 및 유사체를 사용하는 방법을 제공한다.
따라서, 한 측면으로 본 발명은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공하는데, 이 폴리펩티드는 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합하며, 폴리펩티드는 도 1 에 도시되어 있는 바와 같이 (SEQ ID NO:1) 무상(intact) β2GPI의 아미노산 서열로 구성되어 있지 않으며, 나아가 β2GPI의 도메인 1, 2, 및 3 또는 도메인 1, 2, 3, 및 4 로 구성되지 않는 것으로 여겨진다. 어떤 구체예에서는, 폴리펩티드는 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 도메인 1 의 단편들을 포함한다. 다른 구체예에서는, 폴리펩티드는 형태적인 에피토프를 포함한다. 또 다른 구체예에서는 폴리펩티드는 도메인 1 로 구성된다.
다른 측면으로, 본 발명은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공하는데, 상기 폴리펩티드는 (검출가능한) T 세포 에피토프가 없으며, 상기 T 세포 에피토프는 β2GPI 의존성 항인지질 항체를 가지고 있는 개체에서 T 세포를 활성화시킬 수 있다.
본 발명은 또한 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) (또는 β2GPI 폴리펩티드(들)을 포함하고 있는 폴리펩티드)중 어느 것의 포합체, 융합물, 및/또는 중합체 형태를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) (특히 T 세포 에피토프가 결핍되어 있는 것들)은 단백성 또는 비-단백성일 수 있는 적절한 다가의 플랫폼 분자와 포합된다.
다른 측면으로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 구체예중 하나를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 (분리된 자연-발생적인 및 비-자연 발생적인 폴리뉴클레오티드를 포함하여)를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 클로닝 또는 발현 벡터, 및/또는 적당한 숙주 세포에서 분리될 수 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 유사체를 제공하는데, 상기 유사체는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있다 (즉, 유사체는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드와 에피토프를 공유한다). 유사체는 폴리펩티드이거나 또는 유기 및 무기 분자를 포함한, 본원에서 설명되는 많은 물질중 어느 것일 수 있다. 유사체는 T 세포 에피토프를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는데, 상기 T 세포 에피토프는 β2GPI 의존성 항인지질 항체를 가지고 있는 개체에서 T 세포를 활성화할 수 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 본원에서 설명되는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및/또는 유사체 구체예들중 어느 하나를 포함하는 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서는, 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 부형제를 함유한다. 어떤 구체예에서는, 유효량의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 조성물내에 함유되는데, 상기 유효량은 내성을 유도하기에 충분한 양이다. 어떤 구체예에서는 (검출 목적의), 유효량은 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 (또는 유사체)에 결합하는 항체를 검출하기에 충분한 양이다.
다른 측면으로, 본 발명은 샘플중의 β2GPI-의존성 항인지질 항체 (또는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)에 특이적으로 결합하는 항체)를 검출하기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 샘플중의 항체를 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들) (또는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 포함하는 폴리펩티드 또는 도메인 1 β2GPI 유사체(들))과 안정한 항원-항체 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 접촉시키는 단계; 그리고 (b) 상기 단계 (a)에서 형성된 안정한 복합체가 있는 경우, 그 복합체를 검출하는 단계로 이루어진다.
다른 측면으로, 본 발명은 유효량의 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들), 특히 T 세포 에피토프가 결핍되어 있는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 개체에 투여하는 것으로 이루어지는, 개체에서 내성을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 유효량은 내성을 유도하기에 충분한 양이다.
실시예 1
β2GPI의 도메인 1은 β2GPI-의존성 항인지질 항체와 면역반응한다.
재료 및 방법
도메인 결실 돌연변이체의 구성
β2GPI는 5개의 "셔시"로 이루어진다. β2GPI의 항원성 영역(들)을 측정하기 위해서, 본 발명자들은 β2GPI로부터 하나 이상의 도메인을 선택적으로 제거하였다. 이 접근법은 문헌에서 사용되었으며[참조: Igarashi et al (1996) Blood 87:3262-3270], 여기에서 이들은 도메인 4 및 5, 도메인 3 내지 5, 도메인 2 내지 5, 도메인 1 내지 4 및 도메인 1 내지 3을 함유하는 사람 β2GPI의 결실을 만들었다. Igarashi 등에 의해 기술된 도메인 결실 돌연변이제 이외에, 본 발명자들은 도메인 1 및 2만을 함유하는 사람 β2GPI 돌연변이체를 구성하였다.
이들 결실 돌연변이체를 제조하기 위한 출발 지점은 S. Krills로부터의 증여물, pBacPAK9(Clontech)로 클로닝된 사람 β2GPI의 전체 길이 cDNA[참조: Steinkasserer et al. (1991) Biochem. J. 277:387-391]이었다. 개시 단계는 C 말단에서 GlyHis6을 도입하는 것이었다. 이 공정에서, 독특한 Msc 1 제한 부위(TGGCCA)를 C 말단 Cys 코돈을 TGC 내지 TGT, 이후에 Gly(GGC) 및 His(CAC)로부터 변화시켜 형성하였다. His6택의 목적은 Ni 킬레이트화 크로마토그래피에 의해 돌연변이체 단백질의 용이한 정제를 허용하는 것이었다.
GlyHis6은 단일 표준 DNA 부위 배향된 돌연변이에 의해 도입되었다. 방법은 공개된 방법에 근접하게 따라서 사용하였다[참조: Kunkel et al. Methods in Enzymology (1987) 154:367-382]. 사람 β2GPI에 대한 cDNA가 삽입된 파지미드 pBacPAK9를 함유하는 세포가 헬퍼 파지, M13K07에 의해 감염된 경우, 파지 입자는 pBacPAK9의 단일 스트랜드 DNA 변형을 주로 함유하는 성장 배지로부터 수집하였다. 또한, 사용된 세포가 CJ236와 같은 dut 1, ung 1 유전자형의 것인 경우, DNA 중의 특정 티미딘은 유리딘으로 대체되었다. 단일 스트랜드 DNA는 파지로부터 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제시켰다.
C 말단 Cys의 어떠한 측면 위의 영역에 상보성이고 GlyHis6을 암호화하는, 서열 5' AAACCACCTTAATGGTGATGGTGATGGTGGCCACATGGCTTTACA 3'(SEQ ID NO:13)를 갖는 올리고뉴클레오티드, ApoH-G6H는 E. coli, CJ236에서 성장된 사람 β2GPI에 대한 유전자를 함유하는 pBacPAK9의 단일 스트랜드 DNA로 어닐링하였다. Kunkel의 방법을 사용하여 상보성 올리고뉴클레오티드를 연신시킴으로써 이중 스트랜드 DNA를 생산하였다. 반응물을 E. coli로 형질전환시켰다. K91 균주는 dut 1, ung 1 유전자형을 함유하지 않으며, 이때 결과는 DNA를 함유하는 유리딘이 열화되는 것이다. GlyHis6을 암호화하는 새로 합성된 스트랜드가 풍부하다. 클론은 DNA 서열에 의해 T7 세쿼나제 키트 또는 열 세쿼나제 키트(Amersham Life Sciences)를 사용하여 분석하였다.
다음 올리고뉴클레오티드는 상기에서 기술된 방법으로 사용하여 사람 β2GPI의 도메인 결실 돌연변이체를 생산하였다:
올리고뉴클레오티드의 수는 사람 β2GPI의 아미노산을 언급하는 것이다. 예를 들어, B2del3-60은 아미노산 3-60이 β2GPI로부터 결실됨을 언급한다. 생산된 단백질은 도메인 2 내지 5를 함유한다. 구성의 요약은 다음과 같다.
PCR을 사용하여 다른 돌연변이체를 발생시켰다. 반응에 대한 원형은 사람 β2GPI에 대한 cDNA를 함유하는 pBacPAK9이었다. 서열 5' CTA TAA ATA CGG ATC CCG GGA ATT CG 3'(SEQ ID NO:25)를 갖고 pBacPAK9에서 멀티클로닝 영역의 상류를 준비하는 올리고뉴클레오티드, pBacPac9 PCR 1270,1297을 5' 프라이머로서 사용하였다. 도메인 1만으로 클론을 구성하기 위해서, 서열 5' GCA GCT GGC CAA CTC TGG GTG TAC ATT TCA GAG TG 3'(SEQ ID NO:26)을 갖는 올리고뉴클레오티드 도메인 1 PCR(64) Msc 1을 3' 프라이머로서 사용하였다. 유사하게, 도메인 1 및 2를 함유하는 돌연변이체를 발생시키기 위해서, 서열 5' GCA GCT GGC CAA TGA TGG GAG CAC AGA GAG GAA G 3'(SEQ ID NO:27)을 갖는 도메인 1, 2 PCR(122) Msc 1을 3' 프라이머로서 사용하였다. PCR의 25 순회를 수행하였다. 생산물을 페놀 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 분절을 5' 말단에서 Bam Hl로 3' 말단에서 Msc 1으로 용해시켰다. 용해된 DNA 분절을 겔 정제시키고 전체 길이 β2GPI가 절제된 pBacPAK9에 동일한 제한 효소를 사용하여 결찰시켰다. 결찰물을 E. coli XL1-청색으로 형질전환시키고, 클론을 DNA 서열화에 의해 규정하였다. 결과는 다음과 같다:
β2GPI의 모든 결실 돌연변이체를 감염된 곤충 세포의 배지로부터 정제시켰다. 일반적으로, 세포는 원심분리하여 제거하고, 배지를 10배 이상 용량의 인산염 완충된 식염수(PBS; 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4·7H2O, 1.4mM KH2PO4)에 대해 18시간동안 4℃에서 투석하였다. 다음 날, 침전은 원심분리하여 제거하였다. 투석된 배지는 50mM NaPO4, pH 7.5, 0.5M NaCl로 제조되고 Ni-NTA 수지를 투석된 배지에 약하게 혼합하면서 첨가하였다. 4℃에서 1시간 후, 수지를 깔때기로 수집하고, 4도에서 유지된 수 자켓 컬럼으로 충전하였다. 컬럼을 단백질이 검출되지 않을 때까지 50mM NaPO4, pH 7.5, 0.5M NaCl로 광범위하게 세척하였다. 컬럼을 20mM, 35mM 또는 100mM 이미다졸을 함유하는 동일한 완충액으로 순차적으로 용출시켰다. 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE)에 의해 분석하였다. 적합한 분획을 통합하고, 단백질을 농축시키고, Tris-완충된 식염수(TBS; 50mM TrisCl pH 7.5, 150mM NaCl)에 대해 투석하였다.
친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체
β2GPI-의존성 항인지질 항체를 분리하기 위해서, 다층판, 카디오리핀 함유 지질 분산액(또한 콜레스테롤 및 디세틸포스페이트를 함유)을 β2GPI-의존성 항인지질 혈장(또는 혈청)을 사용하여 배양한다. 이들 리포솜을 혈청으로부터 원심분리에 의해 펠렛화한다. 세척한 후, 리포솜 혼합물을 2% 옥틸글루코사이드 세정제에 의해 분해시키고 단백질 A-아가로스 컬럼에 적용한다. 광범위하게 세척하여 먼저 지질을 제거한 다음에, 비-IgG 성분을 제거한 후, IgG β2GPI-의존성 항인지질 항체를 단백질 A로부터 순한 산으로 용출시키고, 중화시키고, 완충제-교환하고, ACA ELISA로 시험한다. 이 방법에 의해 토끼 IgG 항-사람 β2GPI 항혈청을 사용하는 Western 블롯에 의해 나타나는 바와 같이, 오염된 β2GPI이 없는, 10,000배 이하로 풍부한 aPL 항체를 생산한다. 이 방법의 특정한 예는 다음과 같다.
혈청으로부터 β2GPI-의존성 항인지질 항체 정제
많은 환자로부터의 항체를 다음을 포함하는 많은 증상을 나타내는 여러 연령의 환자로부터 혈청으로부터 정제하였다: SLE, APS(정맥 혈전증, 유산, 혈소판감소증, CVA(뇌혈관 발작, 즉 졸중), TIA(일시적 허혈 발작) 및 동맥 폐색을 포함하여, APS의 많은 현상을 포함).
25mL 둥근 바닥 플라스크(Kontes Scientifid Co., Vineland, N.J.)에, 클로로포름 1mL당 1.2mL의 카디오리핀(Sigma Chemical, St. Louis, MO, #C-1649), 0.464mL의 콜레스테롤(Sigma Diag., St. Louis, MO, #965-25), 0.088mL의 5mg 디세틸포스페이트(Sigma Chemical, St. Louis, MO, D-2631)의 혼합물을 약 5분동안 회전증발기(Bunchi, Switzerland)에서 건조시켰다. 용매를 제거한 후, 2mL의 0.96% (wt/vol)NaCl(J.T. Baker, Inc., Phillipsburg, NJ)을 첨가하고, Vortex Genie Mixer(Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY)에서 11분동안 혼합하였다. 리포솜 현탁액을 1시간동안 37℃에서 배양하였다. 한편, 혈청 6501을 600 x g로 Sorvall RT 6000 원심분리기(Dupont Co., Wilmington, DE)에서 10분동안 8℃에서 회전하였다. 4mL의 상등액을 준비된 리포솜 현탁액 1mL를 갖는 25mL 둥근 바닥 플라스크에 놓고, 혼합물을 궤도 교반기, Tektator V(Scientific Products, McGraw Park, IL)에서 중간 속도로 교반하면서 4℃에서 48시간동안 및 37℃에서 추가로 2시간동안 배양하였다. 20mL의 차가운 PBS를 첨가하고, 혼합물을 50mL 폴리카보네이트 원심분리 튜브(Nalge Co., Rochester, NY)로 옮기고, 27,000 x g로 15분동안 4℃에서 SS-34 회전기(Sorvall-Dupont, Wilmington, DE)내의 RC3 원심분리기에서 원심분리시켰다. 침전을 25mL의 차가운 0.96% NaCl로 3회, RC3 원심분리기를 사용하여 세척하였다. 펠렛을 TBS 중의 n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드(Calbiochem, La Jolla, CA)의 2%(wt/vol) 용액에 용해시키고, 15배 바닥 용적의 1M 아세트산으로 예비세척하고 15배 바닥 용적의 TBS로 평형시킨 0.6mL 단백질 A/가교결합된 아가로스(Repligen Corporation, Cambridge, MA) 컬럼에 적용하였다. 항체-단백질 A/아가로스 컬럼을 40배 바닥 용적의 2% 옥틸글루코피라노사이드로 세척하여 지질을 제거한 다음에, 280nm에서 용출물의 흡광도가 기선에 접근할 때까지 TBS로 광범위하게 세척하였다. 결합된 항체를 1M 아세트산으로 용출시켰다. 1mL의 분획을 수집하고, 직후에 분획당 0.34mL 3M Tris(Bio-Rad, 전기영동 등급)로 중화시키고, 빙욕에서 유지시켰다. 각 분획의 흡광도는 280nm에서 분광광도계(Hewlett-Packard, 8452A Diode Array Spectrophotometer, Palo Alto, CA)로 측정하였다. 항체를 함유하는 분획을 통합하고, 농축시키고, 제조업자의 프로토콜에 대해 Centricon-30 농축기(Amicon Division, W.R. Grace ＆ Co., Beverly, MA)에서 TBS로 4회 세척하였다. 4mL의 항체 6501로부터 정제된 항체의 최종 수율은 농축물로부터 280회 분취를 수행시에 흡광도를 판독하여 측정하였으며, 여기에서 1mg = 1.34A280nm이다. 수득된 평균 수율은 4mL의 혈청 6501로부터 750μg 항체이었다. 정제된 항체를 ACA에 대해 시험하고, LaemmLi SDS-PAGE를 사용하여 순도에 대해 검사하였다.
