ES2275348T3 - Polipeptidos del dominio 1 de beta2 gp1 terapeuticos y diagnosticos y metodos para usarlos. - Google Patents
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Abstract
Un conjugado que comprende una molécula plataforma de valencia y un polipéptido que comprende al menos seis aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 4, que tiene una longitud menor que 100 aminoácidos y que se une específicamente a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de a2GPI.
Description
Polipéptidos del dominio 1 de \beta_{2}GPI
terapéuticos y diagnósticos y métodos para usarlos.
Esta invención se refiere a conjugados y
polipéptidos para diagnosticar y tratar patologías asociadas con
anticuerpos antifosfolípidos, en particular las patologías asociadas
con anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI.
Anticuerpos antifosfolípidos (aPL) (del inglés,
" antiPhosphoLipid") es la expresión
generalmente empleada para describir autoanticuerpos que está
asociados con trombosis, muerte fetal recurrente y trombocitopenia
constituyendo el síndrome antifosfolípido primario (APS) (del
inglés, " Anti-Phospholipid
Syndrome") así como con enfermedades autoinmunitarias
tales como el lupus eritematoso sistémico (SLE). Harris y col.
(1983) Lancet 2:1211-1214; y
Lockshin y col., (1985) N. Engl. J. Med. 313:152-156. El APS puede ser primario o secundario, indicando que está asociado con otras dolencias, principalmente, con SLE. PHOSPHOLIPID-BINDING ANTIBODIES (Harris y col., redactores, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991; McNeil y col. ADVANCES IN IMMUNOLOGY, Vol. 49, págs. 1993-281 (Austen y col., redactores, Academic Press, San Diego, CA, 1991). Los anticuerpos aPL (que incluyen a los anticuerpos aCL) se detectan en muchas dolencias pero solamente los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI, encontrados en asociación con enfermedades autoinmunitarias, requieren la presencia de la proteína sérica de unión a fosfolípidos, \beta_{2}GPI. Vaarala y col. (1986) Clin. Immunol. Immunopathol. 41:8-15.
Lockshin y col., (1985) N. Engl. J. Med. 313:152-156. El APS puede ser primario o secundario, indicando que está asociado con otras dolencias, principalmente, con SLE. PHOSPHOLIPID-BINDING ANTIBODIES (Harris y col., redactores, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991; McNeil y col. ADVANCES IN IMMUNOLOGY, Vol. 49, págs. 1993-281 (Austen y col., redactores, Academic Press, San Diego, CA, 1991). Los anticuerpos aPL (que incluyen a los anticuerpos aCL) se detectan en muchas dolencias pero solamente los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI, encontrados en asociación con enfermedades autoinmunitarias, requieren la presencia de la proteína sérica de unión a fosfolípidos, \beta_{2}GPI. Vaarala y col. (1986) Clin. Immunol. Immunopathol. 41:8-15.
Aproximadamente un 30% de los pacientes que
poseen anticuerpos aPL persistentes han padecido un episodio
trombótico. La presencia de anticuerpos aPL define un grupo de
pacientes incluidos en el SLE que presentan un síndrome de
características clínicas consistentes en uno o más episodios de
trombosis, trombocitopenia (TCP) y muerte fetal. El riesgo de este
síndrome en todo el conjunto de SLE es de alrededor del 25%; este
riesgo aumenta hasta el 40% en presencia de anticuerpos aPL y
disminuye hasta el 15% en su ausencia. Debido a que se pensaba que
los aPL estaban dirigidos a fosfolípidos de las membranas
plasmáticas, se ha postulado que pueden ejercer efectos patogénicos
directos in vivo interfiriendo con procesos hemostásicos que
tienen lugar en las membranas fosfolipídicas de células tales como
plaquetas o endotelio. En pacientes con APS, el hecho de que los
anticuerpos aPL (incluyendo a anticuerpos aCL) parecen ser el único
factor de riesgo presente, es una evidencia más de que estos
anticuerpos tienen un papel patogénico directo. La inducción de APS
mediante transferencia pasiva de anticuerpos aPL humanos a ratones
es la mejor evidencia hasta ahora de que los anticuerpos aPL son
directamente patogénicos. Bakimer y col., (1992) J. Clin.
Invest. 89; 1558-1563; Blank y col. (1991)
Proc. Natl. Acad Sci. 88:3069-3073. Las
estimaciones varían pero en aproximadamente en el 15% de todos los
pacientes con apoplejía, se piensa que los anticuerpos aPL son un
factor contribuyente importante.
La clara correlación entre la presencia de estos
anticuerpos con varias enfermedades fuerza a su detección y medida.
Sin embargo, la medida de los anticuerpos aPL en el entorno clínico
es todavía una técnica imperfecta y por lo tanto presenta
importantes problemas. Una colección SET de antisueros estándar
comercialmente disponibles (APL Diagnostics, Inc.,
Louisville, KY) permite la generación de una curva estándar para la
comparación de análisis realizados en distintos laboratorios.
Existe, no obstante, una gran cantidad de discrepancias entre los
resultados obtenidos en estos laboratorios con respecto a las
valoraciones exactas de GPL y MPL, las unidades de medida de los
anticuerpos antifosfolípidos de tipo IgG e IgM respectivamente, para
sueros determinados, y los niveles de GPL y MPL que están
clasificados como altos (80 o más), medios (20-80),
bajos (10-20) o normales (0-10).
Los kits comercialmente disponibles presentan una enorme
variación en los valores asignados a los estándares comercialmente
disponibles. Reber y col. (1995) Thrombosis and Haemostat.
73:444-452.
La naturaleza exacta de la especificidad
antigénica de los autoanticuerpos aPL es controvertida, y se refleja
en las nomenclaturas cambiantes utilizadas para estos anticuerpos.
En un principio se pensó que estos autoanticuerpos estaban
dirigidos contra fosfolípidos aniónicos y de ahí el nombre de
"anticuerpos anticardiolipina". Gharavi y col (1987)
Ann. Rheum. Dis. 46m:1-6. Luego se
evidenció que la \beta_{2}GPI desempeñaba un papel importante
en la especificidad antigénica de los anticuerpos aPL (que incluyen
a los anticuerpos aCL). Vermylen y col. (1992) J. Lab. Clin.
Med. 120:10; McNeil y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87:4120-4124. Estas observaciones indican
que estos anticuerpos se denominan más apropiadamente "anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI", que es la
expresión usada en esta memoria descriptiva.
Los informes sobre que \beta_{2}GPI
desempeñaba un papel como cofactor en la unión de los anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI junto con algunos
informes sobre que los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI podían unirse a la propia \beta_{2}GPI, han
dado lugar a interpretaciones contradictorias acerca de la
naturaleza del sitio antigénico reconocido por estos anticuerpos.
Sin embargo, el papel desempeñado por \beta_{2}GPI sigue sin
estar claro, y se han sugerido varias explicaciones. Algunos grupos
han llegado a la conclusión de que los anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI reconocen un antígeno complejo que
incluye tanto a la \beta_{2}GPI como a un fosfolípido aniónico,
mientras que otros grupos han observado la unión de anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI a
\beta_{2}GPI en ausencia de fosfolípido. McNeil y col. (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:4120-4124; Galli y col., (1990) Lancet
335:1544; Roubey y col. (1995) J. Immun.
154(2):954-960; Arvieux y col. (1991) J.
Immunol. Methods 143: 223. Se han ofrecido varias
interpretaciones para explicar estas diferencias. Galli y col.
postulan que debido a que los anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI son anticuerpos de baja afinidad
por \beta_{2}GPI, requieren la participación de ambos sitios en
conjunción sobre una molécula de IgG determinada por medio de un
antígeno multivalente sobre una fase sólida. Galli y col. (1990).
Estos autores sostienen además que en determinadas condiciones, por
ejemplo la irradiación con rayos gamma de los pocillos de
microtitulación, se puede inmovilizar una cantidad suficiente de
\beta_{2}GPI para permitir que estos anticuerpos de baja
afinidad se unan. Otros autores sostienen que un epítopo críptico,
reconocido por los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI, se genera cuando \beta_{2}GPI se une a
pocillos irradiados con radiación gamma o a pocillos revestidos con
cardiolipina. Matsura y col (1994) J. Exp. Med. 179:457.
La \beta_{2}GPI es una glicoproteína
plasmática de 50 kilodalton que presenta varias propiedades que
definen a un anticoagulante, tal como la inhibición de la
activación por contacto de la ruta intrínseca de coagulación, de la
actividad de protombinasa de las plaquetas, y de la activación de
las plaquetas inducida por ADP. Roubey (1996) Arthritis
Rheum. 39:1444; Valesinit y col. (1992) Automimmunity
14:105. La secuencia de aminoácidos de \beta_{2}GPI ha sido
determinada. La \beta_{2}GPI está compuesta por cinco dominios
homólogos. Cuatro de ellos están compuestos por aproximadamente 60
aminoácidos que contienen cistinas, prolinas y triptófanos
altamente conservados. Lozier y col. (1984) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81:3640; Steinkasserer y col. (1991) Biochem.
J. 277:387-391. Este motivo de proteínas
estructurales fue descrito por primera vez en \beta_{2}GPI y se
caracteriza por su longitud, su plegamiento independiente, y por una
región estructural con una localización homóloga de 4 residuos de
medias cistinas implicados en la formación de dos puentes disulfuro
internos; dos prolinas; dos residuos de fenilalaninas, tirosina o
histidina; dos glicinas; y una leucina o valina. Estos motivos de
repetición se denominaron estructuras sushi debido a su forma
o a veces se ha hecho referencia a ellos como repeticiones consenso
cortas. Reid y col (1989) Immunol. Today 10: 177.
Ichinose y col. (1990) J. Biol. Chem. 265:
13411-13414. El quinto dominio contiene 82 residuos
de aminoácidos y 6 medias cistinas.
Además de la controversia anteriormente
comentada que rodea a la naturaleza de la especificidad antigénica
de los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI, ha existido una considerable controversia con
respecto a la naturaleza y localización de los epítopos reconocidos
por los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI, en \beta_{2}GPI. Se ha sugerido que el sitio
de unión a fosfolípidos de \beta_{2}GPI está localizado en el
dominio quinto. Hunt y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:2141. Hunt y col. también informaron sobre las diferencias
estructurales entre una forma activa de \beta_{2}GPI y una
forma inactiva de \beta_{2}GPI que carecía de la actividad de
cofactor antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI y
concluyeron que el epítopo putativo para los anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI era muy probable
que estuviera en el dominio quinto de \beta_{2}GPI. Hunt y col.
(1994) J. Immunol. 152:653-659. Otros grupos
han usado proteínas \beta_{2}GPI recombinantes para intentar
localizar el sitio antigénico de los anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI. Dos de estos grupos produjeron
proteínas \beta_{2}GPI mutantes de las que diferentes dominios
se han delecionado en un sistema de expresión en baculovirus. Ambos
grupos concluyeron que el epítopo para los anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI era críptico y
que el dominio 4 podía estar implicado de manera dominante en la
exposición del epítopo. Igarashi y col (1996) Blood
87:3262-3270; George y col., (1998) J.
Immunol. 160:3917-3923. Otro grupo expresó en
Escherichia coli proteínas \beta_{2}GPI mutantes en las
que diferentes dominios habían sido delecionados y concluyeron que
el dominio 5 contenía epítopos reconocidos por anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI. Yang y col.
(1997) APLAR J. Rheumatol., 1:96-100.
Existe una seria necesidad de sistemas de
detección mejorados y de tolerágenos para dolencias mediadas por
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI.
Todas las referencias bibliográficas aquí
citadas, se incorporan como referencia en su totalidad.
Del Papa y col. (1998) J. Immunol.
160:5572-5578 describen que la
\beta_{2}-glicoproteína I humana se une a
células endoteliales a través de una agrupación de residuos de
lisina que son críticos para la unión de fosfolípidos aniónicos y
ofrece epítopos para anticuerpos
anti-\beta_{2}-glicoproteína
I.
Hagihara y col. (1995) J. Biochem.
118:129-136 describe que los dominios N- y
C-terminales de la
\beta_{2}-glicoproteína I bovina desempeñan un
papel en su interacción con la cardiolipina.
El documento WO97/46251 describe análogos de aPL
que se unen específicamente a células B a las que está unido un
epítopo para aPL. Los análogos optimizados carecen de
epítopo(s) para células T y son útiles como conjugados para
tratar enfermedades mediadas por anticuerpos aPL. También se
describen conjugados que comprenden análogos de aPL y moléculas
plataforma de valencia, no inmunogénicas.
El documento
EP-A-0730155 describe un método de
análisis de un anticuerpo antifosfolípido contenido en una muestra
usando la \beta_{2}-glicoproteína I, en el que
se usa, en lugar de la propia
\beta_{2}-glicoproteína I, un polipéptido que
tiene la misma secuencia de aminoácidos que la del dominio IV de la
\beta_{2}-glicoproteína I o un polipéptido que
es parcialmente diferente del polipéptido anteriormente mencionado
pero que tiene una función equivalente, permitiendo con ello un
análisis fácil y preciso de un autoanticuerpo que se ha originado
en un síndrome asociado con anticuerpos antifosfolípidos.
La invención proporciona un conjugado que
comprende una molécula plataforma de valencia y un polipéptido que
comprende al menos 6 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 4, que
tiene una longitud menor que 100 aminoácidos y que se une
específicamente a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI. El polipéptido recibe aquí el nombre de
"polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI", y se une
específicamente a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI.
En algunas realizaciones, el polipéptido
comprende fragmentos del dominio 1, tales como los que se muestran
en la Tabla 1. En otras realizaciones, el polipéptido comprende un
epítopo conformacional. En otras realizaciones más, el polipéptido
consiste en el dominio 1. El polipéptido puede carecer de un epítopo
para células T (detectable), siendo dicho epítopo para células T
capaz de activar las células T de un individuo que posee anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI.
La invención también proporciona un polipéptido
que se une específicamente a un anticuerpo antifosfolípido
dependiente de \beta_{2}GPI, que tiene una longitud menor que 75
aminoácidos y que comprende al menos 30 aminoácidos contiguos del
SEQ. ID. NO: 4 o, si tiene una longitud menor que 30 aminoácidos,
comprende al menos 6 aminoácidos contiguos seleccionados entre los
SEQ ID NOS: 5, 9, 10, 11 y 12, y un polipéptido de fusión que
comprende ese polipéptido.
En otro aspecto, la invención proporciona
polinucleótidos (que incluyen polinucleótidos aislados, presentes
en la naturaleza y no presentes en la naturaleza) que codifican
cualquiera de los polipéptidos de esta invención. Los
polinucleótidos se pueden aislar en vectores de clonación o de
expresión y/o en células hospedadoras adecuadas. Y además, la
invención proporciona:
- un kit para detectar (a)
polipéptidos \beta_{2}GPI o (b) coagulación, comprendiendo dicho
kit un conjugado o un polipéptido de la invención en un
estuche adecuado;
- una composición que comprende una cantidad
efectiva de un conjugado o de un polipéptido de la invención, en la
que el polipéptido carece de un epítopo para células T capaz de
activar las células T de un individuo que posee anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI, y en la que una
cantidad efectiva es una cantidad suficiente para inducir
tolerancia;
- una composición que comprende una cantidad
efectiva de un conjugado o de un polipéptido de la invención, en la
que una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para detectar
un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI;
- un método para detectar un anticuerpo que
se une específicamente a un polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI contenido en una muestra, que comprende (a) poner
en contacto el anticuerpo contenido en la muestra con un conjugado
o con un polipéptido de la invención en condiciones que permiten la
formación de un complejo estable
antígeno-anticuerpo; y (b) detectar el complejo
estable formado en la etapa (a), si se ha formado;
- un polipéptido o un conjugado de la
invención en el que el polipéptido carece de un epítopo para células
T capaz de activar las células T de un individuo que posee
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI, para
usarlo en un método para inducir tolerancia en un individuo;
- un método para detectar la mediación de
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI en la
coagulación, que comprende las etapas de:
- (a)
- realizar un primer ensayo de coagulación usando una muestra biológica adecuada procedente de un individuo, en el que en el ensayo se añade un conjugado o un polipéptido según la invención se añade al ensayo;
- (b)
- realizar un segundo ensayo de coagulación usando una muestra biológica adecuada procedente de un individuo en ausencia del polipéptido; y
- c)
- comparar los resultados de las etapas (a) y (b) de los ensayos, en el que una diferencia en los resultados indica una mediación de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI en la coagulación; y
- uso de un polipéptido o un conjugado de la
invención, en que el polipéptido carece de un epítopo para células
T capaz de activar las células T en un individuo que posee
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI, en
la fabricación de un medicamento para inducir tolerancia en un
individuo.
La Figura 1 representa la secuencia de
nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:
2) de \beta_{2}GPI. Los números situados encima de las líneas
indican las posiciones de los aminoácidos.
La Figura 2 representa la secuencia de
nucleótidos (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:
4) del dominio 1 de \beta_{2}GPI. Los números situados encima
de las líneas indican las posiciones de los aminoácidos.
La Figura 3 es un modelo de la estructura
terciaria del dominio 1 de \beta_{2}GPI, que incluye los
aminoácidos clave en la unión a anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI.
La Figura 4 es una gráfica que representa los
resultados de los análisis ELISA de inhibición competitiva
realizados en placas de microtitulación NUNC. Las placas se
revistieron con el anticuerpo contra \beta_{2}GPI de tipo
salvaje. La unión del anticuerpo (procedente del paciente 7104) se
hizo competir con las diferentes proteínas \beta_{2}GPI
mutantes. Los símbolos representan a las proteínas \beta_{2}GPI
recombinantes de la siguiente manera:
Manera de designar a las proteínas
recombinantes: los guiones indican los dominios ausentes; los
números indican los dominios presentes en la proteína. Por ejemplo,
"- - -345" es una proteína \beta_{2}GPI
recombinante a la que faltan los dominios 1 y 2 pero que conserva
los dominios 3, 4 y 5.
La Figura 5 es una gráfica que representa los
resultados de los análisis ELISA de la unión del anticuerpo
anti-\beta_{2}GPI procedente de conejo a las
diferentes proteínas \beta_{2}GPI recombinantes. Pocillos de
microtitulación revestidos con níquel quelato se revistieron con las
diferentes proteínas \beta_{2}GPI recombinantes en las
concentraciones que se muestran, y a continuación se ensayaron con
respecto a la capacidad del anticuerpo
anti-\beta_{2}GPI procedente de conejo para
unirse. Los símbolos representan a las proteínas \beta_{2}GPI
recombinantes de la siguiente manera:
La Figura 6 es una gráfica que representa los
resultados de los análisis ELISA de la unión de anticuerpos
anti-\beta_{2}GPI a las diferentes proteínas
\beta_{2}GPI recombinantes. Pocillos de microtitulación
revestidos con níquel quelato se revistieron con las diferentes
proteínas \beta_{2}GPI recombinantes en las concentraciones que
se muestran, y después se utilizaron en el ensayo de la capacidad
del anticuerpo 6701 anti-\beta_{2}GPI humano
(procedente del paciente 6701) para unirse. Los símbolos
correspondientes a las \beta_{2}GPI recombinantes son iguales
que los de la Figura 5. Los símbolos adicionales son los
siguientes:
La Figura 7 es una gráfica que representa los
resultados de un análisis ELISA que midió la capacidad del
anticuerpo anti-\beta_{2}GPI procedente de
conejo para unirse a las diferentes proteínas \beta_{2}GPI
recombinantes que primero se habían unido a pocillos de
microtitulación revestidos con cardiolipina (CL). Placas IMMULON®
se revistieron con CL y después se cargaron con las concentraciones
indicadas de las proteínas \beta_{2}GPI recombinantes. Los
símbolos correspondientes a las \beta_{2}GPI recombinantes son
iguales que los de la Figura 5.
La Figura 8 es una gráfica que representa los
resultados de un análisis ELISA que midió la capacidad de la
preparación 6641 de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI (procedente del paciente 6641) para unirse a las
diferentes proteínas \beta_{2}GPI recombinantes que primero se
habían unido a pocillos de microtitulación revestidos con CL.
Placas IMMULON® se revistieron con CL y después se cargaron con las
concentraciones indicadas de las proteínas \beta_{2}GPI
recombinantes. Los símbolos correspondientes a las \beta_{2}GPI
recombinantes son iguales que los de la Figura 6.
La Figura 9 es una gráfica que representa los
resultados de un análisis ELISA de inhibición competitiva en el que
diferentes péptidos se sometieron a un ensayo con respecto a su
capacidad para competir con la \beta_{2}GPI de tipo salvaje por
la unión a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI. Los símbolos correspondientes a los péptidos son
los siguientes:
Las Figuras 10A y 10B son gráficas que
representan los valores aparentes de la unión en el equilibrio,
correspondientes a diferentes concentraciones de un polipéptido del
dominio 1 (Figura 10A) y del conjugado tetramérico compuesto 44
(Figura 10B), a anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI, purificados por afinidad, procedentes del
paciente 6626. También se muestran las constantes de disociación
aparentes en el equilibrio.
La Figura 11A y la Figura 11B son gráficas que
representan los valores aparentes de la unión en el equilibrio,
correspondientes a diferentes concentraciones de un polipéptido del
dominio 1 (Figura 11A) y del conjugado tetramérico compuesto 44
(Figura 11B), a anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI, purificados por afinidad, procedentes del paciente
6701.
La Figura 12 es una gráfica que representa los
resultados de experimentos de unión competitiva en los que
\beta_{2}GPI (que reviste placas de microtitulación NUNC) se
hizo reaccionar con plasma procedente del paciente 6501 y con
cantidades variables del dominio 1 tetramérico (-- \lozenge --),
del conjugado tetramérico compuesto 44 (-- \blacktriangledown --)
y del compuesto 45 (-- * --) así como con un polipéptido del dominio
1 de \beta_{2}GPI (-- \blacklozenge --) y un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI que había sido reducido y alquilado
(-- \blacksquare --).
Las Figuras 13A y 13B son gráficas que
representan la respuesta frente a la dosis de células de ganglios
linfáticos poplíteos procedentes de ratones inmunizados con un
conjugado formado por polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI
- KLH en CFA (Fig. 13A) o inmunizados con sólo CFA (Fig. 13B).
Símbolos: (-- \square --), conjugado con KLH; (--
\blacktriangledown --), polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI no conjugado con KLH; (-- \blacksquare --), KLH;
y (-- \Delta --), PPD.
La Figura 14 es un diagrama de barras que
representa una respuesta frente a la dosis (en relación con el
anticuerpo anti-\beta_{2}GPI) de la
sensibilización inmunológica con el conjugado formado por
polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI - KLH (10 \mug, 50
\mug y 100 \mug).
La Figura 15 es una gráfica que representa la
especificidad de anticuerpos policlonales de ratón inducidos contra
un conjugado formado por polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI - KLH, determinada mediante ensayos de competición
usando diferentes mutantes de los dominios de \beta_{2}GPI.
La Figura 16 es un diagrama de barras que
representa el efecto de anticuerpos antifosfolípidos dependientes
de \beta_{2}GPI, purificados por afinidad, sobre la actividad
del Factor Va en sangre de diferentes pacientes (6501, 6636, 6644,
7011, 7013, 6701, 7001, 6625, 6641) así como en plasma normal e IgG
normal.
Los autores de la invención han descubierto que
\beta_{2}GPI se une específicamente a anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI (es decir,
contiene un epítopo(s) de un anticuerpo antifosfolípido
dependiente de \beta_{2}GPI). Este descubrimiento es
especialmente significativo a la vista de la literatura existente
que describía a los dominios 5 y 4 como los únicos importantes para
esta unión. Véase, p. ej., George y col. (1998) y Yang y col.
(1997). Los autores de la invención también han descubierto que el
dominio 1 de \beta_{2}GPI se une a anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI de entre al menos 100 anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI diferentes, lo
que es especialmente significativo e importante en el contexto de la
detección/diagnóstico así como en el contexto de tolerágeno, ya que
un polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI puede por
ello ser útil para una gran parte de la población que porta
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI.
Además, se ha encontrado que péptidos particulares del dominio 1
(aquí descritos) parecen unirse a anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI de manera específica.
Por consiguiente, la invención proporciona
polipéptidos que comprenden polipéptidos del dominio 1 de
\beta_{2}GPI (que incluyen el dominio 1 aislado) que se unen
específicamente a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI. La invención también proporciona polipéptidos que
consisten esencialmente en polipéptidos del dominio 1 de
\beta_{2}GPI que se unen específicamente a un anticuerpo
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI. Los polipéptidos
de la invención son útiles en la detección de anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI (en el contexto
del diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento), y también son útiles
como tolerágenos. En algunas realizaciones, en particular en el
contexto de tolerágenos, el polipéptido(s) \beta_{2}GPI
carece de un epítopo para células T y/o está en forma multivalente,
tal como conjugado con una molécula plataforma. La invención
también proporciona polinucleótidos que codifican un
polipéptido(s) \beta_{2}GPI. Esos polinucleótidos se
pueden usar para producir un polipéptido(s) \beta_{2}GPI,
ya sea in vitro o in vivo. La invención también
proporciona composiciones que comprenden un polipéptido(s)
del dominio 1 de \beta_{2}GPI y polinucleótidos que codifican un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI. La
invención proporciona además métodos que usan un
polipéptido(s) \beta_{2}GPI tal como para detección o
para inducir tolerancia (es decir, para la inducción de tolerancia
de células B).
La práctica de la presente invención utilizará,
salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de
biología molecular (que incluyen técnicas recombinantes), de
microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que
están dentro de la experiencia en la técnica. Esas técnicas se
encuentran perfectamente explicadas en la literatura, tal como, en
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda
edición (Sambrook y col., 1.989); "Oligonucleotide
Synthesis" (M.J. Gait, redactor, 1.984); "Animal Cell
Culture" (R. I. Freshney, redactor, 1.987); "Methods in
Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of
Experimental Immunology" (D.M. Weir & C.C. Blackwell,
redactores); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"
(J.M. Miller y M.P. Calos, redactores, 1.987); "Current
Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel y col.,
redactores, 1.987); "PCR: The Polymerase Chain
Reaction", (Mullis y col., redactores, 1.994); y
"Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan y col.,
redactores, 1.991).
Un "polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI" es un polipéptido que se une específicamente a
un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI y
tiene al menos seis aminoácidos contiguos representados en la Fig.
2 (SEQ ID NO: 4; dominio 1). Se puede demostrar que un polipéptido
del dominio 1 de \beta_{2}GPI se une específicamente a un
anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI usando
ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como ensayos de
inhibición competitiva, que se encuentran descritos aquí así como
en la técnica. La expresión "polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI" abarca distintas realizaciones (muchas de las
cuales se encuentran aquí descritas), que incluyen, pero que no se
limitan a ellas, el SEQ ID NO: 4; fragmentos de SEQ ID NO: 4;
extensiones, inserciones y/o deleciones de SEQ ID NO: 4; variantes
de secuencia de SEQ ID NO: 4. Por lo tanto, la expresión
"polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI" quiere
describir una clase de moléculas basadas en el dominio 1 que exhiben
la funcionalidad requerida. En este sentido, un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI puede tener al menos 10, al menos 12,
al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40 y/o
al menos 60 aminoácidos contiguos mostrados en la Fig. 2 (SEQ ID
NO: 4). Un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI también
puede comprender diferentes regiones del dominio 1, de manera que,
conjuntamente, estas regiones son capaces de unirse específicamente
a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI
(como por ejemplo al producir un epítopo conformacional). Según se
comenta más adelante, en algunas realizaciones, un "polipéptido
del dominio 1 de \beta_{2}GPI" además carece de un (todos)
epítopo para células T detectable. Para los fines de esta invención,
se define que el epítopo para células T es capaz de activar las
células T en un individuo que posee anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI.
Un polipéptido que "se une específicamente"
a un anticuerpo es una expresión muy conocida en la técnica, y los
métodos para determinar esa unión específica también son muy
conocidos en la técnica. Se dice que una molécula exhibe "unión
específica" si reacciona o se asocia de una manera más frecuente,
más rápida, con una mayor duración y/o con una mayor afinidad con
una célula particular o con una sustancia particular de lo que lo
hace con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo se "une
específicamente" a una diana si se une a ella con una mayor
afinidad, mayor avidez, con más facilidad y/o con una mayor duración
que como se une a otras sustancias.
Un "anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI" es todo anticuerpo que se une específicamente
a \beta_{2}GPI. Según se ha comentado en lo que antecede, la
nomenclatura usada en la técnica clínica y en la literatura, emplea
denominaciones alternativas para estos anticuerpos, tales como
anticuerpos "aPL" y "aCL", que están incluidas en la
definición de la expresión "anticuerpo antifosfolípido dependiente
de \beta_{2}GPI", siempre y cuando esté presente la
propiedad de unión requerida (es decir, las expresiones anticuerpos
"aPL" y "aCL" incluyen los anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI). Como claramente se indica en la
definición de "anticuerpo" que aquí se proporciona, un
"anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI"
abarca fragmentos que contienen la región variable, tales como los
fragmentos Fab, siempre y cuando se conserve su capacidad para
unirse específicamente a \beta_{2}GPI. Según se comentará más
adelante, se sobreentiende que la unión específica a algún
anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI es
suficiente, aunque en el caso de un polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI, puede ser preferible unirse a más de uno,
preferiblemente a al menos dos, preferiblemente a al menos cinco,
más preferiblemente a al menos diez, aún más preferiblemente a al
menos 20 anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI.
Un "anticuerpo" (usado indistintamente en
plural) es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse
específicamente a una diana, tal como un polipéptido, a través de
al menos un sitio de reconocimiento para antígeno, situado en la
región variable de la molécula de inmunoglobulina. Según aquí se
utiliza, el término abarca no sólo a anticuerpos intactos, sino
también a sus fragmentos (tales como Fab, Fab’, F(ab’)_{2},
Fv), el fragmento de cadena sencilla (ScFv), sus mutantes,
proteínas de fusión, anticuerpos humanizados, y cualquier otra
configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que
comprenda un sitio de reconocimiento para antígeno de la
especificidad requerida.
"\beta_{2}GPI intacta" se refiere a la
secuencia de aminoácidos de la molécula de \beta_{2}GPI completa
(representada en la Fig. 1 y en SEQ ID NO: 2). La secuencia
polinucleotídica y la secuencia polipeptídica de \beta_{2}GPI
se encuentran también públicamente disponibles en la literatura y en
GeneBank (Núm. de Registro X58100).
Un "polipéptido de fusión" es un
polipéptido que comprende regiones que están en una posición
diferente a la que presentan en la naturaleza. Esas regiones pueden
normalmente existir en proteínas distintas, y se reúnen en el
polipéptido de fusión, o pueden normalmente existir en la misma
proteína pero se encuentran colocadas en una nueva distribución en
el polipéptido de fusión. Un polipéptido de fusión también puede
provenir de formas poliméricas, ya sean lineales o ramificadas, de
un polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI.
Un "epítopo para células T" es una
expresión muy conocida en la técnica y significa un sitio de unión
para una célula T, más concretamente, una secuencia polipeptídica o
una estructura química que activa una célula(s) T. Los
métodos para determinar la presencia de epítopos para células T son
también muy conocidos en la técnica y se describen en el presente
documento. Se sobreentiende que, con el transcurso del tiempo, se
pueden desarrollar ensayos más sensibles para detectar la presencia
de epítopos para células T y que la especificación de la ausencia
de epítopos para células T depende del tipo de sistema de detección
utilizado. Para los fines de esta invención, la "ausencia" de
un epítopo para células T se considera que significa que un epítopo
para células T no es detectable cuando se usan ensayos estándar en
la técnica, en particular los habidos en la fecha de presentación
inicial de esta solicitud. Se sobreentiende también que, para los
fines de esta invención, un "epítopo para células T" es un
epítopo que es capaz de estimular a las células T de un individuo
que posee anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI.
