ES2567437T3

ES2567437T3 - Oligómeros beta-(1,42) amiloides, derivados de los mismos y anticuerpos para estos, métodos para la preparación de los mismos y uso de los mismos

Info

Publication number: ES2567437T3
Application number: ES04707201.2T
Authority: ES
Inventors: Heinz Hillen; Andreas Striebinger; Carsten Krantz; Achim Moeller; Reinhold Mueller
Original assignee: AbbVie Deutschland GmbH and Co KG
Current assignee: AbbVie Deutschland GmbH and Co KG
Priority date: 2003-01-31
Filing date: 2004-02-02
Publication date: 2016-04-22
Anticipated expiration: 2024-02-02
Also published as: AU2010257323A1; EP2336159A3; US20160090406A1; EP2336159A2; CA3000519A1; KR20090019911A; EP2336161A3; JP2014005295A; EP1594891B1; NZ563779A; CN100595210C; IL205430A0; JP2012250981A; JP2010168385A; EP2336161B1; AU2010257323A8; US9176150B2; US20120034166A1; US20100209346A1; US10464976B2

Abstract

Oligómero de la β(1-42) amiloide truncado N-terminalmente soluble en solución salina fisiológica a diferencia de formas fibrilares más bien globulares que comprende fragmentos de Aβ(X-42), en el cual X representa un número de 10 a 24, pudiendo conseguirse el oligómero según un método que comprende que: (a) el detergente pueda actuar sobre una proteína β(1-42) amiloide monomérica para formar un oligómero A de la Aβ(1-42) soluble en solución salina fisiológica más bien globular a diferencia de formas fibrilares; (b) el efecto del detergente se reduzca y el oligómero A de la Aβ(1-42) se vuelva a incubar para formar un oligómero B de la Aβ(1-42) soluble en solución salina fisiológica más bien globular a diferencia de formas fibrilares; y (c) el oligómero B de la Aβ(1-42) se trate con proteasa, siendo el detergente un compuesto de la fórmula R-X, en el que el resto R representa opcionalmente alquilo ramificado con 6 a 20 átomos de carbono u opcionalmente alquenilo ramificado con 6 a 20 átomos de carbono, y el resto X representa un grupo ácido o su sal, y presentando el oligómero B de la Aβ(1-42) un peso molecular aparente en la electroforesis en gel de SDS de aproximadamente 38 kDa y/o aproximadamente 48 kDa.

Description

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DESCRIPCION

Oligomeros p-(1,42) amiloides, derivados de los mismos y anticuerpos para estos, metodos para la preparacion de los mismos y uso de los mismos

La presente invencion se refiere a oligomeros neuromoduladores a base de formas truncadas de la protema P(1-42) amiloide, un metodo de preparacion espedfico por el cual los oligomeros son obtenibles en una manera reproducible y con rendimiento elevado, asf como al uso de los oligomeros como agentes de diagnostico y terapeuticos.

Los metodos para generar anticuerpos espedficos del oligomero o para encontrar sustancias que puedan de interactuar con los oligomeros y con la formacion de los mismos se describen de la misma manera que los anticuerpos en sf y el uso de los anticuerpos o sustancias como agentes de diagnostico y terapeuticos.

La protema P(1-42) amiloide, denominada tambien Ap(1-42) para abreviar, es un componente central de deposiciones extracelulares insolubles (placas seniles o neunticas) compuestas de protemas, lfpidos, carbohidratos y sales en los cerebros de pacientes con smdrome de Alzheimer y smdrome de Down (C.L. Masters et al. PNAS 82, 4245 - 4249, 1985). Esta protema la cual tiende a polimerizar en un ambiente acuoso puede presentarse en formas moleculares muy diferentes.

Una simple correlacion de la deposicion de la protema insoluble con la aparicion o la progresion de trastornos de demencia tales como, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, ha probado ser poco convincente (R.D. Terry et al Ann. Neurol. 30, 572-58o (l991), D.W. Dickson et al. Neurobiol. Aging 16, 285-298 (1995)). En contraste, la perdida de sinapsis y percepcion cognitiva parece correlacionarse mejor con las formas solubles de Ap(1-42) (L.F. Lue et al. Am. J. Pathol. 155, 853-862, (1999) C.A. McLean et al. Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999)).

Con las formas solubles de Ap(1-42), existen esencialmente dos hipotesis diferentes con respecto a las formas moleculares que debenan ser la causa de trastornos de demencia como, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer.

Por una parte, se postula una accion citotoxica de las protofibrillas Ap(1-42). Estas son formas Ap(1-42) solubles fibrilares de alto nivel de agregacion con pesos moleculares en el intervalo de 150-250 kDa (Arispe et al. PNAS 90. 567 (1993), Lashuel et al., Nature 418, 291 (2002)), que, debido a las propiedades que forman poro, debenan provocar un influjo de calcio no controlado a traves de las membranas de las celulas neuronales.

Por otra parte, se describen derivados Ap(1-42) oligomericos con pesos moleculares en el intervalo de 15-30 kDa (M.P. Lambert et al. PNAS 95, 6448-6453 (1998)). Estos oligomeros no fibrilares se denominan tambien ligandos difundibles y que contribuyen a la demencia derivados de amiloide (ADDL, del ingles Amyloid Derived Dementing Ligands, veanse los documentos US-A 6.218.506 y WO 01/10900, o de Amyloid Derived Diffusible Ligands, vease Lambert et al. supra) pueden encontrarse en preparaciones que muestran una influencia inhibidora en la velocidad de potencializacion a largo plazo de neuronas en cortes de hipocampo.

Sin embargo, el estado de la investigacion de oligomeros previa se caracteriza por mayor incertidumbre sobre las especies actualmente relevantes. La informacion en la literatura difiere en gran medida. De este modo, en el documento US-A 6.218.506 describen ADDL con 3 a 12 subunidades, mientras que los ADDL descritos en el documento WO 01/10900 pueden presentar hasta 24 subunidades.

Mas espedficamente, se discuten al menos dos formas, las cuales presentan un analisis electroforetico de gel en pesos moleculares de condiciones no desnaturalizadas en el intervalo de 27 a 28 kDa y 23 a 24 kDa (documento US-A 6.218.506) o de aproximadamente 26 kDa a 28 kDa (documento WO 01/10900) o 17 kDa y 27 kDa (M.P. Lambert et al. PNAS 95, 6448-6453 (1998)) y en analisis electroforetico en gel SDS en pesos moleculares de condiciones de desnaturalizacion de 17 kDa y 22 kDa (M.P. Lambert et al. PNAS 95, 6448-6453 (1998)) o de aproximadamente 22 kDa a aproximadamente 24 kDa y de aproximadamente 18 kDa a aproximadamente 19 kDa (documento WO 01/10900). Tambien se han comprobado oligomeros Ap(1-42) estables de SDS con pesos moleculares en el intervalo de 8 kDa y 12 kDa por metodos de Western Blot en cerebros de pacientes de Alzheimer (C.A. McLean et al. Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999)).

Las prescripciones de preparacion descritas tienen la desventaja de dar lugar a preparaciones del oligomero no homogeneo.

De este modo, no ha sido posible todavfa proporcionar de una manera reproducible, y mucho menos identificarse de manera inequvoca, las formas moleculares de Ap(1-42) responsables de la neuromodulacion.