카디오리핀 기본 ELISA
미소적정 플레이트(Immulon 1 #3350, Dynex Technologies)를 에탄올 중의 30μL의 카디오리핀의 50μg/mL 용액으로 도포하고, 밤새 4℃에서 건조시키고, PBS, pH 7.2로 3회 세척하고, 1시간동안 실온에서 75μL의 5%(wt/v) 생선 젤라틴을 사용하여 차단하였다(Hipure Liquid Gelatin, Norland Procucts Inc. 695 Joyce Kilmer Ave., New Brunswick N.J. USA). 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 5% 생선 젤라틴 중의 10μg/mL로 50μL의 전체 길이 재조합체 β2GPI로 충전하고, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 50μL의 친화성 정제된β2GPI-의존성 항인지질 항체(사용된 각각의 항체의 농도는 표 2에 나타나 있다) 또는 토끼 항-β2GPI를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 5% 생선 젤라틴에 적당히 희석된, 50μL의 알칼리성 포스파타제 포합된 항-면역글로불린(항-사람 IgG, 감마 사슬 특이적 Zymed #62-8422) 또는 항-토끼 IgG, Zymed #362-61220을 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 50μL의 알칼리성 포스파타제 색소원 기질을 첨가하고(PPMP 용액; 사용하기 직전에 물로 1:26으로 희석된 100mL의 수 원액 중에서 7.8g의 페놀프탈레인 모노포스페이트 + 69.5g의 2-아미노-2-메틸-1-프로판올), 30분동안 실온에서 배양하였다. 550nm에서 흡광도는 미소플레이트 자동판독기에서 플레이트를 판독하여 측정하였다(Bio-Teck Instruments, model EL311).
경합적 억제 ELISA
미소적정 플레이트(MaxiSorp™, Nalge Nund International, Denmark)를 50μL의 전체 길이 재조합체 β2GPI을 사용하여 0.1M 중탄산염, pH 9.5 중의 10μg/mL로 도포하고, 밤새 4℃에서 배양하고, 0.15M PBS, pH 7.2로 3회 세척하고, 1시간동안 실온에서 75μL의 2% 탈지분유(Carnation, 2% NFDM)로 차단하였다. 시험 억제제를 2% NFDM에 희석시키고, 25μL의 각 희석액을 도포된 웰에 첨가하였다. 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 2% NFDM에 희석시키고, 일정한 농도의 25μL를, 양의 대조로서 작용하는, 억제제를 갖지 않는 웰의 군을 포함하여, 웰에 첨가하였다. 웰의 내용물을 혼합하고, 플레이트를 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 2% NFDM에 적당히 희석된, 50μL의 알칼리성 포스파타제 포합된 항-사람 IgG, 감마 사슬 특이적 Zymed #62-8422를 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 50μL의 알칼리성 포스파타제 PPMP 색소원 기질 용액을 첨가하고, 30분동안 실온에서 배양하였다. 550nm에서 흡광도는 미소플레이트 자동판독기(Bio-Teck Instruments, model EL311)에서 플레이트를 판독하여 측정하였다. 억제율은 억제제의 존재하에 수득된 OD550을 억제제의 부재하에 웰로부터 수득된 평균 OD550으로 나눈 다음에, 100을 곱하여 측정하였다(특히, [배경의 A550을 감한 억제제의 부재하에 대조 웰로부터 수득된 평균 A550] - [배경의 A550을 감한 억제제의 존재하에 수득된 A550]을 [배경의 A550을 감한 억제제의 부재하에 대조 웰로부터 수득된 평균 A550]으로 나누고, 여기에 X 100).
ELISA에 의해 평가된, 재조합체 β2GPI 및 돌연변이체의 직접 결합
니켈 킬레이트-도포된 마이크로웰 플레이트(NCP 010 00 Xenopore Corp. 374 Midland Ave. Saddle Brook, NJ USA)를 PBS 중의 많은 재조합체 β2GPI의 일련의 희석액 50μL로 실온에서 2시간동안 도포하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, PBS 중의 1% 젤라틴(Sigma #G-2500) 75μL로 1시간동안 실온에서 차단하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 50μL의 친화성 정제된β2GPI-의존성 항인지질 항체(약 80%의 최대 결합을 제공한다고 이전에 나타난 농도에서) 또는 토끼 항-β2GPI를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 1% 젤라틴에 적당히 희석된, 50μL의 알칼리성 포스파타제 포합된 항-면역글로불린(항-사람 IgG, 감마 사슬 특이적 Zymed #62-8422) 또는 항-토끼 IgG(Zymed #62-6122)을 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 50μL의 알칼리성 포스파타제 색소원 기질 용액을 첨가하고, 30분동안 실온에서 배양하였다. 550nm에서 흡광도는 미소플레이트 자동판독기에서 플레이트를 판독하여 측정하였다(Bio-Teck Instruments, model EL311).
억제 연구의 결과
7 내지 9개의 상이한 재조합 β2GPI 돌연변이체 단백질을 사용하여 상이한 13명의 환자로부터 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체 제제의 항원 특이성을 측정하였다. 각각의 돌연변이성 재조합체 β2GPI 단백질을, 용량 의존 방식으로, 전체 길이 재조합체 β2GPI에 대한 결합으로부터 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 대표적 검정의 결과는 도 4에 도시되어 있다. 13개의 모든 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 검정 결과는 표 2에 요약되어 있다. 다음 값은 또한, 도메인 1만의 재조합체 단백질에 대해 관찰되었다(1----; 지시에 대해서는 표 2 참고):
도메인 1을 함유하는 돌연변이체만이 전체 길이 재조합체 β2GPI에 대한 결합으로부터 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 억제하였다(도 4). 이는 13개의 모든 β2GPI-의존성 항인지질 항체 제제에 대해 사실이었다(표 2). 도메인 1을 함유하는 모든 재조합 돌연변이체 β2GPI 단백질이 90% 이상 억제한다는 사실은 이들 항체의 모든 검출가능한 항-β2GPI 활성이 도메인 1을 향함을 지시한다.
재조합 돌연변이체 β2GPI 단백질의 직접 결합을 카디오리핀의 부재하에 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 의해 시험한 결과
7 내지 9개의 상이한 재조합 β2GPI 돌연변이체 단백질을 시험하여 이들이 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체 제제의 직접 결합을 음이온성 인지질의 부재하에 지지하는가를 측정하였다. 모든 재조합 돌연변이체 β2GPI은 11명의 상이한 환자로부터 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체 제제를 사용하여 검정하였다. 각각의 돌연변이성 재조합체 β2GPI 단백질을 용량 의존성 방식으로 시험하고, GST-6his를 음의 대조로서 포함시켰다. 재조합 돌연변이체 β2GPI 단백질을 니켈 도포된 미소적정 플레이트에 이의 6-his 꼬리를 거쳐 결합시켰다. 시험된 모든 재조합 돌연변이체 β2GPI 단백질은 토끼 항-β2GPI를 결합시켜, 이들이 항체에 의해 평가가능함을 나타낸다(도 5). 대표적 결합 실험의 결과는 도메인 1을 함유하는 단백질만이 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 결합시킴을 나타낸다(도 6). 11개의 모든 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체의 검정 결과는 표 3에 요약되어 있다. 결과는 모든 환자의 항체가 도메인 1-함유 β2GPI 재조합체 단백질에 상당히 결합되는 한편, 존재한다 해도, 도메인 1이 결핍된 재조합체 단백질에 대한 특이적 결합이 거의 없음을 나타낸다.
카디오리핀의 존재하에 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 의한 재조합 돌연변이체 β2GPI 단백질의 직접 결합
7개의 상이한 재조합 β2GPI 돌연변이체 단백질을 시험하여 이들이 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체 제제의 직접 결합을 음이온성 인지질의 존재하에 지지하는가를 측정하였다. 7개의 모든 재조합 돌연변이체 β2GPI은 토끼 항-β2GPI 및 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체 제제를 사용하여 검정하였다. 각각의 돌연변이성 재조합체 β2GPI 단백질을 용량 의존성 방식으로 시험하고, GST-6his를 음의 대조로서 포함시켰다. 재조합 돌연변이체 β2GPI 단백질을 미리 카디오리핀으로 도포된 미소적정 플레이트에 결합시켰다. 7개의 모든 재조합 돌연변이체 β2GPI 단백질은 토끼 항-β2GPI를 결합시켜, 이들이 카디오리핀에 결합되고 항체에 대해 평가가능함을 나타낸다(도 7). 환자 항체를 사용하는 대표적 실험의 결과는 도메인 1 및 도메인 5를 둘다 함유하는 단백질만이 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 결합시킴을 나타낸다(도 8).
본 실시예에서 상기 데이터를 근거로 하여, 본 발명자들은 특정한 조건하에 β2GPI이 고체상 지지체에, 도메인 1 상의 항원성 에피토프(들)이 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 자유롭게 접근할 수 있게 하는 방식으로(예: 6-his 꼬리를 함유하는 재조합체 β2GPI 단백질의 경우, 조사된 플레이트, 카디오리핀 도포된 플레이트, Nunc 상품명 미소적정 플레이트 및 니켈 킬레이트화 플레이트) 결합되지만, 비-조사된 플레이트, 많은 다른 상품명의 미소적정 플레이트와 같은 다른 표면에 결합되는 경우에는 아니라고 본다. 이들 억제 연구는 β2GPI-의존성 항인지질 항체가 인지질의 부재하에 β2GPI을 결합시킬 수 있다는, 타인에 의한 보고를 확인시킨다[참조: Galli et al. (1990) Lancet 335:1544; Rouby et al (1995); Arvieux et al. (1991) J. Immunol. Methods 143:223]. 경합적 억제 검정에서 억제하는 동일한 5개의 재조합 돌연변이체 β2GPI--도메인 1을 함유하는 것--은 니켈 킬레이트화 플레이트에서 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 결합시키는 것과 동일하다. 니켈 킬레이트화 플레이트에 결합된 재조합 β2GPI 돌연변이체 단백질은 토끼 항-β2GPI가 9개의 모든 재조합체 단백질에 결합되는 능력에 의해 확인되었다. 반대로, 전체 길이 재조합체 β2GPI만(즉, 도메인 1 및 도메인 5를 둘다 함유하는, 시험된 재조합체 단백질만) 카디오리핀 도포된 플레이트에서 용이하게 검출될 수 있었다. 카디오리핀 도포된 플레이트에 결합된 재조합 β2GPI 돌연변이체 단백질은 토끼 항-β2GPI이 9개의 모든 재조합체 단백질에 결합되는 능력에 의해 확인되었다.
억제 데이터(도 4) 및 니켈 도포된 플레이트를 거친, 직접 결합 데이터(도 6)는 둘다 연구된 13개의 β2GPI-의존성 항인지질 항체 제제의 항원 특이성이 β2GPI의 도메인 1에 존재하는 에피토프를 향함을 명백히 나타낸다.
실시예 2
APS 환자로부터 항체의 특이성
앞의 실시예에서 기술된 연구에서 에피토프 결합 영역의 국재는 고 역가 APS 환자로부터 친화성 정제된 항체의 사용에 의존하였다. APS 항체의 친화성 정제는 고 역가 환자를 필요로 하며, 저 역가 환자 또는 큰 집단의 환자 연구에 용이하게 도움이 되지 않는다. 따라서, 본 발명자들은 혈청을 기본으로 하고 다수의 환자 평가를 받아들이는, APS 환자 샘플에서 항체 결합 도메인(들)을 평가하는 대체 접근법을 개발하였다.
표면 플라스몬 공명(SPR)은 고정된 단백질 및 가용성 분석물 사이의 상호작용의 정량적 측정을 제공한다. 현재의 연구는 SPR에 적용되어 고정된 β2GPI 및 β2GPI의 도메인 결실 돌연변이체 사이의 상호작용을, 정상 코호트 및 APS 환자로부터 사람 혈장을 사용하여 측정하였다. 연구를 고안하여 β2GPI 도메인 1의 면역우성이 큰 집단의 APS 환자에게 발생하는가를 측정하였다.
재료 및 방법
시약. CM5 칩, NHS 및 EDC 및 HBS-EP 완충제는 BIAcore로부터의 것이었다. 사람 합토글로빈(표현형 1-1), β2GPI에서 발견된 짧은 컨센서스 반복 모티브를 함유하는 단백질을 칩 상의 별도의 유동 세포에서 고정시키고, 음의 대조로서 사용하였다. 재조합체 β2GPI 및 β2GPI의 도메인 결실 돌연변이체는 Tn5 세포에서 바큘로바이러스 단백질 발현 시스템을 사용하여 발현되며, 상등액으로부터 니켈-킬레이트화 친화성 컬럼에 의해 정제하였다[참조: Iverson et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15542-15546]. 정상인의 혈장 샘플을 구입하거나(George King Biomedical) 가정에서 수득하였다. 1차 또는 2차(내지 루푸스) 항인지질 항체 증후군으로 진단된 개체로부터 환자 혈장 샘플은 다수의 임상적 공급원으로부터 수득하였다.
이 연구에서 사용된 55가지 대조는 불균질 샘플로부터 유도되었다. George King Bio-Medical(Overland Park, KS)로부터 구입된 30가지 대조 샘플(15명 남성; 15명 여성; 평균 연령 34세, 19 내지 45세 범위), 5명의 부분 지원자(3명 남성, 2명 여성), 2가지 통합된 상업 공급원 및 미지의 원천의 18가지 혈액 은행 공여자가 분석에 포함되었다. 환자 샘플을 여러 공급원으로부터 수집하고, 정맥 혈전증, 동맥 폐색, 뇌혈관성 폐색, 다발성 유산 및 혈소판감소증의 병력을 갖는 환자가 포함되었다. 연구에 포함된 모든 환자는 내부 검정에 의해 IgG 항인지질 항체 수준(GPL) 수준≥20을 나타내었다.
전체 IgG 분획은 면역순수 플러스 단백질 G 아가로스 비드 및 면역순수 IgG 결합 및 용출 완충액을 사용하여 제조업자 추천(Pierce)에 따라서 혈장으로부터 분리하였다.