El término "polinucleótido" y la expresión
"ácido nucleico", usados aquí indistintamente, se refieren a
una forma polimérica de nucleótidos de una longitud cualquiera, ya
sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término y esta
expresión incluyen DNA monocatenario, bicatenario o tricatenario,
DNA genómico, cDNA, los RNA híbridos de DNA-RNA, o
un polímero que comprende bases púricas y pirimidínicas, u otras
bases nucleotídicas naturales, química o bioquímicamente
modificadas, no naturales o en forma de derivados. La cadena
principal del polinucleótido puede comprender azúcares y grupos
fosfato (iguales que los que se encuentran habitualmente en el RNA
o en el DNA), o azúcares o grupos fosfato modificados o sustituidos.
Como alternativa, la cadena principal del polinucleótido puede
comprender un polímero de subunidades sintéticas como por ejemplo
fosforamiditas y por lo tanto puede ser un
oligodesoxinucleósido-fosforamidato
(P-NH_{2}) o una mezcla de oligómeros de
fosforamidatos y fosfodiésteres. Se puede usar un enlace
fosforotioato en lugar de un enlace fosfodiéster. Además, se puede
obtener un polinucleótido bicatenario a partir del polinucleotídico
monocatenario producto de una síntesis química, ya sea sintetizando
la cadena complementaria e hibridando las cadenas en las condiciones
apropiadas, o sintetizando de novo la cadena complementaria
usando una DNA polimerasa con un cebador apropiado.
Los siguientes son ejemplos no limitativos de
polinucleótidos: un gen o un fragmento génico, exones, intrones,
mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleótidos recombinantes,
polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, DNA aislado de
una secuencia cualquiera, RNA aislado de una secuencia cualquiera,
sondas de tipo ácido nucleico y cebadores. Preferiblemente, el
polinucleótido es DNA. Según aquí se utiliza, "DNA" incluye no
solamente las bases A, T, C y G, sino que también incluye cualquiera
de sus análogos o formas modificadas de estas bases, tales como
nucleótidos metilados, modificaciones internucleótidos tales como
enlaces sin carga y tioatos, uso de análogos de azúcares, y
estructuras de cadena principal modificadas y/o alternativas, tales
como poliamidas.
"Presente en la naturaleza" se refiere a
una secuencia polinucleotídica o polipeptídica endógena, es decir,
una secuencia que se encuentra en la naturaleza. La expresión
incluye alelos y formas alélicas de la proteína codificada, así
como polinucleótidos y polipéptidos tanto de longitud completa como
procesados. El procesamiento puede tener lugar en una o más etapas,
y estas expresiones abarcan todas las fases del procesamiento. Por
el contrario, una secuencia "no presente en la naturaleza" se
refiere al resto de secuencias, es decir, a las secuencias que no
se encuentran en la naturaleza, tales como las secuencias
recombinantes.
Una "célula hospedadora" incluye una célula
individual o un cultivo de células, que puede ser o que ha sido
receptora de un vector(s) o de la incorporación de
polinucleótidos y/o proteínas. Las células hospedadoras incluyen la
progenie de una célula hospedadora única, y esa progenie puede no
necesariamente ser completamente idéntica (en su morfología o en el
DNA genómico del complemento de DNA total) a la célula parental
original debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas.
Una célula hospedadora incluye célula transfectadas in vivo
con un polinucleótido(s) de esta invención.
"Transformación" o "transfección" se
refieren a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula
hospedadora, independientemente del método usado para la inserción,
por ejemplo, lipofección, transducción, infección o
electroporación. El polinucleótido exógeno se puede mantener en
forma de un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o como
alternativa se puede integrar en el genoma de una célula
hospedadora.
Un "individuo" es un vertebrado,
preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los
mamíferos incluyen, pero no se limitan a ellos, animales de granja,
animales usados en competiciones deportivas, mascotas, primates
ratones y ratas.
"Anergia de células B" es una expresión muy
conocida en la técnica y significa la falta de respuesta de esas
células B que requieren la ayuda de las células T para producir y
secretar anticuerpos, e incluye, pero no se limita a ello, la
deleción clonal de células B inmaduras y/o de células B maduras y/o
la incapacidad de las células B para producir anticuerpos.
"Que induce tolerancia" significa una
disminución y/o una estabilización de la intensidad de una
inmunorrespuesta a un inmunógeno. Una "inmunorrespuesta" puede
ser humoral y/o celular, y se puede medir utilizando ensayos
estándar conocidos en la técnica. Para los fines de esta invención,
la inmunorrespuesta generalmente viene reflejada por la presencia
de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI.
Cuantitativamente la disminución (medida por la disminución en la
producción de anticuerpos) es de al menos aproximadamente un 25%,
más preferiblemente de al menos aproximadamente un 50%, más
preferiblemente de al menos aproximadamente un 75%, más
preferiblemente de al menos aproximadamente un 90%, aún más
preferiblemente de al menos aproximadamente un 95%, y muy
preferiblemente del 100%. Se sobreentiende que la tolerancia es
específica de antígeno, y se aplica, para los fines de esta
invención, a los individuos que poseen anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI. "Que induce tolerancia"
incluye también la aminoración y/o el retardo de la velocidad de
aumento del nivel de anticuerpos.
Una "muestra biológica" abarca diversos
tipos de muestras obtenidos procedentes de un individuo y se puede
usar en un ensayo diagnóstico o en un ensayo de seguimiento. La
definición abarca muestras de origen biológico de sangre y de otros
líquidos, muestras de tejidos sólidos tales como especímenes
procedentes de biopsias, o cultivos de tejidos, o células derivadas
de cultivos de tejidos, y su progenie. La definición también incluye
muestras que han sido manipuladas de alguna manera después de su
obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos,
solubilización, o enriquecimiento con respecto a determinados
componente, tales como proteínas y polinucleótidos. La expresión
"muestra biológica" abarca una muestra clínica, e incluye
también células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados
celulares, y muestras de suero, plasma, fluidos biológicos y
tejidos.
Un "complejo estable" formado entre dos o
más componentes cualesquiera de una reacción bioquímica, se refiere
a un dúplex o a un complejo que tiene una durabilidad lo
suficientemente larga para persistir durante el tiempo transcurrido
entre la formación del dúplex o del complejo y su posterior
detección, incluyendo etapas opcionales de lavado u otra
manipulación que pueda tener lugar en el ínterin.
Un polipéptido o polinucleótido "aislado" o
"purificado" es un polipéptido o polinucleótido que está
sustancialmente libre de los materiales con los que se encuentra
asociado en la naturaleza. Por sustancialmente libre se indica que
está libre en al menos el 50%, preferiblemente en al menos el 70%,
más preferiblemente en al menos el 80%, aún más preferiblemente en
al menos el 90%, de los materiales con los que se encuentra asociado
en la naturaleza.
Se dice que un polinucleótido "codifica" un
polipéptido si, en su estado natural o cuando es sometido a
manipulación con métodos muy conocidos por los expertos en la
técnica, puede ser transcrito y/o traducido para producir el
polipéptido o uno de sus fragmentos. Para los fines de esta
invención, y para evitar referencias engorrosas a cadenas
complementarias, la cadena antisentido (o cadena complementaria) de
ese polinucleótido se dice también que codifica la secuencia, es
decir, una secuencia polinucleotídica que "codifica" un
polipéptido incluye tanto la cadena codificadora convencional como
la secuencia (o cadena) complementaria.
Una "cantidad efectiva" (cuando se usa en
el contexto toleragénico) es una cantidad suficiente para producir
los resultados clínicos beneficiosos o deseados. Una cantidad
efectiva puede ser administrada en una o más tomas. Para los fines
de esta invención, una cantidad efectiva de un polipéptido(s)
del dominio 1 de \beta_{2}GPI es una cantidad suficiente para
inducir tolerancia, en particular con respecto a anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI. En relación con
un tratamiento, una "cantidad efectiva" de un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI es una
cantidad suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir,
aminorar o retardar la progresión de un estado patológico asociado a
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI (es
decir, un estado en el que anticuerpos antifosfolípidos dependientes
de \beta_{2}GPI indican la existencia una patología potencial o
real). La detección y medida de indicadores de eficacia se basan
generalmente en la medida de un anticuerpo antifosfolípido
dependiente de \beta_{2}GPI y/o en los síntomas clínicos
asociados con el estado patológico, tales como cuadros clínicos de
trombosis arterial o venosa, muerte fetal, ataque isquémico
transitorio, accidentes cerebrovasculares, amaurosis fugaz (visión
monocular), anemia hemolítica autoinmunitaria, lesiones en las
válvulas cardíacas, infarto de miocardio, trombocitopenia y
migraña.
Según aquí se utiliza, "molécula plataforma de
valencia" significa una molécula no inmunogénica que contiene
sitios que permiten la unión de un número discreto de polipéptidos
(en esta invención, polipéptidos del dominio 1 de \beta_{2}GPI)
y/o polipéptido(s) mimético(s).
"No inmunogénica", cuando se usa para
describir la molécula plataforma de valencia, significa que la
molécula plataforma de valencia no es capaz de provocar una
inmunorrespuesta suficiente, cuando se administra ella sola a un
individuo. El grado de inmunorrespuesta aceptable depende del
contexto en el que la molécula plataforma de valencia se utiliza, y
puede ser determinado de manera empírica.
Según aquí se utiliza, "farmacóforo"
significa la orientación tridimensional y las propiedades químicas
de grupos clave implicados en la unión de un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI a un anticuerpo diana.
La invención proporciona polipéptido(s)
del dominio 1 de \beta_{2}GPI. Según se ha descrito en lo que
antecede, un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI (a)
contiene al menos seis aminoácidos contiguos de la Fig. 2 (SEQ ID
NO: 4), que representa el dominio 1; y (b) se une específicamente a
un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI (es
decir, a uno o más anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI). Un modelo de la estructura tridimensional del
dominio 1 de \beta_{2}GPI se presenta en la Figura 3 (basado en
la estructura real del dominio sushi 16 del factor H1,
determinada mediante nmr (Norman y col. (1991) J. Mol. Biol.
219:717; Barlow y col. (1991) Biochem. 30:997), y se indican
los residuos que pueden estar implicados en la integridad
estructural y/o en la unión al anticuerpo, según se han determinado
mediante estudios de mutagénesis, que incluyen los estudios que
aquí se presentan. Con respecto a todas las realizaciones de
polipéptidos de la invención, se sobreentiende que los polipéptidos
de la invención no incluyen la \beta_{2}GPI natural intacta, o
cualquier otra forma de \beta_{2}GPI previamente aislada y
caracterizada, tal como los mutantes por deleción de los dominios
(es decir, dominios 1, 2, 3; dominios 1, 2, 3, 4).
En una de las realizaciones, la invención
incluye un polipéptido que consiste en (o, en algunas realizaciones,
consiste esencialmente en) la secuencia de aminoácidos mostrada en
la Fig. 2 (SEQ ID NO: 4) que representa el dominio 1. Los autores
de la invención han puesto de manifiesto que solamente aquellos
polipéptidos de \beta_{2}GPI con dominios delecionados que
contienen el dominio 1 son capaces de unirse específicamente a un
anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI, y que el
dominio 1 solo es capaz de unirse a un polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI, según se describe en el Ejemplo 1. Para los fines
de esta invención, el dominio 1 de \beta_{2}GPI va generalmente
desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el
aminoácido 64 de \beta_{2}GPI (Figura 1). Como alternativa, y
también para los fines de esta invención, el dominio 1 (y por
consiguiente un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI de la
invención) puede extenderse (a) desde aproximadamente la primera
cisteína hasta aproximadamente la cuarta cisteína (cuando se
determina desde el extremo N-terminal); (b) desde
aproximadamente el extremo N-terminal hasta
aproximadamente la quinta cisteína (más exactamente, hasta
aproximadamente el último aminoácido anterior a la quinta cisteína);
(c) desde aproximadamente la primera cisteína hasta aproximadamente
la quinta cisteína. En algunas realizaciones, se puede añadir una
cisteína adicional en cualquier posición adecuada, para que sirva
como grupo reactivo para la conjugación. Por consiguiente, se puede
incluir una cisteína adicional (que en algunas realizaciones es la
quinta cisteína de la \beta_{2}GPI) en cualquiera de las
posiciones, en particular cerca del extremo
C-terminal o del extremo N-terminal.
Un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI también puede
comprender (o consistir en, o consistir esencialmente en,
cualquiera de los siguientes: (a) desde el aminoácido 1 hasta el
aminoácido 59 del (SEQ ID NO: 4); (b) desde el aminoácido 2 hasta el
aminoácido 60 del (SEQ ID NO: 4); (c) desde el aminoácido 2 hasta
el aminoácido 63 del (SEQ ID NO: 4); (d) desde el aminoácido 1 hasta
el aminoácido 66 del (SEQ ID NO: 1); (e) desde el aminoácido 4
hasta el aminoácido 66 del (SEQ ID NO: 1); (f) aproximadamente
desde el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 60 del
(SEQ ID NO: 4); (g) aproximadamente desde el aminoácido 1 hasta
aproximadamente el aminoácido 66 del (SEQ ID NO: 1). Los autores de
la invención han encontrado que los polipéptidos del dominio 1 de
\beta_{2}GPI que contienen la quinta cisteína son
particularmente convenientes para la conjugación (se comenta más
adelante). En el caso de las realizaciones que contienen (que
comprenden) las primeras cuatro cisteínas de \beta_{2}GPI, se
sobreentiende que, en general, la secuencia de aminoácidos que está
situada entre las cisteínas debe ser tal que se formen los puentes
disulfuro adecuados, mientras que las secuencias de aminoácidos que
flanquean las cisteínas (es decir, los aminoácidos del extremo N-
terminal y del extremo C-terminal) pueden ser
cualquier secuencia (siempre y cuando se conserve la estructura
requerida que permite la unión a un anticuerpo).
En otras realizaciones, la invención incluye un
polipéptido que comprende cualquiera de los polipéptidos mostrados
en la Tabla 1 (SEQ ID NOS: 5-11). Los experimentos
de los autores de la invención (descritos en el Ejemplo 3)
demuestran que estos polipéptidos son capaces de unirse
específicamente a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI.
Con respecto a todas las realizaciones de los
polipéptidos de esta invención, el polipéptido(s) se une
específicamente a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI. La unión específica a un anticuerpo
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI se puede determinar
usando métodos estándar en la técnica, tales como los ensayos de
unión competitiva. Por ejemplo, las placas de microtitulación se
pueden revestir con \beta_{2}GPI (ya sea la presente en la
naturaleza o la recombinante, siempre y cuando la molécula
recombinante exhiba las propiedades de unión requeridas) y el
polipéptido que se ha de ensayar se puede añadir en concentraciones
variables. A continuación se añade un anticuerpo antifosfolípido
dependiente de \beta_{2}GPI y purificado por afinidad, y se
deja que la unión tenga lugar. La cantidad de anticuerpo unido se
determina mediante sistemas de detección, tales como el sistema que
utiliza IgG anti-seres humanos conjugada con
fosfatasa alcalina, o con radiactividad. La unión específica viene
indicada por la capacidad del polipéptido a ensayar para competir
por la unión a \beta_{2}GPI. Los Ejemplos 1 y 3 proporcionan
ensayos ilustrativos para la detección de la unión competitiva. La
unión específica también se puede determinar mediante ensayos de
unión directa, que son conocidos en la técnica y que se ilustran en
los Ejemplos 1 y 3.
Se sobreentiende que, para los fines de esta
invención, un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI necesita
solamente unirse a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI, aunque puede ser conveniente (por ejemplo, en el
contexto de la detección), en el caso de un polipéptido del dominio
1 de \beta_{2}GPI, que se una a más de un anticuerpo
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI. La fuente del
anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI
generalmente procede de un individuo, y la secuencia del anticuerpo
puede variar de un individuo a otro. Se sobreentiende también que la
unión específica a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI se puede demostrar usando un fragmento u otro
producto recombinante de un anticuerpo antifosfolípido dependiente
de \beta_{2}GPI, tal como un fragmento Fab, o construcciones
monocatenarias de la región variable (scFV) (del inglés,
"single chain variable region constructs"), que son
conocidas en la técnica.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, un
polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI se une a más de un
anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI (es
decir, a al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos
50 o más). Estas realizaciones son particularmente útiles para la
detección, ya que este polipéptido(s) se puede usar para
detectar de entre un amplio espectro de individuos, quienes peden
portar un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI.
En algunas realizaciones, un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI contiene una estructura sushi.
"Dominio sushi" es una expresión conocida por los
expertos en la técnica y generalmente se caracteriza por (a)
contener determinados residuos (tales como prolina, fenilalanina,
tirosina, glicina, leucina, valina y/o histidina) que enrollan la
cadena polipeptídica en forma de una estructura circular; (b) tener
generalmente un peso molecular de aproximadamente 6 kDa; y (c)
contener una estructura plegada en configuración \beta. Ichmose y
col (1990) J. Biol. Chem. 265:13411.
También es sabido que un polipéptido del dominio
1 de \beta_{2}GPI se puede unir a un anticuerpo antifosfolípido
dependiente de \beta_{2}GPI a través de un epítopo(s)
conformacional. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un
polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI comprende (a) los
aminoácidos 55, 56 y 58 (ile; asn; leu) de la Fig. 3 (aminoácidos
55, 56 y 58 de (SEQ ID NO: 4); (b) los aminoácidos
43-45 (arg; lys; phe) de la Fig. 3 (aminoácidos de
43 a 45 de (SEQ ID NO: 4); (c) los aminoácidos del 40 al 45 del (SEQ
ID NO: 4) (gly; gly; met; arg; lys; phe), preferiblemente los
aminoácidos 38-44 de la Figura 3 (aminoácidos de 38
al 44 de (SEQ ID NO: 4); y/o (d) el aminoácido 19 (lys) de la Fig.
3 (aminoácido 19 de (SEQ ID NO: 4), preferiblemente (a) y (b);
preferiblemente (a) y (c); preferiblemente (a) y (d);
preferiblemente (b) y (d); preferiblemente (c) y (d);
preferiblemente (a), (b) y (d); preferiblemente (a), (c) y (d);
preferiblemente (b), (c) y (d); preferiblemente (a), (b) y (c);
preferiblemente (a), (b), (c) y (d). Los autores de la invención han
encontrado a través de sus estudios de mutagénesis que estos
aminoácidos pueden ser críticos para la unión, ya sea de manera
colectiva o individual.
El tamaño de un polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI (o de un polipéptido que comprende un polipéptido
del dominio 1 de \beta_{2}GPI) puede variar mucho, siempre y
cuando se satisfaga la funcionalidad requerida (basada en la unión
específica a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI). Los datos de los autores de la invención han
mostrado que secuencias de tan sólo 6 mer son capaces de unirse
específicamente a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI (Ejemplo 3).
En algunas realizaciones, el
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI (y el
polipéptido que comprende o que consiste esencialmente en un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI) tiene una
longitud menor que aproximadamente 100 aminoácidos, preferiblemente
tiene una longitud menor que aproximadamente 75 aminoácidos,
preferiblemente tiene una longitud menor que aproximadamente 60
aminoácidos, preferiblemente tiene una longitud menor que
aproximadamente 50 aminoácidos, preferiblemente tiene una longitud
menor que aproximadamente 25 aminoácidos, preferiblemente tiene una
longitud menor que aproximadamente 15 aminoácidos y preferiblemente
tiene una longitud menor que aproximadamente 10 aminoácidos.
Se sobreentiende que un polipéptido(s)
del dominio 1 de \beta_{2}GPI puede estar asociado con,
conjugado con, y/o conectado a, otro polipéptido(s) del
dominio 1 de \beta_{2}GPI (ya sean estos polipéptido(s)
del dominio 1 de \beta_{2}GPI iguales o diferentes), así como
con otros dominios de \beta_{2}GPI. Por consiguiente, la
invención abarca formas poliméricas del polipéptido(s) del
dominio 1 de \beta_{2}GPI. Según aquí se utiliza, una forma
polimérica de un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI
contiene una pluralidad (es decir, más de 1) de
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI. En una de
las realizaciones, se proporcionan polímeros lineales de
polipéptidos del dominio 1 de \beta_{2}GPI. En otra de las
realizaciones, se proporcionan polímeros ramificados de
polipéptidos del dominio 1 de \beta_{2}GPI. En otras
realizaciones, la invención proporciona una pluralidad de
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI.
En otra realización, se proporcionan múltiples
péptidos antigénicos (Maps) del dominio 1 de \beta_{2}GPI. Los
Maps contienen un pequeño núcleo central inmunológicamente inerte,
que contiene dendritas de lisina radialmente ramificadas, sobre las
que se pueden anclar varios polipéptidos del dominio 1 de
\beta_{2}GPI (es decir, se pueden unir covalentemente). Posnett
y col. (1988) J. Biol. Chem. 263:1719-1725;
Tam (1989) Meth. Enz. 168:7-15. El resultado
es una gran macromolécula que tiene una alta proporción en moles de
polipéptidos del dominio 1 de \beta_{2}GPI con respecto al
núcleo central. Los Maps son antígenos útiles y eficientes en
ensayos tales como ELISA, y también pueden ser útiles para una
presentación multivalente, tal como en el contexto toleragénico.
Los Maps se pueden fabricar sintéticamente o se pueden obtener
comercialmente (Quality Controlled Biochemicals, Inc.
Hopkinton, MA). En un sistema típico de Maps, una matriz central
está hecha de hasta tres niveles de lisina y ocho aminoácidos para
anclar polipéptidos del dominio 1 de \beta_{2}GPI. El Map se
puede sintetizar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la
técnica, por ejemplo, un método en fase sólida, por ejemplo, R.B.
Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149.
Se sobreentiende que se puede utilizar cualquier
estructura ramificada, tal como la ciclodextrina. La estructura
ramificada puede tener un tamaño pequeño, pero no es necesario. En
el contexto de inducción de tolerancia, la plataforma no debe
actuar como un antígeno independiente de células T.
Se sobreentiende también que en un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI se pueden
introducir determinadas variaciones de la secuencia que pueden
preservar o aumentar su reactividad. Por consiguiente, la invención
incluye modificaciones de polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI que no afectan significativamente a sus
propiedades, así como variantes que presentan una actividad
aumentada. Estas variantes y secuencias modificadas se designan
colectivamente "variantes funcionalmente equivalentes", y
pueden presentar una unión igual, aumentada o disminuida cuando se
compara con otros polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI, y se designan "equivalentes" porque
mantienen la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI. La modificación de
polipéptidos es una práctica rutinaria en la técnica y no es
necesario describirla aquí con detalle. Los ejemplos de polipéptidos
modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservadoras
de residuos de aminoácidos, con una o más deleciones o adiciones de
aminoácidos que no cambian de manera significativa ni perjudicial
la actividad funcional, o el uso de análogos químicos, que incluyen
sustituciones con
alfa-metil-aminoácidos, aminoácidos
no proteicos presentes en la naturaleza (tales como canavanina,
DL-sulfóxido de metionina, hidrocloruro de
delta-hidrolisina y ácido aminoisobutírico) y
aminoácidos no naturales. Los residuos de aminoácidos que se pueden
sustituir entre sí de manera conservadora incluyen, pero no se
limitan a ellos: glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina;
asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico;
serina/treonina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina. Estos
polipéptidos también incluyen polipéptidos glicosilados y no
glicosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones
post-traduccionales, tales como, por ejemplo, la
glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación.
Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos serán
conservadoras, es decir, el aminoácido sustituido poseerá
propiedades químicas similares a las del aminoácido original. Esas
sustituciones conservadoras son muy conocidas en la técnica, y
ejemplos de las mismas se han proporcionado en lo que antecede.
Se sobreentiende que determinadas variaciones
(tales como sustituciones) pueden o no afectar a la unión de un
polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI a anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI de la misma
manera, o en el mismo grado. Además, la naturaleza del
aminoácido(s) sustituido podría afectar a la manera y/o al
grado de la unión. Por ejemplo, se ha encontrado que la sustitución
de un residuo de arginina de la posición 43 (aminoácido 43 del (SEQ
ID NO: 4) por un residuo de glicina ocasiona la pérdida de la
capacidad de unión a anticuerpo en algunos sueros de pacientes,
mientras que otros sueros no experimentan cambio en la capacidad de
unión (e incluso otros sueros la alteran (es decir, capacidad de
unión intermedia). Como otro ejemplo, la sustitución de la
metionina de la posición 42 por una lisina o una treonina no parece
afectar a la unión (en los pacientes estudiados); sin embargo, si
la metionina de la posición 42 es sustituida por una valina la
unión aparece suprimida en todos los pacientes.
Además de los veinte aminoácidos presentes en la
naturaleza, y de sus homoanálogos o noranálogos, en la presente
invención se pueden utilizar algunas otras clases de alfa
aminoácidos. Los ejemplos de estas otras clases incluyen
d-aminoácidos,
N^{a}-alquil-aminoácidos,
alfa-alquil-aminoácidos, aminoácidos
cíclicos, aminoácidos quiméricos y aminoácidos misceláneos. Estos
aminoácidos no naturales se han utilizado mucho para modificar
polipéptidos bioactivos para aumentar su resistencia a la
degradación proteolítica y/o para impartir restricciones
conformacionales para mejorar su actividad biológica. Hruby y col.
(1990) Biochem. J. 268:249-262; Hruby y col.
(1995) Methods in Mol. Biol.
35:201-240.
Los
N^{a}-alquil-aminoácidos más comunes son
los N^{a}-metil-aminoácidos, tales como
N^{a}-metil-cisteína (nC),
N^{a}-metil-glicina (nG),
N^{a}-metil-leucina (nL),
N^{a}-metil-lisina (nK), y
N^{a}-metil-valina (nV). Los ejemplos de
alfa-alquil-aminoácidos incluyen
alfa-metil-alanina, (mA), ácido
alfa-aminoisobutírico (aiB),
alfa-metil-prolina (mP),
alfa-metil-leucina (mL),
alfa-metil-valina (mV), ácido
alfa-metil-alfa-aminobutírico
(tv), dietilglicina (deG), difenilglicina (dpG) y
diciclohexilglicina(dcG). Balaram (1992) Pure & Appl.
Chem. 64:1061-1066; Toniolo y col., (1993)
Biopolymers 33:1061-1072; Hinds y col.,
(1991) Med. Chem. 34:1777-1789.
Los ejemplos de aminoácidos cíclicos incluyen el
ácido
1-amino-1-ciclopropano
carboxílico (cG), ácido
1-amino-1-ciclopentano
carboxílico (Ac5c), ácido
1-amino-1-ciclohexano
carboxílico (Ac6c), ácido aminoindano carboxílico (ind), ácido
tetrahidroisoquinolino carboxílico (Tic) y ácido pipecolínico (Pip).
C. Toniolo (1990) Int’l. J. Peptide Protein Res.
35:287-300; Burgess y col. (1995) J. Am. Chem.
Soc. 117:3808-3819. Los ejemplos de aminoácidos
quiméricos incluyen penicilamina (Pe), combinaciones de cisteína con
valina, 4R- y 4S-mercaptoprolinas (Mpt),
combinaciones de homocisteína y prolina y 4R- y 4S- hidroxiprolinas
(hyP) y una combinación de homoserina y prolina. Los ejemplos de
alfa aminoácidos misceláneos incluyen análogos de aminoácidos
básicos tales como la ornitina (Or),
N^{a}-metil-lisina (mK),
4-piridil-alanina (pyA),
4-piperidino-alanina (piA) y
4-aminofenilalanina; análogos de aminoácidos ácidos
tales como citrulina (Cit) y 3-hidroxivalina;
análogos de aminoácidos aromáticos tales como
1-naftilalanina (1-Nal),
2-naftilalanina (2-Nal),
fenilglicina (pG), 3,3,difenilalanina (dpA),
3-(2-tienil)alanina (Thi) y halofenilalaninas
(p. ej., 2-fluorofenilalanina y
4-clorofenilalanina); análogos de aminoácidos
hidrófobos tales como t-butilglicina (es decir,
leucina terciaria (tL)), ácido 2-aminobutírico
(Abu), ciclohexilalanina (Cy),
4-tetrahidropiranil-alanina (tpA),
3,3-diciclohexil-alanina (dcA) y
3,4-deshidroprolina.
Además de los alfa-aminoácidos,
en la presente invención también se pueden usar otros aminoácidos
tales como los beta-aminoácidos. Los ejemplos de
estos otros aminoácidos incluyen ácido
2-aminobenzoico (Abz), ácido
\beta-aminopropanoico
(\beta-Apr), ácido
\gamma-aminobutírico
(\gamma-Abu) y ácido
6-aminohexanoico
(\varepsilon-Ahx). También se pueden usar ácidos
carboxílicos tales como ácido 4-clorobutírico (By) y
ácido 3-cloropropiónico (Pp) como primer residuo del
extremo N-terminal en la síntesis de péptidos
cíclicos de tipo tioéter.
Se pueden usar otros métodos de modificación que
incluyen el uso de métodos de acoplamiento conocidas en la técnica,
que incluyen, pero que no se limitan a ellos, medios enzimáticos,
sustitución oxidativa y quelación. Los métodos de modificación se
pueden usar, por ejemplo, para la unión de marcadores para
inmunoensayos, tales como la unión de restos radiactivos para
radioinmunoensayos. Los polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI modificado se preparan utilizando procedimientos
establecidos en la técnica y se pueden someter a escrutinio usando
ensayos estándar conocidos en la técnica, algunos de los cuales se
describen aquí y en los ejemplos.
La invención también abarca proteínas de fusión
que comprenden uno o más polipéptidos del dominio 1 de
\beta_{2}GPI. Para los fines de esta invención, una proteína de
fusión con el dominio 1 de \beta_{2}GPI contiene uno o más
polipéptidos de \beta_{2}GPI y otra secuencia de aminoácidos a
la que no se encuentra unida en la molécula natural, por ejemplo,
una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga de otra región,
tal como de otro dominio de \beta_{2}GPI. Las secuencias
heterólogas útiles incluyen, pero no se limitan a ellas, secuencias
que posibilitan la secreción por parte de una célula hospedadora,
que aumentan la reactividad inmunológica, o que facilitan el
acoplamiento del polipéptido a un soporte para inmunoensayo o a una
molécula de transporte. Por ejemplo, un polipéptido de
\beta_{2}GPI se puede fusionar con una secuencia heteróloga que
facilita su purificación. En la técnica se conocen ejemplos de esas
secuencias e incluyen las secuencias que codifican epítopos tales
como las secuencias Myc, HA (derivada de la hemaglutinina del virus
de la gripe), His-6 o FLAG. Otras secuencias
heterólogas que facilitan la purificación derivan de proteínas tales
como glutation-S-transferasa (GST),
proteína de unión a maltosa (MBP) (del inglés,
" Maltose-Binding Protein") o la
porción Fc de inmunoglobulinas.
Un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI
puede contener o no un epítopo para células T. Para fines de la
detección, un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI puede
contener o no contener un epítopo(s) para células T, ya que
el uso principal de ese polipéptido en este contexto es la detección
de un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI,
lo cual es independiente de la presencia de epítopos para células
T. En el contexto de tolerágeno, sin embargo, un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI carece de un (o de todos)
epítopo(s) para células T detectable en relación con un
individuo que posee anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI. Así, en algunas realizaciones, un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI no contiene (es decir, carece de) un
epítopo para células T (y, por consiguiente, un polipéptido que
comprende un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI no
contiene un epítopo para células T).