Sin embargo, la importancia de una preparacion homogenea puede calibrarse, por ejemplo, a partir del transcurso del primer estudio clmico de inmunizacion activa en pacientes con Alzheimer. La vacunacion con una forma pre- agregada de Ap(1-42) ha dado como resultado efectos secundarios considerables (mengioencefalitis, hemorragias) en algunos de los pacientes, ya que los anticuerpos formados reconocieron tambien las formas Ap(1-42)

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presumiblemente necesarias para el revestimiento celular, lo cual dio como resultado reacciones inflamatorias (D. Schenk,; Nat. Rev. Neurosci. 3, 824-828 (2002)). Mas sobre ADDL y la agregacion de peptidos AU se encuentra, por ejemplo, en: DAHLGREN KARIE N ET AL: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 277, N.° 35, 30 de agosto, 2002 (2002-08-30), paginas 32046-32053; DEMEESTER N ET AL: EUROPEAN JOURNAL OF NEUROSCIENCE, Vol. 13, N.° 11, junio de 2001 (2001-06), paginas 2015-2024; BITAN GAL ET AL: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES, Vol. 100, N.° 1, 7 de enero, 2003 (2003-01-07), paginas 330-33; WURTH C ET AL: JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, LONDON, GB, Vol. 319, N.° 5, 21 de junio, 2002 (2002-06-21), paginas 1279-1290; PIKE C. ET AL.: J. OF NEUROCHEMISTRY, Vol. 64, N.° 1, 1995, paginas 253-265; KIRKITADZE, M. ET AL.: J. MOL. BIOL:, Vol. 312, 2001, paginas 1103-1119; y LAMBERT M P ET AL:, JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY, WILEY INTERSCIENCE, NEW YORK, NY, US, Vol. 79, N.° 3, 1 de noviembre, 2001, paginas 595-605.

Para una terapia habitual que aspira especialmente a neutralizar la forma de protema realmente perjudicial, el requisito indispensable es, por lo tanto, su identificacion y preparacion definida.

Ademas, se ha reportado la aparicion de formas N-terminalmente truncadas de la protema Ap(1-42) junto con la enfermedad de Alzheimer. Ya en 1985 se detectaron tambien formas N-terminalmente truncadas junto a la Ap(1-42) en las deposiciones de cerebros de pacientes de Alzheimer fallecidos (C. Masters et al., PNAS 82, 4245-4249 (1985)). De este modo, tambien se conoce que proteasas particulares presentes en el cerebro, tales como neprilisina (NEP 24.11) o IDE (abreviatura de la enzima que degrada la insulina) pueden degradar Ap(1-42) (D.J. Selkoe, Neuron 32, 177-180 (2001)).

Sin embargo, la importancia de formas N-terminalmente truncadas en la patogenesis de la enfermedad de Alzheimer no es clara (E.B. Lee et al, JBS 278, 4458-4466 (2003)). De manera interesante, algunos pacientes que sufren de enfermedad de Alzheimer o smdrome de Down esporadico o familiar acumulan preferentemente estas formas truncadas (J. Naslund et al. PNAS 91, 8378-8382 (1994), C. Russo et al., Nature 405, 531-532 (2000), T.C. Saido et al., Neuron 14, 457-466, (1995)). Un estudio mas reciente (N. Sergeant et al, J. of Neurochemistry 85, 1581-1591 (2003)) se demostro que el 60 % de todos los peptidos Ap insolubles en cerebros de pacientes con Alzheimer fallecidos se basan en formas N-terminalmente truncadas.

Los anticuerpos que estan dirigidos contra la protema Ap(1-42) monomerica y los fragmentos particulares de los mismos ya se han descrito.

De este modo, los documentos WO 03/016466 y WO 03/016467 se refieren al anticuerpo 266 monoclonal y analogos de los mismos que carecen de un sitio de glicosilacion particular en CDR2. Tambien se conocen las versiones humanizadas de las mismas (Hu-266). En estas publicaciones tambien estan mencionados otros anticuerpos monoclonales que, como el anticuerpo 226, reconocen los epitopes en la region de los aminoacidos 1328 de Ap(1-42). A esto pertenecen los anticuerpos 4G8 (tambien mencionados en Lue et al. (1999), supra) y 1C2. Ademas, McLean et al. (1999), supra, menciona el anticuerpo 1E8 monoclonal, el cual debena reconocer un epitope en la region de los aminoacidos 18-22 de Ap(1-42).

Ademas, se conoce un numero de anticuerpos adicionales, los cuales reconocen epitopes de las secuencias N- terminales de Ap(1-42). A esto pertenecen el anticuerpo 6E10 monoclonal comercialmente disponible (tambien mencionado en el documento WO 01/10900; Naslund et al. (1994), supra; Sergeant et al. (2003), supra) y los anticuerpos 3D6 y 10D5 monoclonales (vease el documento WO 03/016467) asf como Ban50 y NAB228 (Lee et al (2003) supra).

Ademas, debe hacerse mencion de los anticuerpos WO2, 21F12 y 3D6 monoclonales asf como del suero ADA42 policlonal (Sergeant et al. (2003), supra).

Una vision general de anticuerpos anti-Ap(1-42), que se encuentran en pruebas preclmicas, puede encontrarse en Schenk et al. (2002), supra.

El objetivo de la presente invencion se basa en proporcionar las formas moleculares que provocan un aumento de la accion causal neuromoduladora y, en particular que dana la neurona de Ap(1-42) y en trastornos de demencia tales como la enfermedad de Alzheimer y el smdrome de Down, la invencion lo resuelve por oligomeros Ap(1-42) particulares a base de formas Ap(1-42) truncadas que son conseguibles en forma de preparaciones homogeneas con un metodo especial de la protema Ap(1-42) monomerica. El metodo de preparacion permite a la protema Ap(1- 42) sintetica de peptido, que es deficientemente soluble en medios acuosos, convertirse en oligomeros solubles definidos con rendimiento elevado.

El objeto de la presente invencion son, por lo tanto, los objetos definidos en las reivindicaciones.

De este modo, la presente invencion se refiere a oligomeros de la protema p(1-42) amiloide, los oligomeros que tienen un peso molecular aparente de aproximadamente 15 kDa, 20 kDa, 38 kDa o 48 kDa en electroforesis en gel

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de SDS, o a derivados de tales oligomeros que tienen un peso molecular que puede o no haber cambiado de acuerdo a la derivatizacion.

De esta manera, la presente invencion se refiere a un oligomero de la P(1-42) amiloide truncado N-terminalmente soluble en solucion salina fisiologica y a diferencia de formas fibrilares mas bien globulares que comprende fragmentos de Ap(X-42), en el cual X representa un numero de 10 a 24, pudiendo conseguirse el oligomero segun un metodo que comprende que:

(a) el detergente pueda actuar sobre una protema P(1-42) amiloide monomerica para formar un oligomero A de la

Ap(1-42) soluble en solucion salina fisiologica y mas bien globular a diferencia de formas fibrilares;

(b) el efecto del detergente se reduzca y el oligomero A de la Ap(1-42) se vuelva a incubar para formar un

oligomero B de la Ap(1-42) soluble en solucion salina fisiologica y mas bien globular a diferencia de formas

fibrilares; y

(c) el oligomero B de la Ap(1-42) se trate con proteasa,

siendo el detergente un compuesto de la formula R-X, en el que el resto R representa opcionalmente alquilo ramificado con 6 a 20 atomos de carbono u opcionalmente alquenilo ramificado con 6 a 20 atomos de carbono, y el resto X representa un grupo acido o su sal, y presentando el oligomero B de la Ap(1-42) un peso molecular aparente en la electroforesis en gel de SDS de aproximadamente 38 kDa y/o aproximadamente 48 kDa.

La protema p(1-42) amiloide es un polipeptido que tiene 42 aminoacidos que se deriva de la protema precursora amiloide (APP, por sus siglas en ingles) por procesamiento proteolttico. Esto incluye tambien, ademas de variantes humanos, las isoformas de la protema p(1-42) amiloide presentes en los organismos diferentes de los humanos, en particular otros mairnferos, sobre todo ratas.

Especialmente, la protema p(1-42) amiloide es protema p(1-42) amiloide humana. Las protemas p(1-42) amiloides humanas incluyen especialmente la protema con la secuencia de aminoacido SEQ ID NO:1, asf como mutemas y variantes alelicas de las mismas derivadas de la secuencia anteriormente mencionada, especialmente por intercambio de aminoacido. En esta conexion, deben mencionarse sobre todo las siguientes sustituciones de aminoacidos: A21G, E22K, E22Q, E22G y D23N. De este modo, las mutemas o variantes alelicas de la protema p(1- 42) amiloide incluyen, de acuerdo con la invencion, especialmente protemas con una secuencia de aminoacido SEQ ID NO:1 en donde uno o mas aminoacidos seleccionados de entre alanina 21, acido glutamico 22 y acido aspartico 23 han sido sustituidos por otro aminoacido, preferentemente seleccionado de entre glicina, lisina, glutamina y asparagina. Particularmente importante de acuerdo con la invencion son sustituciones en la posicion 22 especialmente con glutamina o glicina.