표면 플라스몬 공명. 모든 실험은 25℃에서 BIAcore™ 2000을 사용하여 10μL/min의 유속으로 수행하였다. 칩 평형 및 결합 연구는 탈기된 HBS-EP 완충액을 사용하여 수행하였으며, 이는 0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA 및 0.005%(v/v) 계면활성제 P20으로 이루어진다. 단백질 리간드의 자유 아미노기를 통한 CM5 칩으로 이의 공유 결합은 40μL의 0.05M NHS/0.2M EDC를 칩 위에서 유동시켜 칩을 활성화한 다음에, 적합한 단백질 리간드에 노출시켜 수행하였다. 재조합체 β2GPI(His)6, β2GPI의 도메인-결실 돌연변이체 및 합토글로빈을 10mM 아세테이트(pH 4.8) 중의 50μL의 25μg/mL 용액을 NHS 활성화된 CM5 칩 위로 유동시켜 고정시켰다. 다음에, 칩 표면에서 과량의 반응기를 40μL의 1M 에탄올아민(pH 8.5)을 사용하여 급냉시켰다. 사람의 혈장 샘플(130μL)을 HBS-EP를 사용하여 1:1로 희석시키고, β2GPI 칩 위로 유동시키고, 반응 값을 780초동안 수집하였다. 칩을 샘플 노출 사이에 80μL의 0.1M 글리신-HCl(pH 2.1), 0.1M NaCl을 사용하여 재생시켰다. 결합 평형에 대한 접근법은 측정 기간 동안에 불완전하므로, 평형 결합가(Req)는 관련 커브를 제조업자의 소프트웨어를 사용하는 다음 식에 맞추어 측정하였다(BiaEvaluation version 2.2, Uppsala, Sweden):
Rt= Req(1-e-ks(t-t0)) + R0
상기 식에서,
Rt는 시간 t에 측정된 BIAcore이고,
Req는 평형 플래토 반응이며,
t는 시간이고,
t0은 최초 시간이며,
ks는 외관상 연관 상수(ks= kaC + kdis)이고,
ka는 연관 상수이며,
C는 분석물 농도이고,
kdis는 해리 상수이며,
R0은 반응 옵셋이다.
특정한 실험에서, 사람 혈장 샘플로부터 전체 IgG 분획은 단백질 G에 대한 결합 및 이로부터의 산 용출물로부터 수득되었다. 단백질 G에 대한 결합 후에 잔류하는 혈장을 신선한 단백질 G 비드와 재혼합하고, IgG-스트립핑된 혈장으로 분리하였다. 중화된 IgG 제제 및 완충제를 사용하여 1:1로 희석시킨 IgG-스트립핑된 혈장을 상기에서 기술된 바와 같이 β2GPI 칩 위로 유동시켰다.
결과 및 토론
도메인 1-5, 2-5 및 도메인 1만을 함유하는 재조합체 사람 β2GPI을 바큘로바이러스 발현 벡터로 클로닝하고, TN5 세포에서 발현시켰다. 정제된 단백질의 분취량을 분석하고, 아미노산 분석에 의해 정량화하였다. 각각의 단백질은 단일 아미노 말단을 함유하며, 내부 표준은 아미노산 분석을 기본으로 하는 정확한 정량화를 가능하게 하였다.
APS 환자 코호트는 다수의 중심으로부터 수득하고, GPL≥20인 106명의 환자로 이루어지며, 이들은 항인지질 항체 증후군(APS)의 증상으로 진단되었다. 환자 병력은 완전하지 않지만, 입수가능한 병력은 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 뇌혈관 발작, 다발성 유산, 조산 및 혈소판감소증을 포함한다. GPL 값은 20 내지 807(413±161, 평균±SD) 범위이며, 중간 값은 77이었다. 정상 대조 집단은 내부 공여자, 상업적 공급원 또는 San Diego 혈액 은행으로부터 입수된 55개의 샘플로 이루어졌다.
APS 환자 및 대조로부터 혈청을 완충제에 1:1로 희석하고, 고정된 β2GPI(D1-5)에 대한 결합에 대해 평가하였다. β2GPI(D1-5)과의 상호작용의 정도가 표 4에 나타나 있다. β2GPI(D1-5)에 대한 평균 Req는 730 및 328이고, 106명의 APS 환자 및 55명의 대조 환자에 대한 중간 값은 각각 635 및 201이었다. 환자 및 대조군 사이의 차이는 통계학적으로 유의성이 있었다(p ＜ 0.01, 스튜던트 t 시험). APS 및 β2GPI(D2-5)을 갖는 대조 혈청의 상호작용의 정도는 이들 군 사이에서 상이하지 않았다(표 4).
선택도 비를 계산하여 도메인 1의 존재에 의해서만 상이한 β2GPI 도메인 결실 돌연변이체에 대한 혈청 샘플의 상대적 결합을 기술하였다. 이러한 선택도 비는 β2GPI(D1-5)에 대한 결합(Req)을 β2GPI(D2-5)에 대한 결합으로 나누어 계산하였다. 3 이상의 인자가 임의로 선택되어 도메인 1을 함유하는 본래의 단백질과 우선적인 상호작용을 나타내는 환자를 한정하였다. β2GPI(D1-5) 및 β2GPI(D2-5) 둘다와의 상호작용의 정도는 대조군에서 낮으며, 대부분의 대조 환자는 고정된 단백질에 대해 선택도를 나타내지 않았다(표 4). 반대로, APS 환자의 88%는 도메인 1을 함유하는 β2GPI에 대한 선택도를 3배 이하로 나타내었다. APS 환자의 41%(43/106)는 β2GPI(D2-5)(Req ＜ 9)와 사소한 상호작용을 나타내어, 매우 높은 선택도 비를 초래하였다.
선택도 비 3을 갖는 10명의 환자로부터 혈청을 추가로 특성화하여 혈청에서 관찰된 상호작용이 IgG 분획의 원인이 되는가를 결정하였다. 전혈장, IgG-스트립핑된 혈장 및 총 IgG와 β2GPI(D1-5)의 결합 상호작용이 표 5에 나타나 있다. 혈청으로부터 단백질 G를 사용하여 IgG를 제거함으로써 고정된 단백질과 필수적으로 모든 특이적 결합 상호작용을 제거하였다. IgG 분획을 단백질 G 분획으로부터 산 용출시키고, 단백질과의 상호작용에 대해 시험하였다(표 5에서 총 IgG로 표시됨; 후속 중화에 의해 IgG 분획을 전혈장 및 IgG-스트립핑된 혈장에 대해 50%까지 희석시켰다). IgG 분획은 β2GPI(D1-5)와의 상호작용만을 나타내며, β2GPI(D1-5)과의 원래 혈청 상호작용과 정도가 유사한 반응을 발생시켰다(희석 차이 주의). 따라서, β2GPI에 대한 도메인 1 선택성 환자 혈청의 결합은 검정 시스템에서 IgG 분획에 의해 설명될 수 있다.
비-선택성 APS 환자(선택도 비 ＜ 3)의 부분군을 추가로 평가하여 이의 결합이 IgG 분획의 원인이 되는가를 결정하였다. 결과는 표 6에 나타나 있다. 도메인 1 선택성 환자의 경우에서와 같이, 고정된 단백질과의 모든 상호작용은 혈청을 단백질 G로 처리하여 제거함으로써 IgG 분획을 결실시킬 수 있었다. 환자로부터 IgG 분획은 원래의 혈청 샘플에서 관찰된 결합에 영향을 주는 것으로 나타났다(표 6).
본 연구는 표면 플라스몬 공명을 사용하여 항체 결합 도메인을 APS 환자(n = 106; GPL ≥ 20)의 큰 횡단면 집단에 국재시켰다. APS 환자 혈청은 비-APS 대조보다 β2GPI에 상당히 더 큰 결합을 나타내었다. 또한, 대부분의 환자의 혈청은 본래의 β2GPI(D1-5)을 도메인 1을 제외한 모든 도메인을 함유하는 β2GPI의 도메인 결실 돌연변이체보다 큰 정도로 결합시켰다. 환자의 88%는 도메인 1이 결핍된 도메인 결실 돌연변이체에 비해서 도메인 1을 함유하는 β2GPI에 대해 3배 이상의 특이성을 나타내었다. APS 환자 혈청에서 도메인 1 결합 활성은 IgG 성분의 결실에 의해 완전히 제거되었으며, 결합 활성은 IgG 분획에서 완전히 재구성될 수 있었다. 이들 결과는 대부분의 APS 환자에서 면역우성 결합 에피토프가 β2GPI의 아미노 말단 도메인으로 국재됨을 지시한다.
실시예 3
β2GPI-의존성 항인지질 항체에 대한 면역반응성을 위한 도메인 1 분절의 시험
헥사펩티드 합성
Wang 수지에 부착된 N-α-Fmoc 아미노산을 디메필포름아미드(DMF) 중의 20% 피페리딘에 30분의 총 반응 시간동안 2회 현탁시켜 아민을 탈보호시켰다. C 말단 프롤린을 갖는 헥사펩티드는 Wang 수지 대신에 클로로트리틸 수지에 부착된 비보호 프롤린을 사용하여 제조하였다.
수지는 각각 DMF 및 메틸 알콜로 2회 헹구었다. N-히드록시벤조트리아졸 (6당량), 1,3-디이소프로필카보디이미드(6당량) 및 제2 아미노산(6당량)의 용액 + DMF 중의 지시약을 수지에 첨가하였다. 반응 혼합물을 최소 1.5시간동안 실온에서 교반하였다. 다음에, 수지를 각각 DMF 및 메틸 알콜로 2회 헹구었다. Kaiser 시험(에틸 알콜 중의 5% 닌히드린 2 방울 + 피리딘 1 방울 + 에틸 알콜 중의 80% 페놀 1 방울)을 소량의 헹군 수지에 대해 수행하여 자유 아민의 부재를 입증하였다.
탈보호 및 아미노산 첨가 단계를 반복하여 순서를 종결시켰다. 최종 아미노산을 상기와 같이 탈보호시켜 자유 아민을 수득하였다.
펩티드는 트리플루오로아세트산(TFA) 중의 7.5중량% 페놀, 2.5용적% 에탄디티올, 5.0용적% 물 및 5.0용적% 티오아니솔의 용액을 사용하여 수지로부터 분리하였다. 혼합물을 최소 3시간동안 교반하였다. TFA는 진공을 사용하여 제거하고, 펩티드를 침전시키고, 에테르로 2회 세척하였다. 고체를 분석하기 위해서 1:1 아세토니트릴/물에 용해시켰다. 펩티드를 1.0 x 150mm C18(5μ, 150Å) 컬럼 상에서 LCMS에 의해 특성화하였다(A: 0.1% TFA, 2% 물 중의 아세토니트릴; B: 0.08% TFA, 2% 아세토니트릴 중의 물).
아세토니트릴 및 물은 진공하에 또는 냉동건조에 의해 제거하고, 펩티드를 0℃에서 저장하였다.
활성을 나타내는 펩티드를 대량으로 다시 제조하고, C18 컬럼을 사용하여 정제시켰다(A: 0.1% 물 중의 TFA B: 0.08% 아세토니트릴 중의 TFA).
경합적 억제 ELISA
미소적정 플레이트(MaxiSorp™, Nalge Nund International, Denmark)를 50μL의 전체 길이 재조합체 β2GPI을 사용하여 0.1M 중탄산염, pH 9.5 중의 10μg/mL로 도포하고, 밤새 4℃에서 배양하고, 0.15M PBS, pH 7.2로 3회 세척하고, 1시간동안 실온에서 75μL의 2% 탈지분유(Carnation, 2% NFDM)로 차단하였다. 시험 억제제를 2% NFDM에 희석시키고, 25μL의 각 희석액을 도포된 웰에 첨가하였다. 친화성 정제된 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 2% NFDM에 희석시키고, 일정한 농도의 25μL를, 양의 대조로서 작용하는, 억제제를 갖지 않는 11개 웰의 군을 포함하여, 웰에 첨가하였다. 웰의 내용물을 혼합하고, 플레이트를 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 2% NFDM에 적당히 희석된, 50μL의 알칼리성 포스파타제 포합된 항-사람 IgG, 감마 사슬 특이적 Zymed #62-8422를 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 50μL의 알칼리성 포스파타제 PPMP 색소원 기질 용액을 첨가하고, 30분동안 실온에서 배양하였다. 550nm에서 흡광도는 미소플레이트 자동판독기(Bio-Teck Instruments, model EL311)에서 플레이트를 판독하여 측정하였다. 억제율은 억제제의 존재하에 수득된 OD550을 억제제의 부재하에 웰로부터 수득된 평균 OD550으로 나눈 다음에, 100을 곱하여 측정하였다.
억제 연구
74개의 펩티드를 합성하고, 경합적 억제 ELISA로 선별하였다. 간단하게, '조' 펩티드, 즉 이들은 정제되지 않았으며, 상이한 친화성 정제된 항-카디오리핀 항체에 대해 1:2로 희석시에 선별하였다. 다음에, 1:2로 희석시에 양성인 펩티드를 추가의 이중 희석시에 재선별하였다. 고도로 희석시에 억제된 28개의 펩티드를 재합성하고 정제시켰다. 다음에, 이들 정제된 펩티드를 경합적 억제 검정으로 검정하였다. 또한, 재조합체 β2GPI을 양의 대조로서 검정하였다.
도 9에 도시된 결과는 몇가지 펩티드가 β2GPI에 대한 결합으로부터 항-카디오리핀 항체의 결합을 억제할 수 있음을 나타낸다. 시험된 대부분의 펩티드는 억제하지 않으므로, 일정한 정도의 특이성을 실제로 억제하는 것에 부여하였다. 두가지 양의 펩티드를 제외한 전부는 도메인 1에 존재하는 두가지 집합의 이황화 결합된 시스테인 주위에 집중 생산되었다. 그렇게 집중 생산되지 않은 두가지 펩티드는 또한, 억제시에 가장 불량하다. 이들 설파이드 결합된 시스테인은 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 의해 인식된 구조물을 생산할 수 있다.
실시예 4
β2GPI-의존성 항인지질 항체에 결합하기 위한 도메인 1에서 중요한 아미노산 잔기를 측정하는 돌연변이 유발 및 마이크로패닝 데이터
잘못되기 쉬운 PCR
잘못되기 쉬운 PCR은 다음과 같이 수행되었다. 사람 β2GPI의 도메인 1을 PCR에 의해 Taq 폴리메라제의 착오율을 증가시키는 조건하에 증폭시켰다. 프라이머는 아미노산 1-64가 증폭되도록 하였다. Sfc 1 제한 부위는 아미노산 1의 일부로서 혼입되었다. 3' 말단에서 Sal 1 제한 부위는 아미노산 64 다음에 혼입되었다. PCR 반응은 문헌에 기술된 바와 같이[참조: Leung et al. (1989) Technique 1:11], 0.25mM MnCl2을 사용하여 수행되었다. PCR 생산물을 Sfc 1 및 Sal 1로 용해시키고, Apal 1 및 Sal 1으로 용해된 fd-tet-DOG2로 클로닝시켰다. 이는 도메인 1을 pIII 신호 서열 직후에 pIII의 N 말단에 배치한다. 결찰 반응물을 E. coli K91에서 전기포레이션시켰다. 파지를 수확하고, 표준 방법으로 적정하였다. 생산된 파지 클론을 마이크로패닝 기술을 사용하여 검정하였다.