Los métodos para detectar la presencia de un
epítopo para células T son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo,
se pueden usar distintos ensayos que detectan la proliferación de
células T (tal como el ensayo de incorporación de timidina). La
presencia de epítopos para células T se puede también determinar
midiendo la secreción de linfoquinas derivadas de células T
mediante métodos muy conocidos en la técnica. Los polipéptidos que
no son capaces de inducir una incorporación estadísticamente
significativa de timidina por encima de la del fondo (es decir,
generalmente p es menor que 0,05 usando métodos estadísticos
estándar) se consideran de modo general que carecen de epítopos
para células T, aunque se tendrá en cuenta que la cantidad
cuantitativa de incorporación de timidina puede variar, dependiendo
del polipéptido sometido al ensayo. Generalmente, un índice de
estimulación por debajo de aproximadamente 2 - 3, más
preferiblemente menor que aproximadamente 1, indica la ausencia de
epítopos para células T. La localización y el contenido de los
epítopos para células T se determina de manera
empírica.
empírica.
En el contexto de tolerágeno, un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI preferiblemente se une de manera
específica a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI sobre la superficie de una célula B (es decir, se
une a un anticuerpo de superficie dispuesto sobre una célula B, en
el caso en el que el anticuerpo es capaz de unirse específicamente
a un epítopo para un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI). Esta unión, especialmente en conjunción con la
formación de enlaces cruzados, se piensa que desencadena la anergia
de células B. Se entiende que, debido a que por definición un
polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI es capaz de unirse
específicamente a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI, se esperaría que cualquier polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI fuera igualmente capaz de unirse a un
anticuerpo de superficie antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI, sobre una célula B.
Como se tratará más adelante (y se ha tratado en
lo que antecede al hablar de las formas poliméricas),
preferiblemente, en el contexto de tolerágeno, un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI se presenta en una forma multivalente,
ya sea a través de una forma polimérica y/o conjugado con una
molécula plataforma de valencia apropiada.
Los polipéptidos de esta invención se pueden
preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los
polipéptidos se pueden reproducir mediante métodos recombinantes (es
decir, polipéptidos individuales o polipéptidos de fusión) o
mediante síntesis química. Los polipéptidos, especialmente
polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se
preparan convenientemente mediante síntesis química. Los métodos de
síntesis química son conocidos en la técnica y se encuentran
comercialmente disponibles. Por ejemplo, se podría producir un
polipéptido con un sintetizador automático de polipéptidos
utilizando el método de síntesis en fase sólida. También se pueden
preparar polipéptidos mediante síntesis química usando métodos
conocidos en la técnica.
También se pueden preparar anticuerpos con
sistemas de expresión, usando métodos recombinantes. La
disponibilidad de polinucleótidos que codifican polipéptidos
permite la construcción de vectores de expresión que codifican un
polipéptido intacto (es decir, natural), sus fragmentos
funcionalmente equivalentes, o formas recombinantes. Un
polinucleótido que codifica el polipéptido deseado, ya sea en una
forma fusionada o en la forma madura, y ya sea conteniendo o no una
secuencia señal que permite la secreción, se puede ligar en vectores
de expresión adecuados para cualquier hospedador conveniente. Se
pueden usar sistemas de hospedadores tanto eucariotas como
procariotas. El polipéptido se aísla luego a partir de las células
lisadas o a partir del medio de cultivo y se purifica hasta el
grado necesario para el uso requerido. La purificación o el
aislamiento de los polipéptidos expresados en sistemas de
hospedadores se puede realizar mediante cualquiera de los métodos
conocidos en la técnica. Por ejemplo, el cDNA que codifica un
polipéptido intacto o uno de sus fragmentos se puede ligar
operativamente a un promotor adecuado, se puede insertar en un
vector de expresión, y se puede utilizar para transfectar una
célula hospedadora adecuada. La célula hospedadora se cultiva luego
en condiciones que permiten que tenga lugar la transcripción y la
traducción, y el polipéptido deseado se recupera. También se pueden
utilizar otros segmentos que controlan la transcripción o la
traducción, tales como secuencias señal que dirigen el polipéptido
hacia un compartimento celular específico (es decir, para su
secreción). En la técnica se conocen células hospedadoras
procariotas e incluyen, por ejemplo, E. coli y B.
subtilis. En la técnica se conocen células hospedadoras
eucariotas e incluyen células de levaduras, aves, insectos, plantas
y células de animales tales como células COS7, HeLa, CHO y otras
células de mamífero. Los sistemas de levaduras incluyen
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y
Pichia pastoris.
Por ejemplo, para expresar un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI en Pichia pastoris (usando,
por ejemplo, las cepas SMD1168 y SMD1168H), un cDNA de longitud
completa que codifica \beta_{2}GPI se usa como molde de PCR
para crear fragmentos del gen del dominio 1 que llevan un sitio Kex2
reconstituido de escisión del péptido señal en la terminación
amino. Los fragmentos se clonan en el vector de expresión pPICZalfa
(Invitrogen Corp.) que se lineariza con las enzimas de
restricción Xho I y Sal I. Los genes construidos reemplazan el
péptido señal natural del dominio 1 con el péptido señal del factor
alfa de levaduras, y finalizan en los aminoácidos seleccionados en
la terminación carboxi.
Cuando se usa un sistema de expresión para
producir polipéptidos de \beta_{2}GPI, muchas veces es
preferible construir una proteína de fusión que facilita la
purificación. Los ejemplos de componentes de estas proteínas de
fusión incluyen, pero no se limitan a ellos, myc, HA, FLA,
His-6,glutation-S-transferasa,
proteína de unión a maltosa o la porción Fc de inmunoglobulinas.
Estos métodos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Redd
y col. (1997) J. Biol. Chem. 272:11193-11197.
Se pueden emplear métodos conocidos en la técnica para retirar de
las fusiones los aminoácidos no deseados, tales como
His-6. Por ejemplo, se puede utilizar la
carboxipeptidasa A para eliminar aminoácidos carboxi terminales. La
carboxipeptidasa A se detiene en los aminoácidos prolina o
arginina. Por comodidad en la purificación, se puede utilizar
carboxipeptidasa A para fase sólida (Sigma).
Preferiblemente, en especial si se usa con fines
diagnósticos, los polipéptidos se encuentran al menos parcialmente
purificados o aislados de otros constituyentes celulares.
Preferiblemente, los polipéptidos tienen una pureza de al menos el
50%. En este contexto, la pureza se calcula en forma de un
porcentaje en peso del contenido total en proteínas de la
preparación. Más preferiblemente, las proteínas tienen una pureza
del 50%-75%. También se pueden obtener anticuerpos con un nivel de
pureza mayor y esos polipéptidos están abarcados en la presente
invención. Para uso clínico, los polipéptidos preferiblemente tienen
un nivel de pureza alto, con una pureza de al menos aproximadamente
el 80%, y se encuentran libres de pirógenos y de otros
contaminantes. En la técnica se conocen métodos de purificación de
proteínas y no se describen aquí con detalle.
En algunos sistemas, en especial en algunos
sistemas recombinantes, en el caso de realizaciones que contienen
una cisteína extra (una quinta cisteína) o que contienen una
cisteína que ha de ser reducida (por ejemplo, con el fin de
conjugar el polipéptido con una molécula plataforma), el producto
inicial puede comprender una mezcla de disulfuros de bajo peso
molecular, en los que la quinta cisteína (o la cisteína extra,
reactiva) está unida covalentemente a otro resto o restos de peso
molecular relativamente bajo. En estos casos, conviene hacer una
reducción selectiva de la cisteína extra (que mantenga al mismo
tiempo los otros enlaces disulfuro). Esa reducción selectiva se
puede llevar a cabo usando un agente reductor en fase sólida, tal
como el DTT, sobre un soporte sólido, tal como acrilamida (como por
ejemplo REDUCTACRYL, de CalBiochem, San Diego).
Además, en sistemas que se diseñan y/o se usan
para producir un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI que
contiene una cisteína extra, (es decir, esa cisteína se va a
utilizar como grupo reactivo), puede ser conveniente preparar el
polipéptido de manera que un aminoácido adicional o aminoácidos
adicionales vayan detrás de la cisteína extra en la secuencia, para
proteger esa cisteína durante la síntesis y/o la producción.
Preferiblemente, especialmente si el polipéptido
se ha de conjugar con una plataforma (caso tratado más adelante),
se utiliza la síntesis química. La síntesis química permite la
modificación del extremo N-terminal o
C-terminal, lo que facilita la conjugación con una
molécula plataforma.
Cuando se está produciendo un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI, tal como los que contienen una
cisteína adicional además de las cuatro cisteínas del dominio 1 (que
forman enlaces disulfuro), se deben seleccionar condiciones que
promuevan la correcta formación de puentes disulfuro. Como ejemplo,
un polipéptido reducido se desnaturaliza disolviéndolo en
hidrocloruro de guanidina (GnHCl) 6 M para obtener una concentración
de 0,5 mg/ml. El plegamiento se consigue mediante una diálisis a
temperatura ambiente frente al siguiente tampón de
renaturalización: GnHCl 0,1 M, Tris-HCl 0,5 mM y
EDTA 1 mM, pH 8,5. Para ayudar a la correcta formación de los
puentes disulfuro, se añade una mezcla de glutation oxidado 0,3 mM y
glutation reducido 3 mM. El seguimiento de la mezcla de reacción se
realiza mediante HPLC y los diferentes productos se analizan
mediante espectrometría de masas. En los experimentos de los
autores de la invención, pasadas 5 horas de ciclación, una HPLC
analítica mostró una conversión de aproximadamente el 65% de la
cual \sim50% tenía la masa correcta (Mw = 7.260) y \sim15%
existía en forma de un aducto de glutation
(Mw = 7.567). La proteína plegada que carece de glutation, se purifica luego mediante HPLC de fase inversa.
(Mw = 7.567). La proteína plegada que carece de glutation, se purifica luego mediante HPLC de fase inversa.
La invención también proporciona conjugados de
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI. En algunas
realizaciones, un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI se puede conjugar con una molécula de transporte o
con un marcador. En la técnica se conocen varios métodos para
obtener esos tipos de enlace y no es necesario describirlos aquí
con detalle. Se puede usar cualquier molécula de transporte que sea
inocua y que no induzca por sí misma la producción de anticuerpos
perjudiciales para el hospedador. Las moléculas de transporte
adecuadas son típicamente macromoléculas de gran tamaño que se
metabolizan lentamente, como por ejemplo proteínas; polisacáridos
tales como látex, Sepharose funcionalizada, agarosa,
celulosa, bolitas de celulosa y macromoléculas similares;
aminoácidos poliméricos tales como poli(ácido glutámico),
polilisina, y aminoácidos poliméricos similares; copolímeros de
aminoácidos; y partículas víricas inactivas o bacterias atenuadas,
tales como Salmonella. Son sustratos proteicos especialmente
útiles las albúminas séricas, hemocianina de lapa californiana,
moléculas de inmunoglobulinas, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide
tetánico y otras proteínas muy conocidas por los expertos en la
técnica.
Los marcadores son conocidos en la técnica y no
es necesario describirlos aquí con detalle. Existen muchos
marcadores y métodos de marcaje diferentes conocidos por los
expertos en la técnica. Los ejemplos de los tipos de marcadores que
se pueden utilizar en la presente invención incluyen enzimas,
radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales,
compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Las
personas con una experiencia ordinaria en la técnica conocerán
otros marcadores adecuados, o serán capaces de determinar esos
marcadores, utilizando una experimentación de rutina. Además, la
unión de estos marcadores a los polipéptidos de la invención se
puede realizar usando técnicas estándar, comunes para personas con
una experiencia ordinaria en la técnica.
Un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI (más preferiblemente, que carece de un epítopo para
células T) se puede conjugar con una molécula plataforma de
valencia no inmunogénica (también llamada "plataforma") que
mejora la presentación del polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI. Patentes de EE. UU. Núms. 5.162.515; 5.276.013;
5.552.391. Una plataforma puede ser de naturaleza proteica o no
proteica (es decir, orgánica). Los ejemplos de plataformas de
naturaleza proteica incluyen, pero no se limitan a ellos, albúmina,
gammaglobulina, inmunoglobulina (IgG) y ovoalbúmina. Borel y col.
(1990) Immunol. Methods 126:159-168; Dumas y
col. (1995) Arch. Dermatol. Res.
287:123-128; Borel y col. (1995) Int. Arch.
Allergy Immunol. 107:264-267; Borel y col.
(1996) Ann. N.Y. Acad. Sci. 778:80-87. Más
preferiblemente, una plataforma es multivalente (es decir, contiene
más de un único sitio de unión, o de formación de enlaces).
Preferiblemente, una plataforma multivalente contiene al menos dos,
más preferiblemente al menos 3, más preferiblemente al menos 5, más
preferiblemente al menos 7, más preferiblemente al menos 10, aún
preferiblemente al menos 12, aún más preferiblemente al menos 15,
sitios de formación de enlaces. Se sobreentiende, sin embargo, que
en el contexto de inducción de la tolerancia (es decir, cuando una
plataforma se usa en conjunción con un polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI apropiado para producir inmunotolerancia),
dependiendo de la naturaleza del polipéptido(s) del dominio 1
de \beta_{2}GPI utilizado y de la dolencia particular, un
número cualquiera de varios sitios de unión puede ser suficiente.
Se sobreentiende también que una plataforma no es un antígeno
independiente de células T.
Las moléculas plataforma de valencia preferidas
son moléculas biológicamente estabilizadas, es decir, exhiben una
semivida de excreción in vivo con frecuencia de horas a días
o hasta a meses para conferir eficacia terapéutica, y
preferiblemente se componen de una única cadena sintética de
composición definida. Generalmente tienen un peso molecular en el
intervalo desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 200.000,
preferiblemente desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente
50.000 (o un peso molecular menor, como por ejemplo de 30.000). Son
ejemplos de moléculas plataforma de valencia incluidas en la
presente invención los polímeros (o están formadas por polímeros)
tales como polietilenglicol (PEG),
poli(D-lisina), poli(alcohol
vinílico), poli(vinilpirrolidona), polímeros de D-ácido
glutámico y D-lisina (en proporción 3:2). Los
polímeros preferidos son los que tienen como base
polietilenglicoles (PEG) que tienen un peso molecular desde
aproximadamente 200 hasta aproximadamente 8.000. Otras moléculas
que se pueden conjugar con un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI son la albúmina y la IgG.
Otras moléculas plataforma de valencia adecuadas
para usar en la presente invención son las moléculas plataforma de
valencia no poliméricas y químicamente definidas, tales como las
descritas en la Patente de EE. UU., de propiedad compartida,
5.552.391. En contraste con las plataformas tradicionales
previamente descritas, estas plataformas presentan la ventaja de
tener un peso molecular homogéneo (es decir, uniforme) (en
contraposición a un peso molecular polidisperso), y están por lo
tanto "químicamente definidas". Por consiguiente, se
sobreentiende que una población de conjugados que utilizan estas
plataformas comprende una plataforma de pesos moleculares
homogéneos o es una población sustancialmente monodispersa (es
decir, presenta un distribución de pesos moleculares estrecha). Una
medida de la amplitud de la distribución de pesos moleculares de una
muestra (tal como una composición y/o una población de moléculas
plataforma) de una molécula plataforma es la polidispersidad de la
muestra. La polidispersidad se usa como medida de la homogeneidad o
no homogeneidad de los pesos moleculares de una muestra polimérica.
La polidispersidad se calcula dividiendo el peso molecular medio
ponderado (Mw) entre el peso molecular medio numérico (Mn). El
valor de Mw/Mn es la unidad en el caso de un polímero perfectamente
monodisperso. La polidispersidad (Mw/Mn) se mide con métodos
disponibles en la técnica, tales como la cromatografía de
permeabilidad en gel. La polidispersidad (Mw/Mn) de una muestra de
moléculas plataforma es preferiblemente menor que 2, más
preferiblemente menor que 1,5, o menor que 1,2, menor que 1,07,
menor que 1,02, o, p. ej., desde aproximadamente 1,05 hasta 1,5, o
desde aproximadamente 1,05 hasta 1,2. Los polímeros típicos
generalmente tienen una polidispersidad de 2 - 5, o en algunos
casos de 20 o más. Las ventajas de la propiedad de baja
polidispersidad de las moléculas plataforma de valencias incluyen
una biocompatibilidad y una biodisponibilidad mejoradas debido a
que las moléculas tienen un tamaño sustancialmente homogéneo y a que
se minimizan las variaciones de la actividad biológica debidas a
las grandes variaciones en los pesos moleculares. Las moléculas con
una baja polidispersidad debido a ello se formulan
farmacéuticamente de manera óptima y son fáciles de analizar. Existe
también una valencia controlada de la población de moléculas
presentes en la muestra.
Los ejemplos de moléculas plataforma de valencia
preferidas, homogéneas y químicamente definidas, adecuadas para
usar en la presente invención, incluyen 2,2’-etilendioxidietilamina
(EDDA) y trietilenglicol (TEG) en forma de derivados. Otros
ejemplos de plataformas preferidas, homogéneas y químicamente
definidas, se describen más adelante y también se encuentran
descritas en la técnica. En otras realizaciones, un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI está
conjugado con albúmina, IgG y/o PEG.
Moléculas plataforma de valencia adicionales
adecuadas incluyen, pero no se limitan a ellas, tetraaminobenceno,
heptaaminobetaciclodextrina, tetraaminopentaeritritol,
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (Cyclam) y
1,4,7,10-tetraazaciclododecano (Cyclen).
En general, estas plataformas se preparan
mediante técnicas estándar de síntesis química. El PEG debe estar
en forma de derivados y debe haberse hecho multivalente, lo cual se
lleva a cabo utilizando técnicas estándar. Algunas sustancias
adecuadas para la síntesis de conjugados, como por ejemplo PEG,
albúmina e IgG, se encuentran comercialmente disponibles.
La conjugación de un polipéptido(s) del
dominio 1 de \beta_{2}GPI con una molécula plataforma de
valencia se puede efectuar de muchas maneras, que habitualmente
incluyen uno o más agentes formadores de enlaces cruzados y grupos
funcionales presentes en el polipéptido y en la molécula plataforma
de valencia. Las plataformas y un polipéptido(s) del dominio
1 de \beta_{2}GPI deben contener grupos formadores de enlaces
apropiados. Los grupos formadores de enlaces se añaden a las
plataformas usando técnicas estándar de síntesis química. Los
grupos formadores de enlaces se pueden añadir a un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI usando, o
bien técnicas estándar de síntesis en fase sólida, o bien técnicas
recombinantes. Las estrategias recombinantes pueden requerir
modificación post-traduccional con el fin de unir un
fragmento enlazador, y esos métodos son conocidos en la técnica.
A modo de ejemplo, los polipéptidos contienen
restos de aminoácidos en cadenas laterales, que contienen grupos
funcionales tales como amino, carboxilo o sulfidrilo, que sirven
como sitios para el acoplamiento del polipéptido a la plataforma.
Al polipéptido se pueden añadir residuos que contienen estos grupos
funcionales en caso de que el polipéptido no contenga ya estos
grupos. Estos residuos se pueden incorporar mediante técnicas de
síntesis en fase sólida o mediante técnicas recombinantes, ambas de
las cuales son muy conocidas en las artes de síntesis de péptidos.
Cuando el polipéptido contiene una cadena(s) lateral de tipo
carbohidrato, se pueden incorporar a ella grupos funcionales amino,
sulfidrilo y/o aldehído por medio de la química convencional. Por
ejemplo, se pueden incorporar grupos amino primarios mediante
reacción con etilendiamina en presencia de cianoborohidruro sódico,
se pueden introducir grupos sulfidrilo mediante reacción de
dihidrocloruro de cisteamina seguida de reducción con un agente
estándar reductor de disulfuros, mientras que se pueden generar
grupos aldehídos después de una oxidación con peryodato. De manera
similar, la molécula plataforma de valencia puede estar también en
forma de un derivado de manera que contenga grupos funcionales en el
caso de que no posea ya grupos funcionales apropiados.
Los polipéptidos también se pueden modificar en
sitios específicos en sus extremos C-terminal
mediante un procedimiento denominado proteolisis inversa.
Esencialmente, la proteolisis inversa usa enzimas proteolíticas
para catalizar la formación de enlaces amida mediante el empleo de
condiciones que dirigen la reacción en esa dirección. Se han
modificado polipéptidos usando la proteolisis inversa para unirles
fragmentos enlazadores que contienen hidrazida (Rose, K. y col.
Bioconjugate Chemistry 1991, 1, 154-159) o
fragmentos enlazadores que contienen aminooxi (Rose, K. y col.
Bioconjugate Chemistry 1996, 7, 552-556) en
sus extremos C-terminal a través de enlaces amida.
Esos polipéptidos modificados se pueden hacer reaccionar para formar
enlaces de tipo hidrazona u oxima con otras moléculas de interés
que contienen grupos aldehído o cetona. Además otros fragmentos
enlazadores, tales como los fragmentos enlazadores que contienen
grupos sulfidrilo, se podrían unir posiblemente a través de
proteolisis
inversa.
inversa.
Los fragmentos enlazadores hidrófilos de
longitudes variables son útiles para conectar polipéptidos (u otras
moléculas bioactivas) a moléculas plataforma de valencia. Los
fragmentos enlazadores adecuados incluyen oligómeros o polímeros
lineales de etilenglicol. Estos fragmentos enlazadores incluyen
fragmentos enlazadores que tienen la fórmula:
R^{1}S(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}O(CH_{2})_{m}CO_{2}R_{2}
en la que n = 0-200, m = 1 ó 2, R^{1}=H o un
grupo protector tal como tritilo, R^{2} = H o un alquilo o arilo,
p. ej., éster de 4-nitrofenilo. Estos fragmentos
enlazadores son útiles para conectar una molécula que contiene un
grupo reactivo tiol tal como haloaceilo, maleiamida, etc., a través
de un tioéter, a una segunda molécula que contiene un grupo amino a
través de un enlace amida. Estos fragmentos enlazadores son
flexibles en lo que respecta al orden de la unión, es decir, el
tioéter se puede formar en primer lugar o en último
lugar.
lugar.
Según se ha comentado en lo que antecede, un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI se puede
conjugar con cualquiera de las varias plataformas adecuadas
mediante cualquiera de varios modos. En una realización preferida,
se usa la plataforma con tetra-bromoacetilo
PIZ/IDA/TEG-dominio 1 de \beta_{2}GPI. Otras
realizaciones preferidas se encuentran en los Ejemplos.
Se pueden preparar derivados de la plataforma
PIZ/IDA/TEG (PITG) de la manera que se muestra a continuación.
Ejemplos de grupos compatibles formadores de
enlaces cruzados, presentes en la Plataforma PITG
Plataforma
(bromoacetil-PITG)
Conjugado
A modo de ejemplo de realización de un
conjugado, se prepara un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI que lleva un fragmento enlazador que contiene tiol
en el extremo N-terminal mediante síntesis de
péptidos en fase sólida o mediante métodos recombinantes. El
fragmento enlazador puede ser cisteína o un resto que contiene SH.
El polipéptido modificado se puede luego alquilar por medio de una
plataforma que forma un derivado adecuado (tal como un derivado con
bromoacetilo o yodoacetilo).
En algunas realizaciones, un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI se conjuga a través de un grupo
sulfidrilo (tiol o SH), por ejemplo, con una cisteína, dando como
resultado la presencia de un enlace tioéter en el conjugado. En
algunas realizaciones, esta cisteína reactiva se proporciona
incluyendo la quinta cisteína de \beta_{2}GPI (Ejemplo 5).
En algunas realizaciones, los conjugados se
forman a través de un enlace oxima. Se puede formar un enlace oxima
haciendo reaccionar, por ejemplo, un grupo carbonilo, tal como un
aldehído o una cetona presentes en un polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI, con una plataforma que contiene un grupo reactivo
aminooxi, tal como aminooxi, aminooxiacetilo y aminooxialquilo. Los
grupos aminooxi pueden estar sobre cadenas de trietilenglicol o
sobre cadenas de hexilo; sin embargo cualquier cadena que comprenda
átomos de carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre podían bastar
siempre y cuando termine en -ONH^{2}.
Para preparar estos conjugados, un polipéptido
del dominio 1 de \beta_{2}GPI se modifica de manera selectiva
para generar un resto de aldehído o de cetona en una posición
específica del polipéptido, tal como el extremo
N-terminal. En segundo lugar, el polipéptido se hace
reaccionar con una plataforma multivalente que contiene grupos
aminooxi para formar enlaces oxima entre la plataforma y el
polipéptido.
El extremo N-terminal del
polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI se puede convertir en
un aldehído o en una cetona mediante una reacción de
transaminación, que es conocida en la técnica. Generalmente, la
reacción de transaminación convierte el enlace simple
carbono-nitrógeno N-terminal en un
doble enlace entre carbono y oxígeno. Una glicina del extremo
N-terminal reacciona para formar un grupo glioxilo,
un aldehído. Muchos otros aminoácidos reaccionan para formar una
cetona en virtud de la cadena lateral de aminoácidos.
Otra manera de generar un grupo glioxilo en el
extremo N-terminal es oxidar una serina o una
treonina del extremo N-terminal con peryodato
sódico. Esta oxidación escinde el enlace
carbono-carbono entre el grupo hidroxilo y el grupo
amino de la serina o treonina N-terminal
proporcionado un grupo glioxilo.
En algunas realizaciones, se pueden producir
plataformas multivalentes que contienen grupos reactivos
aminooxilacetilo (AOA), para conectar los polipéptidos
selectivamente modificados a las plataformas. Los grupos
aminooxilacetilo (AOA) se pueden unir convenientemente a
plataformas multivalentes que contienen grupos amino mediante
acilación con un grupo aminooxilacetilo
N-protegido, seguido de la retirada del grupo
protector. Sin embargo, la reacción de polipéptidos que contienen
el grupo glioxilo con plataformas que forman un derivado con grupos
AOA, transcurre lentamente, tardando varios días en formar enlaces
oxima entre el polipéptido y la plataforma. El Ejemplo 5 describe
la síntesis del compuesto conjugado 44, que conlleva unir un
polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI transaminado a una
plataforma tetramérica aminoacetilada. La invención incluye este
conjugado.
En otras realizaciones, se pueden usar
plataformas que contienen grupos reactivos aminooxialquilo. Los
grupos aminooxialquilo se definen como un grupo aminooxi dispuesto
sobre un primer carbono, en el que ese primer carbono
preferiblemente no está directamente unido a un grupo aceptor de
electrones tal como un segundo carbono que forma parte de un grupo
carbonilo. Los autores de la invención han observado que los grupos
aminooxialquilo reaccionan más fácilmente con cetonas y aldehídos
para formar oximas que los grupos aminooxiacetilo. El grupo
aminooxilacetilo parece ser generalmente menos reactivo que otros
grupos aminooxi (grupos aminooxialquilo) que se encuentran al lado
de un carbonilo. Se piensa que el carbonilo del grupo
aminooxilacetilo produce un descenso de reactividad debido a los
efectos aceptores de electrones. En los Ejemplos se encuentra más
información concerniente a estas plataformas y conjugados. El
compuesto conjugado 45, descrito en el Ejemplo 5, se sintetizó
uniendo un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI
transaminado a una plataforma tetramérica que contiene grupos
aminooxi. La invención incluye este conjugado, así como los
conjugados de polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI y oxima
que resultan de una síntesis basada en AO.
La invención proporciona también polinucleótidos
(que incluyen polinucleótidos aislados presentes en la naturaleza y
no presentes en la naturaleza) que codifican un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI. Estos
polinucleótidos son útiles, por ejemplo, para la producción de
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI. La
producción de polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI se puede efectuar usando métodos estándar de la
técnica tales como vectores de clonación/expresión recombinantes y
métodos de purificación de proteínas. Si la producción va a tener
lugar in vivo, se usa un sistema de expresión apropiado, tal
como los que aparecen listados más adelante. Conociendo la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido(s) del dominio 1
de \beta_{2}GPI (que se obtiene usando técnicas estándar de
secuenciación de proteínas), se puede diseñar un polinucleótido que
codifica esa secuencia de aminoácidos particular. Los
polinucleótidos se pueden sintetizar o se pueden obtener (según
convenga) a partir de secuencias genómicas o de secuencias de
cDNA.
La invención también incluye vectores de
clonación y vectores de expresión que contienen cualquiera de los
polinucleótidos anteriormente descritos. Estos vectores son muy
conocidos en la técnica (p. ej., los de uso en sistemas de
expresión in vitro, en bacterias, en mamíferos, en levaduras
y en insectos) y no es necesario describirlos aquí. Véase, por
ejemplo, Gacesa y Ramji, Vectors, John Wiley & Sons
(1994).
La invención también incluye células
hospedadoras que contienen (es decir, que se han transformado con, o
que comprenden) cualquiera de los polinucleótidos y/o vectores aquí
descritos. Se pueden usar células hospedadoras procariotas y
eucariotas. Los hospedadores procariotas incluyen células
bacterianas, por ejemplo, E. coli, B. subtilis y
micobacterias. Entre los hospedadores eucariotas se encuentran
células de hongos (que incluyen levaduras), de insectos, aves,
plantas y mamíferos. Los sistemas hospedadores son conocidos en la
técnica y no es necesario describirlos aquí con detalle. Las
células hospedadoras de esta invención se pueden usar, inter
alia, como repositorios de los polinucleótidos anteriormente
descritos y/o como vehículos para la producción de polinucleótidos
y/o polipéptidos del dominio 1 de \beta_{2}GPI. También se
pueden usar como vehículos para el suministro in vivo de
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI.
La presente invención proporciona además
composiciones que comprenden polipéptidos del dominio 1 de
\beta_{2}GPI (que incluyen todas las realizaciones de
polipéptidos anteriormente descritas, tales como fusiones,
polipéptidos poliméricos, y conjugados), así como composiciones que
comprenden polinucleótidos que codifican el dominio 1 de
\beta_{2}GPI. Estas composiciones son especialmente útiles para
su administración a aquellos individuos que se pueden beneficiar de
una inducción de tolerancia. Las composiciones son también útiles
como reactivos en sistemas de detección.
Generalmente, las composiciones de la invención
para usar en la inducción de tolerancia comprenden una cantidad
efectiva de un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI, preferiblemente en un excipiente farmacéuticamente
aceptable, y pueden estar en diversas formulaciones. Como se conoce
bien en la técnica, un excipiente farmacéuticamente aceptable es
una sustancia relativamente inerte que facilita la administración de
una sustancia farmacológicamente efectiva. Por ejemplo, un
excipiente puede conferir forma o consistencia, o actuar como
diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a
ellos, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulgentes,
sales para variación de la osmolaridad, agentes de encapsulación,
tampones, y potenciadores de la penetrabilidad dérmica. Los
excipientes así como formulaciones para el suministro parenteral y
no parenteral de fármacos se exponen en Remington’s
Pharmaceutical Sciences, 19ª Edición, Mack Publishing
(1.995).
Generalmente, estas composiciones se formulan
para su administración por inyección (p. ej., por vía
intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). Por
consiguiente, estas composiciones preferiblemente se mezclan con
vehículos farmacéuticamente aceptables tales como disolución salina,
disolución de Ringer, disolución de dextrosa y disoluciones
similares. Generalmente, el conjugado constituirá normalmente
aproximadamente del 0,01% al 10% en peso de la formulación, debido
a consideraciones prácticas y empíricas tales como la solubilidad y
la osmolaridad. La pauta posológica concreta, es decir, la dosis,
las horas y la repetición, dependerá del individuo particular y del
historial clínico del individuo. De manera general, semanalmente se
administrará una dosis desde aproximadamente 1 \mug hasta
aproximadamente 100 mg de conjugado/kg de peso corporal,
preferiblemente desde aproximadamente 100 \mug/kg hasta
aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Consideraciones
empíricas, tales como la semivida, generalmente contribuirán a la
determinación de la dosificación. Otras pautas de dosificación
apropiadas pueden ser una frecuencia máxima diaria, o 3 dosis a la
semana, o una dosis a la semana, o una dosis cada de dos a cuatro
semanas, o una dosis con una pauta mensual o menos frecuente
dependiendo del individuo o del estado patológico clínico. Se
pueden requerir administraciones repetidas, normalmente pautadas
conforme a la velocidad de recambio de las células B, para alcanzar
y/o mantener un estado de anergia humoral. Esas administraciones
repetidas generalmente implican tratamientos desde aproximadamente 1
\mug/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal o de
dosis mayores cada de 30 a 60 días, o antes, si se detecta un
aumento del valor GPL del anticuerpo. De manera alternativa, en el
caso de algunas patologías pueden estar indicadas formulaciones de
liberación continua y prolongada de las composiciones. En la técnica
se conocen distintas formulaciones y dispositivos para alcanzar una
liberación
prolongada.
prolongada.
