TWI572617B - 重組β-醣蛋白胜肽及其於抗腫瘤之應用 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種做為腫瘤抑制劑的重組β2-醣蛋白胜肽,及其於抗腫瘤治療上的應用。更特別地,本發明係關於一種利用病毒表現系統製造之重組β2-醣蛋白胜肽,包含至少一具有抑制腫瘤細胞增生及移動能等抑制腫瘤功能的β2-醣蛋白I(β2-GPI)胜肽片段。
β2-醣蛋白I(β2-GPI)為一種存在於人類血漿中的醣蛋白並參與許多生理功能,其分子量約50kDa由326個胺基酸組成(SEQ ID No.1),β2-醣蛋白I的胺基酸序列具有五個功能域(domains),前四個功能域由大約60個胺基酸所組成,而第五個功能域含有約80個胺基酸,其前四個domains各含有兩組雙硫鍵結構,這樣的序列結構被稱做短共有重複序列(short consensus repeat,SCR)或補體調控蛋白重複序列(complement control protein repeats,CCP)(Kristensen,T.等人,FEBS Lett 289(2):p.183-6,1991)。
由已發表的文獻指出,β2-GPI存在於動脈硬化的斑塊中,認為β 2-GPI可能參與動脈硬化的形成(Ross,R.,Am Heart J 138(5 Pt 2):p.S419-20,1999;Weber,C.,A.Zernecke與P.Libby,Nat Rev Immunol 8(10):p.802-15,2008)過去實驗室研究顯示β2-GPI具有抑制低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)氧化的保護功能以及降低巨噬細胞吞噬膽固醇(cholesterol)的作用(Lin,K.Y.等人,Life Sci 69(6):p.707-19,2001),但有其他文獻發現
β2-GPI會與氧化性低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)結合,加上APS病患的抗-β2-GPI抗體後更加惡化動脈硬化的過程(Liu,Q.等人,J Lipid Res 43(9):p.1486-95,2002),對於β 2-GPI在動脈硬化中所扮演的角色尚有爭議。
近年已有文獻報導,β2-GPI在Lys317-Lys318的位置被plasmin切割過後的clipped form具有壓制血管新生的能力(Beecken,W.D.等人,Cancer Lett 296(2):p.160-7,2010.;Sakai,T.等人,Am J Pathol 171(5):p.1659-69,2007),在β2-GPI基因剔除的小鼠血管新生的現象會加劇(Passam,F.H.等人,J Autoimmun 35(3):p.232-40,2010)。美國專利申請案US 2013/0165391揭露,一種自β 2-GPI之功能域V衍生的片段296Cys-Ser(胺基酸序列第296至第345),可減低黑色素瘤、乳癌腫瘤的體積,以及減輕因黑色素瘤、乳癌所導致的血管新生。
腫瘤細胞在原位生長超過3mm3時,周圍組織所提供的養分不足提供腫瘤細胞生長,腫瘤細胞會分泌生長因子刺激周圍組織血管新生到腫瘤位置,以提供腫瘤足夠的營養繼續生長,所以血管新生和腫瘤生長間具有密不可分的關係。已有許多文獻指出,具有調節血管新生活性的血漿蛋白,例如angiostatin、endostatin及thrombospondin等蛋白,能影響相關血管新生的生理功能外,也作用在小鼠實驗中影響腫瘤生長和轉移(Cui,R.等人,Cancer Sci 98(6):p.830-7,2007;Gonzalez-Gronow,M.等人,Exp Cell Res 303(1):p.22-31,2005;O'Reilly,M.S.等人,Cell 88(2):p.277-85,1997;Reiher,F.K.等人,Int J Cancer 98(5):p.682-9,2002)。本實驗室過去的研究顯示,β2-GPI能藉由抑制黑色素癌細胞Akt的磷酸化及NF-κ B路徑的活化,抑制黑色素
癌(melanoma)細胞的生長和移行的能力。也在小鼠皮下植入黑色素癌細胞的實驗中,發現純化之β2-GPI能抑制腫瘤細胞的生長,這些實驗結果證實β2-GPI不僅有影響血管新生的功能,也具備抑制腫瘤發展的能力。