마이크로패닝
Immulon 2형 플레이트를 단백질 G로 도포하였다. 단백질 G는 0.1M NaHCO3중의 5μg/mL로 제조하고, 웰당 100μL를 미량적정 플레이트의 웰에 첨가하고, 밤새 4℃에서 배양하였다. 플레이트로부터 과량의 단백질 G 용액을 폐기한 후, 각각의 웰을 200μL 2YT를 사용하여 1시간동안 실온에서 교반하면서 진동 플랫폼 상에서 차단하였다. Tris-완충된 식염수, pII 7.4/0.5% Tween 20(TBS/Tween)을 자동 플레이트 세척기로 사용하여 웰을 4회 200μL로 세척하였다. 2YT를 사용하여 2.5μg/mL로 희석된, 100μL 사람 β2GPI-의존성 항인지질 항체 6626, 6501, 6701, 토끼 β2GPI-의존성 항인지질 또는 대조 정상 IgG를 첨가하여 웰을 세척하였다. 플레이트를 1시간동안 실온에서 회전 플랫폼 상에서 배양하였다.
마이크로패닝에 의해 시험되는 파지는 바이오패닝에 의해 발생된 한천 플레이트로부터 수득되었다. 시험되는 각각의 클론을 멸균 이쑤시개를 사용하여 웰당 200μL 2YT/Tet를 함유하는 둥근 바닥 96웰 미량적정 플레이트(Corning, Corning, NY)의 별도의 웰로 이동시키고, 밤새 30℃에서 배양하였다. 밤새 배양한 후, 파지 배양물을 미량적정 플레이트 홀더를 사용하여 1300 x g로 10분동안 실온에서 원심분리하였다. 상등액은 "니이트" 파지의 공급원을 구성하였다. 니이트 파지를 1:100 내지 1:1000으로 희석시키고, 100μL를 단백질 G-결합된 β2GPI-의존성 항인지질 항체-6501 및 상기에서 기술된 정상 IgG를 함유하는 플레이트에 첨가하였다. aPL 항체 또는 대조 IgG로 희석된 파지의 배양은 2시간동안 실온에서 편평한 회전기에서 수행하였다. TBS/Tween로 자동 플레이트 세척기에서 9회 세척한 후, IgG-결합된 파지를 20μL의 0.2N HCl-글리세린/0.1% BSA, pH 2.2로 용출시켰다. 용출 배양은 10분동안 실온에서 계속하고, 이 동안에 웰당 20μL의 방금 영양소를 빼앗긴 E. coli를 함유하는 신규한 Corning 미량적정 플레이트를 제조하고, 냉각시킨 채 유지하였다. 140μL의 29mM Tris를 pH를 중화시키기 위해서, 파지 용출물을 함유하는 플레이트에 첨가한 후, 20μL의 파지 현탁액을 각각의 웰로부터 상응하는 웰로 영양소를 빼앗긴 E. coli를 함유하는 플레이트에서 이동시켰다. 37℃에서 10분 배양한 후, 200μL 2YT를 첨가하고, 배양을 37℃에서 추가로 30분동안 수행하였다. 다채널 피펫을 사용하여, 각 웰로부터 8μL로 대형 2YT/Tet 한천 플레이트에 블롯을 형성하면서, 최종 미량적정 플레이트로부터 원래의 8 x 12 웰 패턴 및 배향을 유지하였다. 블롯을 30분동안 건조시킨 후, 플레이트를 밤새 30℃에서 배양하였다. 다음 날, 콜로니를 0 내지 +4로 반정량적으로 점수를 매겼으며, 이때 0은 10개 미만의 콜로니를, 1+는 10 내지 30개의 콜로니를, 2+는 30개의 콜로니 내지 70% 융합물을, 3+는 70 내지 90% 융합물을, 4+는 융합물을 의미한다.
결과는 표 7a 및 7b에 나타나 있다. 표 7a에 대해, 토끼 항-사람 β2GPI을 두가지 별도 경우에 대해 수행하였다. 돌연변이는 원래 아미노산, 위치 번호 및 돌연변이체의 위치에서 아미노산의 일치를 사용하여 기재한다. 예를 들어, S31F는 31 위치에서 Ser가 Phe로 돌연변이되었음을 지시한다. 비-돌연변이 도메인 1은 3+의 점수를 갖는 한편, 도메인 5 파지는 -의 점수를 제공하였다. 불활성 돌연변이는 나타나지 않는다. 클론은 N 말단에서 시작하여 C 말단으로 나간다.
표 7b는 돌연변이 분석의 연장을 나타내어, 추가 항체에 대해 시험된 추가 돌연변이체를 보여준다. 최종의 4개 파지 클론은 별표로 표시된 돌연변이를 나타내어, 파지가 다수 돌연변이를 나타냄을 지시한다(3A4:D8A, S13T; 3F123: L10I, P17Q, Y22C; 3G1:R2W, S38T; 4D1:N56T, R63G).
결과는 특히(다음 참고), (a) 검정은 일관성 있으며, (b) 모든 항체가 동일하게 반응하지 않고, (c) 동일한 위치에서 상이한 돌연변이는 매우 상이한 효과를 가짐을(예를 들어, Met 42 참고) 지시한다.
전체 결과가 도 3에 도시된 도메인 1의 3차 구조물 모델로 도시되어 있다. 이는 아미노산 55-58(ile, asn, leu), 아미노산 40-45(아미노산 43-45, 즉 arg, lys, phe를 포함) 및 아미노산 19(lys)가 aCL 항체에 결합하기 위해서 중요함을 나타낸다.
실시예 5
플랫폼에 포합된 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)
4가 플랫폼 BA/PIZ/IDA/TEG(BA/PITG)의 합성
화합물 1: 0℃로 냉각된, 무수 THF 50mL 중의 N-(t-부톡시카르보닐)-이미노디아세트산(U.S. 제5,552,391호, 화학적으로 정의된 비-중합체 원자가 플랫폼 분자 및 이의 포합체에서 화합물 5) 1.02g(4.37mmol) 및 N-히드록시석신이미드 1.01g(8.75mmol)의 용액에 디시클로헥실카보디이미드 2.26g(10.94mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 16시간동안 실온으로 서서히 가온하고, THF 25mL 중의 모노-CBZ-피페라진 2.22g(10.1mmol)의 용액을 혼합물에 첨가한 다음에, Et3N 1.22mL(887mg, 8.75mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 7시간동안 실온에서 교반한 다음에, 여과하였다. 여액을 농축시키고, 잔류물을 EtOAc 125mL에 용해시키고, 2 X 125mL 분량의 1N HCl, 125mL의 포화된 NaHCO3용액으로 교반하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고, 농축시켜 점착성 고체 2.39g을 수득하였다. 실리카 겔 크로마토그래피(95/5 CH2Cl2/MeOH)에 의해 정제시켜 화합물 1을 1.85g(66%) 수득하였다.
화합물 2: CH2Cl210mL 중의 1.74g(2.74mmol)의 화합물 1의 용액에 트리플루오로아세트산 10mL를 첨가하고, 혼합물을 3시간동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 CH2Cl25mL에 용해시켰다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 포화 NaHCO3100mL를 첨가하였다. 다음에, 혼합물을 100mL 분량의 CH2Cl2로 4회 추출하였다. CH2Cl2층을 합치고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고, 농축시켜 화합물 2를 점착성 흡습성 고체로서 1.46g(99%) 수득하며, 이는 다음 단계에서 직접 사용되었다.
화합물 3: 0℃에서 0.7g(1.3mmol)의 화합물 2 및 226μL(168mg, 1.30mmol)의 디이소프로필에틸아민의 용액에 CH2Cl24mL 중의 트리에틸렌글리콜 비스-클로로포르메이트 127μL의 용액을 첨가하고, 혼합물을 3시간동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 CH2Cl280mL 및 1N HCl 80mL 사이에 분배시켰다. CH2Cl2층을 80mL 분량의 물로 2회 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고, 농축시켜 화합물 3을 결정성 고체로서 736mg(93%) 수득하였다.
화합물 5: 화합물 3(61mg, 0.48mmol)을 30% HBr/HOAc 3mL에 용해시키고, 수득된 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하고, 이때 Et2O 5mL를 첨가하였다. 혼합물을 냉장고에 1시간동안 두고 원심분리시켰다. 수득된 펠렛을 Et2O로 세척하고 건조시켜 H2O 1mL에 용해된 테트라히드로브로마이드염 4를 수득하였다. 혼합물에 NaHCO349mg(0.58mmol) 및 디옥산 3mL를 첨가하였다. 필요한 경우, 다량의 NaHCO3를 첨가하여 혼합물을 염기성으로 만들었다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 브로모아세트산 무수물 748mg(2.89mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 2시간동안 교반하고, 1N H2SO420mL 및 80/20 CH2Cl2/MeOH 20mL 사이에 분배하였다. 유기 층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 농축시켜 조 화합물 5를 수득하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피하여(CH2Cl2/MeOH) 정제시켜 화합물 5를 수득하였다.
AOA/PITG 사량체 플랫폼 및 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드 포합체 화합물 44의 합성
도메인 1 (TA/D1)의 아미노기전이: 사용전에 물과 아세트산나트륨 완충액을 헬륨으로 살포하였다. 도메인 1(10.55mg, 1.49μmol)을 폴리프로필렌 튜브안에서 0.5mL의 H2O에 용해하고, 4.0mL의 2M pH 5.5 NaOAc 완충액을 첨가하였다. 0.5mL의 H2O중 3.73mg(14.9μmol)의 CuSO4의 용액을 이 혼합물에 첨가한 다음, 이어서 0.5mL의 2M pH 5.5 NaOAc 완충액중 2.75mg(29.9μmol)의 글리옥실산의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 질소대기하에 유지하고 18시간동안 서서히 교반하였고, 이때 4.6mm X 250 mm, 300Å, 5㎛, 디페닐 칼럼(Vydac)을 사용하고 280nm에서 검출하는 분석적 HPLC에 의하여 이 반응은 완결된 것으로 보였다(1mL/분; 구배 25%-45% B, 0-20분, A = 0.1% TFA/H2O, B = 0.1% TFA/CH3CN). 대략적인 체류시간은 다음과 같다: D, 13.2분; TA/D1, 13.7분; 산화된 TA/D1, 13.4분. 이 혼합물을 H20로 20mL의 부피로 희석하고 여과한 다음 HPLC에 의하여 정제하였다(22.4mm X 250 mm, 300Å, 10㎛, 디페닐 칼럼(Vydac, Hesperia, CA) (12mL/분; 구배 25%-40% B, 0-40분, A = 0.1% TFA/H2O, B = 0.1% TFA/CH3CN). 분석적 HPLC에 의해 증명될 때 순수한 TA/D1을 포함하는 분획을 통합하고 냉동건조시켜 5.0mg(48%)의 TA/D1을 제공하였다.