Ademas, la protema p(1-42) amiloide es protema p(1-42) amiloide de ratas. Las protemas p(1-42) amiloide de ratas incluyen especialmente la protema con la secuencia de aminoacido SEQ ID NO:2, asf como mutemas y variantes alelicas de la misma derivadas de la secuencia anteriormente mencionada, especialmente por intercambio de aminoacido. En esta conexion, deben mencionarse sobre todo aquellas sustituciones de aminoacido que corresponden a las sustituciones de aminoacido explicadas para la secuencia humana.

La protema p(1-42) amiloide puede prepararse por metodos sinteticos de peptido conocidos o recombinantemente. Ademas, un numero de estas protemas estan comercialmente disponibles. Lo mismo se aplica tambien a mutemas y variantes alelicas.

Los oligomeros de acuerdo con la invencion son obtenibles por oligomerizacion de la protema p(1-42) amiloide y tratamiento con proteasa posterior. La oligomerizacion comprende una agregacion no covalente de la protema amiloide monomerica, de manera que puede suponerse que los oligomeros estan compuestos de una pluralidad de monomeros de protema p(1-42) amiloides.

Dependiendo del grado de oligomerizacion, los oligomeros presentan diferentes pesos moleculares. De este modo, es posible asignar pesos moleculares aparentes a los oligomeros por medio de la electroforesis en gel desnaturalizada. Estos son aproximadamente 15 kDa para el oligomero A1, aproximadamente 20 kDa para el oligomero A2, aproximadamente 38 kDa para el oligomero B1 y aproximadamente 48 kDa para el oligomero B2, cuando la electroforesis en gel se lleva a cabo en condiciones estandar desnaturalizadas (gel de Tris-glicina, 4-20 %, vease Lammli UK, Nature 227, 680-685 (1970)), presentando las siguientes protemas estandar los siguientes pesos moleculares aparentes en condiciones identicas: miosina 250 kDa, albumina de suero bovino 98 kDa, glutamina hidrogenasa 64 kDa, carboanhidrasa 36 kDa, mioglobina 30 kDa, lisozima 16 kDa, aprotinina 6 kDa, cadena B de insulina 4 kDa (vease azul estandar pretenido). De acuerdo a otro aspecto, los pesos moleculares para los oligomeros B son de aproximadamente 64 a 90 kDa, cuando la electroforesis en gel se lleva a cabo en condiciones estandar nativas (gel de Tris-glicina, 4-20%) presentando las siguientes protemas estandar los pesos moleculares aparentes en condiciones identicas: miosina 250 kDa, albumina de suero bovino 98 kDa, glutamina hidrogenasa 64 kDa, carboanhidrasa 36 kDa, mioglobina 30 kDa, lisozima 16 kDa, aprotinina 6 kDa, cadena B de insulina 4 kDa (vease azul estandar pretenido). Derivados de los oligomeros presentan un peso molecular modificado

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correspondiente, en caso necesario, a la derivatizacion.

De acuerdo a otro aspecto, los oligomeros de acuerdo con la invencion se caracterizan por una afinidad para celulas neuronales. Puede suponerse que los oligomeros se unen a protemas de superficie celular particulares, especialmente receptores.

Se describe tambien a un metodo para determinar la union de un oligomero de acuerdo con la invencion a una estructura celular predefinida, cuyo metodo comprende

i) dejar al oligomero de acuerdo con la invencion actuar sobre la estructura celular y

ii) determinar si el oligomero de acuerdo con la invencion se une a la estructura celular.

De acuerdo a otro aspecto, los oligomeros de acuerdo con la invencion se caracterizan por una accion neuromoduladora. Esta accion neuromoduladora puede manifestarse en sf misma especialmente en una supervivencia reducida de celulas neuronales, por ejemplo, celulas de neuroblastoma (neurotoxicidad) cuando al menos un oligomero de acuerdo con la invencion se deja actuar sobre un cultivo de estas celulas. A este respecto, puede evaluarse la supervivencia de las celulas de una manera conocida per se, por ejemplo, determinando el grado de apoptosis provocada por la accion de los oligomeros de acuerdo con la invencion. Para este proposito, estan disponibles metodos de ensayo adecuados, por ejemplo, metodos colorimetricos basados en bromuro de 3-[4,5- dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio (MTT). Esta accion neuromoduladora puede manifestarse in vivo especialmente en una modulacion de la velocidad de activacion de las neuronas.

Tambien se describe un metodo para determinar la actividad, especialmente la neurotoxicidad, de un oligomero de acuerdo con la invencion, cuyo metodo comprende i) dejar al oligomero de acuerdo con la invencion actuar sobre celulas y ii) determinar si se modifica el estado de las celulas.

Para metodos anteriormente mencionados, el oligomero de acuerdo con la invencion se puede proporcionar en la manera descrita anteriormente, por ejemplo, en forma de una de las composiciones anteriormente mencionadas. Las celulas o estructuras celulares se proporcionan convenientemente in vitro, especialmente como cultivos celulares o en estructuras celulares tambien como homogenatos. En la presente, las celulas neuronales y especialmente las celulas de neuroblastoma sirven para determinar la neurotoxicidad. Alternativamente, es tambien posible proporcionar las celulas in vivo, especialmente como parte de un organismo, por ejemplo, de un animal experimental, o ex vivo.

El estado de las celulas se determina usualmente al menos una vez antes de, y al menos una vez despues de la accion del oligomero. Si la comparacion entre el estado antes de y el estado despues de la accion resulta en una desviacion, el oligomero probado tiene actividad.

El tipo del estado que se determina depende del tipo de la actividad que se determina. Una neurotoxicidad puede determinarse determinando la supervivencia, por ejemplo. Para este proposito, la proporcion de las celulas vivas basadas en el numero total de las celulas antes de y despues de la accion del oligomero puede determinarse y compararse entre sf.

Con base en los metodos anteriores para determinar la union o actividad, es posible, de acuerdo con modalidades particulares, probar sustancias ya sea que inhiban la union de oligomeros de acuerdo con la invencion y/o modulen su actividad, es decir, la reduzcan especialmente o la detengan (inhiban) esencialmente de manera completa o la aumenten.

Para este proposito, el metodo se lleva a cabo en principio al menos dos veces, una vez en presencia de la sustancia de prueba y una vez mas sin la sustancia de prueba. Para este fin, la sustancia de prueba se agrega a los oligomeros usualmente despues de que han sido proporcionados.

Sin embargo, si se pretende determinar si una sustancia que se prueba afecta la formacion de los oligomeros o no, la sustancia se agrega convenientemente antes de la formacion de los oligomeros, es decir, antes de que hayan sido proporcionados, por ejemplo, al o los reactivos utilizados para la formacion del oligomero. De este modo, es posible llevar a cabo el metodo de preparacion de acuerdo con la invencion agregando la sustancia de prueba y luego determinar si y a que grado se forman los oligomeros. Para este proposito, puede determinarse si los productos del metodo obtenidos en esta forma tienen las propiedades de los oligomeros de acuerdo con la invencion, es decir, por ejemplo, su peso molecular, capacidad de union y actividad.

En el sentido de una accion neuromoduladora tan pronunciada como sea posible, cabe mencionar los oligomeros B. En relacion a esto, tambien cabe mencionar derivados de estos oligomeros, estando realzados especialmente los oligomeros basados en una protema Ap(1-42) N-terminalmente truncada.

Por razones de diseno de proceso, los oligomeros A o los oligomeros B pueden producirse como mezcla en forma de composiciones que, ademas de los oligomeros, comprenden ademas pequenas proporciones de otros

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polipeptidos, especialmente la protema P(1-42) amiloide monomerica y, cuando sea apropiado, tambien formas de alto peso molecular de la protema P(1-42) amiloidea agregada. Las composiciones de esta clase se someten asimismo material objeto de la presente invencion y se distinguen especialmente por la proporcion del o de los oligomeros de la invencion que es al menos el 70 % en peso, preferentemente al menos el 90 % en peso y especialmente al menos el 95 % en peso, con base en la totalidad de las protemas derivadas a partir de la protema P(1-42) amiloidea. En una preparacion de los oligomeros A, la proporcion del oligomero A2 (banda de 20 kDa en el gel SDS) es al menos el 50 % en peso y preferentemente al menos el 70 % en peso y especialmente al menos el 85 % en peso. En una preparacion de los oligomeros B, la proporcion de los oligomeros B1 y B2 (bandas de 38 kDa y 48 kDa en el gel SDS) es al menos el 60 % en peso, preferentemente al menos el 75 % en peso y especialmente al menos el 90 % en peso.