2012年本案發明人之實驗室發現,β2-GPI醣蛋白可抑制人類主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cells,HARECs)移行,而細胞進行增生和移行作用亦在腫瘤生長過程中扮演重要的角色(Fearon,ER等人,Cell 61(5):p 759-67,1990,;Wood LD等人,Science 318(5853):p1108-13.2007;Guan X等人, Acta Pharm Sin B .,5(5):p402-18,2015)。因此本發明欲進一步探討,β2-GPI的胜肽抑制腫瘤移行的功能性區域(functional domain),進而達到將β2-GPI胜肽開發成為蛋白質藥物之目的,在此β 2-GPI蛋白胜肽片段傾向越小越好,可以強化作用效率。
本發明基於以上之目的,本發明首先利用病毒與真核細胞表現系統,大量表現不同的β2-GPI胜肽片段,於活體外細胞實驗鑑定出具有抑制腫瘤細胞增生及移動能力的功能性區域,並於活體內(in vivo)實驗測定老鼠皮下注射之腫瘤生長之抑制能力。
於是,本發明之一方面係關於,一種重組β2-醣蛋白I(β2-GPI)胜肽,包含至少一具有抑制腫瘤功能的β2-醣蛋白I胜肽片段。
於本發明之一些具體實施態樣,所述之β2-醣蛋白I胜肽片段係選自功能域1(D1,SEQ ID No.2)、功能域2(D2,SEQ ID No.3)、功能域3(D3,SEQ ID No.4)、功能域4(D4,SEQ ID No.5)及功能域5(D5,SEQ ID No.6)。於本發明之一些具體實施態樣,所述之重組β2-醣蛋白胜肽包含
β2-GPI-D1功能性片段。於本發明之另一些具體實施態樣,所述之重組β2-醣蛋白胜肽包含β2-GPI-D4功能性胜肽片段。
本發明之另一方面,係關於一種用於抑制腫瘤之醫藥組成物,包含如前述之重組β2-醣蛋白I胜肽。於本發明之一項具體實施態樣,所述之重組β2-醣蛋白I胜肽包含β2-醣蛋白I功能域1。於本發明之另一項具體實施態樣,所述之重組β2-醣蛋白I胜肽包含β2-醣蛋白I之功能域4。於本發明之又一項具體實施態樣,所述之重組β2-醣蛋白I胜肽包含β2-醣蛋白I之功能域1-4(β2-GPI-D1234,SEQ ID No.7)。於本發明之又另一項具體實施態樣,所述之重組β2-醣蛋白I胜肽包含β2-醣蛋白I之功能域1-5(β2-GPI-D12345,SEQ ID No.8)。
於本發明之一些具體實施態樣,所述之醫藥組成物係用於抑制腫瘤細胞生長。於本發明之其他具體實施態樣,所述之醫藥組成物係用於抑制腫瘤部位之血管生成。於本發明之其他具體實施態樣,所述之醫藥組成物係用於抑制腫瘤轉移。
圖1為以桿狀病毒表現系統製備人類β2-醣蛋白-I不同胜肽片段之表現質體示意圖。
圖2為用於構築表現人類β2-GPI-D1-Fc、β2-GPI-D4-Fc、β2-GPI-D5-Fc、β2-GPI-D1234-Fc及β2-GPI-D12345-Fc重組蛋白之桿狀病毒載體多選殖區的限制酶切點示意圖。
圖3係顯示利用西方墨點法分析以桿狀病毒表現系統表現人類
β2-GPI-D1-Fc、β2-GPI-D4-Fc、β2-GPI-D5-Fc、β2-GPI-D1234-Fc及β2-GPI-D12345-Fc重組蛋白。
圖4係顯示利用12%SDS-PAGE分析所純化之人類β2-GPI-D1-Fc、β2-GPI-D4-Fc、β2-GPI-D5-Fc、β2-GPI-D1234-Fc及β2-GPI-D12345-Fc重組蛋白的純度與產量。
圖5係顯示從血漿利用肝素親和性管柱純化之β2-醣蛋白-I蛋白,圖(A)顯示β 2-醣蛋白-I之UV光波長280nm吸光值圖譜,其中吸光值及收集管數分別以X軸及Y軸表示。圖(B)顯示利用SDS-PAGE及西方點墨法分析所純化之β2-醣蛋白-I純度。
圖6係顯示以(A)MTT試驗、(B)BrdU細胞增生試驗及(C)細胞計數試驗測試,不同β2-醣蛋白-I胜肽片段處理對於B16-F10老鼠黑色素瘤細胞的存活及細胞增生之抑制作用。
圖7係顯示利用Modified Boyden chamber assay分析處理不同β2-醣蛋白-I胜肽片段重組蛋白抑制B16-F10老鼠黑色素瘤細胞移動情形。