아미노옥시아세틸 (AOA)/PITG 플랫폼 4-니트로페닐-N-(tert-부틸옥시카르보닐)아미노옥시아세테이트, 2'의 합성: 0℃의 35mL의 무수 THF중 1.5g(7.85mmol)의 N-(tert-부틸옥시카르보닐)아미노옥시아세트산(Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO), 화합물 1'의 교반된 용액에 1.09g(7.85mmol)의 4-니트로페놀을 첨가한 다음 1.62g(7.85mmol)의 DCC를 첨가하였다. 이 혼합물을 질소대기하에서 0℃에서 0.5시간동안 및 실온에서 18시간동안 교반하였다. 이 혼합물을 여과하여 디시클로헥실유레아를 제거하고, 여액을 농축하고 실리카겔 크로마토그래피(95/5 CHCl3/이소프로필 알콜)에 의하여 정제하여 2.30g(94%)의 화합물 2'를 백색고체로서 얻었다:
BOC-보호된 AOA/PITG 플랫폼, 4'의 합성: 화합물 3(300mg, 0.235mmol)을 아세트산중 HBr의 30% 용액 1.5mL로 30분동안 처리하였다. 결과적인 4차-아민의 HBr염은 디에틸 에테르의 첨가에 의하여 침전되었다. 이 혼합물을 원심분리하고 상청액을 제거하고 부어버렸다. 남은 고체를 에테르로 세척하고 진공하에서 건조하고 9mL의 DMF에 용해하였다. 결과적인 혼합물에 294㎕(1.69mmol)의 디이소프로필에틸아민을 첨가한 다음 3mL의 DMF중 410mg(1.31mmol)의 화합물 2의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 질소대기하에서 4시간동안 교반하고 15/1 CHCl3/MeOH와 염수간에 분배하였다. 수성상을 15/1 CHCl3/MeOH로 두번 세척하고, 조합된 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축하여 680mg의 오일을 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(단계구배 95/5 내지 75/25 CHCl3/MeOH)에 의한 정제로 215mg(65%)의 화합물 4'를 백색고체로서 얻었다:
AOA/PITG 플랫폼, 화합물 5': HCl 기체를 10/1/1 EtOAc/CHCl3/MeOH중 67mg(.047mmol)의 화합물 4'의 교반된 용액을 통하여 15분동안 끓이고, 이 혼합물을 15분동안 더 교반하였다. 이 혼합물을 진공하에서 농축하고 진공하에서 16시간동안 유지하여 43mg(78%)의 화합물 5'를 백색고체로서 제공하였다:
4가 D1 포합체 화합물 44의 합성: TA/D1(0.90mg, 1.28 x 10-7mol)을 폴리프로필렌 튜브안에서 250㎕의 0.1M 아세트산나트륨 pH 4.60 완충액에 용해하였다. 이 혼합물에, 0.1M 아세트산나트륨 pH 4.60 완충액중 AOA/PITG 플랫폼, 화합물 5'의 0.97μmol/mL 용액 16.6㎕(18.9㎍, 1.60 x 10-8mol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 질소하에서 6일동안 천천히 교반하고, 이때 4.6mm X 250 mm, 300Å, 5㎛, 디페닐 칼럼(Vydac)을 사용하고 280nm에서 검출하는 분석적 HPLC에 의하여 이 반응은 완결된 것으로 보였다(1mL/분; 구배 25%-45% B, 0-20분, A = 0.1% TFA/H2O, B = 0.1% TFA/CH3CN). 대략적인 체류시간은 다음과 같다: TA/D1, 13.7분; 화합물 44, 17.2분. 이 혼합물을 95/5 물/아세토니트릴로 1mL의 부피로 희석하고 HPLC에 의하여 정제하였다(10mm X 250 mm, 300Å, 5㎛, 디페닐 칼럼(Vydac) (3mL/분; 구배 25%-45% B, 0-40분, A = 0.1% TFA/H2O, B = 0.1% TFA/CH3CN). 분석적 HPLC에 의해 증명될 때 순수한 포합체 화합물 44를 포함하는 분획을 통합하고 냉동건조시켜 0.4mg(25%)의 화합물 44를 제공하였다:
사량체 AOTEG/DEA/DEG 플랫폼 및 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드 포합체의 합성
2-[2-(2-요오도에톡시)에톡시]에탄올, 7: 2-[2-(2-클로로에톡시)에톡시]에탄올(12.66g, 75.1mmol) 및 요오도나트륨(33.77g, 225.3mmol)을 250mL의 아세톤에 용해하였다. 환류 콘덴서를 플라스크에 부착하고 이 혼합물을 18시간동안 환류로 가열하였다. 냉각된 때 이 혼합물을 농축하고, 잔류물을 400mL의 CH2Cl2및 300mL의 물과 100mL의 포화 수성 아황산수소 나트륨 용액의 혼합물과 진탕하였다. 수성층을 CH2Cl2의 400mL부분으로 두번 세척하고, 조합된 CH2Cl2층을 건조시키고(MgSO4) 여과후 농축하여 18.3g(94%)의 7을 연황색 오일로서 제공하였고, 이것을 더이상의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다:
2-[2-(2-N-(tert-부틸옥시카르보닐)아미노옥시에톡시)에톡시]에탄올, 8: 5.85g(1.50mmol)의 2-[2-(2-요오도에톡시)에톡시]에탄올, 화합물 7에 2.00g (1.00mmol)의 N-(tert-부틸옥시카르보닐)히드록실아민(Aldrich Chemical Co.)과 3.36mL(3.42g, 1.50mmol)의 DBU를 첨가하였다. 이 혼합물을 교반하여 점성 액체를 얻었는데, 이것을 손대면 뜨겁게 하고 55℃ 오일 욕조에 18시간동안 둔 결과, 백색침전물이 형성되어 혼합물을 고체화시켰다. 이 혼합물을 20mL의 CH2Cl2에 용해하고 500mL의 교반된 EtOAc에 첨가한 결과, 형성된 침전물을 여과에 의하여 제거하고, 이 여액을 농축시켜 갈황색 오일을 얻었다. 플래쉬 크로마토그래피(50% 아세톤/헥산)에 의한 정제로 2.61g(67%)의 8을 오일로서 얻었다:
2-[2-(2-N-(tert-부틸옥시카르보닐)아미노옥시에톡시)에톡시]에틸브로미드, 화합물 9: 브롬(대략 0.283mmol)을, 오렌지색이 존속할 때까지 2mL의 CH2Cl2중 50mg(0.188mmol)의 화합물 8, 74mg(0.283mmol)의 트리페닐포스핀, 및 31㎕(30mg, 0.377mmol)의 피리딘의 용액에 적가하였다. 이 혼합물을 실온에서 0.5시간동안 교반하고 1mL의 아황산수소 나트륨의 포화용액을 첨가하여 과다한 브롬을 퀘엔칭하였다. 그리고나서, 이 혼합물을 10mL의 H2O와 2 x 15mL의 EtOAc간에 분배하였다. 조합된 유기층을 염수로 세척하고, 건조(Na2SO4)하고 여과한 후 농축하였다. 실리카겔 크라마토그래피(35/65 아세톤/헥산)에 의한 잔류물의 정제로 54mg의 화합물 9를 오일로서 제공하였다:
2-[2-(2-N-(tert-부틸옥시카르보닐)아미노옥시에톡시)에톡시]에틸아지드, 10: 화합물 9로부터의 합성: 0.25mL의 무수 DMF중 100mg(0.305mmol)의 화합물 9의 용액을, 0.5mL의 무수 DMF중 159mg(2.44mmol)의 나트륨 아지드의 용액에 첨가하였다. 부가적인 0.25mL의 DMF를 사용하여 잔여 9를 반응혼합물안으로 세정해내고, 이 혼합물을 115℃에서 3시간동안 가열하였다. 냉각된 때, 이 혼합물을 3mL의 H2O와 4 x 3mL의 CH2Cl2간에 분배하였다. 조합된 유기층을 10mL의 H2O로 세척하고, 건조하고 (Na2SO4), 여과후 농축하여 황색 오일을 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(35/65 아세톤/헥산)에 의한 정제로 67mg(76%)의 10을 오일로서 제공하였다:
화합물 13으로부터 10의 합성: 질소대기하에서 5mL의 DMF중 258mg(0.69mmol)의 화합물 13의 용액에, 358mg(5.50mmol)의 나트륨 아지드를 첨가했다. 이 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하고, 100mL의 물을 첨가하고, 이 혼합물을 3 x 50mL의 EtOAc로 추출하였다. EtOAc층을 조합하고 50mL의 물로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 여과후 농축하여 294mg의 무색 오일을 제공하였다. 실리카겔 크로마토그래피(30/70 아세톤/헥산)에 의한 정제로 화합물 10을 무색 오일로서 제공하였다.
화합물 11: (MR-508-128) 화합물 10(1.36g, 4.70mmol)과 트리페닐포스핀 (1.48g, 5.64mmol)을 24mL의 THF와 8mL의 H2O에 용해시켰고, 결과적인 용액을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 약 160㎕(여덟 방울)의 1N NaOH를 첨가하고, 이 혼합물을 18시간동안 교반하였다. 이 혼합물을 진공하에서 농축하고, 농축물을 실리카겔 크로마토그래피(80/8/2 CH3CN/H2O/con NH4OH)에 의하여 정제하여 1.16g(94%)의 11을 황색 오일로서 얻었다:
1,2-비스(2-요오도에톡시)에탄, 화합물 12: 110mL의 아세톤중 10.0g(5.3mmol)의 1,2-비스(2-클로로에톡시)에탄(Aldrich Chemical Co.) 및 16.0g (107mmol)의 요오도나트륨의 용액을 환류로 18시간동안 가열하였다. 이 혼합물을 농축하고 잔류물을 CHCl3로 연화하여, 생성물을 용해하는 반면 염은 용해되지 않고 남게 하였다. 이 혼합물을 여과하고, 여액을 농축하여 오렌지 오일을 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(단계구배, 10/90 EtOAc/헥산 내지 15/85 EtOAc/헥산)에 의한 정제로 17.8g(90%)의 오렌지 오일을 제공하였다:
화합물 13: DBU(284㎕, 290mg, 1.90mol)를, 266mg(2.0mmol)의 N-(tert-부틸옥시카르보닐)히드록실아민(Aldrich Chemical Co.) 및 2.96g(8.0mmol)의 화합물 12의 혼합물에 첨가하고, 이 혼합물을 뚜껑을 덮어 균질하게 될 때까지 진탕하였다. 15분후에 이 혼합물이 고체화되었고, 45분동안 세워두었다. 이 혼합물에 5mL의 CH2Cl2를 첨가하고, 이 혼합물을 다시 진탕하여 고체를 용해시켰다. 결과적인 용액을 200mL의 EtOAc에 첨가하였다. 50mL의 EtOAc를 더 첨가하고, 이 혼합물을 여과하여 고체를 제거하였다. 여액을 농축하여 오일을 얻고, 이것을 100mL의 EtOAc와 3 x 50mL의 1N HCl 용액간에 분배하였다. EtOAc층을 2 x 50mL의 1N NaOH로 세척한 다음 이어서 2 x 50mL의 5% 아황산수소 나트륨 용액으로 세척하였고, 농축하여 2.6g의 황색 오일을 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(단계구배, 20/80 내지 45/55 EtOAc/헥산)에 의한 정제로 515mg(69%)의 화합물 13을 황색 오일로서 얻었다:
디에틸렌글리콜 비스-4-니트로페닐카르보네이트, 화합물 60: 피리딘(30.5mL, 377mmol)을, 500mL의 THF중 5.0g(47.11mmol)의 디에틸렌 글리콜 및 23.74g (118mmol)의 4-니트로페닐클로로포르메이트의 0℃ 용액에 서서히 첨가하였다. 냉각 욕조를 제거하고, 이 혼합물을 18시간동안 실온에서 교반하였다. 이 혼합물을 다시 0℃로 냉각하고, 6N HCl로 산성화하고, 400mL의 1N HCl과 2 X 400mL의 CH2Cl2간에 분배하였다. 조합된 유기층을 건조하고(MgSO4), 여과후 농축하여 24.3g의 백색고체를 얻었다. 헥산/EtOAc로부터의 결정화로 16.0g(78%)의 화합물 37을 백색분말로 얻었다:
화합물 61: 17mL의 피리딘중 2.5g(5.73mmol)의 화합물 37의 용액을, 3mL의 피리딘중 1.8g(17.2mmol)의 디에탄올아민의 0℃ 용액에 첨가하였다. 냉각욕조를 제거하고, 이 혼합물을 5시간동안 실온에서 교반하여 화합물 38을 얻었는데, 이것은 분리되지 않았으나 다음 단계에서 그대로 사용되었다.
화합물 14: 이전 단계로부터의 혼합물을 다시 0℃로 냉각하고, 40mL의 CH2Cl2를 첨가한 다음 이어서 60mL의 CH2Cl2중 11.55g(57.3mmol)의 4-니트로페닐클로로포르메이트의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 다시 0℃로 냉각하고 1N HCl로 산성화하고, 300mL의 1N HCl과 2 X 200mL의 CH2Cl2간에 분배하였다. 조합된 유기층을 건조하고(MgSO4), 여과후 농축하여 13.6g의 황색 고체를 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH 및 EtOAc/헥산)에 의한 정제로 4.91g(83%)의 화합물 39를 점착성 비결정성 고체로서 제공하였다:
BOC-보호된 AOTEG/DEA/DEG 플랫폼, 화합물 15: 트리에틸아민(157㎕, 114mg, 1.13mmol)을 193mg(0.188mmol)의 화합물 14(상기에서 그리고 1998년 12월 9일에 제출된 미국 일련번호 60/111,641에서대로 제조됨)의 교반된 용액에 첨가한 다음 이어서 298mg(1.13mmol)의 화합물 11을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온이 되게 하고 밤새 교반하였다. 이 혼합물을 0℃로 냉각하고, 1N HCl로 산성화하고, 20mL의 1N HCl과 4 x 20mL의 CH2Cl2간에 분배하였다. 조합된 유기층을 포화 NaHCO3용액으로 세척하고, 건조하고(MgSO4) 여과후 농축하여 279mg의 황색 오일을 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(97/3 CH2Cl2/MeOH)에 의한 정제로 138mg(48%)의 15를 오일로서 얻었다:
화합물 16: 화합물 15(60mg, 39.2μmol)를 10mL의 1/9 트리플루오로아세트산/CH2Cl2에 용해하고, 이 혼합물을 실온에서 3시간동안 유지하였다. 질소를 천천히 흐르게 하여 용매를 증발시키고, 잔류물을 최소량의 크로마토그래피 용매(5/7.5/87.5 con NH4OH/H2O/CH3CN)에 용해하였고, 이것은 실리카겔 칼럼상으로 이 혼합물을 로딩하는데 이용되었다. 실리카겔 크로마토그래피(단계구배 5/7.5/87.5 내지 5/10/85 con NH4OH/H2O/CH3CN)에 의한 정제로 36mg(82%)의 16을 무색 오일로서 얻었다:
분석적 HPLC에 의하여 순도를 점검하기 위하여, 테트라-아세톤 옥심을 다음과 같이 제조하였다. 화합물 16(0.38mg, 0.34μmol)을 HPLC 샘플 바이알안에서 240㎕의 0.1M NaOAc 완충액에 용해하였다. 이 용액에, 2.0mL의 0.1M NaOAc 완충액중 49㎕의 아세톤 용액을 10㎕ 첨가하였다. 이 혼합물을 1시간동안 세워두고, 분액을 HPLC에 의하여 분석하였다(4.6mm C18칼럼, 1mL/분, 210nm 검출, 구배, 10-60% B 20분동안, A = 0.1% TFA/H2O, B = 0.1% TFA/CH3CN, tR= 19분); 수집된 용출액의 질량스펙트럼 (ES) m/z C54H101N10O25(M+H)를 위한 계산치:1289. 실측치: 1289.
4가 D1 포합체 화합물 45의 합성: TA/D1(5.20mg, 7.37 x 10-7mol)을, 폴리프로필렌 튜브안에서 He 살포된 0.1M 아세트산나트륨 pH 4.60 완충액 2.0mL에 용해하였다. 이 혼합물에, 0.1M 아세트산나트륨 pH 4.60 완충액중 AOTEG/DEA/DEG 플랫폼, 화합물 16의 8.147μmol/mL 용액을 15.07㎕(139㎍, 1.23 x 10-7mol) 첨가하였다. 이 혼합물을 질소하에서 23시간동안 서서히 교반하고, 이때 4.6mm X 250 mm, 300Å, 5㎛, 디페닐 칼럼(Vydac)을 사용하고 280nm에서 검출하는 분석적 HPLC에 의하여 이 반응은 완결된 것으로 보였다(1mL/분; 구배 25%-45% B, 0-20분, A = 0.1% TFA/H2O, B = 0.1% TFA/CH3CN). 대략적인 체류시간은 다음과 같다: TA/D1, 13.7분; 포합체 화합물 45, 17.2분. 이 혼합물을 물로 5mL의 부피로 희석하고 HPLC에 의하여 정제하였다(10mm X 250 mm, 300Å, 5㎛, 디페닐 칼럼(Vydac) (3mL/분; 구배 25%-45% B, 0-40분, A = 0.1% TFA/H2O, B = 0.1% TFA/CH3CN). 분석적 HPLC에 의해 증명될 때 순수한 포합체 화합물 45를 포함하는 분획을 통합하고 냉동건조시켜 1.73mg(48%)의 포합체 화합물 45를 제공하였다: 질량스펙트럼(ES, 평균 m/z) C1322H2048N3340377S20을 위한 계산치: 29,294, 실측치: 29,294.
알킬할리드 플랫폼을 이용한 제5의-Cys의 알킬화에 의한 4가 D1 포합체, 화합물 65의 제조: 도메인 1은 산화된 형태인 4개의 시스테인을 가지고, 완전하게 접힌 도메인 1은 두개의 이황화 결합을 가진다. 제5의 시스테인은 천연 시스테인의 바깥쪽 N-말단 또는 C-말단의 어느 위치에서든 포함될 수 있다. 이 실시예에서, β2GPI의 제2의 도메인에 천연인 제5의 시스테인이 포함된다. 제5의 시스테인은, 그것의 자유 설프히드릴기때문에, 설프히드릴기와 반응하도록 고안된 플랫폼과 반응하는데 이용될 수 있다. 한 그러한 플랫폼은 화합물 23과 같은 할로아세틸 플랫폼이다.
제5의-Cys D1(4당량)을, 헬륨 살포된 100mM pH 8.0 붕산나트륨 완충액에 용해한다. 이 용액을 질소대기하에서 유지하고, 브로모아세틸화된 플랫폼, 화합물 23 (1당량)의 용액을 첨가한다. 이 혼합물을 반응이 완결될 때까지 교반하고, 준비 HPLC에 의하여 혼합물을 정제하여 4가 포합체, 화합물 65를 제공한다.