Los oligomeros de acuerdo con la invencion pueden tambien estar derivatizados. El proposito de tales derivatizaciones puede ser, por ejemplo, modular las propiedades fisicoqmmicas de los oligomeros, especialmente con respecto a la biodisponibilidad, proveer los oligomeros de una marca detectable o inmovilizarlos, por ejemplo, para poder acoplarlos a los soportes. El etiquetado y la inmovilizacion son particularmente importantes para aplicaciones de diagnostico.

Las etiquetas adecuadas familiares en el campo bioqmmico de la protema se conocen suficientemente por el experto. Estas incluyen etiquetas fluorescentes, por ejemplo, derivados de fluorescema y de tetrametilrodamina particulares, etiquetas luminiscentes, etiquetas colorimetricas, etiquetas radioactivas y etiquetas magneticas asf como etiquetas con afinidad para parejas de union complementarias, tales como derivados de biotina y de estreptavidina.

Con respecto a los pesos moleculares aparentes, se debe tomar en cuenta que los derivados de oligomero presentan pesos moleculares que pueden haberse incrementado correspondientemente, comparados con los oligomeros no derivados, pero siendo el numero de agregacion identico. De este modo, por ejemplo, un derivado de biotina basado en el oligomero B1 Ap(1-42) con un peso molecular de 38 kDa en el gel SDS presenta un peso molecular de 42 kDa.

De acuerdo a una modalidad de realizacion especial de la presente invencion, los oligomeros estan reticulados. Los reticuladores adecuados se conocen por el experto y representan reactivos usualmente bifuncionales tales como formaldelddo, glutardialdelddo, suberato de disuccinimidilo, ditiobis(propionato de succinimidilo), tartrato de disuccinimidilo, tartrato de disulfosuccinimidilo, adipimidato de dimetilo, pimelidato de dimetilo, suberimidato de dimetilo, 3,3-ditiobispropionimidato de dimetilo, ester de N-y-maleinimidobutiloxisuccinimida, 4-(N-

maleinimidometil)ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo, (4-yodacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo y 3-(2- piridiltio)-propionato de N-succinimidilo.

Tales oligomeros reticulados tienen la ventaja de que estan estabilizados y de que su oligomerizacion usualmente ya no es reversible. Por lo tanto, sirven especialmente para el uso en sistemas de prueba de diagnostico o como inmunogenos para la produccion de anticuerpos espedficos de los oligomeros.

Los oligomeros de acuerdo la invencion comprenden fragmentos de la protema P(1-42) amiloide. Se da preferencia a aquellos fragmentos que son obtenibles por la accion de las proteasas de origen natural. Especialmente los fragmentos obtenibles por proteolisis en tampones fisiologicos en condiciones no desnaturalizadas poseen una estabilidad proteolttica incrementada en comparacion con la protema P(1-42) amiloide. Se da preferencia a fragmentos obtenibles por la accion de las endopeptidasas. De acuerdo a una forma de realizacion especial de la presente invencion, los fragmentos son obtenibles por la accion de tripsina, quimotripsina, termolisina, elastasa, papama o endoproteinasa GluC. Segun otro aspecto, se da preferencia a aquellos fragmentos cuyos oligomeros de acuerdo con la invencion se caracterizan por una accion de neuromodulacion. Para una explicacion mas detallada de este aspecto, se hace referencia a las realizaciones correspondientes en la accion neuromoduladora de los oligomeros de la protema P(1-42) amiloide.

Estructuralmente, los fragmentos estan caracterizados especialmente por que se derivan de la protema P(1-42) amiloide por desdoblamiento de secuencias N-terminales. Por lo tanto, en estas secuencias N-terminales se trata de fragmentos que tienen hasta 23, preferentemente hasta 21 y especialmente hasta 19 aminoacidos de la secuencia N-terminal de la protema P(1-42) amiloide. Por consiguiente, se trata, de acuerdo con la invencion, de fragmentos de la protema AP(1-42) cuya secuencia comprende los aminoacidos 24 a 42 contiguos, preferentemente 22 a 42 y especialmente 20 a 42. En las secuencias N-terminales que se desdoblan se trata de secuencias con al menos 9 y especialmente con al menos 11 aminoacidos de la secuencia N-terminal de la protema P(1-42) amiloide. Por consiguiente, se da preferencia, de acuerdo con la invencion, especialmente a fragmentos de la protema P(1-42) amiloide que estan truncados N-terminalmente de 9 a 21 y especialmente 11 a 19 aminoacidos. Estos fragmentos corresponden a la formula AP(X-42), en donde X de 10 a 22 y especialmente 12 a 20. De acuerdo con la invencion, los fragmentos AP(X-42) estan seleccionados preferentemente, por lo tanto, de entre los siguientes fragmentos: AP(12-42), AP(13-42), AP(14-42), AP(15-42), AP(16-42), AP(17-42), AP(18-42), AP(19-42), AP(20-42). Los fragmentos especiales son el fragmento P(20-42) amiloide obtenible por la accion de termolisina asf como el fragmento P(12-42)

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amiloide obtenible por la accion de endoproteinasa GluC.

El metodo de acuerdo con la invencion para preparar los oligomeros puede incluir esencialmente tres etapas, la primera de las cuales es opcional pero ventajosa, la segunda etapa se requiere absolutamente para la preparacion de los oligomeros A y B y la tercera etapa sirve para preparar los oligomeros B de acuerdo con la invencion.

La etapa 1 se refiere al desdoblamiento de la protema. Para este proposito, los agentes de ruptura de union de hidrogeno tales como, por ejemplo, hexafluoroisopropanol (HFIP) pueden dejarse actuar sobre la protema. Los tiempos de accion de unos pocos minutos, por ejemplo, aproximadamente 10 a 60 minutos, son suficientes cuando la temperatura de accion es de aproximadamente 20 a 50 °C y especialmente aproximadamente 35 a 40 °C. La disolucion subsiguiente del residuo evaporado hasta sequedad, preferentemente en forma concentrada, en solventes organicos adecuados miscibles con tampones acuosos, tal como, por ejemplo, sulfoxido de dimetilo (DMSO), resulta en una suspension de al menos la protema parcialmente desdoblada, que puede utilizarse en la etapa 2 del metodo de acuerdo con la invencion. Si se requiere, la suspension madre puede almacenarse entretanto a temperatura baja, por ejemplo a aproximadamente -20 °C.

Alternativamente a la etapa 1 anterior, la protema puede alojarse en una solucion preferentemente acuosa, ligeramente acfdica, por ejemplo, en aproximadamente 10 mM de solucion de HCl acuosa. Despues de un tiempo de incubacion de usualmente unos pocos minutos, los componentes insolubles se eliminan por centrifugacion. Son apropiados unos pocos minutos para 10 000 g. Estas etapas de metodo se llevan a cabo preferentemente a temperatura ambiente, es decir, a una temperatura en el intervalo de 20 a 30 °C. El sobrenadante obtenido despues de la centrifugacion contiene la protema P(1-42) amiloide y puede almacenarse entretanto a temperatura baja, por ejemplo a aproximadamente -20 °C.

La etapa 2 se refiere a la oligomerizacion de la protema para dar los oligomeros A. Para este proposito, se deja actuar un detergente sobre la protema opcionalmente al menos parcialmente desdoblada hasta que se ha producido el oligomero A de manera suficiente.

Se usan preferentemente detergentes ionicos, especialmente detergentes anionicos, de la formula (I):

R-X,

en donde

el radical R es opcionalmente alquilo ramificado con 6 a 20 y preferentemente 10 a 14 atomos de carbono u opcionalmente alquenilo ramificado con 6 a 20 y preferentemente 10 a 14 atomos de carbono, el radical X es un grupo acfdico o sal del mismo, estando seleccionado X preferentemente desde entre -COO'M+, - SO3M y sobre todo -OSO3M y M+ es un cation de hidrogeno o un cation inorganico u organico preferentemente seleccionado de cationes de metal alcali y metal alcalinoterreo y cationes de amonio.