圖8係顯示利用Matrigel invasion assay分析處理血漿β2-醣蛋白-I抑制B16-F10老鼠黑色素瘤細胞侵襲情形。
圖9係顯示利用Matrigel invasion assay分析,處理不同β2-醣蛋白-I胜肽片段重組蛋白抑制B16-F10老鼠黑色素瘤細胞侵襲情形。
圖10為用於建構人類β2-GPI-D1-Flag、β2-GPI-D12-Flag、β2-GPI-D123-Flag、β2-GPI-D1234-Flag及β2-GPI-D12345-Flag之重組慢病毒載體中多選殖區示意圖。
圖11係顯示以圖9之重組慢病毒感染A375人類黑色素瘤細胞(A)及
B16-F10老鼠黑色素瘤細胞(B),大量表現不同β2-醣蛋白-I胜肽片段並以西方點墨法分析蛋白表現結果。
圖12係顯示利用Modified Boyden chamber assay分析,以重組慢病毒表現之不同β2-醣蛋白-I胜肽,β2-GPI-D1、β2-GPI-D12、β2-GPI-D123、β2-GPI-D1234及β2-GPI-D12345重組蛋白抑制B16-F10老鼠黑色素瘤細胞移動情形。
圖13係顯示利用傷口癒合試驗分析,以重組慢病毒表現不同重組β2-醣蛋白-I胜肽,β2-GPI-D1、β2-GPI-D12、β2-GPI-D123、β2-GPI-D1234及β2-GPI-D12345蛋白抑制B16-F10老鼠黑色素瘤細胞移動情形。
圖14係顯示利用Modified Boyden chamber assay分析,以重組慢病毒表現不同重組β2-醣蛋白-I胜肽,β2-GPI-D1、β2-GPI-D12、β2-GPI-D123、β2-GPI-D1234及β2-GPI-D12345蛋白抑制A375人類黑色素瘤細胞移動情形。
於本說明書中所稱的“純化的重組β2-醣蛋白I胜肽”係指,經由表現系統大量表現及純化得到,且包含至少一具有抑制腫瘤功能的β2-醣蛋白I(β2-GPI)功能性胜肽片段之重組蛋白。
於本說明書中所述之“具有抑制腫瘤功能的β2-醣蛋白I(β2-GPI)胜肽片段”意指,經由活體外或活體內試驗確定具有至少一種選自抑制腫瘤細胞生長、增生、抑制腫瘤部位之血管生成及抑制腫瘤細胞移動之腫瘤抑制功能的β2-醣蛋白I(β2-GPI)胜肽片段,包括β2-醣蛋白之功能域1(D1,SEQ ID No.2)、功能域2(D2,SEQ ID No.3)、功能域3(D3,SEQ
ID No.4)、功能域4(D4,SEQ ID No.5)、功能域5(D5,SEQ ID No.6)及其組合胜肽片段。
用於本發明之載體實施例包含,一質體、黏質體或病毒載體。該載體包括一在適宜的形式在宿主細胞中表達之核酸。該載體較佳的是包括連接到該表達之核酸序列的一個或多個調控序列。一調控序列包括啟動子、增強子及其他等表達控制元件(例如T7啟動子、花椰菜鑲嵌病毒35S啟動子或聚腺苷酸化信號)。該等調控序列包括其引導核苷酸序列的持續性表達,如組織特異性調節及/或誘導型序列。該表達載體之設計可取決於此類因素作為選擇該轉形的宿主細胞,所需蛋白質的表達水平等等。該表達載體可以被導入該宿主細胞以產生本發明之多肽或融合蛋白。該宿主細胞為,例如,大腸桿菌、百日咳桿菌、芽孢桿菌、非洲綠猴腎臟細胞、嗜血桿菌、真菌、酵母或中國倉鼠卵巢細胞。於本發明之較佳實例,可使用桿狀病毒或慢病毒表達系統產生β2-醣蛋白I重組蛋白。
一種宿主細胞包含該上述核酸是可被生產的。實施例包括大腸桿菌、昆蟲細胞(例如使用桿狀病毒表達載體)、植物細胞、酵母菌細胞及哺乳動物細胞。
本發明關於一種重組β2-醣蛋白I胜肽片段或融合蛋白,可用於製備一種抗腫瘤組成物,用於易罹患癌症或已罹患癌症之個體(例如人),產生防止腫瘤發生、轉移,抑制腫瘤細胞增生、移動及/或血管生成的功效。該組成物可以經由例如以下所述之方式,或通過本領域任何已知其它方法製備。
例如,該組成物可包含有效劑量之重組β2-醣蛋白I胜肽片
段或融合蛋白及醫藥上可接受之載體,如一磷酸鹽緩衝液或一碳酸氫鹽溶液。該載劑在某種意義上必須為“可接受的”,係指載劑與組成物活性成分相容,且不有害於待治療之患者。基於投藥方式途徑及標準醫藥實務程序之基礎上選擇載劑。適合之藥物載劑與稀釋劑及用於醫藥用品,已描述於雷明登製藥科學(Remington's Pharrmaceuticai Sciences)。