Otras formulaciones incluyen formas de
suministro adecuadas y conocidas en la técnica que incluyen, pero
que no se limitan a ellas, moléculas de transporte tales como
liposomas. Mahato y col. (1977) Pharm. Res.
14:853-859. Las preparaciones liposomales incluyen,
pero que no se limitan a ellas, citofectinas, vesículas
multilamelares y vesículas unilamelares.
En algunas realizaciones, en una composición
pueden estar presentes más de un único polipéptido(s) del
dominio 1 de \beta_{2}GPI. Esas composiciones pueden contener
al menos 1, al menos, 2 al menos 3, al menos 4, al menos 5 un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI diferentes.
Esos mezclas "cócteles", como muchas veces se les denomina la
técnica, pueden ser particularmente útiles para tratar un margen más
amplio de población de individuos. También pueden ser útiles en ser
más efectivos que cuando se usa solamente un polipéptido(s)
del dominio 1 de \beta_{2}GPI (o menos de los que están
contenidos en el cóctel).
Las composiciones se pueden administrar solas o
junto con otras formas de agentes que sirven para mejorar y/o
complementar la efectividad de un polipéptido(s) del dominio
1 de \beta_{2}GPI, que incluyen, pero que no se limitan a
ellos, tratamientos anti-células T auxiliares, Esos
tratamientos, normalmente utilizan agentes que suprimen células T/
supresores de células T/ tales como esteroides o ciclosporina.
Los individuos adecuados para que reciban esas
composiciones se pueden identificar usando parámetros clínicos
conocidos en la técnica, tales como la determinación de los valores
de GPL de los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI, la determinación de la presencia de anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI asociados en
concreto con un estado(s) patológico, y/o con síntomas de
patologías asociadas a anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI. Preferiblemente, el individuo es un ser humano.
Con respecto a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI, un valor de GPL de al menos aproximadamente 10,
preferiblemente de al menos aproximadamente 20, más preferiblemente
de al menos aproximadamente 40, puede indicar de la administración
de cualquiera de estas composiciones. Este valor está basado en el
ensayo que en la actualidad se encuentra comercialmente disponible,
que es un ensayo de ELISA en fase sólida de determinación de
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI (p.
ej., Inova (San Diego); Theratest (Chicago); APL
Diagnostics (Louisville)). También son indicados para que se les
administren estas composiciones aquellos individuos que tienen un
historial familiar de algún trastorno (es decir, enfermedad)
asociado con la presencia de anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI, o aquellos individuos que se
considera que tienen un valor de GPL "normal" pero que han
presentado un aumento en el valor de GPL durante un período de
tiempo.
Generalmente, la eficacia de la administración
de cualquiera de estas composiciones se establece midiendo
cualquier cambio en los parámetros clínicos anteriormente descritos,
en particular el valor de GPL de los anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI. Sin embargo, es adecuada la medida
de cualquier parámetro que se cree, o que se ha observado, que está
asociado con la dolencia que está siendo tratada.
Con respecto a las composiciones que se pueden
usar como reactivos (tal como en ensayos de detección), estas
composiciones generalmente comprenden una cantidad de
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI (es decir,
uno o más polipéptidos) suficiente para efectuar la detección. Estas
cantidades son fáciles de determinar empíricamente. Estas
composiciones pueden comprender además una sustancia, tal como un
tampón, para llevar a cabo la detección. Estas composiciones pueden
también opcionalmente formar un complejo con una matriz de
detección, tal como una fase sólida (p. ej., en una columna de
inmunoafinidad).
La invención proporciona también kits que
contienen (es decir, que comprenden) uno o más polipéptido(s)
del dominio 1 de \beta_{2}GPI y, opcionalmente, anticuerpos
dirigidos contra polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI como un estándar, preferiblemente kits
diagnósticos para la detección de un anticuerpo antifosfolípido
dependiente de \beta_{2}GPI. Los procedimientos diagnósticos y
los procedimientos para realizar el seguimiento, que usan
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI de esta
invención pueden ser realizados por laboratorios clínicos,
laboratorios experimentales, facultativos, practicantes, o por
individuos privados. Los kits constituidos por la
realización de esta invención incluyen kits que permiten
llevar a cabo un ensayo con respecto a la presencia de anticuerpos
contra polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI,
como cualquiera de los que aquí descritos, detectando y/o
cuantificando así esos anticuerpos. Los kits constituidos
por esta invención también incluyen kits que permiten la
detección de anticuerpos dirigidos contra polipéptido(s) del
dominio 1 de \beta_{2}GPI, por ejemplo, en células transfectadas
ex vivo o in vivo. Por consiguiente, la invención
incluye un kit que contiene polipéptido(s) del dominio
1 de \beta_{2}GPI para la detección y/o cuantificación de un
anticuerpo anti-
polipéptido(s del dominio 1 de \beta_{2}GPI, preferiblemente un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI, en una muestra biológica. Los kits de esta invención están en un estuche adecuado y pueden opcionalmente suministrar componentes adicionales que son útiles en el procedimiento. Estos componentes opcionales incluyen, pero que no se limitan a ellos, tampones, reactivos de captura, reactivos de revelado, marcadores, superficies reaccionantes, medios de detección, muestras de control, instrucciones e información explicativa.
polipéptido(s del dominio 1 de \beta_{2}GPI, preferiblemente un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI, en una muestra biológica. Los kits de esta invención están en un estuche adecuado y pueden opcionalmente suministrar componentes adicionales que son útiles en el procedimiento. Estos componentes opcionales incluyen, pero que no se limitan a ellos, tampones, reactivos de captura, reactivos de revelado, marcadores, superficies reaccionantes, medios de detección, muestras de control, instrucciones e información explicativa.
Se puede utilizar cualquier medio apropiado para
detectar la unión de los anticuerpos (y se puede suministrar en los
kits) tal como un anticuerpo anti-seres
humanos marcado, cuando se realizan ensayos con respecto a la
presencia de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI humanos, en los que el marcador puede ser una
enzima, fluoróforo, material quimioluminiscente, radioisótopo,
coenzima. Generalmente, el marcador usado es una enzima.
Además de detectar anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI, un polipéptido(s) de
\beta_{2}GPI puede ser un componente de un kit para
detectar coagulación (formación de coágulos). Ese kit
permitiría la detección de una función (si existe) de los
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI como
mediadores de la ruta que conduce a una trombosis. Por ejemplo, los
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI
retrasan la inactivación del Factor Va activado por parte de la
proteína C activada, o activan la ruta de coagulación en la que
intervienen factores tisulares. Los autores de la invención han
encontrado que los anticuerpos
anti-\beta_{2}GPI específicos del dominio 1
retrasan la inactivación del Factor Va, según se comenta en el
Ejemplo 11. Un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI puede ser útil para discriminar efectos mediados
por anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI de
entre otros mecanismos que influyen sobre la inactivación del
Factor Va o sobre la activación de la ruta en la que intervienen
factores tisulares. Además, los polipéptido(s) del dominio 1
de \beta_{2}GPI pueden ser útiles en otros ensayos funcionales
de coagulación (como por ejemplo una trombosis) en los que
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI o
suero o plasma procedente de individuos, influyen sobre el resultado
final del ensayo de coagulación específico. Por ejemplo, si la
presencia de un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI altera el resultado final de un ensayo de
coagulación (cuando se compara con los resultados de ese ensayo en
ausencia de un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI), los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI están implicados en la ruta de coagulación. Esta
información podría ser especialmente valiosa a la hora de evaluar
los potenciales tratamientos específicos.
La invención también proporciona métodos que
usan un polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI que
se pueden aplicar en un contexto de detección y/o en un contexto
terapéutico. Por consiguiente, la invención abarca métodos que usan
polipéptido(s) de \beta_{2}GPI de la invención para
detectar dianas adecuadas en una muestra biológica. En la técnica
se conocen extensamente procedimientos para llevar a cabo ensayos
diagnósticos (es decir, de detección) utilizando polipéptidos, y
esos procedimientos son de rutina para un facultativo con una
experiencia ordinaria. Generalmente, para realizar un método
diagnóstico (es decir, de detección) de esta invención, uno de los
polipéptidos de esta invención (generalmente en forma de una
composición) se proporciona como reactivo para detectar una diana
con la que reacciona en una muestra biológica. La diana se
suministra obteniendo una muestra biológica adecuada procedente de
un individuo en el que se quiere medir el parámetro diagnóstico. Si
se quiere, la diana se puede purificar parcialmente a partir de la
muestra o se puede amplificar antes de llevar a cabo el ensayo. La
invención también proporciona métodos para purificar un anticuerpo
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI usando un
polipéptido(s) de la invención. La invención también
proporciona métodos que usan los polipéptidos y polinucleótidos de
la invención para inducir tolerancia.
En una de las realizaciones, la invención
proporciona métodos para detectar un anticuerpo que se une
específicamente a un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI, preferiblemente un anticuerpo antifosfolípido
dependiente de \beta_{2}GPI, en una muestra biológica. Estos
métodos son generalmente aplicables en el entorno clínico, por
ejemplo, para diagnosticar y/o realizar el seguimiento de los
niveles de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI en un individuo. Estos métodos conllevan poner en
contacto un anticuerpo (antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI) presente en la muestra, con un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI (es decir,
cualquiera de los polipéptidos de esta invención) en condiciones
adecuadas para permitir la formación de un complejo estable entre
un anticuerpo específico anti-dominio 1 de
\beta_{2}GPI (tal como un anticuerpo antifosfolípido
dependiente de \beta_{2}GPI) y un polipéptido(s) del
dominio 1 de \beta_{2}GPI, y detectar el complejo estable
formado, si se ha formado. El polipéptido(s) del dominio 1
de \beta_{2}GPI de la invención hace que estos métodos sean
particularmente útiles, debido a que aún no ha sido desarrollado un
ensayo conveniente o adecuado en general de determinación de estos
anticuerpos. En la técnica se conocen varios métodos de
inmunoensayo y no es necesario describirlos con detalle. Las
muestras adecuadas en las que medir un anticuerpo antifosfolípido
dependiente de \beta_{2}GPI son las muestras biológicas, que
incluyen suero o plasma (preferiblemente suero) y un eluido
procedente del tejido diana. En la técnica es muy conocido que la
detección de un complejo formado puede ser directa (como por ejemplo
midiendo la cantidad de un marcador asociado con un complejo) o
indirecta (como por ejemplo midiendo la cantidad de un ligando
marcado que es desplazado durante el ensayo).
Para usar el polipéptido(s) de esta
invención en la detección de estos anticuerpos en un individuo, se
lleva a cabo un inmunoensayo. El polipéptido(s) se
proporciona en forma de reactivo, y el anticuerpo es la diana
presente en la muestra biológica. Por ejemplo, moléculas del
anticuerpo IgG de seres humano presentes en una muestra de suero se
pueden capturar con proteína A en una fase sólida, y después se
pueden cubrir con el reactivo del polipéptido marcado. La cantidad
de anticuerpo sería entonces proporcional al marcador unido a la
fase sólida. Como alternativa, células o secciones de tejido que
expresan el polipéptido se pueden primero cubrir con la muestra a
ensayar que contiene el anticuerpo, y luego con un reactivo de
detección tal como un reactivo anti-inmunoglobulina
marcado. La cantidad de anticuerpo sería entonces proporcional al
marcador unido a las células. La cantidad de anticuerpo detectado
en la muestra se compararía con la cantidad detectada en una muestra
de control.
En los métodos de la invención, un polipéptido
del dominio 1 de \beta_{2}GPI se inmovilizará típicamente,
mediante técnicas conocidas, sobre una fase sólida adecuada, tal
como un material de empaquetamiento de columnas de afinidad, o una
superficie de plástico tal como una placa de microtitulación o una
varilla. Los materiales apropiados de empaquetamiento para una
columna de afinidad incluyen, por ejemplo, una matriz de agarosa en
forma de bolitas, poliacrilamida, vidrio, celulosa o dextrano
reticulado. Las superficies de plástico adecuadas incluyen
polimetacrilato, poliestireno, polietileno, politereftalato,
etilenglicol, poliésteres, polipropileno y polímeros similares. En
general, se puede usar cualquier placa de microtitulación estándar.
Como alternativa, la fase sólida puede encontrarse en forma de un
gel o de una matriz a los que se incorpora un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI.
Para una mayor ilustración, una muestra a
ensayar que potencialmente contiene un anticuerpo que se une
específicamente a un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI (tal como un anticuerpo antifosfolípido dependiente
de \beta_{2}GPI) se puede mezclar con una cantidad
predeterminada no limitante del polipéptido(s) del dominio 1
de \beta_{2}GPI que generalmente está marcado con un marcador
detectable (tal como con un radioisótopo o una enzima). En un
ensayo en fase líquida, los reactivos que no han reaccionado se
retiran aplicando una técnica de separación, tal como una
filtración o cromatografía. En estas técnicas de inmunoensayos, la
cantidad de marcador asociado con el complejo se correlaciona
positivamente con la cantidad de anticuerpo antifosfolípido
dependiente de \beta_{2}GPI presente en la muestra. Se pueden
diseñar ensayos similares en los que un anticuerpo antifosfolípido
dependiente de \beta_{2}GPI presente en la muestra a ensayar
compite con el anticuerpo marcado por la unión a una cantidad
limitante del polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI. En este caso, la cantidad de marcador se
correlaciona de manera negativa con la cantidad de anticuerpo
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI presente en la
muestra.
En algunas realizaciones, la muestra biológica
es una muestra de tejido, o un eluido procedente de un tejido, y la
cantidad de anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI asociado con la muestra de tejido se mide, por
ejemplo, mediante un ensayo de unión competitiva. Estos métodos
pueden ser especialmente útiles en los contextos en los que un
tejido particular debe ser sometido al ensayo y/o a un seguimiento
con respecto a la presencia y/o a la cantidad de anticuerpo
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI. Este tipo de
ensayo puede indicar, por ejemplo, si una enfermedad concreta (o el
riesgo de contraer una enfermedad) puede ser indicado (tal como una
forma particular de trombosis o un trastorno de la coagulación. Un
ensayo de este tipo también puede ser útil para proporcionar una
determinación más precisa y sensible de la localización de un
anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI con fines
diagnósticos y/o de realizar el seguimiento. Además, la información
relativa a la localización, referente a un anticuerpo
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI, también puede
proporcionar al médico una indicación sobre las opciones adecuadas
para el tratamiento.
Se sobrentiende que estos métodos de detección
son aplicables en diversos contextos clínicos. Por ejemplo, la
detección se puede usar para identificar individuos que presentan
riesgo de desarrollar dolencias o trastornos asociados con
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI (que
pueden a su vez haberse producido de la capacidad de distinguir
anticuerpos asociados con enfermedades y los no asociados con
enfermedades). La detección también se puede usar para realizar el
seguimiento de un tratamiento (tal como la administración de
cualquiera de las composiciones anteriormente descritas). La
detección también puede ayudar a distinguir entre anticuerpos
patogénicos y anticuerpos no patogénicos. La detección también puede
ayudar al médico a decidir las mejores opciones de tratamiento y/o
el pronóstico.
Como se ha comentado en lo que antecede, un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI también se
puede usar como un componente diagnóstico en un ensayo de
coagulación, en concreto en un ensayo en el que anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI pueden modificar
el resultado final de un ensayo de coagulación específico. Por
ejemplo, si la presencia de un polipéptido(s) del dominio 1
de \beta_{2}GPI altera el resultado final de un ensayo de
coagulación (cuando se compara con los resultados de un ensayo de
ese tipo en ausencia de un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI, los anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI están implicados en la ruta de coagulación. Debido
a que un polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI
puede ser útil para discriminar los efectos mediados por anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI de entre otros
mecanismos de coagulación (tales como una trombosis), la invención
incluye métodos para detectar la participación (mediación) de un
anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI en la
coagulación (tal como en una trombosis), que comprenden (a) realizar
un ensayo de coagulación usando una muestra biológica adecuada
procedente de un individuo y usando un polipéptido(s) del
dominio 1 de \beta_{2}GPI; (b) realizar un ensayo de
coagulación usando una muestra biológica adecuada procedente de un
individuo, sin usar un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI; (c) comparar los resultados de (a) y (b), en donde una diferencia en los resultados indica la participación de un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI en la coagulación. Estos métodos también se pueden usar para realizar el seguimiento del estado de salud de un paciente en lo que se refiere a la mediación de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI en la coagulación, así como en la detección inicial. Estos métodos también indican, o detectan, una anormalidad en la coagulación que implica a (es decir, que está mediada por) anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI.
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI; (c) comparar los resultados de (a) y (b), en donde una diferencia en los resultados indica la participación de un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI en la coagulación. Estos métodos también se pueden usar para realizar el seguimiento del estado de salud de un paciente en lo que se refiere a la mediación de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI en la coagulación, así como en la detección inicial. Estos métodos también indican, o detectan, una anormalidad en la coagulación que implica a (es decir, que está mediada por) anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI.
Para estos métodos, se puede usar plasma o
suero. Como alternativa, se usa la fracción de IgG, aislada
utilizando métodos estándar en la técnica. Un ejemplo de un sistema
de detección de coagulación se proporciona en el Ejemplo 11. En
algunas realizaciones, se determinan los niveles del factor V
activado (Va), generalmente midiendo el tiempo de coagulación. Los
ensayos, los equipos y los kits para detectar coagulación son
conocidos en la técnica y se encuentran comercialmente
disponibles.
La invención también incluye métodos para
purificar un anticuerpo que se une específicamente a un
polipép-
tido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI (tal como un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI), que comprenden poner en contacto una muestra biológica que contiene un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI con un polipép-
tido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo estable, y obtener el complejo formado, si se ha formado. Típicamente, un polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI se acopla a una matriz de afinidad para la purificación en una columna de afinidad. Esos métodos son de rutina en la técnica y no es necesario describirlos aquí con detalle. El Ejemplo 1 también describe la purificación por afinidad de un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI.
tido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI (tal como un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI), que comprenden poner en contacto una muestra biológica que contiene un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI con un polipép-
tido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo estable, y obtener el complejo formado, si se ha formado. Típicamente, un polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI se acopla a una matriz de afinidad para la purificación en una columna de afinidad. Esos métodos son de rutina en la técnica y no es necesario describirlos aquí con detalle. El Ejemplo 1 también describe la purificación por afinidad de un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI.
En esta invención también se incluyen métodos
para inducir la tolerancia (es decir, un estado toleragénico), que
comprenden administrar a un individuo una cantidad efectiva de un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI (o de un
polipéptido que comprende un polipéptido(s) del dominio 1 de
\beta_{2}GPI) que además carece(n) de un epítopo
detectable para células T. Preferiblemente, el polipéptido(s)
del dominio 1 de \beta_{2}GPI (o un polipéptido que comprende
un polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI) está
también conjugado con una molécula plataforma adecuada, según se ha
descrito en lo que antecede. Se entiende que, para los fines de
esta invención, la inmunorrespuesta que ha de ser disminuida (y/o
eliminada, estabilizada y/o su velocidad de aumento disminuida), a
través de la inducción de tolerancia, es una inmunorrespuesta a
\beta_{2}GPI. Por consiguiente, la tolerancia inducida es
específica de antígeno, el antígeno es \beta_{2}GPI, y la
tolerancia se logra obtener en un individuo en el que se ha
determinado que posee (al menos antes de la administración del
polipéptido(s) de esta invención) anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI.
Los polipéptidos apropiados de esta invención
(es decir, los polipéptidos que comprenden un polipéptido(s)
del dominio 1 de \beta_{2}GPI que carece de un epítopo para
células T) se pueden usar solos o en conjunción con otros agentes
que promueven la actividad y el objetivo deseados. Según se ha
comentado en lo que antecede, se pueden usar también distintos
polipéptidos en distintas combinaciones de unos con otros. En lo que
antecede se ha tratado sobre distintas formulaciones y medios de
administración.
La determinación de si la tolerancia se ha
inducido se puede realizar mediante cualquiera de los medios
conocidos en la técnica. En general, la tolerancia se determina
midiendo la inmunorrespuesta frente a un polipéptido(s) del
dominio 1 de \beta_{2}GPI. Una inmunorrespuesta a un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI se puede
medir usando ensayos estándar, que incluyen, por ejemplo, medir los
niveles de un anticuerpo que se une a un polipéptido(s) del
dominio 1 de \beta_{2}GPI; medir la producción de citoquinas
después de la inmunización con un polipéptido(s) del dominio
1 de \beta_{2}GPI; realizar análisis in vitro de la
respuesta de las células T frente a un polipéptido(s) del
dominio 1 de \beta_{2}GPI después de administrar un
polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI de la
invención usando células T procedentes del individuo que está
recibiendo esa administración (es decir, de un individuo con
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI), que
incluyen, por ejemplo, ensayos estándar de incorporación de
^{3}H-timidina para medir la proliferación de
células T cuando están presentes junto con un polipéptido(s)
del dominio 1 de \beta_{2}GPI en el contexto de una célula
presentadora de antígeno, ensayos estándar de liberación de
^{51}Cr para medir la destrucción de una célula que presenta un
polipéptido(s)
del dominio 1 de \beta_{2}GPI por acción de las células T citotóxicas, y ensayos similares.
del dominio 1 de \beta_{2}GPI por acción de las células T citotóxicas, y ensayos similares.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar, pero no limitar, la presente invención.
\beta_{2}GPI está formada por 5 dominios
"sushi". Para determinar la región (regiones)
antigénica(s) de \beta_{2}GPI, los autores de la
invención retiraron selectivamente uno o más dominios de
\beta_{2}GPI. Esta estrategia había sido empleada por Igarashi
y col., ((1996) Blood 87:3262-3270) que
hicieron deleciones en la \beta_{2}GPI humana de manera que
contenía los dominios 4 y 5, los dominios del 3 al 5, los dominios
del 2 al 5, los dominios del 1 al 4 y los dominios del 1 al 3.
Además de los mutantes por deleción de dominios, descritos por
Igarashi y col., los autores de la invención construyeron mutantes
de la \beta_{2}GPI humana que contenían sólo los dominios 1 y
2.
El punto de partida para la construcción de
estos mutantes por deleción fue el cDNA de longitud completa de la
\beta_{2}GPI humana (Steinkasserer y col., (1991) Biochem.
J. 277:387-391) clonado en pBacPAK9
(Clontech), una donación de por S-Krilis. La
etapa inicial consistió en introducir una secuencia GlyHis_{6} en
el extremo C-terminal. En este procedimiento, se
creó un sitio de restricción único Msc I (TGGGCCA) cambiando el
codón C-terminal correspondiente a Cys, de TGC a
TGT, seguido de Gly (GGC) e His (CAC). El propósito de la secuencia
identificadora His_{6} fue permitir una fácil purificación de las
proteínas mutantes mediante una cromatografía de quelación con
Ni.
GlyHis_{6} se introdujo en forma de una
mutagénesis dirigida a un sitio específico de DNA monocatenario. El
método utilizado siguió de cerca los procedimientos publicados por
Kunkel y col., Methods in Enzymology (1987)
154:367-382. Cuando las células que contienen el
fagómido pBacPAK9 en el que se ha insertado el cDNA de la
\beta_{2}GPI humana se infectaron con una fago auxiliar, M13K07,
las partículas del fago recogidas en el medio de crecimiento
contenían predominantemente una versión del DNA monocatenario del
pBacPAK9. Además, si las células utilizadas eran de genotipo
dut1, ung1, tal como las células CJ236, parte de la
timidina en el DNA fue reemplazada por uridina. El DNA
monocatenario se purificó procedente del fago mediante extracción
en fenol y precipitación en etanol.
El oligonucleótido, ApoH-G6H,
que tiene la secuencia:
5’ AAACCACCTTAATGGTGATGGTGATGGTGGCCACATGGCTTTACA
3’ (SEQ ID NO: 13) que es complementaria a las regiones situadas a
cada uno de los lados de la Cys del extremo
C-terminal y que codifica GlyHis_{6}, se hibridó
con el DNA monocatenario de pBacPAK9 que contiene el gen de la
\beta_{2}GPI humana que se había hecho crecer en E. coli
CJ 236. El método de Kunkel se usó para extender el oligonucleótido
complementario obteniéndose como resultado un DNA bicatenario. Con
el producto de la reacción se transformó E. coli K91. La cepa
K91 no contiene el genotipo dut 1, ung 1, con el
resultado de que el DNA que contenga uridina será degradado. La
cadena recién sintetizada que codifica GlyHis_{6} debió ser
enriquecida. Los clones se analizaron mediante secuenciación del
DNA utilizando o el kit de la secuenasa de T7 o el kit
de la termo-secuenasa (Amershan Life
Sciences).
Los siguientes oligonucleótidos se utilizaron de
la manera anteriormente descrita para generar mutantes por deleción
de dominios de la \beta_{2}GPI humana:
Los números indicados en los oligonucleótidos
hacen referencia a los aminoácidos de la \beta_{2}GPI humana.
Por ejemplo, B2del3-60 hace referencia a los
aminoácidos 3-60 que han sido delecionados de la
\beta_{2}GPI. La proteína resultante contiene los dominios
2-5.
A continuación viene un sumario de las
construcciones:
Se usó una PCR para generar otros mutantes. El
molde de la reacción fue el pBacPAK9 que contiene el cDNA de la
\beta_{2}GPI humana. El oligonucleótido pBacPac9PCR1270,1297,
que tiene la secuencia: 5’ CTA TAA ATA CGG ATC CCG GGA ATT CG 3’
(SEQ ID NO: 25) y que es el cebador aguas arriba de la región de
multiclonación en pBacPAK9, se usó como cebador 5’. Para construir
los clones que tienen solamente el dominio 1, el oligonucleótido
Dominio1PCR(64)Msc1, que tiene la secuencia: 5’ GCA
GCT GGC CAA CTC TGG GTG TAC ATT TCA GAG TG 3’ (SEQ ID NO: 26), se
usó como el cebador 3’. De manera similar, para generar un mutante
que contiene los dominios 1 y 2, el oligonucleótido
Dominio1,2PCR(122)Msc1, que tiene la secuencia: 5’ GCA
GCT GGC CAA TGA TGG GAG CAC CAC AGA GAG GAA G 3’ (SEQ ID NO: 27),
se usó como el cebador 3’. Se realizaron veinticinco rondas de PCR.
El producto se extrajo en fenol y se precipitó en etanol. Los
fragmentos se digirieron en el extremo 5’ con Bam HI y en el
extremo 3’ con Msc 1. Los fragmentos de DNA digeridos se purificaron
en gel y se ligaron en pBacPAK9 en el que se había cortado la
\beta_{2}GPI de longitud completa utilizando las mismas enzimas
de restricción. Las ligaciones se usaron para transformar E. coli
XL-1blue y los clones se caracterizaron
mediante secuenciación del DNA. Los resultados fueron los
siguientes:
Todos los mutantes por deleción se purificaron a
partir los medios de las células de insecto infectadas. En general,
las células se separaron mediante centrifugación y los medios se
dializaron frente a al menos 10 volúmenes de disolución salina
tamponada con fosfato (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM,
Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O 4,3 mM, KH_{2}PO_{4} 1,4 mM),
durante 18 horas a 4ºC. Al día siguiente, todos los precipitados se
separaron mediante centrifugación. El medio dializado se llevó a
una concentración de NaPO_{4} 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, y se
añadió resina de Ni-NTA al medio dializado con
mezclado suave. Pasada 1 hora a 4ºC, la resina se recogió con un
embudo Buchner y se empaquetó en una columna provista con camisa de
agua mantenida 4 grados. La columna se lavó de manera prolongada
con NaPO_{4} 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M hasta que no hubo proteínas
detectables. La columna se eluyó de manera secuencial con el mismo
tampón que contenía por orden imidazol 20 mM, 35 mM o 100 mM. El
análisis se realizó mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecilsulfato sódico
(SDS-PAGE). Las fracciones apropiadas se reunieron y
la proteína se concentró y se dializó frente a disolución salina
tamponada con Tris (TBS; TrisCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM).
Para aislar anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI, dispersiones lipídicas
multilamelares que contienen cardiolipina (y que también contienen
colesterol y dicetilfosfato), se incuban con un plasma (o suero)
que contiene anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI. Estos liposomas se sedimentan en el suero
mediante centrifugación. Después de los lavados, la mezcla de
liposomas se rompe con el detergente octilglucósido al 2% y se
aplica a una columna de agarosa-proteína A. Después
de lavados prolongados para primero retirar los lípidos y después
retirar los componentes de naturaleza no IgG, un anticuerpo IgG
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI se eluye desde la
proteína A con un ácido suave, se neutraliza, se somete a
intercambio con tampón y se somete a un ensayo ELISA de ACA. Este
procedimiento produce un anticuerpo aPL enriquecido hasta 10.000
veces que está desprovisto de toda \beta_{2}GPI contaminante
según se demuestra mediante transferencia Western con un antisuero
que contiene IgG anti-\beta_{2}GPI humana,
procedente de conejo. A continuación sigue un ejemplo específico de
este procedimiento.
Se purificaron anticuerpos procedentes de
distintos pacientes a partir de sueros de pacientes de edades
diferentes que presentaban diversos síntomas que incluían: SLE, APS
(que incluyen diferentes manifestaciones de APS, incluyendo
trombosis venosa, aborto espontáneo, trombocitopenia, CVA (accidente
cerebrovascular, es decir, apoplejía), TIA (ataques isquémicos
transitorios)) y oclusión arterial.
En un matraz de 25 ml de fondo redondeado
(Kontes Scientific Co., Vineland, N.J.) una mezcla de 1,2 ml
de cardiolipina (Sigma Chemical, St. Louis, MO, Núm.
C-1649), 0,464 ml de colesterol (Sigma Diag., St.
Louis, Núm.965-25) y 0,088 ml de una disolución
de 5 mg de dicetilfosfato (Sigma Chemical, St. Louis, MO,
D-263 1) por ml de cloroformo, se secó durante
aproximadamente 5 minutos en un Rotavap (Buchi, Suiza).
Después de retirar el disolvente, se añadieron 2 ml de NaCl (J.T.
Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) al 0,96% (p/v) y se mezclaron en
un Vortex Genie Mixer (Scientific Industries, Inc.