AOTEG/PIZ/DEA/DEG 플랫폼, 화합물 17의 합성: 피리딘(610㎕, 596mg, 7.54mmol)을, 14mL의 CH2Cl2중 500mg(1.88mmol)의 화합물 8과 760mg(3.77mmol)의 p-니트로페닐클로로포르메이트의 교반된 용액에 서서히 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하였다. 이 혼합물을 0℃로 냉각하고 1N 수성 HCl로 산성화하였다. 결과적인 혼합물을 100mL의 1N 수성 HCl과 3 x 100mL의 CH2Cl2간에 분배하였다. 조합된 유기층을 건조하고(MgSO4), 여과후 농축하여 1.05g의 점착성 고체를 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(6/4 헥산/EtOAc)에 의한 정제로 505mg(62%)의 화합물 17을 약간 황색의 오일로서 얻었다:
BOC-보호된 AOTEG/PIZ/DEA/DEG 플랫폼, 화합물 19: 수성 중탄산나트륨과 디옥산의 혼합물중 화합물 18(1998년 12월 9일에 제출된 미국 일련번호 60/111,641에서 기술된 대로 제조됨)의 용액에, 디옥산중 4당량의 화합물 17의 용액을 첨가한다. 반응이 완결되면, 이 혼합물을 물과 CH2Cl2간에 분배한다. CH2Cl2층을 농축, 건조하고 실리카겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 화합물 19를 제공한다.
AOTEG/PIZ/DEA/DEG 플랫폼, 화합물 20: BOC-보호기를, 화합물 16을 제조하기 위하여 기술된 방법과 본질적으로 유사한 방법으로 화합물 19로부터 제거하여, 화합물 20을 제공한다.
AOTEG/SA/AHAB/TEG 플랫폼, S-아세틸-2-[2-(2-N-tert-부틸옥시카르보닐아미노옥시에티옥시)에톡시]-에틸메르캡탄, 화합물 21a의 합성: 30mL의 아세톤중 500mg(1.52mmol)의 화합물 9a의 용액에 191mg(1.68mmol)의 티오아세트산 칼륨(Aldrich Chemical Co.)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하고, 결과적인 침전물을 여과에 의하여 제거하였다. 이 침전물을 농축하고 300mL의 EtOAc와 2 x 80mL의 염수간에 분배하였다. EtOAc층을 건조하고(NaSO4), 여과하고 농축하여 460mg(93%)의 화합물 21a를 연갈색 오일로서 얻었다:
2-[2-(2-N-tert-부틸옥시카르보닐아미노옥시에티옥시)에톡시]에틸메르캡탄, 화합물 22a: 화합물 21a를, 질소 살포된 4/1 6N NH4OH/CH3CN의 용액으로 질소대기안에서 1시간동안 실온에서 처리한다. 이 혼합물을 진공하에서 농축하여 화합물 22a를 제공하였고, 이것은 더이상의 정제없이 사용될 수 있다.
BOC-보호된 AOTEG/SA/AHAB/TEG 플랫폼, 24a: 화합물 23(Jones et al. J. Med. Chem. 1995, 38, 2138-2144에서 기술된 대로 제조됨)을, 질소 살포된 10/90 H2O/CH3CN중 4당량의 화합물 22a의 용액에 첨가한다. 결과적인 용액에 4당량의 디이소프로필에틸아민을 첨가한다. 반응이 완결되면, 이 혼합물을 물과 CH2Cl2간에 분배한다. CH2Cl2층을 농축, 건조하고 실리카겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 화합물 24a를 제공한다.
AOTEG/SA/AHAB/TEG 플랫폼, 25a: BOC-보호기를, 화합물 16을 제조하기 위하여 기술된 방법과 본질적으로 유사한 방법으로 화합물 24a로부터 제거하여, 화합물 25a를 제공한다.
AOHEX/SA/AHAB/TEG 플랫폼, 1-요오도-6-(N-tert-부틸옥시카르보닐)아미노옥시헥산, 화합물 9b의 합성: 140mg(1.05mmol)의 N-(tert-부틸옥시카르보닐)히드록실아민 (Aldrich Chemical Co.) 및 658㎕(1.35mg, 4.0mmol)의 화합물 12의 비균질성 혼합물에 149㎕(152mg, 1.0mmol)의 DBU를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 30초동안 교반하였고, 이때 반응혼합물이 고체화되었다. 고체 질량을 밤새 세워두고 50mL의 CH2Cl2에 용해하였다. 이 용액을 2 x 25mL의 1N NaOH와 3 x 25mL의 1N HCl로 세척하였다. 조합된 염기성 수성층을 25mL의 CH2Cl2로 추출하고, 조합된 산성 수성층을 25mL의 CH2Cl2로 추출하였다. 조합된 CH2Cl2층을 건조하고(Na2SO4), 여과후 농축하여 황색오일을 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(단계구배; 1/99/0.1 내지 15/85/0.1 EtOAc/헥산/MeOH)로 216mg(68%)의 9b를 황색 오일로서 얻었다:
S-아세틸-6-(N-tert-부틸옥시카르보닐)아미노옥시헥산-1-티올, 화합물 21b: 화합물 9b(209mg, 0.61mmol)를 15mL의 아세톤중 티오아세트산 칼륨의 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하였다. 아세톤을 진공하에서 제거하고, 잔류물을 50mL의 CH2Cl2와 3 x 25mL의 1N NaOH간에 분배하였다. CH2Cl2층을 건조하고(Na2SO4), 여과후 농축하여 갈색 오일을 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피 (15/85 EtOAc/헥산)에 의한 정제로 166mg(94%)의 화합물 21b를 무색 오일로서 얻었다:
6-(N-tert-부틸옥시카르보닐)아미노옥시헥산-1-티올, 화합물 22b: 22b의 정제된 샘플을 다음과 같이 제조하였다. 화합물 21b(50mg, 172μmol)와 22㎕(17.4mg, 85.8μmol)의 트리-n-부틸포스핀을 질소하에 놓고, MeOH중 NaOH의 질소살포된 1M 용액 2mL을 이 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하고, 172㎕(180mg, 3mmol)의 트리플루오로아세트산을 첨가하였다. 이 혼합물을 25mL의 EtOAc와 3 x 25mL의 1N HCl간에 분배하였다. 조합된 수성층을 25mL의 EtOAc로 추출하고, 건조(Na2SO4), 여과후 농축하여 오일을 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피 (15/85/0.1 EtOAc/헥산/MeOH)에 의한 정제로 28mg의 22b를 무색 오일로서 얻었다:
BOC-보호된 AOHEX/SA/AHAB/TEG 플랫폼, 24b: 화합물 21b(13mg, 45μmol)과 6㎕(4.5mg, 22.3μmol)의 트리-n-부틸포스핀을 질소하에 놓고, 질소 살포된 4/1 6N NH4OH/CH3CN의 용액 3mL을 이 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하고 진공하에서 농축하였다. 잔류물을 질소 살포된 10/90 물/CH3CN의 용액 3mL에 용해하였다. 결과적인 용액을 질소대기하에서 유지하고, 이 용액에 10mg(7.44μmol)의 화합물 23을 첨가한 다음 이어서 8㎕(5.77mg, 44.6μmol)의 디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 이 혼합물을 18시간동안 교반하고 진공하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피(다중 단계구배, 1/99 내지 5/95 내지 7.5/92.5 내지 10/90 내지 15/85 MeOH/CH2Cl2)에 의하여 정제하여 14mg(93%)의 24b를 무색 오일로서 얻었다: TLC(10/90 MeOH/CH2Cl2), Rf= 0.3; 질량스펙트럼(ES) m/z C92H173N14O26S4(M+H)를 위한 계산치: 2018, 실측치: 2018.
AOHEX/SA/AHAB/TEG 플랫폼, 25b: BOC-보호기를, 화합물 16의 제조를 위하여 기술된 방법과 본질적으로 동일한 방법으로 화합물 24b로부터 제거한다.
AOHOC/DT/TEG 플랫폼, 6-(tert-부틸옥시카르보닐아미노옥시)헥산-1-올, 27의 합성: 1mL의 CH2Cl2중 179㎕(183mg, 1.2mmol)의 DBU의 용액에 133mg(1.0mmol)의 N-(tert-부틸옥시카르보닐)히드록실아민(Aldrich Chemical Co.) 및 157㎕(217mg, 1.2mmol)의 6-브로모헥산-1-올(Aldrich Chemical Co.)을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하였다. 이 혼합물을 농축하여 황색 오일을 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(35/5/65 EtOAc/MeOH/헥산)에 의한 정제로 180mg(77%)의 화합물 27을 무색 오일로서 얻었다:
화합물 28: 0℃의 2mL의 CH2Cl2중 100mg(0.428mmol)의 화합물 27의 용액에 90㎕(88.1mg, 1.11mmol)의 피리딘을 첨가한 다음 이어서 113mg(0.557mg)의 p-니트로페닐클로로포르메이트(Aldrich Chemical Co.)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 4시간동안 교반하고, 0℃로 냉각하고 1N HCl로 산성화한 다음, 20mL의 1N HCl과 3 x 20mL의 CH2Cl2간에 분배하였다. 조합된 CH2Cl2층을 NaHCO3의 포화용액으로 세척하고, 건조(MgSO4), 여과후 농축하였다. 실리카겔 크로마토그래피에 의한 정제로 화합물 28을 제공하였다.
화합물 29: EtOAc중 디에틸렌트리아민의 용액에 2당량의 디이소프로필에틸아민을 첨가한 다음 이어서 2당량의 화합물 28을 첨가한다. 이 혼합물을 반응이 완결될 때까지 교반한다. 용매를 제거하고 생성물, 화합물 29를 실리카겔 크로마토그래피에 의하여 정제한다.
BOC-보호된 AOHOC/DT/TEG 플랫폼, 30: 피리딘중 트리에틸렌 글리콜 비스-클로로포르메이트(Aldrich Chemical Co.)의 용액에 2당량의 화합물 29를 첨가한다. 이 혼합물을 반응이 완결될 때까지 교반하고 1N HCl과 CH2Cl2간에 분배한다. CH2Cl2층을 건조시키고 농축하고, 생성물을 실리카겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 화합물 30을 얻는다.
AOHOC/DT/TEG 플랫폼, 31: BOC-보호기를, 화합물 16의 제조를 위하여 기술된 방법과 본질적으로 유사한 방법으로 화합물 30으로부터 제거한다.
AOTEG/IDA/TEG 플랫폼, 화합물 32의 합성: 피리딘중 트리에틸렌 글리콜 비스-클로로포르메이트(Aldrich Chemical Co.)의 용액에 2당량의 이미노디아세트산 (Aldrich Chemical Co.)을 첨가한다. 이 혼합물을 반응이 완결될 때까지 교반하고 1N HCl과 CH2Cl2간에 분배한다. CH2Cl2층을 건조하고 농축하고, 생성물을 실리카겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 화합물 32를 얻는다.
화합물 33: THF중 화합물 32의 용액을 6당량의 NHS와 6당량의 DCC로 1시간동안 처리한다. 이 혼합물에 4당량의 화합물 11을 첨가하고, 이 혼합물을 반응이 완결될 때까지 교반한다. 아세트산을 첨가하여 과다한 DCC를 퀘엔칭하고, 결과적인 고체를 여과에 의하여 제거한다. 여액을 농축하고 실리카겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 화합물 33을 제공한다.
화합물 34: BOC-보호기를, 화합물 16의 제조를 위하여 기술된 방법과 본질적으로 동일한 방법으로 화합물 33으로부터 제거한다.
AOTEGO/LEV/PITG의 합성
플랫폼, p-니트로페닐-레불리네이트, 35: 4.25mL의 피리딘중 800mg (6.89mmol)의 레불린산(Aldrich Chemical Co.)의 용액에 1.78g(7.58mmol)의 4-니트로페닐트리플루오로아세테이트(Aldrich Chemical Co.)를 첨가하였다. 결과적인 용액을 15분동안 교반하고 28mL의 물과 2 x 28mL의 CH2Cl2간에 분배하였다. 조합된 CH2Cl2층을 건조(MgSO4), 여과후 농축하였다. 실리카겔 크로마토그래피(단계구배, 25/75 내지 30/70 EtOAc/헥산)에 의하여 농축물을 정제하여 1.06g(74%)의 화합물 35를 제공했다:1H NMR (CDCl3) δ 2.28 (s, 3H), 2.87 (m, 4H), 7.29 (d, 2H), 8.28 (d, 2H).
1,2-비스(2-(tert-부틸옥시카르보닐)아미노옥시에톡시)에탄, 화합물 36: 243mg(0.66mmol)의 화합물 12에 219mg(1.64mmol)의 N-(tert-부틸옥시카르보닐)히드록실아민(Aldrich Chemical Co.)을 첨가한 다음 이어서 246㎕(250mg, 1.64mmol)의 DBU를 첨가하였다. 이 혼합물을 그것이 고체화하기까지(약 1시간) 실온에서 교반하였다. 1시간 더 세워둔 후, 이 혼합물을 2mL의 CH2Cl2에 용해하고, 결과적인 용액을 100mL의 EtOAc에 첨가하여 DBU의 수소-요오드 염을 침전시켰다. 50mL의 EtOAc를 더 첨가하고, 이 혼합물을 여과하였다. 여액을 2 x 50mL의 1N HCl, 2 x 50mL의 5% 아황산수소 나트륨 용액 및 25mL의 염수로 세척하였다. EtOAc층을 건조(Na2SO4), 여과후 농축하여 오일을 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(단계구배, 40/60 내지 50/50 내지 80/20 EtOAc/헥산)에 의한 정제로 164mg(65%)의 화합물 36을 무색 오일로서 얻었다:
1,2-비스(2-아미노옥시에톡시)에탄, 화합물 37: 화합물 36(559mg, 1.47mmol)을 15mL의 EtOAc에 용해하고, HCl 기체를 이 용액을 통하여 30분동안 끓였다. 이 혼합물을 진공하에서 농축하여, 72mg(90%)의 화합물 37을 점착성 잔류물로서의 HCl염으로서 제공하였다:1H NMR (D2O) δ 3.75 (s, 4H), 3.87 (m, 4H), 4.27(m, 4H); 질량스펙트럼(ES) m/z C6H17N2O4(M+H)를 위한 계산치: 181.1, 실측치: 181.1.
화합물 38: 화합물 3을 아세트산중 HBr의 30% 용액으로 처리하여 CBZ 보호기를 제거하고 테트라-아민 브롬화수소 염을 제공한다. 테트라-아민을 물과 디옥산중 중탄산나트륨의 용액에 용해하고, 결과적인 용액에 4당량의 화합물 35를 첨가한다. 반응이 완결되면, 이 혼합물을 물과 CH2Cl2간에 분배한다. CH2Cl2층을 농축하고 건조후 실리카겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 화합물 38을 제공한다.
AOTEGO/LEV/PITG 플랫폼, 화합물 39: 0.1M pH 4.6 아세트산나트륨 완충액중 화합물 38의 용액에 20당량의 화합물 37을 첨가한다. 반응이 완결되면, 이 혼합물을 물과 CH2Cl2간에 분배한다. CH2Cl2층을 농축하고 건조후 실리카겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 화합물 39를 제공한다.