本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明,而該實施範例僅作為輔助說明,並非用於限制本發明之範圍。
首先構築包含β 2-GPI-D12345、β 2-GPI-D1234、β 2-GPI-D2345、β 2-GPI-D1、β2-GPI-D4和β 2-GPI-D5之重組蛋白表現質體,如圖1所示為用於製備人類β2-醣蛋白-I不同胜肽片段之桿狀病毒表現載體pFastBac1,圖2所示為用於構築表現人類β2-GPI-D1-Fc、β2-GPI-D4-Fc、β2-GPI-D5-Fc、β2-GPI-D1234-Fc及β2-GPI-D12345-Fc重組蛋白之桿狀病毒載體多選殖區的限制酶切點。將質體pFastBac1-NT-FLAG以SpeI和KpnI限制酶切割,再以凝膠萃取法進行純化。接著以引子β 2-GPI-SpeI-s(Bac)(GTACTAGTGGACGGACCTGTCCCAAGC,SEQ ID No.9)、β2-GPI-D1-KpnI-a(Bac)(GAGGTACCTGTACATTTCAGAGTGTTGATG,SEQ ID No.10)、β2-GPI-D5-SpeI-s(Bac)(GTACTAGTGCATCTTGTAAAGTACCTGTG,SEQ ID No.11)、β2-GPI-KpnI-a(Bac)(GAGGTACCGCATGGCTTTACATCGGATG,SEQ ID No.
12)、β2-GPI-D4-SpeI-a(Bac)(GCCACTAGTGAAGTAAAATGCCCATTCCC,SEQ ID No.13)和β2-GPI-D4-KpnI-a(Bac)(GAGGTACCTTTACAACTTGGCATGGCAGACCAGTT,SEQ ID No.14),利用PCR擴增包含編碼β 2-GPI之D1至D5之的各段插入(insert),將PCR產物接上TA質體上,再以SpeI和KpnI兩個限制酶把β 2-GPI從TA質體上切割下,接著把此DNA片段與已被SpeI和KpnI切割開的NPFastBac1-NT-FLAG載體進行接合(Ligation),再轉形至DH10Bac勝任細胞後,抽取小量質體DNA,以限制酶確認各插入片段是否有接入載體NPFastBac1-NT-FLAG中,接著送定序確認序列之正確性。
將所得包含各種β 2-GPI胜肽片段之pFastBac1重組質體,轉染於實驗前一天預先種於6 well細胞培養皿中(約五成滿)的Sf9昆蟲細胞。方法如下述:先將Sf9昆蟲細胞種於6孔盤中(約五分滿),置於27℃培養箱培養16小時後,進行昆蟲細胞轉染,準備兩個微量離心管,一管取1μg之Bacmid DNA與100μl無血清培養液,另一管取6μl Cellfectin轉染輔助試劑與100μl無血清培養液,將兩管混合均勻並於室溫靜置30分鐘,再加入0.8毫升無血清培養液混合均勻後將混合液加至Sf9細胞上,置於27℃培養箱轉染6-8小時後再置換回2毫升含血清的培養液培養7天,收集含病毒之細胞培養基,於4℃以500xg離心10分鐘去除細胞及其碎片後保留上清液並保存於4℃。欲大量生產蛋白表現之病毒載體,將第一次取得含病毒之上清液以三十分之一比例加入一個75T培養盤之昆蟲細胞(約五分滿),置於27℃培養箱培養5天,4℃以500 xg離心10分鐘去除細胞及其碎片後保留上清液,將此高濃度病毒溶液保存於4℃。將sf9昆蟲細胞種於6-well plate中(約五成滿),待細胞長至七成滿時,以P3桿狀病毒進行感染。加入事先配置好含有不同稀釋倍率的病毒稀釋液,以滴加方式感
染sf9細胞,並於感染後60小時收集條件培養基(Conditional medium),以西墨點法(Western Blot)進行分析蛋白表現。如圖3之結果顯示,預定包含各種β 2-GPI功能性片段之β 2-GPI-D12345、β 2-GPI-D1234、β 2-GPI-D1、β2-GPI-D4-Fc和β 2-GPI-D5重組蛋白已成功表現於Sf9昆蟲細胞系統。