Bohemia, NY) durante 11 minutos. La suspensión de liposomas se
incubó durante 1 hora a 37ºC. Mientras tanto, el suero 6501 se
centrifugó a 6.000 x g en una centrífuga Sorvall RT 6000 (Dupont
Co., Wilmington, DE) durante 10 minutos a 8ºC. Se pusieron 4 ml
del sobrenadante en un matraz de 25 ml de fondo redondeado con 1 ml
de la suspensión de liposomas preparada y la mezcla se incubó con
una agitación de velocidad media en un agitador orbital, Tektator
V (Scientific Products, McGraw Park, IL) durante 48
horas a 4ºC, y durante 2 horas adicionales a 37ºC. Se añadieron 20
ml de TBS frío y la mezcla se transfirió a un tubo de centrífuga de
policarbonato de 50 ml (Nalge Co., Rochester, NY) y se
centrifugó a 27.000 x g durante 15 minutos a 4ºC en una centrífuga
RC3 con un rotor SS-34
(Sorvall-Dupont, Wilmington, DE). El
precipitado se lavó 3 veces con 25 ml de NaCl al 0,96% frío usando
la centrífuga RC3. El sedimento se disolvió en 1 ml de una
disolución al 2% (p/v) de
n-octil-\beta-D-glucopiranósido
(Calbiochem, La Jolla, CA) en TBS y se aplicó a una columna
de 0,6 ml de agarosa reticulada/proteína A (Repligen
Corporation, Cambridge, MA) que se había prelavado con un
volumen de ácido acético 1 M igual a 15 veces el volumen del lecho
y que se había equilibrado con un volumen de TBS igual a 15 veces el
volumen del lecho. La columna que portaba agarosa/proteína
A-anticuerpo se lavó con un volumen de
octilglucopiranósido al 2% igual a 40 veces el volumen del lecho
para retirar los lípidos, seguido de lavados prolongados con TBS
hasta que la densidad óptica del eluido a 280 nm se aproximó a la
línea base. El anticuerpo unido se eluyó con ácido acético 1 M. Se
recogieron fracciones de 1 ml, se neutralizaron inmediatamente con
0,34 ml de Tris 3 M (Bio-Rad, grado para
electroforesis) por fracción y se conservaron en un baño de hielo.
La densidad óptica de cada fracción se determinó a 280 nm en un
espectrofotómetro (Hewlett-Packard, 8452A, Diode
Array Spectrophotometer, Palo Alto, CA). Las fracciones que
contenían anticuerpo se reunieron, se concentraron y se lavaron 4
veces con TBS en concentradores Centricon-30
(Amicon Division, W.R. Grace&Co., Beverly, MA)
según el protocolo del fabricante. El rendimiento final del
anticuerpo purificado a partir de 4 ml del suero 6501 se determinó
leyendo la densidad óptica a 280 nm de una parte alícuota del
concentrado y siendo 1 mg = 1,34 A_{280nm}. El rendimiento
promedio obtenido fue de 750 \mug de anticuerpo a partir de 4 ml
del suero 6501. El anticuerpo purificado se ensayó con respecto a la
actividad de ACA y se comprobó su pureza con una
SDS-PAGE según Laemmli.
Placas de microtitulación (Immulon 1, Núm. 3350,
procedentes de Dynex Technologies) se revistieron con 30
\mul de una disolución de cardiolipina en etanol de concentración
50 \mug/ml, se secaron toda la noche a 4ºC, se lavaron tres veces
con PBS, pH 7,2, y se bloquearon durante una hora a temperatura
ambiente con 75 \mul de gelatina de pescado al 5% (p/v)
(Hipure Liquid Gelatin, Norland Products Inc., 695 Joyce
Kilmer Ave., New Brunswick N.J., EE. UU.). Las placas se
lavaron tres veces con PBS, se cargaron con 50 \mul de
\beta_{2}GPI recombinante de longitud completa a concentración
de 10 \mug/ml en gelatina de pescado al 5% y se incubaron a 37ºC
durante una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS, a cada
uno de los pocillos se añadieron 50 \mul o de cada uno de los
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI,
purificados por afinidad (la concentración de cada anticuerpo usado
se muestra en la Tabla 2), o de anticuerpo
anti-\beta_{2}GPI procedente de conejo, y las
placas se incubaron a 37ºC durante una hora. Las placas se lavaron
tres veces con PBS, se añadieron 50 \mul de anticuerpo
anti-inmunoglobulina conjugado con fosfatasa
alcalina (IgG anti-humanos, específica de cadena
gamma, Zymed Núm. 62-8422, o IgG
anti-conejo, Zymed Núm. 362-61220),
diluido convenientemente en gelatina de pescado al 5%, y las placas
se incubaron a 37ºC durante una hora. Las placas se lavaron tres
veces con PBS, se añadieron 50 \mul de un sustrato cromogénico de
la fosfatasa alcalina (disolución de PPMP; 7,8 g de monofosfato de
fenoftaleína más 69,5 g de
2-amino-2-metil-1-propanol
en 100 ml de agua, disolución de reserva diluida en proporción 1:26
con agua inmediatamente antes de su uso) y se incubaron durante 30
minutos a temperatura ambiente. La densidad óptica, a 550 nm, se
determinó leyendo las placas en un aparato automático de lectura de
microplacas (Bio-Teck Instruments, modelo
EL311).
Las placas de microtitulación (MaxiSorp^{TM},
Nalge Nunc International, Dinamarca) se revistieron con 50
\mul de \beta_{2}GPI recombinante de longitud completa a una
concentración de 10 \mug/ml en bicarbonato 0,1 M, pH 9,5, se
incubaron toda la noche a 4ºC, se lavaron tres veces con PBS 0,15 M,
pH 7,2, y se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con
75 \mul de leche en polvo desnatada al 2% (Carnation, NFDM
al 2% (del inglés, " Non-Fat Dried
Milk")). Los inhibidores del ensayo se diluyeron en
NFDM al 2% y 25 \mul de cada dilución se añadieron a los pocillos
revestidos. Un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI, purificado por afinidad, se diluyó en NFDM al 2% y
25 \mul de una concentración constante se añadieron a los
pocillos, incluyendo a un grupo de pocillos que no contenían
inhibidor, que hacían de controles positivos. Los contenidos de los
pocillos se mezclaron y las placas se incubaron a 37ºC durante una
hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS, se añadieron 50
\mul de IgG anti-humanos conjugada con fosfatasa
alcalina, específica de cadena gamma, (Zymed Núm.
62-8422) diluida convenientemente en NFDM al 2%, y
se incubaron a 37ºC durante una hora. Las placas se lavaron tres
veces con PBS, se añadieron 50 \mul de la disolución del sustrato
cromogénico PPMP de la fosfatasa alcalina y las placas se incubaron
durante 30 minutos a temperatura ambiente. La densidad óptica, a
550 nm, se determinó leyendo las placas en un aparato automático de
lectura de microplacas (Bio-Teck
Instruments, modelo EL311). El tanto por ciento de inhibición se
determinó dividiendo la OD_{550} obtenida en presencia de
inhibidor entre la OD_{550} media obtenida de los pocillos sin
inhibidor, y multiplicando luego por 100 (más concretamente,
[A_{550} media obtenida de los pocillos de control sin inhibidor
menos A_{550} de fondo] menos [A_{550} obtenida en presencia de
inhibidor menos A_{550} de fondo] dividido entre [A_{550} media
obtenida de los pocillos de control sin inhibidor menos A_{550} de
fondo] multiplicado por 100).
Placas de micropocillos revestidos con níquel
quelato (NCP 010 00 Xenopore Corp., 374 Midland Ave.
Saddle Brook, NJ EE. UU.) se revistieron con 50 \mul de
diluciones seriadas de distintas \beta_{2}GPI recombinantes, en
PBS, a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron
tres veces con PBS y se bloquearon con 75 \mul de una gelatina al
1% (Sigma Núm. G-250) en PBS durante una hora a
temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS, se
añadieron 50 \mul de anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI, purificado por afinidad, (en una concentración
que previamente se había demostrado que proporcionaba
aproximadamente el 80% de la unión máxima) o de anticuerpo
anti-\beta_{2}GPI procedente de conejo y las
placas se incubaron a 37ºC durante una hora. Las placas se lavaron
tres veces con PBS, se añadieron 50 \mul de inmunoglobulina
anti-humanos conjugada con fosfatasa alcalina (IgG
anti-humanos, específica de cadena gamma, Zymed Núm.
62-8422) o de IgG anti-conejo
(Zymed Núm. 62-6122) diluida convenientemente en
gelatina al 1% y las placas se incubaron a 37ºC durante una hora.
Las placas se lavaron tres veces con PBS, se añadieron 50 \mul de
la disolución del sustrato cromogénico PPMP de la fosfatasa
alcalina y las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura
ambiente. La densidad óptica, a 550 nm, se determinó leyendo las
placas en un aparato automático de lectura de microplacas
(Bio-Teck Instruments, modelo
EL311).
EL311).
De siete a nueve proteínas \beta_{2}GPI
mutantes recombinantes diferentes se usaron para determinar la
especificidad antigénica de preparaciones de anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI, purificados por
afinidad, procedentes de 13 pacientes diferentes. Cada una de las
proteínas \beta_{2}GPI mutantes recombinantes se ensayó, de una
manera dependiente de la dosis, con respecto a su capacidad para
inhibir la unión de un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI, purificado por afinidad, a la \beta_{2}GPI
recombinante de longitud completa. Los resultados de un ensayo
típico se muestran en la Figura 4. Los resultados de los ensayos de
los 13 anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI, purificados por afinidad, están resumidos en la
Tabla 2. Los siguientes valores también se observaron en el caso de
la proteína recombinante que tiene solamente el dominio 1
(1- - - -; véase la Tabla 2 en lo referente a la
manera de designarlas):
Solamente los mutantes que contenían el dominio
1 inhibieron la unión de los anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI a la \beta_{2}GPI recombinante
de longitud completa (Fig. 4). Esto fue cierto en el caso de las 13
preparaciones de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI (Tabla 2). El hecho de que todas las proteínas
\beta_{2}GPI mutantes recombinantes que contenían el dominio 1
inhibían en una proporción mayor que el 90% indica que toda la
actividad anti-\beta_{2}GPI detectable de estos
anticuerpos está dirigida contra el dominio 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se estudiaron de siete a nueve proteínas
\beta_{2}GPI mutantes recombinantes diferentes para determinar
si serían capaces de prestar apoyo a la unión directa de
preparaciones de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI, purificados por afinidad, en ausencia de
fosfolípido aniónico. Todas las \beta_{2}GPI mutantes
recombinantes se ensayaron con preparaciones de anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI, purificados por
afinidad, procedentes de 11 pacientes diferentes. Cada una de las
proteínas \beta_{2}GPI mutantes recombinantes se ensayó de una
manera dependiente de la dosis, y se incluyó
GST-6his como control negativo. Las proteínas
\beta_{2}GPI mutantes recombinantes se unieron a placas de
microtitulación revestidas con níquel a través de sus colas de
6-his. Todas las proteínas \beta_{2}GPI mutantes
recombinantes ensayadas se unieron al anticuerpo
anti-\beta_{2}GPI procedente de conejo,
mostrando que eran evaluables con un anticuerpo (Fig. 5). Los
resultados de un experimento de unión típico muestran que sólo las
proteínas que contienen el dominio 1 se unieron al anticuerpo
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI, purificado por
afinidad, (Fig. 6). Los resultados de los ensayos de los 11
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI,
purificados por afinidad, están resumidos en la Tabla 3. Los
resultados muestran que todos los anticuerpos de los pacientes se
unieron significativamente a las proteínas \beta_{2}GPI
recombinantes que contenían el dominio 1, mientras que hubo poca
unión específica, si acaso alguna, a las proteínas recombinantes
que carecían del dominio 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| O.D. máxima correspondiente a cada una de las combinaciones de mutante por deleción:anticuerpo |
Se estudiaron siete proteínas \beta_{2}GPI
mutantes recombinantes diferentes para determinar si serían capaces
de prestar apoyo a la unión directa de preparaciones de anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI, purificados por
afinidad, en ausencia de fosfolípido aniónico. Las siete
\beta_{2}GPI mutantes recombinantes se ensayaron con anticuerpo
anti-\beta_{2}GPI procedente de conejo y con una
preparación de anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI, purificado por afinidad. Cada una de las proteínas
\beta_{2}GPI mutantes recombinantes se ensayó de una manera
dependiente de la dosis, y se incluyó GST-6his como
control negativo. Las proteínas \beta_{2}GPI mutantes
recombinantes se unieron a placas de microtitulación que se habían
revestido previamente con cardiolipina. Las siete proteínas
\beta_{2}GPI mutantes recombinantes se unieron al anticuerpo
anti-\beta_{2}GPI procedente de conejo,
mostrando que se unían a cardiolipina y que eran evaluables con un
anticuerpo (Fig. 7). Los resultados de un experimento típico con
anticuerpos procedentes de pacientes muestran que sólo las
proteínas que contienen tanto el dominio 1 como el dominio 5 se
unieron al anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI, purificado por afinidad, (Fig. 8).
Sobre la base de los datos de este ejemplo
expuestos en lo que antecede, los autores de la invención creen que
en determinadas condiciones \beta_{2}GPI se une a soportes de
fase sólida preparados de una manera (tal como placas irradiadas,
placas revestidas con cardiolipina, placas de microtitulación de la
marca Nunc y placas revestidas con níquel quelato en el caso de las
proteínas \beta_{2}GPI recombinantes que contienen una cola de
6-his) que permiten que el
epítopo(s) antigénico presente sobre el dominio 1 quede libremente accesible a los anticuerpos antifosfolípidos, dependiente de \beta_{2}GPI, pero no cuando \beta_{2}GPI está unida a otras superficies tales como placas no irradiadas y otras muchas marcas de placas de microtitulación. Estos estudios de inhibición confirman publicaciones de otros autores sobre que los anticuerpos antifosfolípidos dependiente de \beta_{2}GPI son capaces de unirse a \beta_{2}GPI en ausencia de fosfolípido. Galli y col. (1990) Lancet 335:1544; Rouby y col. (1995); Arvieux y col., (1991) J. Immunol. Methods 143:223. Las mismas cinco \beta_{2}GPI mutantes recombinantes que producen inhibición en el ensayo de inhibición competitiva, las que contienen el dominio 1, son las mismas que las que se unen a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI sobre placas revestidas con níquel quelato. Que las proteínas \beta_{2}GPI mutantes recombinantes se unían a las placas revestidas con níquel quelato fue confirmado por la capacidad del anticuerpo anti-\beta_{2}GPI procedente de conejo por unirse a las nueve proteínas recombinantes. Por el contrario, únicamente la proteína \beta_{2}GPI recombinante de longitud completa (es decir, la única proteína recombinante estudiada que contiene tanto el dominio 1 como el dominio 5) pudo ser fácilmente detectada sobre las placas revestidas con cardiolipina. Que las proteínas \beta_{2}GPI mutantes recombinantes se unían a las placas revestidas con cardiolipina fue confirmado por la capacidad del anticuerpo anti-\beta_{2}GPI procedente de conejo para unirse a las nueve proteínas recombinantes.
epítopo(s) antigénico presente sobre el dominio 1 quede libremente accesible a los anticuerpos antifosfolípidos, dependiente de \beta_{2}GPI, pero no cuando \beta_{2}GPI está unida a otras superficies tales como placas no irradiadas y otras muchas marcas de placas de microtitulación. Estos estudios de inhibición confirman publicaciones de otros autores sobre que los anticuerpos antifosfolípidos dependiente de \beta_{2}GPI son capaces de unirse a \beta_{2}GPI en ausencia de fosfolípido. Galli y col. (1990) Lancet 335:1544; Rouby y col. (1995); Arvieux y col., (1991) J. Immunol. Methods 143:223. Las mismas cinco \beta_{2}GPI mutantes recombinantes que producen inhibición en el ensayo de inhibición competitiva, las que contienen el dominio 1, son las mismas que las que se unen a un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI sobre placas revestidas con níquel quelato. Que las proteínas \beta_{2}GPI mutantes recombinantes se unían a las placas revestidas con níquel quelato fue confirmado por la capacidad del anticuerpo anti-\beta_{2}GPI procedente de conejo por unirse a las nueve proteínas recombinantes. Por el contrario, únicamente la proteína \beta_{2}GPI recombinante de longitud completa (es decir, la única proteína recombinante estudiada que contiene tanto el dominio 1 como el dominio 5) pudo ser fácilmente detectada sobre las placas revestidas con cardiolipina. Que las proteínas \beta_{2}GPI mutantes recombinantes se unían a las placas revestidas con cardiolipina fue confirmado por la capacidad del anticuerpo anti-\beta_{2}GPI procedente de conejo para unirse a las nueve proteínas recombinantes.
Tanto los datos de los estudios de inhibición
(Fig. 4) como los datos de los estudios de unión directa, por medio
de las placas revestidas con níquel (Fig. 6), muestran claramente
que la especificidad antigénica de las 13 preparaciones estudiadas
de anticuerpos antifosfolípidos dependiente de \beta_{2}GPI,
está dirigida a un epítopo que se encuentra en el dominio 1 de
\beta_{2}GPI.
La localización de la región de unión al epítopo
en los estudios descritos en el Ejemplo anterior se basó en el uso
de anticuerpos purificados por afinidad procedentes de pacientes con
APS que tienen títulos altos de los anticuerpos. La purificación
por afinidad de anticuerpos relacionados con el APS requiere
pacientes que tengan títulos altos y no se presta fácilmente al
estudio de pacientes con títulos más bajos o de grandes poblaciones
de pacientes. Por lo tanto, los autores de la invención han
desarrollado una estrategia alternativa para evaluar el
dominio(s) de unión a anticuerpo en muestras procedentes de
pacientes con APS, que está basada en suero y que se puede adaptar
fácilmente a la evaluación de un gran número de pacientes.
La Resonancia de Plasmones de Superficie (SPR)
proporciona una medida cuantitativa de la interacción entre una
proteína inmovilizada y un analito soluble. Los estudios actuales
aplican la SPR para medir la interacción entre \beta_{2}GPI
inmovilizada y mutantes de \beta_{2}GPI por deleción de
dominios, con plasma humano procedentes de una cohorte de
individuos normales y de pacientes con APS. Los estudios se
diseñaron para determinar si la inmunodominancia del dominio 1 de
\beta_{2}GPI podría ser generalizada a la población más extensa
de pacientes con APS.
Reactivos. Chips CM5, NHS y EDC y el
tampón de HBS-EP procedieron de BIAcore. La
haptoglobina humana (fenotipo 1-1), una proteína
que contiene el motivo consenso repetido corto encontrado en
\beta_{2}GPI, se inmovilizó en una célula de flujo
independiente sobre el chip y se usó como control negativo.
\beta_{2}GPI recombinante y mutantes de \beta_{2}GPI
recombinantes por deleción de dominios se expresaron en células Tn5
usando el sistema de expresión de proteínas en baculovirus y se
purificaron a partir de los sobrenadantes con una columna de
afinidad por quelación con níquel. Iverson y col. (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:15542-15546. Se
adquirieron muestras de plasma humano normal (George King
Biomedical) o se obtuvieron en el laboratorio. Las muestras de
plasma de pacientes procedentes de individuos a los que se había
diagnosticado un síndrome asociado a la presencia de anticuerpos
antifosfolípidos primario o secundario (a lupus) se obtuvieron
procedentes de varias fuentes clínicas.
Los 55 controles usados en este estudio fueron
derivados procedentes de una muestra heterogénea. En el análisis se
incluyeron 30 muestras de control (15 varones; 15 hembras; edad
media de 34 años, intervalo de edades de 19 - 45 años), adquiridas
procedentes de George King Bio-Medical
(Overland Park, KS), 5 voluntarios locales (3 varones y 2
hembras), 2 muestras de material reunido procedente de fuentes
comerciales y 18 muestras procedentes de donantes de un banco de
sangre de origen desconocido. Las muestras de los pacientes se
recogieron procedentes de varias fuentes e incluyeron a pacientes
con historiales de trombosis venosas, oclusiones arteriales,
oclusiones cerebrovasculares, abortos espontáneos múltiples y
trobocitopenia. Todos los pacientes incluidos en el estudio
presentaron niveles del nivel de
anticuerpo IgG antifosfolípido (GPL) (del inglés, "IgG antiphospholipid antiboby level") \geq 20 en un ensayo interno.
anticuerpo IgG antifosfolípido (GPL) (del inglés, "IgG antiphospholipid antiboby level") \geq 20 en un ensayo interno.
La fracción de IgG total se aisló del plasma
usando bolitas de agarosa-proteína G Immunopure
Plus y tampones para la unión y elución de IgG de
Immunopure conforme a las recomendaciones del fabricante
(Pierce).
Resonancia de Plasmones de Superficie.
Todos los experimentos se realizaron usando un instrumento
BIAcore^{TM} 2000 a 25ºC con una velocidad de flujo de 10
\mul/minuto. El equilibrado de los chips y los estudios de unión
se realizaron con tampón de HBS-EP desgaseado, que
consiste en HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM y
tensioactivo P20 al 0,005% (v/v). El acoplamiento covalente de
ligandos proteicos, a través de sus grupos amino libres, al chip
CM5 se realizó haciendo fluir 40 \mul de NHS 0,05 M / EDC 0,2 M
sobre el chip para activar el chip, seguido de la exposición al
ligando proteico apropiado. La
\beta_{2}GPI(His)_{6} recombinante, mutantes de
\beta_{2}GPI por deleción de dominios y haptoglobina se
inmovilizaron haciendo fluir 50 \mul de una disolución de
concentración de 25 \mug/ml en acetato 10 mM (pH 4,8) sobre el
chip de CM5 activado con NHS. Los grupos reactivos en exceso sobre
la superficie del chip se desactivan luego con 40 \mul de
etanolamina 1 M (pH 8,5). Las muestras de plasma humano (130 \mul)
se diluyeron en proporción 1:1 con HBS-EP, se
hicieron fluir sobre el chip que contenía \beta_{2}GPI, y los
valores de las respuestas se recogieron durante 780 segundos. Los
chips se regeneraron entre las exposiciones a las muestras con 80
\mul de glicina 0,1 M en HCl (pH 2,1), NaCl 0,1 M. Debido a que la
aproximación al equilibrio de la unión fue incompleto durante el
período de la medición, el valor de la unión en el equilibrio
(R_{eq}) se determinó haciendo corresponder las curvas de
asociación a la
siguiente ecuación, usando el programa informático de los fabricantes (BiaEvaluation, versión 2.2, Uppsala, Suecia).
siguiente ecuación, usando el programa informático de los fabricantes (BiaEvaluation, versión 2.2, Uppsala, Suecia).
R_{1} =
R_{eq}(1-e^{-ks(t-t0)})
+
R_{0}
en la que R_{t} es la respuesta
medida en el BIAcore a un tiempo t, R_{eq} es la respuesta en la
meseta del equilibrio, t es el tiempo, t_{0} es el tiempo
inicial, K_{a} es una constante de asociación aparente (K_{s} =
k_{a}C + k_{dis}, en la que k_{a} es la constante de
asociación, C es la concentración del analito y k_{dis} es la
constante de disociación), y R_{0} es una respuesta offset.
En algunos experimentos, las fracciones correspondientes a la IgG
total procedentes de las muestras de plasmas humanos se obtuvieron
de la unión a proteína G y de la elución con ácido desde la
proteína G. El plasma restante después de la unión a proteína G se
mezcló de nuevo con bolitas de proteína G nuevas y se aisló como un
plasma desprovisto de IgG. Las preparaciones de IgG neutralizadas y
el plasma desprovisto de IgG diluido en proporción 1:1 con tampón
se hicieron fluir sobre el chip que contenía \beta_{2}GPI como
se ha descrito en lo que
antecede.
Las \beta_{2}GPI humanas recombinantes que
contiene los dominios 1-5, 2-5 y el
dominio 1 solo se clonaron en vectores de expresión en baculovirus
y se expresaron en células TN5. Partes alícuotas de las proteínas
purificadas se analizaron y cuantificaron mediante análisis de
aminoácidos. Cada una de las proteínas contenía un extremo amino
terminal único y estándares internos permitieron una cuantificación
exacta basada en el análisis de aminoácidos.
La cohorte de pacientes con APS se obtuvo
procedente de muchos centros y consistió en 106 pacientes con GPL
> 20 a los que se les había diagnosticado síntomas del síndrome
asociado a la presencia de anticuerpos antifosfolípidos (APS). Los
historiales clínicos de los pacientes no estaban completos, pero
los historiales clínicos disponibles incluían trombosis venosa,
trombosis arterial, accidentes cerebrovasculares, abortos
espontáneos múltiples, alumbramientos prematuros y trombocitopenia.
Los valores de GPL variaron en el intervalo de 20 - 807 (media
\pm SD, 413 \pm 161) con un valor medio de 77. La población
normal de control consistió en 55 muestras obtenidas de donantes
internos, de muestras comerciales o del banco de sangre de San
Diego.
El suero de los pacientes con APS y de los
controles se diluyó en proporción 1:1 en tampón y se evaluó con
respecto a la unión a una \beta_{2}GPI (D1-5)
inmovilizada. La magnitud de la interacción con
\beta_{2}GPI(D1-5) se muestra en la
Tabla 4. La Req media correspondiente a la
\beta_{2}GPI(D-5) fue 730 y 328, con un
valor de la mediana de 635 y 201 correspondiente a los 106
pacientes con APS y a los 55 pacientes de control respectivamente.
La diferencia entre los pacientes y el grupo de control fue
estadísticamente significativa (p < 0,01, prueba de la t de
Student). La magnitud de la interacción de APS y de un suero de
control con \beta_{2}GPI(D2-5) no fue
diferente entre estos grupos
(Tabla 4).
(Tabla 4).
Se calculó un cociente de selectividad para
describir la unión relativa de las muestras de suero a los mutantes
de \beta_{2}GPI por deleción de dominios que difieren solamente
por la presencia del dominio 1. Este cociente de selectividad se
calculó dividiendo la unión (R_{eq}) a
\beta_{2}GPI(D1-5) entre la unión a
\beta_{2}GPI(D2-5). Se seleccionó
arbitrariamente un factor de 3 o superior definir a los pacientes
que exhiben una interacción preferencial con la proteína natural
que contiene el dominio 1. La magnitud de la interacción tanto con
\beta_{2}GPI(D1-5) como con
\beta_{2}GPI(D2-5) fue baja en el grupo
de control y la mayoría de los pacientes de control no mostraron
selectividad por ninguna de las dos proteínas inmovilizadas (Tabla
4). Por el contrario, el 88% de los pacientes con APS exhibieron
una selectividad \geq 3 veces por la \beta_{2}GPI que contiene
el dominio 1. El 41% (43/106) de los pacientes con APS presentaron
una interacción insignificante con
\beta_{2}-GPI(D2-5)
(R_{eq} < 9), que da como resultado unos cocientes de
selectividad muy altos.
El suero de 10 pacientes que presentaban
cocientes de selectividad de 3 fueron caracterizados aún más para
determinar si las interacciones observadas en el suero podrían ser
atribuidas a la fracción de IgG. Las interacciones de unión de
plasma completo, de plasma desprovisto de IgG y de IgG total con
\beta_{2}GPI(D1-5) se muestran en la
Tabla 5. La retirada de la IgG del suero con proteína G eliminó
esencialmente todas las interacciones de unión específica con las
proteínas inmovilizadas. La fracción que contenía IgG se eluyó con
ácido a partir de la fracción de proteína G y se ensayó con
respecto a la interacción con las proteínas (indicado como "IgG
total" en la Tabla 5; la posterior neutralización diluyó la
fracción correspondiente a IgG en el 50% con respecto al plasma
completo y al plasma desprovisto de IgG). La fracción
correspondiente a IgG sólo mostró interacción con
\beta_{2}GPI(D1-5) y produjo respuestas
de magnitud similar a las de la interacción del suero original con
\beta_{2}GPI(D1-5) (téngase en cuenta la
diferencia en la dilución). Por lo tanto, la unión del suero de los
pacientes selectivos con respecto al el dominio 1, a
\beta_{2}-GPI puede explicarse por la fracción
de IgG en este sistema analítico.
\vskip1.000000\baselineskip
Un subgrupo de los pacientes con APS no
selectivos (cociente de selectividad < 3) se evaluaron nuevamente
para determinar si la unión que presentaban podría ser atribuible a
la fracción de IgG. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Al
igual que en el caso de los pacientes selectivos para el dominio 1,
todas las interacciones con cualquiera de las proteínas
inmovilizadas pudieron ser eliminadas tratando el suero con proteína
G para vaciar la fracción de IgG. La fracción de IgG de los
pacientes pareció reflejar la unión observada en la muestra de suero
original (Tabla 6).
\vskip1.000000\baselineskip
El presente estudio utilizó la resonancia de
plasmones de superficie para localizar el dominio de unión a
anticuerpo en una población grande, de una muestra representativa,
de pacientes con APS (n = 106; GPL \geq 20). Los sueros de los
pacientes con APS exhibieron una unión significativamente mayor a
\beta_{2}GPI que los controles sin APS. Además, la mayoría de
los sueros de los pacientes se unieron a la
\beta_{2}GPI(D1-5) natural en mayor
medida que a un mutante de \beta_{2}GPI por deleción de dominios
que contenía todos los dominios excepto el dominio 1. El 80% de los
pacientes mostró una especificidad de tres veces o más por la
\beta_{2}GPI que contenía el dominio 1 en comparación con la de
un mutante por deleción de dominios que carecía del dominio 1. La
actividad de unión al dominio 1 en el suero de pacientes con APS se
eliminó por completo mediante vaciado del componente IgG y esa
actividad de unión pudo ser reconstituida en su totalidad en la
fracción de IgG. Estos resultados indican que los epítopos
inmunodominantes que intervienen en la unión en la mayoría de los
pacientes con APS están localizados en el dominio amino terminal de
_{2}GPI.
Un aminoácido protegido con
N-\alpha-Fmoc unido a una resina
de Wang se suspendió dos veces en piperidina al 20% en
dimetilformamida (DMF) durante un tiempo total de reacción de 30
minutos para desproteger la amina. Se prepararon hexapéptidos con
una prolina C-terminal con la prolina desprotegida
unida a una resina de clorotritilo en lugar de a la resina de Wang
para prevenir la formación de dicetopiperazina.
La resina se lavó dos veces ambas con DMF y
alcohol metílico. A la resina se añadió una disolución de
N-hidroxibenzotriazol (6 equiv.),
1,3-diisopropilcarbo-diimida (6
equiv.) y del segundo aminoácido (6 equiv.) más un indicador en
DMF. La mezcla de reacción se agitó durante un mínimo de 1,5 horas a
temperatura ambiente. La resina se lavó luego dos veces con DMF y
alcohol metílico. El ensayo de Kaiser (2 gotas de ninhidrina al 5%
en alcohol etílico + 1 gota de piridina + 1 gota de fenol al 80% en
alcohol etílico) se realizó en una pequeña porción de la resina
lavada para comprobar la ausencia de grupo amino libre.
Las etapas de desprotección y de adición de
aminoácido se repitieron hasta finalizar la secuencia. El último
aminoácido se desprotegió de la manera anteriormente explicada para
obtener el grupo amino libre.
Los péptidos se escindieron de la resina con una
disolución de fenol al 7,5% (en peso), etanoditiol al 2,5% (en
volumen), agua al 5% (en volumen) y tioanisol al 5% (en volumen) en
ácido trifluoroacético (TFA). La mezcla se agitó durante un mínimo
de tres horas. El TFA se extrajo usando vacío y el péptido
precipitó y se lavó dos veces con éter. El sólido se disolvió en
acetonitrilo/agua en proporción 1:1 para su análisis. Los péptidos
se caracterizaron mediante LCMS en una columna de C18 (5 \mum, 150
\ring{A}), de 1,0 mm x 150 mm (A: TFA al 0,1%, acetonitrilo al 2%
en agua; B: TFA al 0,08%, agua al 2% en acetonitrilo).
El acetonitrilo y el agua se extrajeron al vacío
o mediante liofilización y los péptidos se conservaron a 0ºC.
Los péptidos que mostraron actividad se
volvieron a preparar a mayor escala y se purificaron usando una
columna C18 (A: TFA al 0,1% en agua; B: TFA al 0,08% en
acetonitrilo).
Placas de microtitulación (MaxiSorp^{TM},
Nalge Nunc International, Dinamarca) se revistieron con 50
\mul de la \beta_{2}GPI recombinante de longitud completa a
una concentración de 10 \mug/ml en bicarbonato 0,1 M, pH 9,5, se
incubaron toda la noche a 4ºC, se lavaron tres veces con PBS 0,15 M,
pH 7,2, y se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con
75 \mul de leche en polvo desnatada al 2% (NFDM al 2%, Carnation).