Resultan ventajosos detergentes de la formula (I), en donde R es un alquilo no ramificado del cual los radicales alqu- 1-ilo deben mencionarse especialmente. Resulta especialmente preferente dodesilsulfato de sodio (SDS). El acido laurico y el acido oleico pueden utilizarse tambien ventajosamente. La sal de sodio del detergente lauroilsarcosino (tambien conocido como sarkosyl NL-30 o Gardol®) es tambien particularmente ventajosa.

El tiempo de la accion del detergente depende especialmente de si -y en caso afirmativo, a que grado- la protema sometida a la oligomerizacion esta desdoblada. Si, de acuerdo con la etapa 1, la protema se trato de antemano con un agente de ruptura de union de hidrogeno, es decir, especialmente con hexafluoroisopropanol, los tiempos de accion en el intervalo de unas pocas horas, ventajosamente de aproximadamente 1 a 20 y especialmente de aproximadamente 2 a 10 horas, son suficientes cuando la temperatura de accion es aproximadamente de 20 a 50 °C y especialmente de aproximadamente 35 a 40 °C. Si una protema menos desdoblada o esencialmente no desdoblada es el punto de partida, son apropiados tiempos de accion correspondientemente mas prolongados. Si la protema P(1-42) amiloide se pretrato, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento indicado anteriormente como una alternativa a la etapa 1 o si la protema se introduce directamente en la etapa 2, los tiempos de accion en el intervalo de aproximadamente 5 a 30 horas y especialmente de aproximadamente 10 a 20 horas son suficientes cuando la temperatura de accion es aproximadamente de 20 a 50 °C y especialmente de aproximadamente 35 a 40 °C. Despues de la incubacion, los componentes insolubles se eliminan por centrifugacion de manera ventajosa. Son apropiados unos pocos minutos para 10 000 g.

La concentracion del detergente que se elige depende del detergente utilizado. Si se utiliza SDS, es apropiada una concentracion en el intervalo del 0,01 al 1 % en peso, preferentemente del 0,05 al 0,5 % en peso, por ejemplo, de aproximadamente el 0,2 % en peso. Si se utilizan acido laurico o acido oleico, son apropiadas concentraciones algo mas elevadas, por ejemplo, en un intervalo del 0,05 al 2 % en peso, preferentemente del 0,1 al 0,5 % en peso, por ejemplo, de aproximadamente el 0,5 % en peso.

La accion del detergente debena realizarse a una concentracion salina de aproximadamente en el intervalo

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fisiologico. De este modo, son apropiadas concentraciones de NaCI especiales en el intervalo de 50 a 500 mM, preferentemente de 100 a 200 mM y especialmente a aproximadamente 140 mM.

La solucion resultante que contiene los oligomeros A, es decir, especialmente los oligomeros A1 y/o A2, pueden almacenarse entretanto a temperatura baja, por ejemplo, a aproximadamente -20 °C. Puede someterse como tal a la reaccion adicional para dar los oligomeros B, o pueden anadirse primero etapas de acabado o de purificacion adicionales, con las cuales se logra especialmente una concentracion adicional de al menos uno de los oligomeros A. Especialmente, se pueden separar los oligomeros por medio de metodos cromatograficos a partir de otros componentes de protema presentes en la solucion y especialmente aquellos derivados de la protema P(1-42) amiloide. Particularmente adecuados para este proposito son los metodos de cromatograffa de afinidad, que pueden emplear, por ejemplo, anticuerpos espedficos, es decir, especialmente tambien los anticuerpos espedficos del oligomero de acuerdo con la invencion.

La etapa 3 se refiere a la oligomerizacion para dar los oligomeros B. Se elige una composicion que contiene un oligomero A como reactivo para esta etapa. A este respecto, los oligomeros A son, de acuerdo con la invencion, productos intermedios importantes para la preparacion de los oligomeros B. Si esta composicion procede de la etapa 2, contiene regularmente un detergente y una concentracion salina en el intervalo fisiologico. En este caso, es apropiado reducir la accion del detergente o la concentracion salina. Esto puede realizarse reduciendo la concentracion del detergente o de la sal, por ejemplo, diluyendo convenientemente con agua o un tampon de la concentracion salina inferior, por ejemplo, Tris-HCl, pH 7,3. Los factores de dilucion en el intervalo de aproximadamente 2 a 10, ventajosamente en el intervalo de aproximadamente 3 a 8 y especialmente de aproximadamente 4 han demostrado ser adecuados. La reduccion de la accion del detergente tambien puede lograrse agregando sustancias que pueden neutralizar la accion del detergente. Ejemplos de estas incluyen sustancias capaces de complejar los detergentes, como sustancias capaces de estabilizar celulas en el curso de medidas de purificacion y de extraccion, por ejemplo, copoffmeros en bloque de EO/PO particulares, especialmente el copoffmero en bloque con el nombre comercial Pluronic® F68. Tambien son adecuados alquilfenoles alcoxilados y especialmente etoxilados como t-octilfenoles etoxilados de la serie Triton® X, especialmente Triton® X100, 3-(3- colamidopropildimetilamonio)-1-propansulfonato (CHAPS®) o esteres grasos de sorbitan alcoxilado y especialmente etoxilados como aquellos de la serie Tween®, especialmente Tween® 20, en intervalos de concentracion alrededor o por encima de la respectiva concentracion micelar cntica.

Subsecuentemente, la solucion se incuba hasta que se ha producido suficiente oligomero B. Los tiempos de accion en el intervalo de varias horas, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 10 a 30 horas y especialmente en el intervalo de aproximadamente 15 a 25 horas son suficientes cuando la temperatura de accion es aproximadamente de 20 a 50 °C y especialmente de aproximadamente 35 a 40 °C. La solucion puede entonces concentrarse y pueden eliminarse por centrifugacion posibles residuos. Tambien en este caso han demostrado ser apropiados unos pocos minutos para 10 000 g. El sobrenadante obtenido despues de la centrifugacion contiene oligomeros B.

La solucion resultante que contiene los oligomeros B, es decir, especialmente los oligomeros B1 y/o B2, puede almacenarse entretanto a temperatura baja, por ejemplo, a aproximadamente -80 °C. Puede seguir utilizandose como tal o pueden anadirse primero etapas de acabado o de purificacion adicionales. Respecto a esto, se hace referencia a las realizaciones anteriores para medidas correspondientes relacionadas con los oligomeros A.

Tambien pueden llevarse a cabo etapas de acabado o de purificacion adicionales para el proposito de eliminar completamente de manera esencial el detergente utilizado para preparar los oligomeros. Por ejemplo, los oligomeros B pueden precipitarse primero a partir de la solucion que contiene detergente, extraerse y volverse a disolver en un medio libre de detergente. Las medidas para precipitar las protemas se conocen de manera suficiente por el experto. De acuerdo con la invencion, la adicion de acido acetico metanolico acuoso ha mostrado ser apropiada. Sin unirse a un mecanismo particular, el detergente o la variacion de las concentraciones de detergente y salinas parecen colocar la protema en formas solubles definidas que se difieren claramente de la forma de partida de la protema disuelta en tampones fisiologicos acuosos, como puede detectarse, por ejemplo, por medio de electroforesis de gel nativa o desnaturalizada o cromatograffa de permeacion de gel. Esto es asombroso, puesto que los detergentes son normalmente capaces de desaglomerarse, es decir, desensamblarse en subunidades, mientras que, de acuerdo con la invencion, los oligomeros definidos se obtienen a partir de un monomero propenso a la agregacion.

Los oligomeros de acuerdo con la invencion de fragmentos de la protema P(1-42) amiloide se preparan a partir de oligomeros de la protema P(1-42) amiloide por proteolisis. De esta manera, se trata con proteasa una solucion resultante de la etapa de metodo 3 de acuerdo con la invencion. Si se alcanza el grado de proteolisis deseado, se desactiva la proteasa de manera conocida en general. Los oligomeros resultantes pueden extraerse entonces apoyandose en este caso en maneras de proceder ya descritas asf como procesarse, en caso necesario, por etapas de acabado o de purificacion adicionales.