如前述,本實例是使用Bac-to-Bac桿狀病毒表現系統產製重組蛋白,其中設計將Fc融合蛋白放置於β2-GPI的C'端(圖2),故選擇使用Protein A凝膠來純化β2-GPI重組蛋白。取200μl Protein A親和性凝膠於15ml離心管中。待完全沉降後,移除上清液體,加入5ml 1X TBS緩衝液(以pipette混合均勻),將Protein A親和性凝膠加入玻璃管柱中,並加入5ml之50mM Sodium phosphate/0.75M NaCl pH7.2高鹽溶液清洗,立刻加入5ml 1X TBS緩衝液(pH 7.2)清洗平衡管柱。
將收集好之樣品置於4℃冰箱中以通過管柱來純化蛋白質,幫浦設定流速為1ml/min,待通完管柱後,將管柱由4℃冰箱取出,以15ml 1X TBS(pH 7.2)清洗,接著馬上以每個流份0.5ml之0.1M甘胺酸-HCl(pH 3.5)以重力方式進行沖提,並分別收集5個流份,每個流份收集完後立刻用100μl之1M磷酸鈉緩衝液(Sodium Phosphate buffer,pH 7.2)滴定,並震盪(vortex)以中和甘胺酸的酸性,立即插在冰上暫存。
圖4顯示經純化的β2-GPI-D1-Fc、β2-GPI-D4-Fc、β2-GPI-D5-Fc、β2-GPI-D1234-Fc、β2-GPI-D12345-Fc重組蛋白,以12%SDS-PAGE電泳進行純度及產量分析的結果。另外,從人體血漿中純化β2-GPI做為參考及對照組。於人體血漿中加入過氯酸以沉澱其中大量的血漿蛋白,再以透析方式使用Tris-base緩衝液去除磷酸鹽類,利用肝素親和
性管柱(Heparin affinity column)進行親和性純化,最終以含0.2M NaCl之緩衝溶液進行沖提,收集各管流份後在分光光譜儀280nm_UV下偵測吸光值,繪製成曲線圖,在280nm吸光值可見三個波峰,再以SDS-PAGE展開蛋白質,用西方墨點法確認β2-GPI主要位在第三個波峰(peak III)的位置(圖5A)。圖5B顯示利用SDS-PAGE及西方點墨法分析所純化之β2-醣蛋白-I蛋白的純度。結果顯示所純化到的蛋白在膠體上明顯為單一蛋白,分子量大約為55kDa左右。
利用MTT試驗、BrdU細胞增生試驗與細胞計數試驗,分析重組β2-醣蛋白-I胜肽:β2-GPI-D1、β2-GPI-D4、β2-GPI-D5、β2-GPI-D1234及β2-GPI-D12345等重組蛋白,對於B16-F10老鼠黑色素瘤細胞存活及細胞增生之抑制作用。
首先將Bl6-F10小鼠黑色素瘤細胞以(10μg/ml)β 2-GPI重組蛋白(β2-GPI-D1、β2-GPI-D1234、β2-GPI-D4、β2-GPI-D5和β2-GPI-D12345)處理48小時,並同時處理BSA(negative control)和(200μg/ml)從血漿純化得之β2-GPI達48小時,之後以MTT分析觀察B16-F10細胞的存活率(cell viability)。待處理時間終止後,移除細胞培養液後,以PBS清洗一次後在避光環境下放入100μl的0.5mg/ml MTT溶液,於37℃細胞培養箱作用3小時。待作用時間終止,在避光環境下加入100μl異丙醇,於振盪器上搖晃作用30分鐘後,以手工方式劇烈混合均勻,在於振盪器上搖晃繼續作用30分鐘。最終以ELISA reader測定在波長550nm及690nm下之吸光值,將550nm吸光值減去690nm吸光值即可得淨讀值。
由圖6A之結果發現,β2-GPI-D4、β2-GPI-D5和
β2-GPI-D1234對於B16-F10細胞的存活率和生長沒有顯著的影響,但是β2-GPI-D1與β2-GPI-D12345重組蛋白對於B16-F10細胞,具有與血漿蛋白β 2-GPI相當甚至更佳的細胞抑制作用。另外,於BrdU細胞增生試驗(圖6B)及細胞計數試驗(圖6C)亦得到相似的結果。
接著使用Modified Boyden chamber assay(細胞穿透移行分析法)來探討β 2-GPI重組蛋白對於B16-F10細胞之移行能力的影響。將1.5x 105的B16-F10小鼠黑色素瘤細胞接種在6-well培養盤中培養隔夜,移除舊的細胞培養液後,以PBS清洗一次。使用以2%FBS且不含抗生素的細胞培養液配置之血漿純化β2-GPI(0、200μg/ml)、BSA(200μg/ml)、β2-GPI-D1(10μg/ml)、β2-GPI-D4(10μg/ml)、β2-GPI-D1234(10μg/ml)、β2-GPI-D5(10μg/ml)和β2-GPI-D12345(10μg/ml)處理細胞48小時。待細胞處理時間點終止後,以Trypsin-EDTA使細胞剝落並收集細胞,將10%FBS細胞培養液放入24-孔培養盤中(700μl),再將Insert放上24-well培養盤,並在上層接種3x 104個B16-F10細胞(300μl,以%FBS且不含抗生素的細胞培養液配製),經過24小時後以濕棉花棒將上層細胞擦去,將Insert底部以PBS清洗兩次,以4%副甲醛固定底部細胞後,以結晶紫進行細胞染色1小時,並使用顯微鏡觀察拍照。