AO/DEGA/DEG 플랫폼, 화합물 41의 합성: 오렌지색이 존속할 때까지 브롬(약 6당량)을 CH2Cl2중 화합물 40, 6당량의 트리페닐포스핀, 및 8당량의 피리딘의 용액에 적가한다. 이 혼합물을 실온에서 0.5시간동안 또는 반응이 완결될 때까지 교반하고, 아황산수소 나트륨의 포화용액을 첨가하여 과다한 브롬을 파괴한다. 그리고나서, 이 혼합물을 H2O와 EtOAc간에 분배한다. 조합된 유기층을 염수로 세척하고, 건조(Na2S04), 여과후 농축하고, 실리카겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 화합물 41을 제공한다.
화합물 42: 화합물 41에 6당량의 N-(tert-부틸옥시카르보닐)히드록실아민 (Aldrich Chemical Co.)과 6당량의 DBU를 첨가한다. 필요하다면 이 혼합물을, 반응이 완결되기에 충분한 시간동안 가열한다. 냉각되면, 이 혼합물을 CH2Cl2에 용해하고, 결과적인 용액을 EtOAc에 첨가하여 형성된 침전물을 여과에 의하여 제거하고, 이 여액을 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피에 의한 정제로 8을 제공한다.
화합물 43: BOC-보호기를, 화합물 16의 제조를 위하여 기술된 방법과 본질적으로 동일한 방법으로 화합물 42로부터 제거한다.
이기능적인 링커로서 화합물 37을 이용하는 4가 포합체를 제조하는 양자택일적인 방법: 아미노기전이된 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 4가 아미노옥시 플랫폼과 직접 반응시키는데 대한 양자택일적 방법으로서, 아미노기전이된 도메인 1을 pH 4.6 100mM 아세트산나트륨 완충액중 과다한 화합물 37과 반응시켜 화합물 53을 제공할 수 있는데, 이 화합물에서, 아미노옥시 링커는 옥심 결합에 의하여 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드에 부착된다. 화합물 53은 과다한 링커로부터 분별되고, 4당량의 화합물 53은 pH 4.6 100mM 아세트산나트륨 완충액중 플랫폼 38과 반응하여, 4가 포합체, 화합물 54를 제공하면서 두번째 세트의 옥심 결합을 형성한다.
이기능적인 링커에 대한 전구체로서 화합물 21a를 이용하여 4가 포합체를 제조하는 양자택일적인 방법: 화합물 21a를 수산화암모늄으로 처리하여 아세틸 황 보호기를 제거한 다음, 트리플루오로아세트산으로 처리하여 BOC 보호기를 제거하여 링커 55를 제공한다. 글리옥실-포함 폴리펩티드, 이 경우 TA/D1은 화합물 55와 반응하여 화합물 56, 설프히드릴 링커가 옥심 결합에 의하여 부착되어 있는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 제공한다. 4당량의 화합물 56을 플랫폼 23과 반응시켜 4가 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 포합체, 화합물 57을 제공할 수 있다.
실시예 6
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 사량체 포합체 화합물 44의 결합성질
사량체 포합체 화합물 44의, 두 친화성정제된 인간의 항-β2-GPI 항체에 대한 결합을 표면플라스몬공명을 이용하여 분석하였다.
사량체 포합체 화합물 44의 Kd 측정을 위한 재료 및 방법
시약. CM5 칩(chip), NHS 및 EDC 및 HBS-EP 완충액은 BIAcore로부터 였다. 인간의 통합된(pooled) 정상 IgG(Zymed)를 칩위의 별개의 흐름세포에 부동화시켰고, 음성대조표준으로서 사용하였다. 2명의 환자(6701과 6626)로부터의 친화성정제된 β2-GPI 도메인 1 특이적인 항체를 별개의 흐름세포에 부동화시켰다.
표면플라스몬공명. 모든 실험은 BIAcoreTM2000 기계상에서 25℃에서 10㎕/분의 유속으로 수행되었다. 칩 평형화 및 결합 연구는 가스를 뺀 HBS-EP 완충액을 이용하여 수행되었는데, 이 완충액은 0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA 및 0.005%(v/v) 계면활성제 P20으로 구성된다. 단백질 리간드의, 그것의 자유 아미노기를 통한 CM5 칩으로의 공유결합은 칩을 거쳐 40㎕의 0.05M NHS/0.2M EDC를 흐르게 하여 그 칩을 활성화시키고 적절한 단백질 리간드에 노출시킴으로써 이루어졌다. 친화성정제된 항체와 정상 IgG는, NHS 활성화된 CM5 칩을 거쳐 10mM 아세테이트중 100㎍/mL 용액(pH 4.8) 100㎕를 흐르게 함으로써 부동화되었다. 그리고나서, 칩 표면위의 과다한 반응기는 40㎕의 1M 에탄올로아민(pH 8.5)으로 퀘엔칭된다.
적정. β2-GPI의 배큘로바이러스 발현된 도메인 1 및 사량체 화합물 44를 HBS-EP로 희석하고, 칩을 거쳐 흐르게 하고, 반응값을 780초동안 수집하였다. 이 칩을, 80㎕의 0.1M 글리신-HCl(pH 2.1), 0.1M NaCl을 이용한 샘플 노출사이에서 재생시켰다. 각 샘플에 대하여 일련의 5번의 적정을 수행하였다. 결합 평형으로의 접근은 측정기간동안 불완전하기 때문에, 평형 결합가(Req)는, 제조자 소프트웨어를 이용하여 다음의 식에 연관곡선을 맞춤으로써 측정되었다(BiaEvaluation 버전 2.2, Uppsala, Sweden):
이 식에서, Rt는 시간 t에 측정된 BIAcore 반응이고, Req는 평형 플래토 반응이고, t는 시간이고, t0은 초기시간이고, ks는 외관상 연관상수이고(ks= kaC + kdis, 이때 ka는 연관상수이고, C는 분석물 농도이고, kdis는 해리상수), R0은 반응 옵셋이다(Marquart-Levenberg 알고리듬).
각각의 적정 연관곡선은 공제된 적정을 위한 음성 대조표준(정상 IgG) 세포 배경을 가진다. 계산된 Req는 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 2.01을 이용하여 농도에 대하여 플롯팅되었다. 이 자료는 한 부위 결합에 맞고(직각 쌍곡선: Y = Bmax* X/[Kd + X]), Kd 값은 몰 단위로 계산된다. 도메인 1과 화합물 44의 몰농도는 280nm에서의 흡광도와 1.85의 소광계수에 의하여 측정되었다.
결과 및 토의
환자 6701 및 6626으로부터 친화성정제된 항체를 별개의 미소유체실 (microfluidic chamber)에 부동화시키고, 변하는 농도의 인간 β2GPI 도메인 1 또는 화합물 44에 노출시켰다. 평형 결합가를 각각의 농도에 대하여 측정하였고 플롯팅하여 외관상 평형 해리상수를 측정하였다. 결합 등온선이 도 10과 11에서 보여지고(소광계수 = 1.85; 100㎍/ml 부동화된 항체), 해리상수는 표 8에서 표시된다.
이 실험들은 친화성정제된 항인지질 항체가 β2GPI의 도메인 1에 결합한다는 것을 증명한다. 게다가, 이 실험들은, 플랫폼에 연결된 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 사량체 포합체도 또한 사량체에 존재하는 도메인 1의 몰농도와 등가이거나 그보다 큰 친화성을 가지고 이 항체들에 결합할 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 7
생체외 경합적 항체결합에 대한 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 포합체의 시험
Nunc Maxisorp 미소플레이트(Nalge Nunc International, Denmark)를 PBS중 2.5㎕/mL농도의 β2GPI 100㎕/웰로 코팅하고, 실온에서 2시간동안 인큐베이션하고, 0.4 Tween-80(Sigma Chemical Co.)을 포함한 2% 탈지유 250㎕/웰을 이용하여 실온에서 2시간동안 차단하였다. TBS로 다섯번 세척한 다음, 모두 0.4% Tween-80을 포함한 2% 탈지유중의, 환자 6501로부터의 혈장의 1:200 최종희석 및 다양한 양의 사량체 도메인 1 포합체 화합물 44 및 화합물 45 또는 대조표준 도메인 1 단량체를 웰당 배달하도록 고안되고 한시간이하 이전에 제조된 용액 100㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 1시간동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 TBS로 다섯번 세척하였다. 0.4% Tween-80을 포함하는 2% 탈지유중에 1:1000으로 희석된 감마사슬 특이적인 알칼리성 포스파타제-포합된 항-인간 IgG(Zymed) 100㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서의 1시간후 플레이트를 TBS로 5번 세척하였다. 각각의 웰에, 색전개를 위한 PPMP 발색 기질용액 100㎕를 실온에서 첨가했다. 웰당 광학적 흡광도는 상업적 미소플레이트 판독기(Bio-Tek Instruments EL311)안에서 A550nm에서 측정되었다. 도 12에서 보여지는 그 결과는, 화합물 44와 45 둘다가 혈청(환자 6501)에 존재하는 항인지질 항체에 대하여 효과적으로 경합함을 나타낸다. 환원되고 알킬화된 도메인 1은 그러한 경합을 보여주지 않으며 음성 대조표준이다. 경합적인 결합은 또한 정규의 단량체 도메인 1에 의하여도 보여지며 양성 대조표준으로서 포함된다.
실시예 8
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 포합체를 시험하기 위한 면역화된 마우스 모델
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드에 대한 내성을 시험하기 위한 면역화된 모델의 필요조건은: (1) 면역화가 도메인 1을 인식하는 항체를 발생시켜야 하고 (2)면역화가 도메인 1을 인식하는 T 세포를 발생시키지 않아야 한다는 것이다. 도메인 1 폴리펩티드-KLH 포합체로의 면역화는 KLH를 인식하지만 도메인 1에 대한 검출가능한 반응성은 없는 T 세포를 발생시킨다. 이 목적을 위하여, 본 발명자들은, 곤충세포 시스템에서, 카르복시 말단에 제5의 시스테인을 포함하는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 아미노산 66)를 제조하였다. 이 분자는 제5의 시스테인에 의하여 KLH로 공유결합되었다. 이 포합체를 사용하여 마우스를 면역화하였다. 도메인 1-KLH 포합체를 이용한 면역화는 KLH를 인식하지만 도메인 1에 대하여 검출가능한 반응성이 없는 T 세포를 발생시킨다. 한편, 도메인 1-KLH 포합체를 이용하여 면역화한 결과 도메인 1 특이적인 항체가 생산된다.
재료 및 방법
항-도메인 1 항체를 검출하기 위한 ELISA
NUNC 미소적정 웰을 0.1M 중탄산염(pH 9.5)중 5㎍/ml농도의 β2GPI 50㎕로 밤새 코팅하였다. 이 웰을 PBS로 세척한 다음 2% 탈지분유(NFDM)로 1시간동안 차단하였다. 이 웰을 세척하고, 2% NFDM중 각각의 마우스 혈청의 일련의 희석 50㎕를 첨가하고 실온에서 1시간동안 인큐베이션한 다음 세척하고, 50㎕의 알칼리성 포스파타제 포합된 항-마우스 IgG를 첨가하고, 실온에서 1시간동안 인큐베이션한 다음 세척하고 50㎕의 기질을 첨가하였다. 550nm에서의 OD를 30분후에 판독하였다. 풀(pool)이 50㎍의 포합체로 프라이밍되어 있는 마우스로부터의 혈청으로부터 제조되었다. 이 풀은 모든 검정에서 시험되었고, 그 결과들은 이 표준 풀의 퍼센트로서 표현된다.
경합적 억제 ELISA
NUNC 미소플레이트를 0.1M 중탄산염, pH 9.5중 5㎍/ml농도의 재조합 β2GPI 50㎕로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 0.15M PBS(pH 7.2)로 세번 세척한 다음, PBS(2% NFDM)중 2% 탈지분유 75㎕로 실온에서 1시간동안 차단하였다. 시험 억제제를 2% NFDM에 희석하고, 각각의 희석 또는 NFDM 단독 25㎕를 코팅된 웰에 첨가하였다. 모노클로날 항체를 2% NFDM에 희석하고, 25㎕의 일정 농도를 웰에 첨가하였다. 웰의 내용물을 혼합하고, 플레이트를 실온에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 세번 세척한 후에, 2% NFDM중에 대략 희석된 감마사슬 특이적인 알칼리성 프로파타제-포합된 항-인간 IgG 50㎕를 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 3번 세척하고, 50㎕의 알칼리성 포스파타제 발색기질을 첨가하고, 이 플레이트를 20℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. A550을 미소플레이트 자동판독기안에서 측정하였다. 퍼센트 억제는 다음과 같이 측정되었다: [(배경의 A550를 감한 억제제 없이 대조표준 웰로부터 얻어진 평균 A550)-(배경의 A550를 감한 억제제의 존재하에서 얻어진 A550)/(배경의 A550를 감한 억제제 없이 대조표준 웰로부터 얻어진 평균 A550)] 곱하기 100.
항-도메인 1 항체를 위한 면역화된 마우스 모델
5마리의 C57B1/6 마우스의 그룹은, 애주번트로서 명반 더하기 2 x 109pertussis 유기체에 흡착된 10, 50 또는 100㎍의 KLH-도메인 1 포합체로 프라이밍되었다. 3주후에, 모든 마우스를 식염수중 10㎍의 포합체로 추가접종하였다. 추가접종후 7일째에 마우스를 출혈시켜 혈청을 수확하고 항-도메인 1 활성에 대하여 시험하였다. 그 결과가 도 14에서 보여진다. 도메인 1-KLH로의 면역화는 도메인 1-특이적인 항체반응을 발생시키지 않았다.
마우스 면역화 및 T 세포 증식분석
C57B1/6 마우스를, 완전한 프로인트애주번트(CFA)에 유화된 25㎍의 도메인 1(D1)-KLH 포합체로 후방 풋패드에 주사하였다. 또다른 그룹의 마우스는 유화된 CFA(항원 없음)로 후방 풋패드에 주사하였다. 7일후에, 슬와 림프절을 각 그룹의 5마리 마우스로부터 수확하였다. 유사 면역화로부터의 절을 통합하여 단일세포 헌탁액을 만들었다. 이 세포들을, 시험 항원이 D1-KLH, KLH 및 도메인 1(포합되지 않음)인 것을 제외하고는 인간세포를 위하여 위에서 기술된 대로 배양하였다. PPD를 양성 대조표준으로서 사용하였다. 4일째에, 1μCi를 포함하는3H-티미딘 25㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 5일째에, 웰의 내용물을 수확하고 각각에서의 방사활성의 양을 측정하였다. 자극 지수(SI)는, 웰의 CPM을 음성 대조표준의 평균 CPM에 의하여 나눔으로써 각각의 웰에 대하여 계산되었다. 각각의 중복을 위한 평균(및 표준오차) SI를 측정하였다.