Para la preparacion de derivados de oligomeros de acuerdo con la invencion, se lleva a cabo convenientemente el metodo descrito anteriormente de acuerdo con la invencion en una protema P(1-42) amiloide derivada ya apropiadamente. Alternativamente, es tambien posible derivar el oligomero, pero la estructura del oligomero no

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debena modificarse. Las medidas qmmicas de protema adecuadas se conocen por el experto.

La reticulacion de los oligomeras de acuerdo con la invencion o derivados de los mismos puede llevarse a cabo de una manera conocida per se. Si, por ejemplo, se utiliza glutaraldelddo como agente de reticulacion, una solucion resultante a partir de la etapa de metodo 2 o 3 de acuerdo con la invencion puede tratarse con una solucion de glutaraldelddo. Despues de unas pocas horas a temperatura ambiente, los oligomeros habran reaccionado con el glutaraldelddo. La reaccion puede entonces detenerse de una manera conocida per se haciendo reaccionar el exceso de glutaraldelddo con reactivos generalmente conocidos para este proposito, tales como etanolamina. Dependiendo de si los oligomeros A o B de la invencion se reticulan, se obtiene una solucion de oligomeros reticulados de acuerdo con la invencion que se denominan A-CL o B-CL.

Es posible, en particular para los oligomeros B opcionalmente reticulados o derivados de los mismos, siguiendo la smtesis de los mismos, incrementar de nuevo la concentracion salina, sin deteriorar la estabilidad de los oligomeros. Esto es importante con respecto al uso de los oligomeros, por ejemplo, en el caso de que sean apropiados para condiciones fisiologicas de uso (aplicaciones celulares, aplicaciones in vivo).

Los oligomeros de acuerdo con la invencion y las composiciones que los contienen se distinguen por su homogeneidad y estabilidad. Estos son solubles en medios fisiologicos, por ejemplo, solucion salina fisiologica, y difieren de formas fibrilares por su apariencia mas bien globular. Estos tienen la ventaja de presentar una estructura espacial que es claramente diferente de otras formas de Ap(1-42), en particular el monomero, oligomeros no toxicos, la molecula precursora APP que comprende Ap(1-42), protofibrillas y fibrillas. Estos son particularmente por lo tanto adecuados para generar anticuerpos espedficos tanto in vivo como in vitro y hacen posible, por ejemplo, una inmunizacion activa espedfica. A este respecto, puede ser crucial utilizar para la inmunizacion unicamente aquellos oligomeros que provocan la enfermedad. Otras formas de Ap(1-42), tal como la molecula monomerica u oligomeros mas pequenos, pueden ser necesarios para funciones de senal importantes en el organismo. Del mismo modo, la eliminacion de las deposiciones fibrilares que son presumiblemente importantes para el revestimiento celular puede danar al organismo.

De la misma manera, es posible implementar posibilidades de terapia utilizando los oligomeros homogeneos de acuerdo con la invencion y las composiciones que contienen los oligomeros, tales como inmunizacion pasiva, el uso de estabilizadores de las formas oligomericas y el uso de agonistas o antagonistas receptores (parciales). De este modo, una preparacion del oligomero homogenea hace tambien posible una produccion espedfica de anticuerpos policlonales o monoclonales para la inmunizacion pasiva. Es tambien posible encontrar moleculas receptoras o moleculas de senal que son relevantes para la enfermedad, que estan influenciadas por la forma oligomerica, con los oligomeros de acuerdo con la invencion y las composiciones que contienen estos.

Debido a su participacion en los procesos fisiologicos asociados con la protema p amiloide, los oligomeros de acuerdo con la invencion poseen un valor diagnostico y terapeutico. De este modo, es objeto de la presente invencion el uso de oligomeros de acuerdo con la invencion y derivados de los mismos, opcionalmente en forma de una composicion correspondiente, en metodos de deteccion diagnosticos in vitro e in vivo.

Los procesos fisiologicos asociados con la protema p amiloide incluyen aquellos asociados con las deposiciones de las protemas amiloides (amiloidosis). Estas incluyen tanto aquellos procesos que resultan en las modificaciones estructurales del tejido nervioso y son importantes, por ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer y el smdrome de Down, como aquellos procesos que afectan otros tejidos, tales como microangiopadas amiloides, por ejemplo, angiopada amiloide congodlica (cAa, por sus siglas en ingles).

Otro aspecto de la presente invencion es el uso de oligomeros de acuerdo con la invencion y derivados de los mismos, opcionalmente en forma de una composicion correspondiente, para generar anticuerpos espedficos de los oligomeros.

Aqrn, los oligomeros de acuerdo con la invencion basados en formas truncadas de la protema Ap(1-42) son de importancia particular: debido al termino N faltante, se puede generar una respuesta inmune claramente mas selectiva que con la protema Ap(1-42). Aunque el termino N altamente inmunogenico en la protema Ap(1-42) clasica produce predominantemente anticuerpos que son espedficos para esta region de la molecula, por ejemplo, los anticuerpos 6E10 (F. Signet) y BAM-10 (empresa Sigma, St. Louis), que, conforme a la informacion del fabricante, estan dirigidos contra el termino N (6E10: Ap(1-17) y BAM-10 Ap(1-12)), los anticuerpos obtenibles con los oligomeros de acuerdo con la invencion basados en formas Ap(1-42) truncadas reconocen regiones espedficas de oligomeros, por lo que se logra una selectividad comparada a otras formas Ap(1-42). Esta ventaja puede utilizarse en particular para la vacunacion activa, ya que la respuesta inmune mas selectiva que resulta despues de la inoculacion (contra APP, formas monomericas, protofibrillas, fibrillas, placas) tambien implica pocos efectos secundarios (por ejemplo, hemorragias cerebrales, deterioro de actividad neurotrofica fisiologica de la forma monomerica in situ). Tambien se pueden preparar y seleccionar mejor anticuerpos especialmente monoclonales para una inmunizacion pasiva, es decir, una terapia de anticuerpo.

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Un aspecto de este uso es la generacion de anticuerpos espedficos de oligomeros en el contexto de una terapia.

Por lo tanto, otro objeto de la presente invencion es el uso de un oligomero de acuerdo con la invencion o derivados del mismo en el campo terapeutico, en particular como vacuna.

Tal vacuna representa usualmente una composicion farmaceutica que contiene al menos un oligomero de acuerdo con la invencion y/o al menos un derivado del mismo de acuerdo con la invencion. Para este proposito, es posible utilizar en particular una de las composiciones de acuerdo con la invencion, que incluyen dos o mas oligomeros, o una combinacion de diferentes composiciones. La composicion puede ademas contener un portador fisiologicamente digerible y, opcionalmente, excipientes adicionales, por ejemplo, inmunoestimuladores.

Aunque en principio pueden elegirse cualesquiera portadores adecuados, el tipo del portador usualmente depende de la ruta de administracion. De este modo, las vacunas de acuerdo con la invencion pueden formularse en una forma adecuada particular para administracion parenteral, por ejemplo, intravenosa, intramuscular y subcutanea. En estos casos, el portador incluye preferentemente agua, solucion salina, alcohol, una grasa, una cera y/o un tampon.

Es posible utilizar cualquiera de una multiplicidad de inmunoestimulantes en las vacunas de acuerdo con la invencion. Por ejemplo, puede incluirse un adyuvante. La mayona de los adyuvantes contienen una sustancia que debena proteger el antfgeno del catabolismo rapido, tal como hidroxido de aluminio o un aceite mineral, asf como una protema derivada del lfpido A, Bortadella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Los adyuvantes adecuados estan comercialmente disponibles de manera usual, por ejemplo, adyuvantes de Freund completos o incompletos; AS-2; sales de aluminio tales como hidroxido de aluminio (como un gel, donde sea apropiado) o fosfato de aluminio; sales de calcio, sales de hierro o sales de zinc; una suspension insoluble de tirosina acilada; azucares acilados; polisacaridos cationica o anionicamente derivados; polifosfacenos; microesferas biologicamente degradables; monofosforil lfpido A. Las citocinas tales como GM-CSF o interlucina-2, -7 o -12 pueden utilizarse asimismo como adyuvantes.