另使用細胞穿透移行分析法研究重組β2-醣蛋白-I胜肽對於癌細胞侵襲之抑制功效,細胞以血漿純化β2-GPI(200μg/ml)、BSA(200μg/ml)、Fc(250nM)、β2-GPI-D1(10μg/ml)、β2-GPI-D4(10μg/ml)、β2-GPI-D1234(10μg/ml)、β2-GPI-D5(10μg/ml)和β2-GPI-D12345(10μg/ml)處理細胞48小時。之後將以Trypsin-EDTA使細胞剝落並收集細胞,將1.5x 105的B16-F10小鼠黑色素瘤細胞接種於,一兩腔室分析系統中含有2%FBS之培養基的上層腔室內,並與下層腔室內含有10%FBS之培養基進行培育
24小時。兩層腔室以塗覆有基質膠之微孔過濾膜(孔徑12微米)分隔開。經過培育後,將該經基質膠塗覆之過濾膜染色,並於顯微鏡下定量侵襲入該經基質膠塗覆之過濾膜的細胞數。重複進行該項實驗三次。數據以平均值±SD表示。
由圖7~9之結果顯示,β2-GPI-D1、β2-GPI-D1234和β2-GPI-D12345重組蛋白和血漿中純化的β2-GPI一樣,均具有可抑制B16-F10細胞移行的能力,其中β2-GPI-D1重組蛋白抑制黑色素瘤細胞之移行及侵襲能力的效果最好。
本實例設計五個β2-GPI的重組片段,分別為D1、D12、D123、D1234和D12345,並經由人類慢病毒(lentivirus)傳送進A375和B16-F10黑色素癌細胞使其表現。慢病毒主要是一個將基因產物導入in vitro系統或是動物模型中的實驗工具,最廣泛被使用的功能為導入short-hairpin RNA(shRNA),而使特定的基因表現下降,除此之外,慢病毒也具有另一項功能,可以將一個新的基因導入人類或是動物細胞中,例如患有血友病的小鼠,可藉由導入野生型的血小板因子VIII(platelet-factor VIII),而讓病鼠的病情獲得改善。
首先使用PCR反應,擴增編碼β2-GPI D1、D12、D123、D1234及D12345的DNA片段,使用之引子片段序列如下:用於pLKO-GPI-FLAG(D1),5-NheI-GPI-Sense:5-GTGCTAGCATGATTTCTCCAGTGCTCATC-3(SEQ ID No.15)與3-EcoRI-D2-GPI-Antisense:5-GAATTCCTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCTGTACATTTCAGAGTGT
TGATGGG-3(SEQ ID No.16);用於pLKO-GPI-FLAG(D12),5-NheI-GPI-Sense:5-GTGCTAGCATGATTTCTCCAGTGCTCATC-3(SEQ ID No.17)與3-EcoRI-D2-GPI-Antisense:5-GAATTCCTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCAGCACAGACAGGAAGCTC-3(SEQ ID No.18);用於pLKO-GPI-FLAG(D123),5-NheI-GPI-Sense:5-GTGCTAGCATGATTTCTCCAGTGCTCATC-3(SEQ ID No.19)與3-EcoRI-D3-GPI-Antisense:5-GAATTCCTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCCCTGCATTCTGGTAATTTAGTCC-3(SEQ ID No.20);用於pLKO-GPI-FLAG(D1234),5-NheI-GPI-Sense:5-GTGCTAGCATGATTTCTCCAGTGCTCATC-3(SEQ ID