Inhibidores del ensayo se diluyeron en NFDM al 2% y 25 \mul de
cada una de las diluciones se añadieron a los pocillos revestidos.
Un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI y
purificado por afinidad se diluyó en NFDM al 2% y 25 \mul de
concentración constante de la disolución, se añadieron a los
pocillos, incluso a un grupo de 11 pocillos que no contenían
inhibidor y que hacían de controles positivos. Los contenidos de
los pocillos se mezclaron y las placas se incubaron a 37ºC durante
una hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS y se añadieron
50 \mul de IgG anti-seres humanos conjugada con
fosfatasa alcalina, específica de cadena gamma, (Zymed Núm.
62-8422), diluida convenientemente en NFDM al 2% y
las placas se incubaron a 37ºC durante una hora. Las placas se
lavaron tres veces con PBS, se añadieron 50 \mul de una disolución
del sustrato cromogénico PPMP de la fosfatasa alcalina y las placas
se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La densidad
óptica a 550 nm se determinó leyendo las placas en un aparato
automático de lectura de microplacas (Bio-Teck
Instruments, modelo EL311). El tanto por ciento de inhibición se
determinó dividiendo la OD_{550} obtenida en presencia de
inhibidor entre la OD_{550} media obtenida de los 11 pocillos sin
inhibidor, y multiplicando luego por 100.
Se sintetizaron 74 péptidos y se sometieron a
escrutinio en un ensayo ELISA de inhibición competitiva. Brevemente
expuesto, los péptidos "en crudo", es decir, que no estaban
purificados, se sometieron a escrutinio en dilución 1:2 frente a
tres anticuerpos anticardiolipina diferentes, purificados por
afinidad. Los péptidos que dieron un resultado positivo, en una
dilución 1:2, se volvieron a escrutar luego a diluciones de más del
doble. Veintiocho péptidos, que produjeron inhibición a una
dilución alta, se sintetizaron de nuevo y se purificaron. Estos
péptidos purificados se sometieron después al ensayo de inhibición
competitiva. La \beta_{2}GPI recombinante se ensayó también como
control positivo.
Los resultados, mostrados en la Figura 9,
muestran que algunos de los péptidos impiden que los anticuerpos
anticardiolipina se unan a \beta_{2}GPI. La mayoría de los
péptidos estudiados no produjeron inhibición, confiriendo así un
grado de especificidad a los péptidos que sí produjeron inhibición.
Todos los péptidos positivos excepto dos se agrupan alrededor de
dos grupos de cisteínas unidas por enlaces disulfuro, presentes en
el dominio 1. Esos dos péptidos que no están así agrupados, son
también los que producen la inhibición más pobre. Estas cisteínas
unidas por enlaces disulfuros pueden crear estructuras que son
reconocidas por los anticuerpos antifosfolípidos dependientes
de
\beta_{2}GPI.
\beta_{2}GPI.
Se llevó a cabo una PCR con tendencia al error
de la siguiente manera. Se amplificó el dominio 1 de la
\beta_{2}GPI humana mediante PCR en condiciones que aumentan la
tasa de errores de la Taq polimerasa. Los cebadores fueron de
manera que se amplificaron los aminoácidos 1-64. Se
incorporó un sitio de restricción Sfc 1 como parte del aminoácido
1. En el extremo 3’ se incorporó un sitio de restricción Sal 1
detrás del aminoácido 64. La reacción de PCR se realizó de la
manera descrita por Leung y col. (1989) Technique 1:11,
usando MnCl_{2} 0,25 mM. El producto de la PCR se digirió con Sfc
1 y Sal 1 y se clonó en fd-tet-DOG2
que había sido digerido con Apa 1 y Sal 1. Esto posiciona el
dominio 1 en el extremo N-terminal de pIII
inmediatamente detrás de la secuencia señal de pIII. El resultado
de la reacción de ligación se utilizó para electroporar E.
coli K91. Los fagos se recogieron y se determinó su título
mediante métodos estándar. Los clones de fagos resultantes se
sometieron a ensayo utilizando una técnica de
"micropanning".
"micropanning".
"Micropanning"
Placas de Immulon de tipo 2 se revistieron con
proteína G. La proteína G se preparó a una concentración de 5
\mug/ml en NaHCO_{3} 0,1 M y se añadió una cantidad de 100
\mul por pocillo a los pocillos de las placas de microtitulación
y las placas se incubaron toda la noche a 4ºC. Después de desechar
de las placas la disolución de proteína G en exceso, cada pocillo
se bloqueó con 200 \mul de 2YT durante 1 hora a RT con agitación
sobre una plataforma oscilatoria. Se usó disolución salina tamponada
con Tris, pH 7,4 / Tween 20 al 0,5% (TBS/Tween) junto con un
lavador automático para placas para lavar los pocillos 4 veces con
200 \mul. Cien microlitros de los anticuerpos antifosfolípidos,
dependientes de \beta_{2}GPI 6626, 6501 y 6701, procedentes de
seres humanos, IgG antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI,
procedente de conejo, o IgG normal de control, diluidos hasta una
concentración de 2,5 \mug/ml con 2YT, se añadieron a los pocillos.
La placa se incubó 1 hora a temperatura ambiente sobre una
plataforma giratoria.
Los fagos que se han de utilizar en el ensayo de
"micropanning" se obtuvieron a partir de placas de agar
generadas por "biopanning".Cada uno de los clones a
ensayar se transfirió, usando palillos de dientes esterilizados, a
un pocillo independiente de una placa de microtitulación de 96
pocillos de fondo redondeado (Corning, Corning, NY) que contenía
200 \mul de 2YT/Tet por pocillo y se cultivaron toda la noche a
30ºC. Después de la incubación de toda la noche, los cultivos de
los fagos se centrifugaron usando un soporte para placas de
microtitulación, a 1.300 x g durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Los sobrenadantes constituyeron la fuente del fago
"puros". Los fagos puros se diluyeron en proporciones 1:100 -
1:1.000 y se añadieron 100 \mul a la placa que contenía
anticuerpo 6501 antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI,
unido a proteína G, e IgG normal, preparada según se ha descrito en
lo que antecede. La incubación de los fagos diluidos con anticuerpo
aPL o con IgG de control se llevó a cabo cada 2 horas a temperatura
ambiente sobre un aparato rotatorio plano. Después de 9 lavados con
TBS/Tween en un lavador automático para placas, el fago unido a IgG
se eluyó con 20 \mul de HCl 0,2 N - glicina/BSA al 0,1%, pH 2,2.
La incubación del eluido continuó durante 10 minutos a RT, tiempo
durante el que se preparó una nueva placa de microtitulación Corning
que contenía 20 \mul de E. coli recién privada en cada
pocillo y la placa se mantuvo en frío. Un volumen de 140 \mul de
Tris 29 mM se añadió a la placa que contenía los eluidos con el
fago con el fin de neutralizar el pH, después de lo cual 20 \mul
de la suspensión del fago se transfirió desde cada uno de los
pocillos al correspondiente pocillo de la placa que contenía la
E. coli privada. Después de una incubación de 10 minutos a
37ºC, se añadieron 200 \mul de 2YT, se realizó una incubación
adicional de 30 minutos a 37ºC. Usando pipetas automáticas
multicanales, 8 \mul procedentes de cada pocillo se depositaron
sobre una placa grande de agar-2YT/Tet pero que
conservaba el patrón original de 8 x 12 pocillos y la orientación de
la última placa de microtitulación. Después de dejar secar las
manchas durante 30 minutos, la placa se incubó toda la noche a 30ºC.
Al día siguiente las colonias se valoraron semicuantitativamente
desde 0 hasta 4+, simbolizando el 0 < 10 colonias; 1+ = 10 - 30
colonias; 2+ = desde 30 colonias hasta una confluencia del 70%; 3+ =
una confluencia del 70% - 90%; 4+ = confluencia alcanzada.
Los resultados se muestran en las Tablas 7A y
7B. En el caso de la Tabla 7A, el anticuerpo
anti-\beta_{2}GPI humano procedente de conejo
se procesó en dos ocasiones distintas. Las mutaciones aparecen
listadas con el aminoácido original, el número de la posición, y la
identidad del aminoácido situado en esa posición en el mutante. Por
ejemplo, S31F indica que la Ser de la posición 31 mutó a Phe. El
dominio 1 no mutado tiene un valor de +3, mientras que el fago que
porta el dominio 5 dio un valor -. Las mutaciones silentes no se
muestran. Los clones comienzan en el extremo
N-terminal y van hacia el extremo
C-terminal.
La Tabla 7B representa una expansión del
análisis mutacional, mostrando los mutantes adicionales ensayados
frente a anticuerpos adicionales. Los cuatro últimos clones fágicos
contienen mutaciones indicadas con un asterisco, que indican que el
fago contiene múltiples mutaciones (3A4: D8A, S13T; 3F123: L10I,
P17Q, Y22C; 3G1; R2W, S38T; 4D1: N56T, R63G).
Los resultados indican, inter alia (véase
más adelante, que (a) el ensayo es consistente; (b) no todos los
anticuerpos reaccionan igual; (c) mutaciones diferentes en la misma
posición pueden tener efectos muy diferentes (véase Met 42, por
ejemplo).
Los resultados globales están representados en
el modelo de la estructura terciaria del dominio 1, mostrada en la
Fig. 3. Se observa como los aminoácidos 55-58 (ile,
asn, leu), los aminoácidos 40-45 (que incluyen las
aminoácidos 43-45, en concreto, arg, lys, phe) y el
aminoácido 19 (lys) son importantes para la unión a un anticuerpo
aCL.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Compuesto 1: A una disolución de 1,02 g
(4,37 mmoles) de ácido
N-(t-butoxicarbonil)-iminodiacético
(compuesto 5 en el documento U.S. 5.552.391,
Chemically-defined Non-Polymeric
Valency Platform Molecules and Conjugates Thereof) y 1,01 g
(8,75 mmoles) de N-hidroxisuccinimida en 50 ml de
THF seco, enfriado a 0º, se añadieron 2,26 g (10,94 mmoles) de
diciclohexilcarbodiimida. La mezcla se agitó durante 16 h dejándola
aclimatar lentamente a temperatura ambiente, y una disolución de
2,22 g (10,1 mmoles) de
mono-CBZ-piperazina en 35 ml de THF
se añadió a la mezcla seguida de 1,22 ml (887 mg, 8,75 mmoles) de
Et_{3}N. La mezcla se agitó durante 7 h a temperatura ambiente y
se filtró. El filtrado se concentró y el residuo se disolvió en 125
ml de EtOAc y se agitó con 2 porciones de 125 ml de HCl 1 N, 125 ml
de una disolución saturada de NaHCO_{3}, se secó (MgSO_{4}), se
filtró y se concentró para obtener 2,39 g de un sólido pegajoso. La
purificación mediante cromatografía en gel de sílice
(CH_{2}Cl_{2}/MeOH 95/5) proporcionó 1,85 g (66%) del Compuesto
1.
Compuesto 2: A una disolución de 1,74 g
(2,74 mmoles) del compuesto 1 en 10 ml de CH_{2}Cl_{2}, se
añadieron 10 ml de ácido trifluoroacético, y la mezcla se agitó
durante 3 h a temperatura ambiente. La mezcla se concentró, y el
residuo se disolvió en 5 ml de CH_{2}Cl_{2}. La mezcla se enfrió
a 0º y se añadieron 100 ml de una disolución saturada de
NaHCO_{3}. La mezcla se extrajo después con cuatro porciones de
100 ml de CH_{2}Cl_{2}. Las capas de CH_{2}Cl_{2} se
mezclaron, se secaron (MgSO_{4}), se filtraron, y se concentraron
para obtener 1,46 g (99%) del Compuesto 2 en forma de un sólido
higroscópico pegajoso que se usó directamente en la etapa
siguiente.
Compuesto 3: A una disolución de 0,7 g
(1,3 mmoles) del compuesto 2 y 226 \mul (168 mg, 1,30 mmoles) de
diisopropiletilamina a 0º, se añadió una disolución de 127 \mul de
bis-cloroformiato de trietilenglicol en 4 ml de
CH_{2}Cl_{2} y las mezcla se agitó 3 h a temperatura ambiente.
La mezcla se repartió entre 80 ml de CH_{2}Cl_{2} y 80 ml de
HCl 1 N. La capa de CH_{2}Cl_{2} se lavó con 2 porciones de 80
ml de agua, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para
obtener 736 mg (93%) del compuesto 3 en forma de un sólido
cristalino.
Compuesto 5: El compuesto 3 (61 mg, 0,48
mmoles) se disolvió en 3 ml de HBr al 30% en HOAc y la mezcla
resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, momento
en el que se añadieron 5 ml de Et_{2}O. La mezcla se puso en la
nevera durante 1 h y se centrifugó. El sedimento resultante se lavó
con Et_{2}O y se secó para obtener la sal tetrahidrobromuro 4 que
se disolvió en 1 ml de H_{2}O. A esta mezcla se añadieron 49 mg
(0,58 mmoles de NaHCO_{3} y 3 ml de dioxano. En caso necesario, se
añade más NaHCO_{3} para hacer que la mezcla sea básica. La
mezcla se enfría a 0º y se añaden 748 mg (2,89 mmoles) de anhídrido
bromoacético. La mezcla se agita durante 2 h y se reparte entre 20
ml de H_{2}SO_{4} 1 N y 20 ml de CH_{2}Cl_{2}/MeOH 80/20.
La capa orgánica se seca (Na_{2}SO_{4}), se filtra y se
concentra para obtener un compuesto 5 en crudo que se purifica
mediante cromatografía en gel de sílice (CH_{2}Cl_{2}/MeOH) para
obtener el compuesto 5.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Transaminación del dominio 1 (TA/D1):
Agua y el tampón de acetato sódico se rociaron con helio antes de su
utilización. El dominio 1 (10,55 mg, 1,49 \mumoles) se disolvió
en 0,5 ml de H_{2}O en un tubo de polipropileno y se añadieron
4,0 ml de tampón de NaOAc 2 M pH 5,5. Una disolución de 3,73 mg
(14,9 \mumoles) de CuSO_{4} en 0,5 ml de H_{2}O se añadió a
la mezcla, seguida de una disolución de 2,75 mg (29,9 \mumoles) de
ácido glioxílico en 0,5 ml de tampón de NaOAc 2 M pH 5,5. La mezcla
se mantuvo en atmósfera de nitrógeno y se agitó cuidadosamente
durante 18 h, tiempo al que la reacción mostró haberse completado
mediante una HPLC analítica usando una columna de tipo difenilo, de
4,6 mm x 250 mm, 300 \ring{A}, 5 \mum, (Vydac), con detección a
280 nm (1 ml/min; gradiente B = 25%-45%, 0-20 min,
A = TFA al 0,1% en H_{2}O, B = TFA al 0,1% en CH_{3}CN). Los
tiempos de retención aproximados son los siguientes: D1, 13,2 min;
TA/D1, 13,7 min; TA/D1 oxidado, 13,4 min). La mezcla se diluyó
hasta un volumen de 20 ml con H_{2}O, se filtró y se purificó
mediante HPLC (columna de tipo difenilo, de 22,4 mm x 250 mm, 300
\ring{A}, 10 \mum, (Vydac, Hesperia, CA), (12 ml/min; gradiente
B = 25%-40%, 0-40 min, A = TFA al 0,1% en H_{2}O,
B = TFA al 0,1% en CH_{3}CN). Las fracciones que contenían TA/D1
puro, según se evidenció mediante una HPLC analítica, se reunieron y
se liofilizaron para proporcionar 5,0 mg (48%) de TA/D1.
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4-Nitrofenil-N-(ter-butiloxicarbonil)aminooxi-acetato,
Compuesto 2’: A una disolución agitada de 1,5 g (7,85 mmoles) de
ácido
N-(ter-butiloxicarbonil)aminooxi-acético
(Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO), compuesto 1’, en 35
ml de THF anhidro a 0ºC, se añadieron 1,09 g (7,85 mmoles) de
4-nitrofenol, seguidos de 1,62 g (7,85 mmoles) de
DCC. La mezcla se agitó en atmósfera de nitrógeno durante 0,5 h a
0ºC y a temperatura ambiente durante 18 h. La mezcla se filtró para
separar la diciclohexilurea, y el filtrado se concentró y se
purificó mediante cromatografía en gel de sílice
(CHCl_{3}/alcohol isopropílico 95/5) para proporcionar 2,30 g
(94%) del compuesto 2’ en forma de un sólido blanco: ^{1}H NMR
(CDCl_{3}) \delta 1,51(s, 9H), 4,73(s, 2H),
7,36(d, 2H), 7,73(s, 1H), 8,32(d, 2H).
Síntesis de una plataforma de AOA/PITG
protegida con BOC, Compuesto 4’: El compuesto 3 (300 mg, 0,235
mmoles) se trató con 1,5 ml de una disolución al 30% de HBr en ácido
acético durante 30 min. La sal HBr de la tetra-amina
resultante se precipitó mediante adición de dietil éter. La mezcla
se centrifugó, y el sobrenadante se separó y se desechó. El sólido
remanente se lavó con éter, se secó al vacío y se disolvió en 9 ml
de DMF. A la mezcla resultante se añadieron 294 \mul (1,69 mmoles)
de diisopropiletilamina seguidos de una disolución de 410 mg (1,31
mmoles) del compuesto 2 en 3 ml de DMF. La mezcla se agitó en
atmósfera de nitrógeno durante 4 h y se repartió entre
CHCl_{3}/MeOH 15/1 y salmuera. La capa acuosa se lavó dos veces
con CHCl_{3}/MeOH 15/1, y las capas orgánicas mezcladas se
secaron (Na_{2}SO_{4}) y se concentraron para dar 680 mg de un
aceite. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice
(CHCl_{3}/MeOH en gradiente discontinuo desde 95/5 hasta 75/25)
para dar 215 mg (65%) del compuesto 4’ en forma de un sólido blanco:
^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 1,49(s, 36H),
3,40-3,73(m, 40H), 4,24(m, 12H),
4,59(singletes solapantes, 8H), 8,21(d, 2H),
8,32(s,2H).
Plataforma AOA/PITG, Compuesto 5’: Se
burbujeó HCl gas a través de una disolución agitada de 67 mg (0,047
mmoles) del compuesto 4’ en EtOAc/CHCl_{3}/MeOH 10/1/1 durante 15
min y la mezcla se agitó durante otros 15 min. La mezcla se
concentró al vacío y se mantuvo al vacío durante 16 h para
proporcionar 43 mg (78%) del compuesto 5’ en forma de un sólido
blanco: ^{1}H NMR (DMSO) \delta
3,33-3,67(m, 40H), 4,08(m, 4H),
4,18(s, 8H), 4,90(s, 8H); espectro de masas (ES), m/z
calculado para C_{40}H_{69}N_{14}O_{18}: 1.033. Encontrado
1.033.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de un conjugado tetravalente de D1,
Compuesto 44: Se disolvió TA/DI (0,90 mg, 1,28 x 10^{-7}
moles) en 250 \mul de acetato sódico 0,1 M pH 4,60, en un tubo de
polipropileno. A la mezcla se añadieron 16,6 \mul (18,9 \mug,
1,60 x 10^{-8} moles) de una disolución de la plataforma AOA/PITG,
compuesto 5’, de concentración 0,97 \mumoles/ml, en acetato
sódico 0,1 M pH 4,6. La mezcla se agitó cuidadosamente en atmósfera
de nitrógeno durante 6 días, tiempo al que la reacción mostró
haberse completado mediante una HPLC analítica usando una columna
de tipo difenilo, de 4,6 mm x 250 mm, 300 \ring{A}, 5 \mum,
(Vydac), con detección a 280 nm (1 ml/min; gradiente B = 25%-45%,
0-20 min, A = TFA al 0,1% en H_{2}O, B = TFA al
0,1% en CH_{3}CN). Los tiempos de retención aproximados son los
siguientes: TA/D1, 13,7 min; compuesto 44, 17,2 minutos). La mezcla
se diluyó con agua/acetonitrilo 95/5 hasta un volumen de 1 ml y se
purificó mediante HPLC (columna de tipo difenilo, de 10 mm x 250
mm, 300 \ring{A}, 5 \mum, (Vydac) (3 ml/min; gradiente B =
25%-45%, 0-40 min, A = TFA al 0,1% en H_{2}O, B =
TFA al 0,1% en CH_{3}CN). Las fracciones que contenían el
conjugado puro, compuesto 44, según se evidencia mediante una HPLC
analítica, se reunieron y se liofilizaron para proporcionar 0,4 mg
(25%) del compuesto 44, de masas (ES), m/z promedio) calculado para
C_{1320}H_{2032}N_{338}O_{370}S_{20}: 29.198. Encontrado
29.218.
Síntesis del conjugado formado por la
plataforma tetramérica AOTEG/DEA/DEG y un polipéptido del dominio 1
de \beta_{2}GPI
2-[2-(2-yodoetoxi)etoxi]etanol,
Compuesto 7: Se disolvieron
2-[2-(2-cloroetoxi)etoxi]etanol (12,66
g, 75,1 mmoles) y yoduro sódico (33,77 g, 225,3 mmoles) en 250 ml
de acetona. Un condensador de reflujo se conectó al matraz, y la
mezcla se calentó a reflujo durante 18 h. Una vez enfriada, la
mezcla se concentró, y el residuo se agitó con 400 ml de
CH_{2}Cl_{2} y con una mezcla de 300 ml de agua y 100 ml de una
disolución acuosa y saturada de bisulfito sódico. La capa acuosa se
lavó dos veces con porciones de 400 ml de CH_{2}Cl_{2} y las
capas de CH_{2}Cl_{2} mezcladas se secaron (MgSO_{4}), se
filtraron y se concentraron para dar 18,3 g (94%) del compuesto 7
en forma de un aceite amarillo claro que se usó en la etapa
siguiente sin más purificación: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta
2,43(brd s, 1H), 3,28(t, 2H), 3,61(m, 2H),
3,68(s, 4H), 3,78(m, 4H); espectro de masas (ES), m/z
calculado para C_{6}H_{13}O_{3}INa (M+Na)^{+}: 283,0.
Encontrado 283,0.
2-[2-(2-N-(ter-butiloxicarbonil)aminooxietoxi)
etoxi]etanol, Compuesto 8: A 5,85 g (1,50 mmoles) de
2-[2-(2-yodoetoxi)etoxi]etanol,
Compuesto 7, se añadieron 2,00 g (1,00 mmoles) de
N-(ter-butiloxicarbonil)hidroxilamina
(Aldrich Chemical Co.) y 3,36 ml (3,42 g, 1,50 mmoles) de
DBU. La mezcla se agitó para dar un líquido viscoso que se volvió
caliente al tacto y se colocó en un baño de aceite a 55ºC durante 18
h, dando como resultado la formación de un precipitado blanco que
solidificó la mezcla. La mezcla se disolvió en 20 ml de
CH_{2}Cl_{2} y se añadió a 500 ml de EtOAc removido, dando como
resultado la formación de un precipitado que se separó mediante
filtración, y el filtrado se concentró para dar un aceite de color
amarillo pardo. La purificación se realizó mediante una
cromatografía rápida (acetona al 50% en hexano) para obtener 2,61 g
(67%) del Compuesto 8 en forma de un aceite: ^{1}H NMR
(CDCl_{3}) \delta 1,50(s, 9H), 3,65(t, 2H),
3,70(brd s, 4H), 3,76(m, 4H), 4,06(t, 2H),
7,83(brd s, 1H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 28,0
61,3 68,9 70,1 70,3 72,5 72,6 75,1 81,2 157,1.
Bromuro de
2-[2-(2-N-(ter-butiloxicarbonil)amino-oxietoxi)etoxi]etilo,
Compuesto 9: Se añadió bromo (aproximadamente 0,283 mmoles)
gota a gota a una disolución de 50 mg (0,188 mmoles) del compuesto
8, 74 mg (0,283 mmoles) de trifenilfosfina y 31 \mul (30 mg,
0,377 mmoles) de piridina en 2 ml de CH_{2}Cl_{2} hasta obtener
un color naranja persistente. La mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante 0,5 h, y 1 ml de una disolución saturada de
bisulfito sódico se añadió para inactivar el bromo en exceso. La
mezcla se repartió luego entre 10 ml de H_{2}O y 2 x 15 ml de
EtOAc. Las capas orgánicas mezcladas se lavaron con salmuera, se
secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se concentraron. La
purificación del residuo mediante cromatografía en gel de sílice
(acetona/hexano 35/65) proporcionó 54 mg del compuesto 9 en forma de
un aceite: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 1,49(s, 9H),
3,48(t, 2H), 3,68(s, 4H), 3,73(m, 2H),
3,84(t, 2H), 4,03(t, 2H), 7,50(s, 1H);
^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 28,3 30,4 69,4 70,6 (dos
señales), 71,3 75,5, 81,7, 156,9.
Síntesis a partir del compuesto 9: Una
disolución de 100 mg (0,305 mmoles) del compuesto 9 en 0,25 ml de
DMF anhidro se añadió a una disolución de 159 mg (2,44 mmoles) de
azida sódica en 0,5 ml de DMF anhidro. Un volumen adicional de 0,25
ml de DMF se usó para arrastrar al compuesto 9 residual al interior
de la mezcla de reacción, y la mezcla se calentó a 115ºC durante 3
h. Cuando se hubo enfriado, la mezcla se repartió entre 3 ml de
H_{2}O y 4 x 3 ml de CH_{2}Cl_{2}. Las capas orgánicas
mezcladas se lavaron con 10 ml de H_{2}O, se secaron
(Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se concentraron para dar un
aceite amarillo. La purificación mediante cromatografía en gel de
sílice (acetona/hexano 35/65) proporcionó 67 mg (76%) del compuesto
10 en forma de un aceite: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta
1,47(s, 9H), 3,41(t, 2H), 3,69(brd s, 4H),
3,73(m, 4H), 4,03(t, 2H), 7,50(s, 1H);
^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 28,1 50,5 69,1 70,1 70,4 (dos
señales), 75,2 81,3 156,7.
Síntesis del compuesto 10 a partir del
compuesto 13: A una disolución de 258 mg (0,69 mmoles) del
compuesto 13 en 5 ml de DMF en atmósfera de nitrógeno, se añadieron
358 mg (5,50 mmoles) de azida sódica. La mezcla se removió durante
18 horas a temperatura ambiente, se añadieron 100 ml de agua y la
mezcla se extrajo con 3 x 50 ml de EtOAc. Las capas de EtOAc se
mezclaron y se lavaron con 50 ml de agua, se secaron (MgSO_{4}),
se filtraron y se concentraron para dar 294 mg de un aceite
incoloro. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice
(acetona/hexanos 30/70) proporcionó el compuesto 10 en forma de un
aceite incoloro.
Compuesto 11:
(MR-508-128) El compuesto 10 (1,36
g, 4,70 mmoles) y trifenilfosfina (1,48 g, 5,64 mmoles) se
disolvieron en 24 ml de THF y 8 ml de H_{2}O, y la disolución
resultante se removió a temperatura ambiente durante 2 horas. Se
añadieron aproximadamente 160 \mul (ocho gotas) de NaOH 1 N y la
mezcla se agitó durante 18 horas. La mezcla se concentró al vacío,
y el concentrado se purificó mediante cromatografía en gel de sílice
(80/8/2 CH_{3}CN/H_{2}O/NH_{4}OH) para dar 1,16 g (94%) del
compuesto 11 en forma de un aceite amarillo: ^{1}H NMR
(CDCl_{3}) \delta 1,50(s, 9H), 1,90(brd, 2H),
2,88(t, 2H), 3,56(t, 2H), 3,65(m, 4H),
3,71(m, 2H), 4,01(m, 2H).
1,2-Bis(2-yodoetoxi)etano,
compuesto 12: Una disolución de 10,0 g (5,3 mmoles) de
1,2-bis(2-cloroetoxi)etano
(Aldrich Chemical Co.) y 16,0 g (107 mmoles) de yoduro
sódico en 110 ml de acetona se calentaron a reflujo durante 18 h.
La mezcla se concentró y el residuo se trituró con CHCl_{3} para
disolver el producto mientras que las sales permanecieron sin
disolver. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró para dar un
aceite de color naranja. La purificación mediante cromatografía en
gel de sílice (en gradiente discontinuo, desde EtOAc/hexanos 10/90
hasta EtOAc/hexanos 15/85) para dar 17,8 g (90%) de un aceite de
color naranja: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 3,28(t,
4H), 3,67(s, 4H), 3,78(t, 4H); ^{13}C NMR
(CDCl_{3}) \delta 3,6 70,5 72,2.
Compuesto 13: Se añadió DBU (284 \mul,
290 mg, 1,90 mmoles) a una mezcla de 266 mg (2,0 mmoles) de
N-ter-butiloxicarbonil)hidroxilamina
(Aldrich Chemical Co.) y 2,96 g (8,0 mmoles) del compuesto
12, y la mezcla se tapó y se agitó hasta hacerla homogénea.
Pasados 15 minutos la mezcla solidificó y se dejó reposar durante 45
minutos. A la mezcla se añadieron 5 ml de CH_{2}Cl_{2} y la
mezcla se agitó de nuevo para disolver los sólidos. La disolución
resultante se añadió a 200 ml de EtOAc. Se añadió un volumen
adicional de 50 ml de EtOAc y la mezcla se filtró para separar los
sólidos. El filtrado se concentró para dar un aceite que se repartió
entre 100 ml de EtOAc y 3 x 50 ml de una disolución de HCl 1 N. La
capa de EtOAc se lavó con 2 x 50 ml de NaOH 1 N seguido de 2 x 50 ml
de una disolución de bisulfito sódico al 5% y se concentró para dar
2,6 g de un aceite amarillo. La purificación mediante cromatografía
en gel de sílice (gradiente discontinuo, EtOAc/hexanos desde 20/80
hasta 45/55 dio 515 mg (69%) del compuesto 13 en forma de un aceite
amarillo: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 1,50(s, 9H),
3,28(t, 2H), 3,68(s, 4H), 3,72(m, 4H),
4,02(t, 2H), 7,72(s, 1H); ^{13}C NMR (CDCl_{3})
\delta 2,9 28,3 68,9 69,4 70,2 70,6 72,0 75,4 81,6
156,9.
Bis-4-nitrofenilcarbonato
de dietilenglicol, Compuesto 60: Piridina (30,5 ml, 377 mmoles)
se añadió lentamente a una disolución enfriada a 0ºC de 5,0 g
(47,11 mmoles) de dietilenglicol y 23,74 g (118 mmoles)
4-nitrofenilcloroformiato en 500 ml de THF. El baño
refrigerante se retiró y la mezcla se removió durante 18 horas a
temperatura ambiente. La mezcla se volvió a enfriar a 0ºC, se
acidificó con HCl 6 N y se repartió entre 400 ml de HCl 1 N y 2 x
400 ml de CH_{2}Cl_{2}. Las capas orgánicas mezcladas se secaron
(MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron para dar 24,3 g de un
sólido blanco. La cristalización en el seno de hexanos/EtOAc
proporcionó 16,0 g (78%) del compuesto 37 en forma de polvo blanco:
p.f. 110ºC; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 3,89(t, 4H),
4,50(t, 4H), 7,40(d, 4H), 8,26(d, 4H).
Compuesto 61: Una disolución de 2,5 g
(5,73 mmoles) del compuesto 37 en 17 ml de piridina se añadió a una
disolución enfriada a 0ºC de 1,8 g (17,2 mmoles) de dietanolamina en
3 ml de piridina. El baño refrigerante se retiró y la mezcla se
removió durante 5 horas a temperatura ambiente para obtener el
compuesto 38, que no se aisló sino que se utilizó tal como estaba
en la siguiente etapa.