La presente invencion incluye ademas un metodo para producir anticuerpos, el cual comprende

i) inmunizar un huesped con al menos un oligomero de acuerdo con la invencion, derivado del mismo o una composicion; y

ii) obtener un suero del huesped que contiene un anticuerpo producido como una respuesta a la inmunizacion.

De acuerdo con una forma de realizacion particular para producir los anticuerpos, la inmunizacion se lleva a cabo administrando cocteles de inmunizacion que contienen las mezclas de varios oligomeros o derivados de oligomeros de acuerdo con la invencion. En particular, puede ser apropiado administrar en el curso de tal metodo varios cocteles de inmunizacion cuya composicion oligomerica difiere.

Si los oligomeros o derivados de oligomeros que se utilizan no son, o son solo debilmente inmunogenicos, su inmunogenicidad puede incrementarse acoplandolos a los portadores, preferentemente a una protema portadora tal como hemocianina de lapa californiana (kLh, por sus siglas en ingles), hemocianina de cangrejo herradura (LPH), albumina de suero de bovino (BSA) u ovalbumina (OVA). Para este proposito, existe un numero de posibilidades de acoplamiento comunmente disponibles conocidos por el experto. Un ejemplo conveniente posible es la reaccion con glutaraldehndo, por ejemplo, incubando el oligomero o mezcla oligomerica con un peptido adecuado o mezcla peptfdica en agua o un solvente acuoso. Esta reaccion puede llevarse a cabo convenientemente a temperatura del entorno, es decir, usualmente a temperatura ambiente. Sin embargo, puede tambien ser conveniente reducir o incrementar ligeramente la temperatura. La reaccion produce usualmente el resultado deseado dentro de pocas horas, un tiempo de reaccion de, por ejemplo, 2 horas esta dentro del intervalo usual. La concentracion del glutaraldetndo esta usualmente en ppm a un intervalo en %, convenientemente de 10 ppm hasta el 1 %, preferentemente de 10 ppm al 0,5%. La optimizacion de los parametros de reaccion estan dentro de las experiencias del experto y debe tenerse en cuenta que los oligomeros A y B o derivados oligomericos sean estables en las condiciones de reaccion elegidas.

Los cocteles de inmunizacion se preparan combinando primero los componentes que se utilizan. Resulta ventajoso incubar inicialmente la mezcla de componentes resultante. Esto se realiza convenientemente a temperatura del entorno, es decir, usualmente a temperatura ambiente. Sin embargo, puede ser conveniente enfriar o calentar ligeramente tal mezcla. El periodo de incubacion es usualmente de pocos minutos a unas pocas horas, un tiempo de incubacion de una hora que ha demostrado ser ventajoso.

Los cocteles de inmunizacion contienen, ademas del antfgeno, excipientes usualmente adicionales, en particular adyuvantes comunmente utilizados para la inmunizacion, por ejemplo adyuvante de Freund. Especialmente, el adyuvante de Freund completo se utiliza para la primera inmunizacion, mientras cualesquiera inmunizaciones adicionales se llevan a cabo con adyuvante de Freund incompleto. El coctel de inmunizacion se prepara agregando el antfgeno (inmunogeno), preferentemente en la forma de la mezcla del componentes anteriormente descrita, al o a los excipientes. A este respecto, por regla general, se emulsiona el antfgeno.

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Como huespedes sirven particular roedores o tambien conejos. Estos u otros huespedes adecuados se inyectan con los cocteles de inmunizacion, preferentemente subcutaneamente. Los niveles de anticuerpos pueden determinarse utilizando un inmunoensayo, por ejemplo, utilizando competitivamente un antisuero de oveja dirigido contra el huesped IgG y un oligomero etiquetado. De este modo, puede decidirse hacia el fin de la inmunizacion si el huesped determinado es adecuado para producir anticuerpos. Si, por ejemplo, se llevan a cabo cuatro inmunizaciones, es posible determinar el nivel de anticuerpos despues de la tercera inmunizacion y luego obtener anticuerpos a partir de animales que presentan un nivel de anticuerpos suficiente.

Los anticuerpos producidos se obtienen preferentemente tomando sangre de los huespedes durante un periodo de varias semanas o meses. Finalmente, puede desangrarse el huesped. El suero que contiene los anticuerpos deseados puede obtenerse a partir de la sangre obtenida en una manera conocida per se. El suero completo asf obtenido puede, si se requiere, purificarse adicionalmente por el experto para concentrar la fraccion de anticuerpo presente en el mismo y en particular los anticuerpos que reconocen el oligomero.

De acuerdo con una modalidad particular de este metodo, se selecciona al menos un anticuerpo del suero, cuyo anticuerpo reconoce espedficamente el oligomero utilizado como inmunogeno, un derivado del mismo o al menos un oligomero o derivado del mismo presente en la composicion utilizada como inmunogeno. En este contexto, la especificidad significa una afinidad de union mas elevada del anticuerpo para el inmunogeno que para otro, en particular protemas relacionadas, espedficamente en comparacion con la protema P(1-42) amiloide monomerica asf como con los agregados de protema P(1-42) amiloide oligomerica o multimerica que presentan un peso molecular mas elevado que los oligomeros de acuerdo con la invencion. Es tambien posible obtener de esta manera anticuerpos espedficos de oligomeros monoclonales. Para este fin, sin embargo, se da preferencia a la eliminacion a partir del tejido del bazo de los huespedes e, iniciando a partir de los linfocitos del bazo asf obtenidos, establecerse en los hibridomas de manera usual que producen los anticuerpos monoclonales.

Descripcion detallada de la produccion del anticuerpo

Los linfocitos B que, en su totalidad, contienen un repertorio de anticuerpos compuesto de cientos de millones de diferentes especificidades del anticuerpo son parte del sistema inmune de un mairnfero. Una respuesta inmune normal a un antfgeno determinado significa la seleccion de uno o mas anticuerpos de tal repertorio, el cual se une espedficamente al antfgeno, y el exito de una respuesta inmune se basa al menos parcialmente en la capacidad de tales anticuerpos para reconocer espedficamente (y finalmente eliminar) el antfgeno estimulante y e ignorar, a este respecto, otras moleculas en el ambiente de tales anticuerpos.

La utilidad de los anticuerpos que reconocen espedficamente un antfgeno objetivo particular ha conducido al desarrollo de la tecnologfa de anticuerpos monoclonal. La tecnologfa de hibridoma estandarizada permite ahora la produccion de anticuerpos con una especificidad sencilla para un antfgeno de interes. Mas recientemente, se han desarrollado tecnicas de anticuerpo recombinantes tales como el cribado in vitro de bancos de anticuerpo. Estas tecnicas permiten producir asimismo anticuerpos con una unica especificidad para un antfgeno de interes.

En el metodo de acuerdo con la invencion, el antfgeno de interes puede dejarse actuar en el repertorio del anticuerpo ya sea in vivo o in vitro.

Segun una forma de realizacion, el antfgeno se deja actuar sobre el repertorio inmunizando un animal in vivo con el antfgeno. Este enfoque in vivo puede comprender ademas establecer a partir de los linfocitos de un animal un numero de hibridomas y seleccionar un hibridoma que secreta una union espedficamente del anticuerpo al antfgeno. El animal que se inmuniza puede ser, por ejemplo, un raton, una rata, un conejo, un pollo, un camello o una oveja, o puede ser una version transgenica de cualquiera de los animales mencionados anteriormente, por ejemplo, un raton transgenico con genes de inmunoglobulina humanos, que produce anticuerpos humanos despues de un estfmulo inmunogenico. Otros tipos de animales que pueden inmunizarse incluyen ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID, por sus siglas en ingles) que han sido reconstituidos con celulas sangumeas mononucleares perifericas humanas (ratones hu-PBMC SClD quimericos) o con celulas linfoides o precursores de las mismas, asf como ratones que han sido tratados con irradiacion corporal total letal, luego protegidos contra radiacion con celulas de medula espinal a partir de un raton con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) y subsecuentemente trasplantados con linfocitos humanos funcionales (el denominado sistema “Trimera” ). Otro tipo de un animal que se inmuniza es un animal (por ejemplo, un raton) en cuyo genoma un gen endogeno que codifica el antfgeno de interes ha sido desviado (“anulado”), por ejemplo, por recombinacion homologa, de manera que, despues de la inmunizacion con el antfgeno, el animal reconoce el antfgeno como extrano. Es obvio para el experto que los anticuerpos policlonales o monoclonales producidos por este metodo se caracterizan y seleccionan utilizando metodos de cribado conocidos que incluyen pero no se limitan a tecnicas de ELISA.