No.21)與3-EcoRI-D4-GPI-Antisense:5-GAATTCCTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCTTTACAACTTGGCATGGCAGACC-3(SEQ ID No.22);用於pLKO-GPI-FLAG(D12345),5-NheI-GPI-Sense:5-GTGCTAGCATGATTTCTCCAGTGCTCATC-3(SEQ ID No.23)與3-EcoRI-GPI-Antisense:5-GAATTCCTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGCATGGCTTTACATCGGATGC-3(SEQ ID No.24)。
利用InsTAcloneTM PCR Cloning Kit #K1213,將準備好的PCR產物,計算好之後,依序加入kit提供的3μl Vector pTZ57R/T、6μl 5X Ligation Buffer、適量之PCR product(PCR產物與vector的分子量比例最好為3:1)、1μl T4 DNA接合酶,再補水(nuclease-free)至總體積為30μl,均勻混合後靜置於室溫1小時,或是於16℃下過夜,之後進行轉形至DH5 α勝任細胞中。
接種1×106的293T在6cm細胞培養皿中,培養16-18小時後,確認細胞密度達70-80%滿時即可以TurboFect轉染試劑進行轉染。接種1×106的293T在6cm細胞培養皿中,培養16-18小時後,確認細胞密度達70-80%滿時即可以TurboFect transfection reagent進行轉染。首先將293T細胞更換4ml新鮮RPMI培養液,接著配置轉染所需之質體DNA,取所需量之質體DNA與TurboFect轉染試劑,加入含有400μl無血清RPMI之1.5ml微量離心管中,混合均勻後靜置15-20分鐘。
將帶有β2-GPI-D1-Flag、β2-GPI-D12-Flag、β2-GPI-D123-Flag、β2-GPI-D1234-Flag、β2-GPI-D12345-Flag編碼DNA片段的慢病毒lentivirus感染黑色素癌細胞A375以及B16-F10,使其大量表現包含不同的β 2-GPI功能區域片段之重組β2-GPI胜肽。方法簡述如下:接種2.5×105的A375和2×105的B16-F10在6cm細胞培養皿中,培養16小時,待細胞密度達30%滿時,將DMEM培養液換成1ml含有8μg/ml PS(Protamine sulfate)的培養液,靜置15-20分鐘。將1ml病毒液加入細胞培養皿,並在P2實驗室培養箱培養24小時,更換新鮮DMEM培養液並繼續培養24小時。
開始以puromycin進行篩選(A375細胞用1μg/ml puromycin;B16-F10細胞用3μg/ml puromycin),由於pLKO AS3w.puro plasmid上帶有puromycin resistant gene,所以感染成功的細胞可存活在puromycin的環境下。篩選三天後,換成puromycin濃度減半的培養液,繼續篩選三天後,換回正常培養液繼代培養兩代後,收集細胞蛋白質或是RNA進行western blot及RT-PCR分析,確定基因確是否有大量表現。
從圖11之結果可以發現,在A375細胞中有正確表現大量的
重組β 2-GPI胜肽(圖11A),而無慢病毒感染的對照組(Control)顯示的確沒有重組β 2-GPI胜肽表現;在B16-F10細胞,也正確表現大量的重組β 2-GPI胜肽(圖11B)。
本實施例亦利用細胞穿透移行分析法,來分析表現不同β2-醣蛋白-I胜肽片段抑制B16-F10老鼠黑色素瘤細胞移動情形。將B16-F10老鼠黑色素瘤細胞以200μg/ml BSA及β2-GPI預先處理48小時,或以經過pLKO AS3w.puro載體對照組或構築體pLKO AS3w.puro β2-GPI包裝之慢病毒感染。然後將B16-F10細胞以trypsin-EDTA使細胞剝落並收集細胞,將細胞置入腔室中。經過24小時,將已經通過濾膜而移動至下層之細胞固定、染色,並計算其數量。