Compuesto 14: La mezcla resultante de la
etapa anterior se volvió a enfriar a 0ºC, se añadieron 40 ml de
CH_{2}Cl_{2} seguidos de una disolución de 11,55 g (57,3 mmoles)
de 4-nitrofenilcloroformiato en 60 ml de
CH_{2}Cl_{2} y la mezcla se removió durante 18 horas a
temperatura ambiente. La mezcla se volvió a enfriar a 0ºC, se
acidificó con HCl 1 N y se repartió entre 300 ml de HCl 1 N y 2 x
200 ml de CH_{2}Cl_{2}. Las capas orgánicas mezcladas se
secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron para dar 13,6 g
de un sólido amarillo. La purificación mediante cromatografía en
gel de sílice (CH_{2}Cl_{2}/MeOH y EtOAc/hexanos) proporcionó
4,91 g (83%) del compuesto 39 en forma de un sólido amorfo y
pegajoso: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 3,72(m, 12H),
4,31(t, 4H), 4,48(m, 8H), 7,40(m, 8H),
8,29(m, 8H).
\vskip1.000000\baselineskip
Plataforma AOTEG/DEA/DEG protegida con BOC,
Compuesto 15: Se añadió trietilamina (157 \mul, 114 mg, 1,13
mmoles) a una disolución en agitación de 193 mg (0,188 mmoles) del
compuesto 14 (preparado según se ha descrito en lo que antecede y
en el documento U.S. Núm. de serie 60/111.641, presentado el 9 de
diciembre de 1.998), seguida de 298 mg (1,13 mmoles) del compuesto
11. Se dejó que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente y se
removió toda la noche. La mezcla se enfrió a 0ºC, se acidificó con
HCl 1 N y se repartió entre 20 ml de HCl 1 N y 4 x 20 ml de
CH_{2}Cl_{2}. Las capas orgánicas mezcladas se lavaron con una
disolución saturada de NaHCO_{3}, se secaron (MgSO_{4}), se
filtraron y se concentraron para dar 279 mg de un aceite amarillo.
La purificación mediante cromatografía en gel de sílice
(CH_{2}Cl_{2}/MeOH 97/3) proporcionó 138 mg (48%) del compuesto
15 en forma de un aceite: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta
1,49(s, 36H), 3,35(m, 8H),
3,46-3,78(m, 44H), 4,04(t, 8H),
4,21(m, 12H), 5,80(m, 4H). 7,91(s, 4H);
espectro de masas (ES), m/z calculado para
C_{62}H_{117}N_{10}O_{33} (M+H)^{+}: 1.528,8.
Encontrado: 1.528,5.
Compuesto 16: El compuesto 15 (60 mg,
39,2 \mumoles) se disolvió en 10 ml de ácido trifluoroacético/
CH_{2}Cl_{2} 1/9 y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente
durante 3 h. Se utilizó una corriente suave de nitrógeno para
evaporar el disolvente, y el residuo se disolvió en una cantidad
mínima del disolvente de la cromatografía (NH_{4}OH
concentrado/H_{2}O/CH_{3}CN 5/7,5/87,5) que se usó para cargar
la muestra en una columna de gel de sílice. La purificación
mediante cromatografía en gel de sílice (gradiente discontinuo,
NH_{4}OH concentrado/H_{2}O/CH_{3}CN desde 5/7,5/87,5 hasta
5/10/85) proporcionó 36 mg (82%) del compuesto 16 en forma de un
aceite incoloro: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 3,37(m,
8H), 3,58(m, 16H), 3,67(s, 16H), 3,71(m, 12H),
3,86(m, 8H), 4,17-4,29(m, 12H),
4,93(brd, 8H), 5,91(m, 4H); ^{13}C NMR (CDCl_{3})
\delta 40,9 47,7 48,2 62,9 64,7 69,4 69,6 70,02 70,3 70,5
74,8 156,1 156,6; espectro de masas (ES), m/z calculado para
C_{42}H_{85}N_{10}O_{25} (M+H)^{+}: 1.129.
Encontrado: 1.129.
Con el fin de comprobar la pureza con una HPLC
analítica, se preparó una tetra-acetona oxima de la
siguiente manera. El compuesto 16 (0,38 mg, 0,34 \mumoles) se
disolvió en 240 \mul de tampón de NaOAc 0,1 M en un vial para
muestras para HPLC. A la disolución se añadieron 10 \mul de una
disolución de 49 \mul de acetona en 2,0 ml de tampón de NaOAc 0,1
M. La mezcla se dejó reposar 1 h y se analizó una parte alícuota
mediante HPLC (columna de C_{18}, de 4,6 mm, 1 ml/min, detección
a 210 nm, gradiente B = 10%-60% durante 20 min, A = TFA al 0,1% en
H_{2}O, B = TFA al 0,1% en CH_{3}CN, t_{R} = 19 min); espectro
de masas del eluyente recogido (ES), m/z calculado para
C_{54}H_{101}N_{10}O_{25} (M+H)^{+}: 1.289.
Encontrado 1.289.
Síntesis del conjugado tetravalente de D1,
Compuesto 45: TA/DI (5,20 mg, 7,37 x 10^{-7} moles) se
disolvió en 2,0 ml de tampón de acetato sódico 0,1 M, pH 6,60,
rociado con He, en un tubo de polipropileno. A la mezcla se
añadieron 15,07 \mul (139 \mug, 1,23 x 10^{-7} moles) de una
disolución de la plataforma AOTEG/DEA/DEG, compuesto 16, en
concentración de 8,147 \mumoles/ml, en tampón de acetato sódico
0,1 M pH 4,60. La mezcla se agitó suavemente en atmósfera de
nitrógeno durante 23 horas, tiempo al que la reacción pareció
haberse completado mediante una HPLC analítica usando una columna
de tipo difenilo, de 4,6 mm x 250 mm, 300 \ring{A}, 5 \mum,
(Vydac), con detección a 280 nm (1 ml/min; gradiente B = 25%-45%,
0-20 min, A = TFA al 0,1% en H_{2}O, B = TFA al
0,1% en CH_{3}CN). Los tiempos de retención aproximados son los
siguientes: TA/D1, 13,7 min; compuesto conjugado 45, 17,2 min. La
mezcla se diluyó con agua hasta alcanzar un volumen de 5 ml y se
purificó mediante HPLC (columna de tipo difenilo, de 10 mm x 250
mm, 300 \ring{A}, 10 \mum, (Vydac), (3 ml/min; gradiente B =
25%-45%, 0-40 min, A = TFA al 0,1% en H_{2}O, B =
TFA al 0,1% en CH_{3}CN). Las fracciones que contenían el
compuesto conjugado 45 puro, según se evidenció mediante la HPLC
analítica, se reunieron y se liofilizaron para proporcionar 1,73 mg
(48%) del compuesto conjugado 45: espectro de masas (ES, m/z
promedio) calculado para
C_{1322}H_{2048}N_{334}O_{377}S_{20}: 29.294. Encontrado:
29.294.
Preparación del conjugado tetravalente de D1
a través de la alquilación de la Cys quinta con una plataforma de
tipo alquilhaluro, Compuesto 65: El dominio 1 contiene cuatro
cisteínas que están en forma oxidada, y el dominio 1 correctamente
plegado contiene dos enlaces disulfuro. Una quinta cisteína pueda
estar incluida en cualquiera de las posiciones del extremo
N-terminal o del extremo C-terminal
por fuera de las cisteínas naturales. En este ejemplo se incluye
una quinta cisteína que es natural para el dominio segundo de
\beta_{2}GPI. Se puede usar una quinta cisteína, en virtud de
su grupo sulfidrilo libre, para que reaccione con una plataforma
diseñada para reaccionar con grupos sulfidrilos. Una plataforma de
ese tipo es una plataforma de tipo haloacetilo tal como un compuesto
23.
El D1 que contiene la quinta Cys (cuatro
equivalentes) se disuelve en tampón de borato sódico 100 mM, pH 8,0,
rociado con helio. La disolución se mantiene en atmósfera de
nitrógeno y se añade una disolución de una plataforma
bromoacetilada, compuesto 23 (1 equivalente). La mezcla se remueve
hasta que la reacción se completa, y la purificación de la muestra
mediante una HPLC preparativa proporciona un conjugado tetravalente,
compuesto 65.
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Síntesis de una plataforma AOTEG/PIZ/DEA/DEG,
Compuesto 17: Piridina (610 \mul, 596 mg, 7,54 mmoles) se
añadió lentamente a una disolución en agitación de 500 mg (1,88
mmoles) del compuesto 8 y de 760 mg (3,77 mmoles) de
p-nitrofenilcloroformiato en 14 ml de
CH_{2}Cl_{2} y la mezcla se removió a temperatura ambiente
durante 18 horas. La mezcla se enfrió a 0ºC y se acidificó con una
disolución acuosa de HCl 1 N. La mezcla resultante se repartió
entre 100 ml de la disolución acuosa de HCl 1 N y 3 x 100 ml de
CH_{2}Cl_{2}. Las capas orgánicas mezcladas se secaron
(MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron para dar 1,05 g de un
sólido pegajoso. La purificación mediante una cromatografía en gel
de sílice (hexanos/EtOAc 6/4) proporcionó 505 mg (62%) del
compuesto 17 en forma de un aceite ligeramente amarillo: ^{1}H NMR
(CDCl_{3}) \delta 1,47(s, 9H),
3,67-3,78(m, 6H), 3,80(m, 2H),
4,02(m, 2H), 4,48(m, 2H), 7,40(d, 2H),
7,50(s, 1H), 8,29(d, 2H); espectro de masas (ES), m/z
calculado para C_{18}H_{26}N_{2}O_{10}Na (M+Na): 453,1.
Encontrado: 453,0.
Plataforma AOTEG/PIZ/DEA/DEG protegida con
BOC, Compuesto 19: A una disolución del compuesto 18 (preparada
según se describe en el documento U.S. Núm. de serie 60/111.641,
presentado el 9 de diciembre de 1.998) en una mezcla formada por
una disolución acuosa de bicarbonato sódico y dioxano, se añade una
disolución de cuatro equivalentes del compuesto 17 en dioxano. Una
vez completada la reacción, la mezcla se reparte entre agua y
CH_{2}Cl_{2}. La capa de CH_{2}Cl_{2} se concentra, se seca
y se purifica mediante cromatografía en gel de sílice para dar el
compuesto 19.
Plataforma AOTEG/PIZ/DEA/DEG, Compuesto
20: Los grupos protectores BOC se retiran del compuesto 19 de
manera esencialmente similar a la descrita en la preparación del
compuesto 16, para dar el compuesto 20.
Síntesis de una plataforma AOTEG/SA/AHAB/TEG,
S-acetil-2-[2-(2-N-ter-butiloxicarbonilaminooxietiloxi)etoxi]-etilmercaptano,
Compuesto 21a: A una disolución de 500 mg (1,52 mmoles) del
compuesto 9a en 30 ml de acetona, se añadieron 191 mg (1,68 mmoles)
de tioacetato potásico (Aldrich Chemical Co.). La mezcla se
removió a temperatura ambiente durante 18 horas y el precipitado
resultante se separó mediante filtración. El filtrado se concentró
y se repartió entre 300 ml de EtOAc y 2 x 80 ml de salmuera. La capa
de EtOAc se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró para
dar 460 mg (93%) de un compuesto 21a en forma de un aceite de color
marrón claro: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 1,48(s, 9H),
2,35(s, 3H), 3,12(t, 2H), 3,61(t, 2H),
3,64(m, 4H), 3,73(m,2H), 4,02(m, 2H),
5,52(s, 1H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 28,3 28,8
30,6 69,3 69,8 70,2 70,5 75,3 81,5 156,8 195,3.
2-[2-(2-N-ter-butiloxicarbonilaminooxietiloxi)
etoxi]-etilmercaptano, Compuesto 22a: El
compuesto 21a se trata con una disolución de NH_{4}OH 6 N
/CH_{3}CN 4/1, rociada con nitrógeno, en atmósfera de nitrógeno,
durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se concentra al
vacío para proporcionar el compuesto 22a que se puede usar sin más
purificación.
Plataforma AOTEG/SA/AHAB/TEG protegida con
BOC, Compuesto 24a: El compuesto 23 (preparado según se
encuentra descrito; Jones y col. J. Med. Chem. 1995, 38,
2138-2144) se añade una disolución de cuatro
equivalentes del compuesto 22a en H_{2}O/CH_{3}CN 10/90 rociada
con nitrógeno. A la disolución resultante se añaden cuatro
equivalentes de diisopropilamina. Una vez completada la reacción, la
mezcla se reparte entre agua y CH_{2}Cl_{2}. La capa de
CH_{2}Cl_{2} se concentra, se seca y se purifica mediante
cromatografía en gel de sílice para dar el compuesto 24a.
Plataforma AOTEG/SA/AHABA/TEG, Compuesto
25a: Los grupos protectores BOC se retiran del compuesto 24a de
manera esencialmente similar a la descrita en la preparación del
compuesto 16, para dar el compuesto 25a.
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siguiente)
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Síntesis de una plataforma AOHEX/SA/AHAB/TEG,
1-yodo-6-(N-ter-butiloxicarbonil)aminooxihexano,
Compuesto 9b: A una mezcla heterogénea de 140 mg (1,05 mmoles)
de
N-ter-butiloxicarbonil)hidroxilamina
(Aldrich Chemical Co.) y de 658 \mul (1,35 mg, 4,0 mmoles)
del compuesto 12, se añadieron 149 \mul (152 mg, 1,0 mmoles) de
DBU. La mezcla se removió a temperatura ambiente durante 30
segundos, tiempo al que la mezcla de reacción solidificó. La masa
sólida se dejó reposar toda la noche y se disolvió en 50 ml de
CH_{2}Cl_{2}. La disolución se lavó con 2 x 25 ml de NaOH 1 N y
con 3 x 25 ml de HCl 1 N. Las capas acuosas básicas mezcladas se
extrajeron con 25 ml de CH_{2}Cl_{2} y las capas acuosas ácidas
mezcladas se extrajeron con 25 ml de CH_{2}Cl_{2}. Las capas de
CH_{2}Cl_{2} mezcladas se secaron (Na_{2}SO_{4}), se
filtraron y se concentraron para dar un aceite amarillo. La
purificación mediante cromatografía en gel de sílice (gradiente
discontinuo, EtOAc/hexanos/MeOH desde 1/99/0,1 hasta 15/85/0,1)
proporcionó 216 mg (68%) del compuesto 9b en forma de un aceite
amarillo: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 1,40(m, 4H),
1,48(s, 9H), 1,62(m, 2H), 1,83(m, 2H),
3,20(t, 2H), 3,84(t, 2H), 7,10(s, 1H).
S-acetil-6-(N-ter-butiloxicarbonil)aminooxihexano
-1-tiol, Compuesto 21b: El compuesto 9b (209
mg, 0,61 mmoles) se añadió a una disolución de tioacetato potásico
en 15 ml de acetona y la mezcla se removió a temperatura ambiente
durante 18 horas. La acetona se extrajo al vacío y el residuo se
repartió entre 50 ml de CH_{2}Cl_{2} y 3 x 25 ml de NaOH 1 N.
La capa de CH_{2}Cl_{2} se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y
se concentró para dar un aceite de color marrón. La purificación
mediante cromatografía en gel de sílice (EtOAc/hexanos 15/85)
proporcionó 166 mg (94%) del compuesto 21b en forma de un aceite
incoloro: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 1,39(m, 4H),
1,48(s, 9H), 1,59(m, 4H), 2,32(s, 3H),
2,86(t, 2H), 3,82(t, 2H), 7,10(s, 1H).
6-(N-ter-butiloxicarbonil)aminooxihexano-1-tiol,
Compuesto 22b: Una muestra purificada del compuesto 22b se
preparó de la siguiente manera. El compuesto 21b (50 mg, 172
\mumoles) y 22 \mul (17,4 mg, 85,8 \mumoles) de
tri-n-butilfosfina se pusieron en
atmósfera de nitrógeno, y 2 ml de una disolución de NaOH 1 M
rociada con nitrógeno se añadió a la mezcla. La mezcla se removió
durante 18 horas a temperatura ambiente y se añadieron 172 \mul
(180 mg, 3 mmoles) de ácido trifluoroacético. La mezcla se repartió
entre 25 ml de EtOAc y 3 x 25 ml de HCl 1 N. Las capas acuosas
mezcladas se extrajeron con 25 ml de EtOAc, se secaron
(Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se concentraron para dar un
aceite. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice
(EtOAc/hexanos/MeOH 15/85/0,1) proporcionó 28 mg del compuesto 22b
en forma de un aceite incoloro: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta
1,32(t, 1H), 1,40(m, 4H), 1,49(s, 9H),
1,62(m, 4H), 2,53(d de t, 2H), 3,84(t, 2H),
7,09(s, 1H).
Plataforma AOHEX/SA/AHAB/TEG protegida con
BOC, Compuesto 24b: El compuesto 21b (13 mg, 45 \mumoles) y 6
\mul (4,5 mg, 22,3 \mumoles) de
tri-n-butilfosfina se pusieron en
atmósfera de nitrógeno y 3 ml de una disolución de NH_{4}OH
6N/CH_{3}CN 4/1 se añadieron a la mezcla. La mezcla se removió
durante 1 hora a temperatura ambiente y se concentró al vacío. El
residuo se disolvió en 3 ml de una disolución de agua/CH_{3}CN
10/90 rociada con nitrógeno. A la disolución resultante, que se
mantuvo en atmósfera de nitrógeno, se añadieron 10 mg (7,44
\mumoles) del compuesto 23, seguidos de 8 \mul (5,77 mg, 44,6
\mumoles) de diisopropiletilamina. La mezcla se removió durante
18 horas y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante
cromatografía en gel de sílice (gradiente discontinuo de muchas
etapas, MeOH/CH_{2}Cl_{2} desde 1/99 hasta 5/95, desde 5/95
hasta 7,5/92,5, desde 7,5/92,5 hasta 10/90 y desde 10/90 hasta
15/85) para dar 14 mg (93%) del compuesto 24b en forma de un aceite
incoloro: TLC (MeOH/CH_{2}Cl_{2} 10/90), Rf = 0,3; espectro de
masas (ES), m/z calculado para
C_{92}H_{173}N_{14}O_{26}S_{4} (M+H): 2.018. Encontrado:
2.018.
Plataforma AOHEX/SA/AHAB/TEG, Compuesto
25b: Los grupos protectores BOC se retiran del compuesto 24b de
manera esencialmente similar a la descrita en la preparación del
compuesto 16.
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Síntesis de una plataforma AOHOC/DT/TEG,
6-(ter-butiloxicarbonilaminooxi)hexan-1-ol,
Compuesto 27: A una disolución de 179 \mul (183 mg, 1,2
mmoles) de DBU en 1 ml de CH_{2}Cl_{2} se añadieron 133 mg (1,0
mmoles) de
N-(ter-butiloxicarbonil)hidroxilamina
(Aldrich Chemical Co.) y de 157 \mul (217 mg, 1,2 mmoles)
de 6-bromohexan-1-ol
(Aldrich Chemical Co.), y la mezcla se removió durante 18
horas a temperatura ambiente. La mezcla se concentró para dar un
aceite amarillo. La purificación mediante cromatografía en gel de
sílice (EtOAc/MeOH/hexanos 35/5/65) proporcionó 180 mg (77%) del
compuesto 27 en forma de un aceite incoloro: ^{1}H NMR
(CDCl_{3}) \delta 1,39(m, 4H), 1,48(s, 9H),
1,59(m, 4H), 3,63(t, 2H), 3,85(t, 2H),
7,42(s, 1H). ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 25,6 25,8
28,1 28,4 62,8 76,8 81,7 157,2.
Compuesto 28: A una disolución de 100 mg
(0,428 mmoles) del compuesto 27 en 2 ml de CH_{2}Cl_{2} a 0ºC,
se añadieron 90 \mul (88,1 mg, 1,11 mmoles) de piridina seguidos
de 113 mg (0,557 mg) de p-nitrofenilcloroformiato
(Aldrich Chemical Co.). La mezcla se removió a temperatura
ambiente durante 4 horas, se enfrió a 0ºC, se acidificó con HCl 1 N
y se repartió entre 20 ml de HCl 1 N y 3 x 20 ml de
CH_{2}Cl_{2}. Las capas de CH_{2}Cl_{2} mezcladas se
lavaron con una disolución saturada de NaHCO_{3}, se secaron
(MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La purificación
mediante una cromatografía en gel de sílice proporcionó el
compuesto 28.
Compuesto 29: A una disolución de
dietilentriamina en EtOAc se añaden dos equivalentes de
diisopropiletilamina seguidos de dos equivalentes del compuesto 28.
La mezcla se remueve hasta haberse completado la reacción. Los
disolventes se separan y el producto, el compuesto 29, se purifica
mediante cromatografía en gel de sílice.
Plataforma AOHOC/DT/TEG protegida con BOC,
Compuesto 30: A una disolución de
bis-cloroformiato de trietilenglicol (Aldrich
Chemical Co.) en piridina se añaden dos equivalentes del
compuesto 29. La mezcla se remueve hasta haberse completado la
reacción y se reparte entre HCl 1 N y CH_{2}Cl_{2}. La capa de
CH_{2}Cl_{2} se seca y se concentra y el producto se purifica
mediante cromatografía en gel de sílice para dar el compuesto
30.
Plataforma AOHOC/DT/TEG, Compuesto 31:
Los grupos protectores BOC se retiran del compuesto 30 de manera
esencialmente similar a la descrita en la preparación del compuesto
16.
Síntesis de una plataforma AOTEG/IDA/TEG,
Compuesto 32: A una disolución de
bis-cloroformiato de trietilenglicol (Aldrich
Chemical Co.) en piridina se añaden dos equivalentes de ácido
iminodiacético (Aldrich Chemical Co.). La mezcla se remueve
hasta haberse completado la reacción y se reparte entre HCl 1 N y
CH_{2}Cl_{2}. La capa de CH_{2}Cl_{2} se seca y se
concentra y el producto se purifica mediante cromatografía en gel de
sílice para dar el compuesto 32.
Compuesto 33: Una disolución del
compuesto 32 en THF se trata con seis equivalentes de NHS y con seis
equivalentes de DCC durante 1 hora. A la mezcla se añaden 4
equivalentes del compuesto 11 y la mezcla se remueve hasta haberse
completado la reacción. Se añade ácido acético para inactivar el DCC
en exceso y los sólidos resultantes se separan mediante filtración.
El filtrado se concentra y se purifica mediante cromatografía en gel
de sílice para dar el compuesto 33.
Compuesto 34: Los grupos protectores BOC
se retiran del compuesto 33 de manera esencialmente similar a la
descrita en la preparación del compuesto 16.
Plataforma,
p-nitrofenil-levulinato, Compuesto
35: A una disolución de 800 mg (6,89 mmoles) de ácido
levulínico (Aldrich Chemical Co.) en 4,25 ml de piridina, se
añadieron 1,78 g (7,58 mmoles) de
4-nitrofeniltrifluoro-acetato
(Aldrich Chemical Co.). La disolución resultante se removió
durante 15 minutos y se repartió entre 28 ml de agua y 2 x 28 ml de
CH_{2}Cl_{2}. Las capas de CH_{2}Cl_{2} mezcladas se secaron
(MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La purificación del
concentrado mediante una cromatografía en gel de sílice (gradiente
discontinuo, EtOAc/hexanos desde 25/75 hasta 30/70) proporcionó 1,06
g (74%) del compuesto 35: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta
2,28(s, 3H), 2,87(m, 4H), 7,29(d, 2H),
8,28(d, 2H).
1,2-Bis(2-ter-butiloxicarbonil)aminooxietoxi)-etano,
Compuesto 36: A 243 mg (0,66 mmoles) del compuesto 12 se
añadieron 219 mg (1,64 mmoles) de
N-ter-butiloxicarbonil)hidroxilamina
(Aldrich Chemical Co.) seguidos de 246 \mul (250 mg, 1,64
mmoles) de DBU. La mezcla se removió a temperatura ambiente hasta
que solidificó (aproximadamente 1 hora). Después de dejar en reposo
durante 1 hora adicional, la mezcla se disolvió en 2 ml de
CH_{2}Cl_{2} y la disolución resultante se añadió a 100 ml de
EtOAc para precipitar la sal yoduro de hidrógeno de DBU. Se
añadieron 50 ml adicionales de EtOAc y la mezcla se filtró. El
filtrado se lavó con 2 x 50 ml de HCl 1 N, 2 x 50 ml de una
disolución de bisulfito sódico al 5% y 25 ml de salmuera. La capa
de EtOAc se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró para
dar un aceite. La purificación mediante cromatografía en gel de
sílice (gradiente discontinuo, EtOAc/hexanos desde 40/60 hasta
50/50 y desde 50/50 hasta 80/20) proporcionó 164 mg (65%) del
compuesto 36 en forma de un aceite incoloro: ^{1}H NMR
(CDCl_{3}) \delta 1,48(s, 18H), 3,65(s, 4H),
3,72(t, 4H), 4,02(t, 4H), 7,80(s, 2H). ^{13}C
NMR (CDCl_{3}) \delta 28,2 69,0 70,3 75,2 81,3 156,8.
1,2-Bis(2-aminooxietoxi)etano,
Compuesto 37: El compuesto 36 (559 mg, 1,47 mmoles) se disolvió
en 15 ml de EtOAc, y se burbujeó HCl gas a través de la disolución
durante 30 minutos. La mezcla se concentró al vacío para dar 72 mg
(90%) del compuesto 37 en forma de la sal HCl en forma de un residuo
pegajoso. ^{1}H NMR CD_{2}O \delta 3,75(s, 4H),
3,87(m, 4H), 4,27(m, 4H); espectro de masas (ES), m/z
calculado para C_{6}H_{17}N_{2}O_{4} (M+H): 181,1.
Encontrado: 181,1.
Compuesto 38: El compuesto 3 se trata con
una disolución de HBr al 30% en ácido acético para retirar los
grupos protectores CBZ y proporcionar una sal bromuro de hidrógeno
de tetra-amina. La tetra-amina se
disuelve en una disolución de bicarbonato sódico en agua y dioxano,
y a la disolución resultante se añaden cuatro equivalentes del
compuesto 35. Una vez completada la reacción, la mezcla se reparte
entre agua y CH_{2}Cl_{2}. La capa de CH_{2}Cl_{2} se
concentra, se seca y se purifica mediante cromatografía en gel de
sílice para dar el compuesto 38.
Plataforma AOTEGO/LEV/PITG, Compuesto 39:
A una disolución del compuesto 38 en tampón de acetato sódico 0,1
M, pH 4,6, se añaden veinte equivalentes del compuesto 37. Una vez
completada la reacción, la mezcla se reparte entre agua y
CH_{2}Cl_{2}. La capa de CH_{2}Cl_{2} se concentra, se seca
y se purifica mediante cromatografía en gel de sílice para dar el
compuesto 39.
Síntesis de la plataforma AO/DEGA/DEG,
Compuesto 41: Se añade bromo (aproximadamente seis equivalentes)
gota a gota a una disolución del compuesto 40, seis equivalentes de
trifenilfosfina y 8 equivalentes de piridina en CH_{2}Cl_{2}
hasta que persiste una coloración naranja. La mezcla se remueve a
temperatura ambiente durante 0,5 h o hasta que la reacción se haya
completado y se añade una disolución saturada de bisulfito sódico
para destruir el bromo en exceso. La mezcla se reparte luego entre
H_{2}O y EtOAc. Las capas orgánicas mezcladas se lavan con
salmuera, se secan (Na_{2}SO_{4}), se filtran, se concentran y
se purifican mediante cromatografía en gel de sílice para dar
el
compuesto 41.
compuesto 41.
Compuesto 42: Al compuesto 41, se añaden
seis equivalentes de
N-(ter-butiloxicarbonil)hidroxilamina
(Aldrich Chemical Co.) seguidos de seis equivalentes de DBU.
La mezcla se calienta lo necesario y durante un tiempo suficiente
para que la reacción se complete. Una vez enfriada, la mezcla se
disuelve en CH_{2}Cl_{2} y la disolución resultante se añade a
EtOAc produciéndose la formación de un precipitado que se separa
mediante filtración y el filtrado se concentra. La purificación
mediante una cromatografía rápida proporciona el compuesto 8.
Compuesto 43: Los grupos protectores BOC
se retiran del compuesto 42 de manera esencialmente similar a la
descrita en la preparación del compuesto 16.
Método alternativo para preparar un conjugado
tetravalente usando el compuesto 37 como compuesto enlazador
bifuncional: Como alternativa para hacer reaccionar un
polipéptido del dominio 1 transaminado de \beta_{2}GPI con una
plataforma aminooxi tetravalente, el Dominio 1 transaminado se puede
hacer reaccionar con un exceso del compuesto 37 en tampón de
acetato sódico, 100 mM, pH 4,6, para proporcionar un compuesto 53 en
el que un compuesto enlazador aminooxi está unido al polipéptido
del dominio 1 de \beta_{2}GPI a través de un enlace oxima. El
compuesto 52 se separa del compuesto enlazador en exceso y cuatro
equivalentes del compuesto 53 se hacen reaccionar con la plataforma
38 en tampón de acetato sódico 100 mM, pH 4,6, para formar un
segundo grupo de enlaces oxima que proporcionan un conjugado
tetravalente, el compuesto 54.
El tratamiento del compuesto 21a con hidróxido
amónico para retirar el grupo protector sulfuro de acetilo y
después con ácido trifluoroacético para retirar el grupo protector
BOC, proporciona el compuesto enlazador 55. Un polipéptido que
contiene glioxilo, en este caso TA/D1, se hace reaccionar con el
compuesto 55 para dar el compuesto 56, polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI que lleva unido el compuesto enlazador que
contiene sulfidrilo a través de un enlace oxima. Cuatro equivalentes
del compuesto 56 reaccionan con la plataforma 23 para dar un
conjugado tetravalente del polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI, el compuesto 57.
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siguiente)
La unión del conjugado tetramérico, compuesto
44, a dos anticuerpos anti-\beta_{2}GPI humanos,
purificados por afinidad, se analizó usando la resonancia de
plasmones de superficie.
Reactivos. Chips CM5, NHS y EDC, y el
tampón HBS-EP procedieron de BIAcore. Una mezcla de
IgG humanas normales (Zymed) se inmovilizó en una celda de flujo
independiente colocada sobre el chip y se usó como control negativo.
Anticuerpos específicos del dominio 1 de \beta_{2}GPI
purificados por afinidad y procedentes de dos pacientes (6701 y
6626) se inmovilizaron en celdas de flujo independientes.
Resonancia de plasmones de superficie.
Todos los experimentos se realizaron usando un instrumento
BIAcore^{TM} 2000, a 25ºC, con una velocidad de flujo de 10
\mul/minuto. El equilibrado de los chips y los estudios de unión
se realizaron con tampón de HBS-EP desgaseado, que
consiste en HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM y
tensioactivo P20 al 0,005% (v/v). El acoplamiento covalente de
ligandos proteicos, a través de sus grupos amino libres, al chip
CM5 se realizó haciendo fluir 40 \mul de NHS 0,05 M / EDC 0,2 M
sobre el chip para activar el chip, seguido de la exposición al
ligando proteico apropiado. Los anticuerpos purificados por
afinidad y la IgG normal se inmovilizaron haciendo fluir 100 \mul
de una disolución de concentración 100 \mug/ml en acetato 10 mM
(pH 4,8) sobre el chip CM5 activado con NHH. Los grupos reactivos en
exceso sobre la superficie del chip se desactivan luego con 40
\mul de etanolamina 1 M (pH 8,5).
Titulaciones. El dominio 1 de
\beta_{2}GPI expresado en baculovirus y el compuesto 44
tetramérico se diluyeron con HBS-EP, se hicieron
fluir sobre el chip y los valores de las respuestas se recogieron
durante 780 segundos. Los chips se regeneraron entre las
exposiciones a las muestras con 80 \mul de glicina 0,1 M - HCl (pH
2,1), NaCl 0,1 M. Se realizaron una serie de cinco titulaciones por
cada muestra. Debido a que el acercamiento al equilibrio de la
unión fue incompleto durante el período de la medición, el valor de
la unión en el equilibrio (R_{eq}) se determinó ajustando las
curvas de asociación a la siguiente ecuación, usando el programa de
los fabricantes (BiaEvaluation, versión 2.2, Uppsala,
Suecia).