결과 및 토의
폴리클로날 마우스 항-KLH-도메인 1 포합체의 특이성을 경합적 억제 ELISA 분석에 의하여 측정하였다. 다양한 재조합 형태의 β2GPI를 β2GPI로 코팅되어있는 웰안의 한정적인 양의 항체와 혼합하였다. 그리고나서, 웰에 결합된 채 남아있는 항체의 양을 알칼리성 포스파타제 포합된 2차항체를 이용하여 검출하였다. 퍼센트 억제를 방법난에서 기술된 대로 측정하고, μ몰농도의 억제제에 대하여 플롯팅하였다. 그 결과들이 도 15에서 보여진다. 동일한 포합체로의 면역화는 도메인 1에 대하여 특이적인 항체반응을 발생시킨다(도 15).
T 세포 증식에 관하여, 도 13에서 보여지는 결과들은, 도메인 1-KLH 프라이밍된 마우스로부터의 세포가 양성 대조표준 PPD는 물론 도메인 1-KLH 및 KLH 둘다에 반응하여 증식했다는 것을 증명한다. 그것들은 도메인 1(비-포합)에 반응하지 않았다. 한편, CFA만으로 프라이밍된 마우스로부터의 세포는 시험 항원에 반응하지 않았지만 양성 대조표준 PPD에는 반응하였다.
프라이밍이, 주어진 내성원을 인식하는 T 세포를 프라이밍하지 말아야 하지만 그 내성원을 인식할 기억 B 세포를 생성시켜야 하는, 이른바 면역화된 마우스 모델을 위하여, 면역화된 마우스 모델을 위한 이 두가지 기본 필요조건 둘다가 본원에서 제시된 면역화된 모델에서 달성되었다.
실시예 9
생체내 내성원으로서 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 시험
상기에서 기술된 대로 애주번트로서의 명반 더하기 pertussis상의 키홀 조개 헤모시아닌(KLH)에 포합된 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드로 마우스를 프라이밍한다. 3주후에, 마우스를 내성원의 일정범위의 용량으로 처리하는데, 이 내성원은 플랫폼에 포합되거나 포합되지 않을 수 있다. 한 그룹은 처리되지 않고 대조군으로서 작용한다. 5일후에, 대조군을 포함하여 모든 마우스를, KLH에 포합된 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드 10㎍으로 추가접종하고, 7일후에 이 마우스들을 출혈시킨다. 그것들의 혈청을, 예를 들어 앞서말한 실시예들에서 기술된 대로의 ELISA를 포함하는 어떤 공지방법에 의하여든 항-β2GP2 도메인 1 항체에 대하여 분석한다. 그리고나서 그 값들을 사용하여 그룹의 모든 개체에 대하여 평균 및 표준오차를 측정한다.
실시예 10
T 세포 반응성 시험
도메인 1 β2GPI 폴리펩티드에 대한 T 세포 반응성의 결핍을 확립하는 것은, 내성원으로서, 그것이 T 세포로부터 B 세포로의 제2 신호를 위한 어떤 에피토프도 공급하지 않는다는 것을 가리킨다. 반대로, 만약 내성원이 T 세포로 증식(활성화)신호를 제공한다면, 이 내성원이 B 세포반응을 격화시키는 것이 가능하다.
T 세포 활성화를 측정하기 위하여, 순환하는 림프구를 수집하고 조직배양물에 배치한다. 시험될 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드(들)을 약 한주동안 이 배양물에 첨가한다. 그 주가 끝날 때, T 세포를3H-티미딘으로 펄스하여 세포성 증식이 있었는지 여부를 측정한다. 선택적으로, 조직배양 상청액안의 사이토카인의 존재도 또한 측정된다.
실시예 11
항 β2-GPI 항체는 인자 Va의 비활성화를 연기함으로써 과응고에 기여한다
방법
항인지질 증후군(APS)으로 진단된 환자로부터의 친화성정제된 항체 또는 총 IgG 제제의 존재 및 부재하에서의 응고 시작후에, 활성화된 인자 V(인자 Va) 수준을 정상적인 인간 혈장에서 측정하였다. 친화성-정제된 항체는 항 β2-GPI 도메인 1으로서 특성지워졌다. 총 IgG는 하기에서 기술된 대로 환자 혈청으로부터 제조되었다.
인자 Va 수준의 측정은, 다음과 같이 Amelung KC4A 미소응고측정기 (microcoagulometer)를 이용하여 변형된 2-단계 응고검정에서 측정되었다. 50㎕의 인자 V 결핍 인간 혈장(Chromogenix)을 원심분리 미소큐베트안에서 1분동안 37℃로 예비-인큐베이션하였다. 샘플을 예비-가온된(37℃) Owren 완충액(Sigma)으로 1:10 희석하였다. 이 희석된 샘플의 50㎕를 50㎕의 V결핍 혈장에 첨가하였다. 100㎕의 37℃ ThromboMAX 더하기 칼슘(Sigma)을 첨가하여 응고를 시작시켰다. 시간 대 응고를 기록하였다. Va 활성의 1 유니트는, 정상적인 기준 인간혈장(Accuclot, Sigma)으로 1:10 희석된 V 결핍 혈장을 위한 시간 대 응고로서 정의된다. 이 실험 시스템에 있어서 인자 Va 활성의 1 유니트는 약 30초의 응고 시간에 상응한다.
항인지질 항체 또는 IgG의 존재 또는 부재하에 시간에 걸쳐 생성되는 인자 Va의 양을 측정하기 위하여, 다음의 시스템을 이용하여 상기 표준검정에서 시험되는 샘플을 생성하였다. 다음의 시약을 혼합하고, 37℃에서 인큐베이션하였다: 1부분의 정상적인 인간 기준 혈장(Accuclot, Sigma), 1부분의 25mM CaCl2및 포스패티딜 세린 시약(125㎍/ml)과 Tris-완충 식염수(TBS)와 항체 또는 IgG(원하는 농도에서 적용될 수 있다면)로 구성된 1부분. TBS를 사용하여 항체 또는 IgG의 변하는 부피에 대하여 보정하였다. 정상 혈장, 포스패티딜-세린, 항체 또는 IgG(존재한다면) 및 TBS를 혼합하고, 37℃ CaCl2을 첨가하여 응고를 시작시키기 전에 37℃에서 2분동안 인큐베이션하고, 응괴가 형성되면 이 응괴를 제거하였다. 샘플 혼합물의 총 부피는 분석되는 시점의 수에 의존하였다. 각 시점에서 12.5㎕의 인큐베이션 샘플을 제거하고, Owren 완충액중에 1:10 희석하고, 상기 표준인자 Va 검정에서 분석하였다. 시간에 걸쳐 샘플내에 생성된 Va의 수준은 인자 V 결핍 혈장 응고시간의 보정에 반영된다. 피크 Va 수준은 응고가 시작된 수 4-5분에 발생하고 이 수준은 4-7 유니트의 인자 Va 활성의 범위내이다. 이것은 이 실험시스템을 위한 표준검정에서 약 5-6초의 응고시간에 상응한다.
APS 환자 IgG를 검정에 첨가하는 경우에, 총 IgG는, 100㎕의 혈청(Pierce Immunopure IgG 결합완충액으로 1:1 희석됨)을 100㎕의 아가로스-부동화된 단백질 G 비드(Pierce Immunopure Plus)와 조합함으로써 인간의 혈청샘플로부터 제조되었다.
이 혼합물을 10분동안 주위온도에서 서서히 진탕하였다. 단백질 G는 모든 하위클래스의 인간 면역글로불린 G의 Fc영역과 결합한다. 10분후에, 이 혼합물을 잠시 원심분리시켜 비드를 펠리팅하였다. 이 혈청혼합물 상청액을 부어버렸다.
그리고나서, IgG가 결합되어 있는 비드를 200㎕의 IgG 결합완충액으로 세번 세척하여 흡착된 단백질을 제거하였다. 그리고나서, 결합된 IgG를, 세번의 100㎕의 IgG 용출완충액(Pierce, Immunopure IgG 용출완충액)으로 단백질 G 비드로부터 용출시켰다. 용출된 IgG는 100㎕의 1M NaPO4 pH 7.5로 즉시 중성화되어, 100㎕의 혈장 샘플로부터 총 부피 400㎕의 IgG 제제가 되었다. 중성화된 IgG 제제를 분석하기까지 4℃에서 저장하였다.
IgG 제제의 단백질 농도는 표준적인 미소플레이트 Bradford 방법(Bio-Rad 시약)에 의하여 측정되었다. 각각의 샘플의 5㎕를, 각각의 플레이트상에서의 우혈청 알부민의 표준곡선을 이용하여 삼중으로 분석하였다. 단백질 농도는 KC4 소프트웨어에 의하여 계산되었다.
인자 Va 응고 검정에서의 분석을 위하여, 100㎕의 IgG 제제를 Microcon 원심분리 여과장치(Amicon, 30,000의 분자량 컷오프)를 이용하여 25㎕로 농축하였다. 전체 25㎕를 단일 시점 인자 Va 검정에 이용한다.
결과
항인지질 환자로부터의 총 IgG 및 정상 대조표준으로부터의 친화성정제된 항체의 효과는, 생체외 응고검정에서 인자 Va 비활성화를 연기하는 그것들의 능력에 대하여 비교되었다. 총 IgG와 친화성정제된 항체에 대한 결과는 표 9와 도 16에서 각각 보여진다. 정상 대조표준 피검자로부터의 IgG와 친화성정제된 항체는, 응고를 시작한 후 20분에 관찰된 인자 Va의 비활성화를 변경하지 않았다. 대조적으로, 항인지질 환자로부터의 IgG 분획은 인자 Va(스튜던트 t-테스트에 의하여 p＜0.05)의 비활성화를 연기시켰다. 인자 Va 비활성화에 대한 유사한 효과가 친화성정제된 항체에 대하여 관찰되었다. 이 자료는 인간의 항-b2-GPI 항체가 부분적으로 인자 Va의 비활성화를 연기시킴으로써 과응고상태를 만들어낼 수 있음을 제안한다.
앞서말한 발명이 이해를 명확하게 할 목적으로 예증과 실시예에 의하여 어느정도 상세하게 기술되었음에도 불구하고, 어떤 변화와 변형이 실행될 것임이 당업자에게는 자명할 것이다. 그러므로, 설명과 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안되고, 이것은 첨부된 청구항에 의하여 서술된다.

Claims (44)

  1. 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드로서, β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합하고, 폴리펩티드 SEQ ID NO: 2(도 1); β2GPI의 도메인 1, 2, 및 3; 및 β2GPI의 도메인 1, 2, 3, 및 4로 구성된 군으로 구성되지 않는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드가 폴리펩티드 SEQ ID NO:4(도 2)로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드가 SEQ ID NOS: 5-12로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 대략 아미노산 1 내지 대략 아미노산 66을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  5. 제 1 항에 있어서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드가 SEQ ID NO:4의 대략 아미노산 1 내지 대략 아미노산 59를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  7. 제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 중합체 폴리펩티드.
  8. 제 1 항에 있어서, T 세포 에피토프가 결핍된 폴리펩티드로서, 상기 T 세포 에피토프가 β2GPI 의존성 항인지질 항체를 가지는 개체에서 T 세포를 활성화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제 8 항의 폴리펩티드의 포합체.
  10. 제 9 항에 있어서, 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 포합체.
  11. 제 9 항에 있어서, 원자가 플랫폼 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 포합체.
  12. 제 11 항에 있어서, 플랫폼 분자가 단백성인 것을 특징으로 하는 포합체.
  13. 제 11 항에 있어서, 플랫폼 분자가 비-단백성인 것을 특징으로 하는 포합체.
  14. 제 11 항에 있어서, 원자가 플랫폼 분자의 집단의 분자량이 균질한 것을 특징으로 하는 포합체.
  15. 제 11 항에 있어서, 플랫폼 분자가 티오에테르 결합에 의하여 폴리펩티드에 연결되는 것을 특징으로 하는 포합체.
  16. 제 11 항에 있어서, 플랫폼분자가 옥심 결합에 의하여 폴리펩티드에 연결되는 것을 특징으로 하는 포합체.
  17. 제 11 항에 있어서, 플랫폼 분자가
    인 것을 특징으로 하는 포합체.
  18. 제 11 항에 있어서, 플랫폼 분자가
    인 것을 특징으로 하는 포합체.
  19. 제 11 항에 있어서,
    이고, 이때 D1은 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 포합체.
  20. 제 11 항에 있어서,
    이고, 이때 D1은 β2GPI 도메인 1 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 포합체.
  21. 제 1 항의 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 자연발생적 폴리뉴클레오티드.
  22. 제 1 항의 폴리펩티드를 코드화하는 비-자연발생적 폴리뉴클레오티드.
  23. 제 8 항의 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 자연발생적 폴리뉴클레오티드.
  24. 제 8 항의 폴리펩티드를 코드화하는 비-자연발생적 폴리뉴클레오티드.
  25. 제 21 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  26. 제 21 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 클로닝벡터.
  27. 제 21 항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주세포.
  28. 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드의 유사체로서, 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드가 특이적으로 결합하는 β2GPI-의존성 항인지질 항체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 유사체.
  29. 제 28 항에 있어서, 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 유사체.
  30. 제 29 항에 있어서, T 세포 에피토프가 결핍된 유사체로서, 상기 T 세포 에피토프가 β2GPI 의존성 항인지질 항체를 가지는 개체에서 T 세포를 활성화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 유사체.
  31. 적당한 포장내 제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 도메인 1 β2GPI 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위한 키트.
  32. 적당한 포장내 제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 응고를 검출하기 위한 키트.
  33. 유효량의 제 8 항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 이때 유효량은 내성을 유도하기에 충분한 양인 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 유효량의 제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 이때 유효량은 β2GPI-의존성 항인지질 항체를 검출하기에 충분한 양인 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 샘플내에서 제 1 항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는 방법으로서, (a) 샘플내의 항체를 제 1 항의 폴리펩티드와 안정한 항원-항체 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 접촉시키는 단계와; (b) 단계 (a)에서 형성된 안정한 복합체가 있는 경우, 그 복합체를 검출하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 항체가 β2GPI-의존성 항인지질 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. β2GPI-의존성 항인지질 항체를 정제하는 방법으로서, 생물학적 샘플을 제 1 항의 폴리펩티드와 안정한 항원-항체 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 접촉시키는 단계와, 형성된 복합체가 있는 경우, 그 복합체를 획득하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 개체에서 내성을 유도하는 방법으로서, 제 8 항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 개체가 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 개체에서 내성을 유도하는 방법으로서, 제 11 항의 포합체를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 개체가 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 4의 대략 아미노산 1로부터 대략 아미노산 60까지의 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 응고의 β2GPI-의존성 항인지질 항체 매개를 검출하는 방법으로서,
    (a) 개체로부터의 적당한 생물학적 샘플을 이용하여 제1 응고분석을 수행하는 단계 (이때 제 1 항의 폴리펩티드가 검정에 첨가됨); 및
    (b) 제 1 항의 폴리펩티드의 부재하에서 개체로부터의 적당한 생물학적 샘플을 이용하여 제2 응고검정을 수행하는 단계;
    (c) 단계(a)와 (b)의 검정 결과를 비교하는 단계로 이루어지고, 이때 결과에 있어서의 차이가 응고의 β2GPI-의존성 항인지질 항체 매개를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
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