結果發現,經血漿純化之β2-GPI處理過的組別,其細胞移行能力被抑制了,除此之外,以大量表現之重組β2-GPI-D1234以及D12345胜肽片段處理的細胞,其移行能力相較於對照組也被顯著抑制了(圖12B)。由此等實驗結果亦顯示,血漿純化之β2-GPI以及本發明之重組β2-GPI-D1234和D12345胜肽片段,對於小鼠黑色素癌B16-F10細胞具有顯著抑制其細胞移行的功效。
利用傷口癒合試驗分析,在B16-F10老鼠黑色素瘤細胞大量表現重組β2-GP1胜肽對於B16-F10之細胞移動能力的抑制功效。將0.5 x 105個B16-F10細胞接種在12-well培養盤中培養隔夜,之後以PBS清洗一次。以200μg/ml BSA及β2-GPI預先處理48小時,或以經過pLKO AS3w.puro載體對照組或構築體pLKO AS3w.puro β2-GPI包裝之慢病毒感染。利用1000μl tip尖端由培養盤上端由上往下刮除細胞,使培養盤中間產生一道缺
口,使用2%FBS且不含抗生素的細胞培養液清洗去除細胞殘骸,最後使用2%FBS且不含抗生素的細胞培養液繼續培養,並在0、24、48小時以相機記錄缺口的癒合狀況。以Image J計算各時間點的缺口面積,相減後即可得到細胞移動的面積。
由圖13A之照片及圖13B之細胞移行面積定量圖可發現,有表現重組β2-GPI胜肽β2-GPI-D1234和D12345之B16-F10細胞,移行能力受到明顯抑制。因此,推斷β2-GPI的D1234以及D12345胜肽為抑制黑色素癌細胞移動的有效片段。
如同與前述黑色素癌細胞B16-F10一樣的實驗方法,利用穿孔移動試驗(Transwell migration assay)來進行不同長度β2-GPI片段對人類黑色素腫瘤細胞A375移動的觀察,首先將A375處理200μg/nml的BSA或純化之β2-GPI(以2%FBS且不含抗生素的培養液配製)48小時,另外大量表現不同β2-GPI功能域胜肽片段的A375,單純以2%FBS且不含抗生素的培養液處理48小時,之後將細胞接種至FluoroBlokTM Insert上層,在經過24小時後,利用螢光顯微鏡觀察細胞移動到FluoroBlokTM Insert下層的數量(圖14A)。
結果發現,經過純化之β2-GPI處理過的組別移行能力被抑制了21.6%,除此之外大量表現β2-GPI-D1234以及D12345片段的細胞,移行能力也被抑制了,分別被抑制了26.1%以及35.8%(圖14B)。此實驗結果亦顯示,自血漿純化之β2-GPI以及重組β2-GPI-D1234和β2-GPI-D12345胜肽片段,具有抑制黑色素癌A375細胞移行的能力。
綜合上述結果,本發明之β2-GPI重組蛋白確實具有抑制腫瘤細胞增生及移動能力,可供應用於製備治療或預防腫瘤形成、腫瘤細胞增生及腫瘤轉移之醫藥品。相對於由血漿純化之β2-GPI蛋白,本發明之重
組β2-醣蛋白I胜肽,可利用病毒表現系統於真核細胞大量生產,且僅包含至少一選自β2-醣蛋白I之功能性片段,因此在研發作為抗腫瘤蛋白藥物上更具優勢。
雖然本發明已描述其有限的具體實施範例,然習於本發明所屬技術領域者可借助於本說明書之揭示而了解,在不偏離本說明書所揭露之範圍下,可衍生出其他實施態樣。於是,本發明之範圍應受限於所附的申請專利範圍。
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Claims (6)
- 一種用於抑制腫瘤之醫藥組成物,包含一種包含β2-醣蛋白I功能域1(D1,SEQ ID No.2)功能性片段之純化的重組β2-醣蛋白I胜肽,及醫藥上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
- 如請求項1所述之醫藥組成物,其中該純化的重組β2-醣蛋白I胜肽包含β2-醣蛋白I之功能域1-4(β2-GPI-D1234,SEQ ID No.7)。
- 如請求項1所述之醫藥組成物,其中該純化的重組β2-醣蛋白I胜肽包含β2-醣蛋白I之功能域1-5(β2-GPI-D12345,SEQ ID No.8)。
- 如請求項1所述之醫藥組成物,其中該醫藥組成物係用於抑制腫瘤細胞生長。
- 如請求項1所述之醫藥組成物,其中該醫藥組成物係用於抑制腫瘤部位之血管生成。
- 如請求項1所述之醫藥組成物,其中該醫藥組成物係用於抑制腫瘤轉移。
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