R_{t} =
R_{eq}(1-e^{-ks(t-t0)})
+
R_{0}
en la que R_{t} es la respuesta
medida en el BIAcore a un tiempo t, R_{eq} es la respuesta en la
meseta del equilibrio, t es el tiempo, t_{0} es el tiempo
inicial, K_{s} es una constante de asociación aparente (K_{s} =
k_{a}C + k_{dis}, en la que k_{a} es la constante de
asociación, C es la concentración del analito y k_{dis} es la
constante de disociación), y R_{0} es una respuesta offset
(algoritmo de
Marquart-Levenberg).
Cada una de las curvas de asociación de la
titulación lleva restado el fondo de la celda del control negativo
normal (IgG normal) correspondiente a esa titulación. La R_{q}
calculada se representó gráficamente frente a la concentración
usando el programa GraphPad Prism, versión 2.01. Los datos se
ajustan a uno de los sitios que participan en la unión (hipérbola
rectangular: Y = Bmax* X/[Kd+X] y los valores de Kd se calculan en
unidades de concentración molar. Las concentraciones molares del
dominio 1 y del compuesto 44 se determinaron por su absorbancia a
280 nm y un coeficiente de extinción de 1,85.
Los anticuerpos purificados por afinidad
procedentes de los pacientes 6701 y 6626 se inmovilizaron en cámaras
microfluídicas independientes y se expusieron a concentraciones
variables del dominio 1 de \beta_{2}GPI humana o del compuesto
44. El valor de la unión en el equilibrio se determinó para cada una
de las concentraciones y se representó gráficamente para determinar
la constante de disociación aparente en el equilibrio. Las isotermas
de la unión se muestran en las Figuras 10 y 11 (coeficiente de
extinción = 1,85; anticuerpo inmovilizado 100 \mug/ml) y las
constantes de disociación aparecen indicadas en la Tabla 8.
Estos experimentos demuestran que los
anticuerpos antifosfolípidos purificados por afinidad se unen al
dominio 1 de \beta_{2}GPI. Además, estos experimentos
demuestran que los conjugados tetraméricos de un polipéptido del
dominio 1 de \beta_{2}GPI unido a una plataforma son también
capaces de unirse a estos anticuerpos con afinidades que son
equivalentes o mayores que la concentración molar del dominio 1
presente en el tetrámero.
Microplacas MaxiSorp de Nunc (Nalge Nunc
International, Dinamarca) se revistieron con 100 \mul/pocillo
de \beta_{2}GPI a concentración de 2,5 \mug/ml en PBS, se
incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y se bloquearon
durante 2 horas a temperatura ambiente con 250 \mul/pocillo de
leche en polvo desnatada al 2% con Tween 80 al 0,4% (Sigma
Chemical Co.). Después de cinco lavados con TBS, a cada pocillo
se añadieron 100 \mul de una disolución preparada menos de una
hora antes y diseñada para producir en cada pocillo una dilución
final 1:200 del plasma del paciente 6501 y de cantidades variables
de los conjugados tetraméricos del dominio 1, compuesto 44 y
compuesto 45, o de monómeros del dominio 1 utilizados de control,
todos ellos en leche desnatada al 2% con Tween-80
al 0,4%. Después de una incubación de una hora a temperatura
ambiente, las placas se lavaron 5X con TBS. A cada pocillo se
añadieron 100 \mul de IgG anti-seres humanos
conjugada con fosfatasa alcalina, específica de cadena gamma,
(Zymed), diluida en proporción 1:1.000 en leche desnatada al 2% con
Tween-80 al 0,4%. Después de una hora a temperatura
ambiente, las placas se lavaron 5X con TBS. En cada pocillo se
añadieron 100 \mul de una disolución del sustrato cromogénico PPMP
para el desarrollo del color a temperatura ambiente. La absorbancia
óptica de cada pocillo se determinó a A_{550nm} en un aparato
comercial de lectura de microplacas (Bio-Teck
Instruments, modelo EL311). Los resultados que se muestran en
la Figura 12 indican que los dos compuestos 44 y 45 compiten de
manera efectiva por el anticuerpo antifosfolípido presente en el
suero (paciente 6501). El dominio 1 reducido y alquilado muestra
ausencia de esa competición y es un control negativo. También
exhibe unión competitiva el dominio 1 monomérico normal y se incluye
como control positivo.
Los requerimientos de un modelo en animales
inmunizados para realizar ensayos de la tolerancia frente a
polipéptidos del dominio 1 de \beta_{2}GPI son: (1) la
inmunización debe engendrar anticuerpos que reconocen el dominio 1,
y (2) la inmunización debe no engendrar células T que reconozcan el
dominio 1. La inmunización con el conjugado formado por
polipéptidos del dominio 1 - KLH engendra células T que reconocen a
KLH pero no engendra una reactividad detectable contra el dominio
1. Con este fin, los autores de la invención han preparado, en el
sistema que utiliza células de insectos, un polipéptido del dominio
1 de \beta_{2}GPI que contiene una quinta cisteína en el
extremo carboxilo terminal (desde el aminoácido 1 al aminoácido 66
del SEQ ID NO: 1). Esta molécula se ha unido covalentemente a KLH a
través de la quinta cisteína. Este conjugado se ha utilizado para
inmunizar ratones. La inmunización con el conjugado formado por
dominio 1 - KLH engendra células T que reconocen KLH pero no
engendra una reactividad detectable contra el dominio 1. Por otra
parte, la inmunización con el conjugado formado por dominio 1 - KLH
no da como resultado la producción de anticuerpos específicos para
el dominio 1.
Pocillos de microtitulación de NUNC se
revistieron con 50 \mul de \beta_{2}GPI a una concentración de
5 \mug/ml en bicarbonato 0,1 M (pH 9,5) toda la noche. Los
pocillos se lavaron tres veces con PBS y luego se bloquearon
durante una hora con leche en polvo desnatada (NFDM) al 2%. Los
pocillos se lavaron y se añadieron 50 \mul de diluciones
seriadas, en NFDM al 2%, de suero de un mismo ratón y los pocillos
se incubaron a temperatura ambiente durante una hora, se lavaron, y
se les añadieron 50 \mul de IgG anti-ratón
conjugada con fosfatasa alcalina, se incubaron a temperatura
ambiente durante una hora, se lavaron y se añadieron 50 \mul de
un sustrato. La OD a 550 nm se leyó pasados 30 minutos. Se hizo una
mezcla de sueros procedente de los ratones que habían sido
inmunológicamente sensibilizados con 50 \mul del conjugado. Esta
mezcla se analizó en todos los ensayos y los resultados se expresan
en forma de un porcentaje de esta mezcla estándar.
Microplacas NUNC se revistieron con 50 \mul de
\beta_{2}GPI recombinante a una concentración de 5 \mug/ml en
bicarbonato 0,1 M, pH 9,5, se incubaron toda la noche a 4ºC, se
lavaron tres veces con PBS 0,15 M (pH 7,2) y se bloquearon durante
una hora a temperatura ambiente con 75 \mul de leche en polvo
desnatada al 2% en PBS (NFDM al 2%). Los inhibidores del ensayo se
diluyeron en NFDM al 2% y 25 \mul de cada una de las diluciones o
de NFDM sola se añadieron a los pocillos revestidos. Un anticuerpo
monoclonal se diluyó en NFDM al 2% y 25 \mul de una concentración
constante se añadieron a los pocillos. Los contenidos de los
pocillos se mezclaron y las placas se incubaron a temperatura
ambiente durante una hora. Después las placas se lavaron tres veces
con PBS, se añadieron 50 \mul de IgG anti-ratón
conjugada con fosfatasa alcalina, específica de cadena gamma,
diluida convenientemente en NFDM al 2%, y se incubaron a 37ºC
durante una hora. Después de que las placas se hubieron lavado tres
veces con PBS, se añadieron 50 \mul del sustrato cromogénico de la
fosfatasa alcalina y las placas se incubaron durante 30 minutos a
20ºC. La A_{550} se midió en un aparato automático de lectura de
microplacas. El tanto por ciento de inhibición se determinó de la
siguiente
manera:
manera:
[A_{550}
media obtenida de los pocillos de control sin inhibidor menos
A_{550} de fondo] - [A_{550} obtenida en presencia de
inhibidor menos A_{550} de fondo] / [A_{550} media obtenida de
los pocillos de control sin inhibidor menos A_{550} de
fondo] X
100).
Grupos de 5 ratones C57B1/6 se sensibilizaron
inmunológicamente con 10 \mug o 50 \mug o 100 \mug del
conjugado formado por KLH-Dominio 1 adsorbido en
alumbre más 2 x 10^{9} organismos de pertussis como
adyuvante. Tres semanas más tarde, todos los ratones recibieron una
dosis de refuerzo de 10 \mug del conjugado en disolución salina.
Siete días después de la dosis de refuerzo, se extrajo sangre a los
ratones, se recogieron los sueros y se ensayaron con respecto a la
actividad anti-dominio 1. Los resultados se muestran
en la Figura 14. La inmunización con dominio 1 - KLH no generó una
respuesta de anticuerpos específica para el dominio 1.
A ratones C57B1/6 se les inyectó en las
almohadillas de las patas traseras 25 \mug del conjugado formado
por dominio 1 (D1) - KLH, emulsionado en adyuvante completo de
Freund (CFA). A otro grupo de ratones se les inyectó en las
almohadillas de las patas traseras CFA emulsionado (ausencia de
antígeno). Siete días después se recogieron los ganglios linfáticos
poplíteos procedentes de 5 ratones de cada uno de los grupos. Los
ganglios procedentes de las inmunizaciones simuladas se reunieron y
se prepararon suspensiones de células aisladas. Las células se
cultivaron según se ha descrito en lo que antecede para las células
humanas, excepto que los antígenos a ensayar fueron
D1-KLH, KLH y dominio 1 (no conjugado). Como control
positivo se usó PPD. En el día 4, a cada uno de los pocillos se
añadieron 25 \mul de ^{3}H-timidina que
contenían 1 \muCi. En el día 5 se recogieron los contenidos de
los pocillos y se determinó la cantidad de radiactividad de cada
pocillo. Se calculó un Índice de estimulación (SI) (del inglés,
" Stimulation Index") para cada uno de los
pocillos dividiendo las CPM del pocillo por las CPM medias de los
controles negativos. Se determinó el SI medio (y la desviación
estándar) de cada uno de los duplicados.
La especificidad del anticuerpo policlonal
anti-conjugado KLH-Dominio 1,
procedente de ratón, se determinó mediante ensayos ELISA de
inhibición competitiva. Distintas formas recombinantes de
\beta_{2}GPI se mezclaron con cantidades limitantes del
anticuerpo en pocillos que habían sido revestidos con
\beta_{2}GPI. La cantidad de anticuerpo que quedó unido a los
pocillos se detectó luego con un segundo anticuerpo conjugado con
fosfatasa alcalina. Se determinó el porcentaje de inhibición, según
se ha descrito en la sección de métodos, y se representó
gráficamente frente a la concentración \mumolar del inhibidor. Los
resultados se muestran en la Figura 15. La inmunización con el
propio conjugado no genera una respuesta de anticuerpos específica
para el dominio 1 (Figura 15).
Con respecto a la proliferación de células T,
los resultados mostrados en la Figura 13 demuestran que las células
procedentes de ratones inmunológicamente sensibilizados con dominio
1 - KLH proliferaron en respuesta tanto a dominio 1 - KLH como a
KLH así como al PPD de control positivo. Dichas células no dieron
respuesta al dominio 1 (no conjugado). Por otra parte las células
procedentes de ratones inmunológicamente sensibilizados con sólo
CFA no dieron respuesta a los antígenos sometidos al ensayo pero sí
dieron respuesta al PPD de control positivo.
En el un modelo que utiliza ratones inmunizados,
en concreto, la sensibilización inmunológica no debe activar las
células T que reconocen un tolerágeno determinado pero sí debe
generar células B de memoria que reconozcan el tolerágeno, y ambos
de estos dos requerimientos básicos de un modelo que utiliza ratones
inmunizados se han cumplido en el modelo que utiliza ratones
inmunizados que aquí se presenta.
Se sensibilizan inmunológicamente ratones con un
polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI conjugado con
hemocianina de lapa californiana (KLH) (del inglés,
" Keyhole Limpet Hemocyanin") sobre
alumbre, más pertussis como adyuvante, según se ha descrito
en lo que antecede. Tres semanas después, los ratones se tratan con
un intervalo de dosis de tolerágeno, que puede estar o no conjugado
a una plataforma. Uno de los grupos no recibe tratamiento y hace de
grupo de control. Cinco días después, todos los ratones, incluyendo
el grupo de control, reciben una dosis de refuerzo de 10 \mug de
polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI conjugado con KLH y
siete días más tarde se extrae sangre a los ratones. Sus sueros se
analizan con respecto a la presencia de anticuerpos
anti-dominio 1 de \beta_{2}GPI mediante
cualquiera de los métodos conocidos, que incluyen, por ejemplo, el
ensayo ELISA según se ha descrito en los ejemplos que preceden.
Estos valores se utilizan luego para determinar una media y una
desviación estándar para todos los individuos de un grupo.
La determinación de la falta de reactividad de
las células T frente a un polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI indicaría que, como tolerágeno, ese polipéptido no
suministra epítopos para una segunda señal dirigida a las células B
por parte de las células T. Por el contrario, si el tolerágeno
proporcionara una señal de proliferación (de activación) dirigida a
las células T, es posible que ese tolerágeno exacerbe una respuesta
de las células B.
Para determinar la activación de las células T,
se recogen linfocitos circulantes y se ponen en una placa de
cultivo. El polipéptido(s) del dominio 1 de \beta_{2}GPI
que va a ser ensayado se añade al cultivo durante aproximadamente
una semana. Al final de esa semana, las células T se pulsan con
^{3}H-timidina para determinar si ha habido
proliferación celular. De manera opcional, se determina también la
presencia de citoquinas en el sobrenadante del cultivo de
tejidos.
\hbox{factor Va} Se determinaron los niveles del factor V
activado (factor Va) en plasma humano normal después de la
iniciación de la coagulación en presencia y ausencia de anticuerpos
purificados por afinidad o de preparaciones de IgG total,
procedentes de pacientes a los que se ha diagnosticado el síndrome
antifosfolípido (APS). Los anticuerpos purificados por afinidad
fueron caracterizados como anticuerpos anti-dominio
1 de \beta_{2}GPI. Se preparó IgG total a partir del suero de
los pacientes según se describe más adelante.
La medida de los niveles de factor Va se
determinó en un ensayo de coagulación modificado en dos etapas
usando un microcoagulómetro Amelung KC4A de la siguiente manera.
Cincuenta microlitros de plasma humano deficiente en factor V
(Chromogenix) se preincubaron durante 1 minuto a 37ºC en una
microcubeta para centrífuga. Las muestras se diluyeron en
proporción 1:10 con Tampón de Owren (Sigma) precalentado (37ºC).
Cincuenta microlitros de la muestra diluida se añadieron a 50
\mul de plasma deficiente en factor V. Para iniciar la coagulación
se añadieron 100 \mul de ThromboMAX plus calcium (Sigma) a
37ºC. Se registró el tiempo de coagulación. Una unidad de actividad
de Va se define como el tiempo de coagulación correspondiente al
plasma deficiente en factor V con una dilución 1:10 del plasma
humano normal de referencia (Accuclot, Sigma). Una unidad de
actividad de factor Va en este sistema experimental corresponde a un
tiempo de coagulación de aproximadamente 30 segundos.
Para determinar la cantidad de factor Va que se
genera a lo largo del tiempo en presencia o ausencia de anticuerpo
antifosfolípido o de IgG se usó el siguiente sistema para generar
las muestras ensayadas en el ensayo estándar anteriormente
mencionado. Se mezclaron los siguientes reactivos y se incubaron a
37ºC: una parte de plasma humano normal de referencia (Accuclot,
Sigma), una parte de CaCl_{2} 25 mM y una parte que consiste en
reactivo de fosfatidilserina (125 \mug/ml) y disolución salina
tamponada con Tris (TBS) y el anticuerpo o IgG (si es aplicable en
la concentración deseada). Se usó TBS para corregir los volúmenes
variables de anticuerpo o de IgG. El plasma normal, la
fosfatidil-serina, el anticuerpo o la IgG (en caso
de estar presente) y TBS se mezclaron y se incubaron a 37ºC durante
2 minutos antes de la adición de CaCl_{2} a 37ºC para iniciar la
coagulación, y el coágulo se extrajo con la mano a medida que se iba
formando. El volumen total de la mezcla de la muestra fue
dependiente del número de puntos de tiempo analizados. En cada uno
de los puntos de tiempo, se extrajeron 12,5 \mul de la muestra
incubada, se diluyeron en proporción 1:10 en tampón de Owren y se
sometieron al ensayo estándar de factor Va anteriormente explicado.
Los niveles de factor Va generados en la muestra a lo largo del
tiempo están reflejados en una corrección del tiempo de coagulación
del plasma deficiente en factor V. Los niveles máximos de factor Va
tienen lugar a los 4-5 minutos de haberse iniciado
la coagulación y los niveles están en el intervalo de
4-7 unidades de actividad de factor Va. Esto
corresponde a un tiempo de coagulación de aproximadamente
5-6 segundos en el ensayo estándar correspondiente a
este sistema experimental.
En los casos en los que al ensayo se añadía IgG
procedente de un paciente con APS, se preparó IgG total a partir de
muestras de suero humano mezclando 100 \mul de suero (diluido en
proporción 1:1 con tampón Immunopure IgG binding Buffer, de
Pierce) con 100 \mul de bolitas de agarosa con proteína G
inmovilizada (Pierce Immunopure Plus).
La mezcla se agitó lentamente a temperatura
ambiente durante 10 minutos. La proteína G se une a la región Fc de
todas las subclases de inmunoglobulina G humana. Pasados 10 minutos,
la mezcla se centrifugó brevemente para sedimentar las bolitas. El
sobrenadante de la mezcla de sueros se desechó.
Las bolitas que llevan la IgG unida se lavaron
entonces tres veces con 200 \mul del tampón de unión a IgG para
separar las proteínas adsorbidas. La IgG unida se eluyó luego de las
bolitas de proteína G con 3X 100 \mul del tampón de elución de
IgG Immunopure IgG elution Buffer, de Pierce). La IgG eluida
se neutralizó inmediatamente con 100 \mul de NaPO_{4} 1 M, pH
7,5, en el caso de un volumen final total de 400 \mul de
preparación de IgG procedente de la muestra de plasma de 100 \mul.
Las preparaciones de IgG neutralizada se conservan a 4ºC hasta su
análisis.
La concentración de proteínas de las
preparaciones de IgG se determinó mediante el método de Bradford
estándar para microplacas (reactivo de Bio-Rad).
Cinco microlitros de cada una de las muestras se ensayaron por
triplicado, conteniendo cada placa una curva estándar de albúmina de
suero bovino. Las concentraciones de proteína se calcularon con un
programa informático KC4.
Para el análisis en el ensayo de coagulación con
factor Va, 100 \mul de la preparación de IgG se concentraron
hasta 25 \mul con un dispositivo de filtración centrífuga Microcon
(Amicon, valor de exclusión de peso molecular de 30.000). Los 25
\mul completos se usan para el ensayo sencillo de factor Va a
distintos puntos de tiempo.
El efecto de la IgG total procedente de
pacientes con síndrome antifosfolípido y de los anticuerpos
purificados por afinidad procedentes de controles normales se
comparó en cuanto a su capacidad para retrasar la inactivación del
factor Va en un ensayo de coagulación in vitro. Los
resultados correspondientes a la IgG total y a los anticuerpos
purificados por afinidad se muestran en la Tabla 9 y en la Figura
16, respectivamente. La IgG y los anticuerpos purificados por
afinidad procedentes de individuos normales de control no alteraron
la inactivación del factor Va observada a los 20 minutos de haberse
iniciado la coagulación. Por el contrario, la fracción de IgG
procedente de pacientes con el síndrome antifosfolípido retrasó la
inactivación del factor Va (p<0,05 mediante la prueba de la t de
Student). Se observaron efectos similares sobre la inactivación del
factor Va en el caso de los anticuerpos purificados por afinidad.
Estos datos sugieren que los anticuerpos
anti-\beta_{2}GPI procedentes de seres humanos
crean un estado hipercoagulativo en parte debido a retrasar la
inactivación del Factor Va.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
IgG de individuos
normales
Aunque la invención que precede se ha descrito
con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con el fin de
claridad en su comprensión, se hará evidente a los expertos en la
técnica que podrán practicarse algunos cambios y modificaciones.
Por lo tanto, la descripción y los ejemplos no deben ser
interpretados como limitativos del alcance de la invención, que
está delimitada por las reivindicaciones que se adjuntan.
<110> Marquis, M. David
\hskip1cm Iverson, M. Gilbert
\hskip1cm Victoria, J. Edward
\hskip1cm Jones, S. David
\hskip1cm Linnik, Matthew
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDOS TERAPÉUTICOS Y
DIAGNÓSTICOS DEL DOMINIO 1 DE \beta_{2}GPI Y MÉTODOS PARA EL USO
DE LOS MISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 252312006900
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> no asignado
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
08-06-1.999001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/088.656
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
09-06-1.998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version
3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 978
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(978)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 326
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(192)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Thr Pro Arg Val Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ser Thr Val Val Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Pro Asp Asp Leu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Thr Cys Pro Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Lys Cys Thr Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Cys Pro Leu Thr Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ile Cys Pro Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Thr Tyr Ser Cys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaccaacctt aatggtgatg gtgatggtgg ccacatggct ttaca
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacatactct gggtgtccgt cctgcaatag c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggagggcag atgatccgtc ctgcaatagc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatgggcat tttacttccc gtcctgcaat agc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtaattta caagatgccc gtcctgcaat agc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggtgatgg tggccacaac ttggcatggc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggtgatgg tggccgcatt ctggtaattt ag
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los aminoácidos 3-60
se delecionaron de \beta_{2}GPI (SEQ ID NO: 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Thr Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los aminoácidos
3-120 se delecionaron de \beta_{2}GPI (SEQ
ID NO: 2)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Ile Ile Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los aminoácidos
3-182 se delecionaron de \beta_{2}GPI (SEQ
ID NO: 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Glu Val Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los aminoácidos
3-242 se delecionaron de \beta_{2}GPI (SEQ
ID NO: 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Ala Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los aminoácidos
242-326 se delecionaron o
\hskip1cm los aminoácidos
182-326 se delecionaron o
\hskip1cm los aminoácidos
165-326 se delecionaron o
\hskip1cm los aminoácidos
123-326 se delecionaron de \beta_{2}GPI (SEQ
ID NO: 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Thr Cys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctataaatac ggatcccggg aattcg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagctggcc aactctgggt gtacatttca gagtg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagctggcc aatgatggga gcacagagag gaag
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
Claims (47)
1. Un conjugado que comprende una molécula
plataforma de valencia y un polipéptido que comprende al menos seis
aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 4, que tiene una longitud menor
que 100 aminoácidos y que se une específicamente a un anticuerpo
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI.
2. Un conjugado según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido comprende el polipéptido del dominio 1 de
\beta_{2}GPI del SEQ ID NO: 4.
3. Un conjugado según la reivindicación 1, en
el que dichos seis aminoácidos contiguos se seleccionan entre los
SEQ ID NOS: de 5 a 12.
4. Un conjugado según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido comprende desde el aminoácido 4 hasta el
aminoácido 60 del SEQ ID NO: 4.
5. Un conjugado según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido comprende al menos quince aminoácidos
contiguos del SEQ ID NO: 4.
6. Un conjugado según la reivindicación 5, en
el que el polipéptido comprende al menos treinta aminoácidos
contiguos del SEQ ID NO: 4.
7. Un conjugado según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido tiene una longitud menor que 75
aminoácidos.
8. Un conjugado según la reivindicación 7, en
el que el polipéptido tiene una longitud menor que 50
aminoácidos.
9. Un conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el polipéptido es parte de
una proteína de fusión que contiene uno o más de dichos polipéptidos
y otra secuencia de aminoácidos que no está unida a dicho
polipéptido(s) en la molécula natural.
10. Un conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el polipéptido carece de un
epítopo para células T, siendo dicho epítopo para células T capaz de
activar las células T en un individuo que posee anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI.
11. Un conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la molécula plataforma es
de naturaleza proteica.
12. Un conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10, en el que la molécula plataforma es de
naturaleza no proteica.
13. Un conjugado según la reivindicación 12, en
el que la molécula plataforma es polietilenglicol.
14. Un conjugado según la reivindicación 13, en
el que el polietilenglicol tiene un peso molecular de 200 a
8.000.
15. Un conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10, en el que el peso molecular de una
población de moléculas plataforma de valencia es homogéneo.
16. Un conjugado según la reivindicación 15, en
el que la molécula plataforma está en forma de un derivado de
2,2’-etilenodioxidietilamina o de trietilenglicol.
17. Un conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10, en el que la molécula plataforma está
ligada al polipéptido por medio de un enlace tioéter.
18. Un conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10, en el que la molécula plataforma está
ligada al polipéptido por medio de un enlace oxima.
19. Un conjugado según la reivindicación 18,
que se ha formado haciendo reaccionar un polipéptido de los
mencionados que contiene un grupo carbonilo con una molécula
plataforma de las mencionadas que contiene un grupo reactivo
aminooxi.
20. Un conjugado según la reivindicación 19, en
el que el grupo reactivo aminooxi es un grupo aminooxi,
aminooxiacetilo o aminooxialquilo.
21. Un conjugado según la reivindicación 20, en
el que la molécula plataforma es:
o
22. Un conjugado según la reivindicación 1, en
el que el conjugado es:
en el que D1 es un polipéptido de
los mencionados;
o
en el que D1 es un polipéptido de
los
mencionados.
23. Un polipéptido que se une específicamente a
un anticuerpo antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI, que
tiene una longitud menor que 75 aminoácidos y que comprende al menos
30 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 4 o, si tiene una longitud
menor que 30 aminoácidos, comprende al menos seis aminoácidos
contiguos seleccionados entre los SEQ ID NOS: 5, 9, 10, 11 y
12.
24. Un polipéptido según la reivindicación 23,
que comprende el polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI del
SEQ ID NO: 4.
25. Un polipéptido según la reivindicación 23,
que comprende al menos seis aminoácidos contiguos seleccionados
entre los SEQ ID NOS: de 5 a 12.
26. Un polipéptido según la reivindicación 23,
que comprende desde el aminoácido 4 hasta el aminoácido 60 del SEQ
ID NO: 4.
27. Un polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones de 23 a 26, que carece de un epítopo para células
T, siendo dicho epítopo para células T capaz de activar las células
T de un individuo que posee anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI.
28. Un polipéptido de fusión que comprende un
polipéptido como el definido en una cualquiera de las
reivindicaciones de 23 a 27.
29. Un polinucleótido aislado, presente en la
naturaleza o no presente en la naturaleza, que codifica un
polipéptido como el definido en una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10 o de 23 a 28.
30. Un vector de expresión o de clonación que
comprende un polinucleótido como el definido en la reivindicación
29.
31. Una célula hospedadora transformada con un
polinucleótido como el definido en la reivindicación 29.
32. Un kit para detectar:
(a) un anticuerpo que se une específicamente a
un polipéptido del dominio 1 de \beta_{2}GPI, o
(b) coagulación,
comprendiendo dicho kit un conjugado como
el definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 22 o
un polipéptido como el definido en una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10 y de 23 a 28, en un estuche
adecuado.
33. Una composición que comprende una cantidad
efectiva de un conjugado como el definido en la reivindicación 10,
o de un polipéptido como el definido en la reivindicación 10 ó 27,
en la que una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para
inducir tolerancia.
34. Una composición según la reivindicación 33,
en la que la tolerancia viene indicada por una estabilización o
disminución de la producción de anticuerpos antifosfolípidos
dependientes de \beta_{2}GPI.
35. Una composición según la reivindicación 33
ó 34, que además comprende un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
36. Una composición que comprende una cantidad
efectiva de un conjugado como el definido en una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 22, o de un polipéptido como el definido en
una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10 y de 23 a 28, en
la que una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para
detectar un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI.
37. Un método para detectar un anticuerpo que
se une específicamente a un polipéptido como el definido en una
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10 y de 23 a 28 en una
muestra, que comprende (a) poner en contacto el anticuerpo
contenido en la muestra con un conjugado como el definido en una
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 22 o con un polipéptido
de los mencionados, en condiciones que permiten la formación de un
complejo estable antígeno-anticuerpo; y (b)
detectar el complejo estable formado en la etapa (a), si se ha
formado.
38. Un método según la reivindicación 37, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo antifosfolípido dependiente de
\beta_{2}GPI.
39. Un método para purificar un anticuerpo
antifosfolípido dependiente de \beta_{2}GPI, que comprende
poner en contacto una muestra biológica con un como el definido en
una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 22, o con un
polipéptido como el definido en una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10 y de 23 a 28, en condiciones que
permiten la formación de un complejo estable
antígeno-anticuerpo, y obtener el complejo formado,
si se ha
formado.
formado.
40. Un polipéptido como el definido en la
reivindicación 10 ó 27, o un conjugado como el definido en la
reivindicación 10, para usar en un método para inducir tolerancia
en un individuo.
41. Un polipéptido o un conjugado según la
reivindicación 40, en el que la tolerancia viene indicada por una
estabilización o disminución de la producción de anticuerpos
antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI.
42. Un polipéptido o un conjugado según la
reivindicación 40 ó 41, en el que el individuo es un ser humano.
43. Un conjugado según la reivindicación 10, en
el que el polipéptido consiste en la secuencia que va desde el
aminoácido 1 al aminoácido 60 del SEQ ID NO: 4, para usar en un
método como el descrito en la reivindicación 40.
44. Un método para detectar la mediación de
anticuerpos antifosfolípidos dependientes de \beta_{2}GPI en la
coagulación, que comprende las etapas de:
(a) realizar un primer ensayo de coagulación
usando una muestra biológica adecuada procedente de un individuo,
en el que un conjugado como el definido en una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 22 o un polipéptido según una cualquiera de
las reivindicaciones de 1 a 10 y de 23 a 28 se añade en el
ensayo;
(b) realizar un segundo ensayo de coagulación
usando una muestra biológica adecuada procedente de un individuo,
en ausencia del polipéptido; y
(c) comparar los resultados de los ensayos de
las etapas (a) y (b), en los que una diferencia en los resultados
indica la mediación de los anticuerpos antifosfolípidos dependientes
de \beta_{2}GPI en la coagulación.
45. Uso de un polipéptido como el definido en
la reivindicación 10 ó 27, o de un conjugado como el definido en la
reivindicación 10, en la fabricación de un medicamento para inducir
tolerancia en un individuo.
46. Uso según la reivindicación 45, en el que
la tolerancia viene indicada por una estabilización o disminución
de la producción de anticuerpos antifosfolípidos dependientes de
\beta_{2}GPI.
47. Uso según la reivindicación 45 ó 46, en el
que el individuo es un ser humano.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8865698P | 1998-06-09 | 1998-06-09 | |
| US88656P | 1998-06-09 | ||
| US10308898P | 1998-10-05 | 1998-10-05 | |
| US103088P | 1998-10-05 | ||
| US328199 | 1999-06-08 | ||
| US09/328,199 US6858210B1 (en) | 1998-06-09 | 1999-06-08 | Therapeutic and diagnostic domain 1 β2GPI polypeptides and methods of using same |
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