Segun otra forma de realizacion, el antfgeno se deja actuar sobre el repertorio del anticuerpo in vitro cribando una biblioteca de anticuerpo recombinante con el antfgeno. La biblioteca de anticuerpo recombinante puede expresarse, por ejemplo, en la superficie de los bacteriofagos o en la superficie de celulas de levadura o en la superficie de celulas bacteriales. En una variedad de formas de realizacion, la biblioteca de anticuerpo recombinante es una biblioteca scFv o una biblioteca Fab, por ejemplo. De acuerdo con otra modalidad, las bibliotecas del anticuerpo se

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expresan como fusiones de protema de ARN.

Otro enfoque para producir tales anticuerpos comprende una combinacion de enfoques in vivo e in vitro. Por ejemplo, el antigeno puede dejarse actuar sobre el repertorio del anticuerpo inmunizando un animal in vivo con el antigeno y luego cribando in vitro con el antfgeno una biblioteca de anticuerpo recombinante preparada a partir de las celulas linfoides de tal animal o una biblioteca de anticuerpo de dominio unico (por ejemplo, con cadenas pesadas y/o ligeras). Segun otro enfoque, el antfgeno se deja actuar sobre el repertorio del anticuerpo inmunizando un animal in vivo con el antigeno y luego sometiendo una biblioteca de anticuerpo recombinante o biblioteca de dominio unico producida a partir de celulas linfoides de tal animal para maduracion de la afinidad. Segun otro enfoque, el antigeno se deja actuar sobre el repertorio del anticuerpo inmunizando un animal in vivo con tal antigeno, luego seleccionando las celulas que producen anticuerpos individuales que secretan un anticuerpo de interes y obteniendo ADNcs de estas celulas seleccionadas para la region variable de las cadenas pesadas y ligeras (por ejemplo, por medio de PCR) y expresando tales regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras en celulas huespedes de mairnfero in vitro (lo cual se denomina metodo de anticuerpo de linfocitos seleccionado o SLAM, por sus siglas en ingles), por lo que se deja seleccionar y manipular ademas las secuencias geneticas de anticuerpos seleccionados. Ademas, los anticuerpos monoclonales pueden seleccionarse por clonacion de expresion expresando los genes del anticuerpo para las cadenas pesadas y ligeras en celulas de marnffero y seleccionando aquellas celulas de mamnfero que secretan un anticuerpo con la afinidad de union deseada.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invencion es proporcionar antfgenos definidos para tamizacion y tamizacion opuesta. De esta manera, pueden seleccionarse aquellos anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo, pero no otras formas de la protema Ap(1- 42), APP, fibrillas amiloides o placas amiloides y un numero de otros antfgenos y tejidos no relacionados.

Es suficientemente conocido por el experto que las selecciones del anticuerpo se basan en antfgenos bien definidos. Si, por el contrario, se utilizan menos antfgenos bien definidos, no son suficientemente selectivos. En breve, la actuacion y seleccion in vitro es similar a la cromatograffa por afinidad, con “ligandos” para el antfgeno deseado que se separa a partir de aquellos que no se unen al antfgeno con suficiente afinidad. El grado de concentracion de los anticuerpos deseados a partir del enorme agrupamiento de otros anticuerpos es por lo tanto una consecuencia directa de la calidad del antfgeno. Sorprendentemente, los oligomeros de acuerdo con la invencion y derivados de los mismos representan antfgenos que pueden utilizarse para anticuerpos relevantes y selectivos, adecuados, concentrados y se pueden separar eficientemente de anticuerpos que reconocen otras formas asociadas con la protema Ap(1-42) asf como otros antfgenos no relacionados.

Los metodos de la invencion para producir anticuerpos pueden utilizarse para producir distintos tipos de anticuerpos. Estos incluyen esencialmente anticuerpos humanos, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados y anticuerpos de injerto de CDR asf como porciones de union de antfgeno de los mismos.

A continuacion se describen metodos para producir tales anticuerpos. A este respecto, se diferencia entre enfoques in vivo, enfoques in vitro o una combinacion de ambos.

Enfoques in vivo

A partir de las celulas que producen anticuerpos generados in vivo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse por medio de tecnicas estandarizadas, tales como la tecnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497) (vease tambien Brown et al. (1981) J. Immunol 127:539-46; Brown et al. (1980) J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75). La tecnologfa para producir hibridomas de anticuerpo monoclonales es suficientemente conocida (vease generalmente R. H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analices, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M.L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-35). Brevemente, una lmea celular inmortalizada (normalmente un mieloma) se combina con linfocitos (normalmente esplenocitos o celulas de nodulo linfatico o linfocitos de sangre periferica) de un mamnfero inmunizado con el oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo, y los sobrenadantes de cultivo de las celulas de hibridoma resultantes se criban para identificar un hibridoma el cual produce un anticuerpo monoclonal con especificidad para el oligomero de acuerdo con la invencion o para un derivado del mismo. Cualquiera de los muchos protocolos suficientemente conocidos para la fusion de linfocitos e inmortalizar lmeas celulares puede aplicarse para este proposito (vease tambien G. Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Gefter et al. Somatic Cell Genet., citada supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., citada supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citada supra). Ademas, el experto apreciara que existen diversas variaciones de tales metodos que son asimismo utiles. Normalmente, la lmea celular inmortalizada (por ejemplo, una lmea celular de mieloma) se deriva de las mismas especies de marnffero como los linfocitos. Por ejemplo, los hibridomas murinos pueden establecerse combinando linfocitos a partir de un raton inmunizado con una preparacion inmunogenica de acuerdo con la invencion con una lmea celular de raton inmortalizada. Las lmeas celulares inmortalizadas preferentes son lmeas celulares de mieloma de raton que son sensibles a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina (medio de HAT). Cualquier numero de lmeas celulares de mieloma puede utilizarse de manera estandar como un companero de fusion, por ejemplo, las lmeas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas lmeas celulares

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de mieloma estan disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. Normalmente, las celulas de mieloma de raton sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de raton utilizando polietilenglicol (PEG). Las celulas de hibridoma que resultan de la fusion se seleccionan entonces utilizando medio HAT, por lo que se aniquilan celulas de mieloma improductivamente fusionadas y no fusionadas (los esplenocitos no fusionados mueren despues de varios dfas, puesto que no estan transformados). Las celulas de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales que reconocen espedficamente el oligomero de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo se identifican al cribar los sobrenadantes del cultivo de hibridoma para tales anticuerpos, por ejemplo, utilizando un ensayo ELISA estandar para seleccionar aquellos anticuerpos que pueden unir espedficamente el oligomero de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo.

Dependiendo del tipo del anticuerpo deseado, pueden utilizarse varios animales huespedes para inmunizacion in vivo. Puede utilizarse un huesped que expresa por sf mismo una version endogena del antigeno de interes. Alternativamente, puede utilizarse un huesped, el cual se ha vuelto deficiente para una version endogena del antigeno de interes. Por ejemplo, se mostro que ratones que se hadan vuelto deficientes para una protema endogena particular a traves de la recombinacion homologa en el gen endogeno correspondiente (es decir, ratones inactivados) generaron una respuesta humoral a la protema, con la cual se inmunizaron y por lo tanto pueden utilizarse para la produccion de anticuerpos monoclonales de afinidad elevada a la protema (vease, por ejemplo, Roes, J. et al. (1995) J. Immunol. Methods 183:231-237; Lunn, M.P. et al. (2000) J. Neurochem. 75:404-412).

Una multiplicidad de marnfferos no humanos son huespedes adecuados para la produccion de anticuerpos no humanos frente al oligomero de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo. Estos incluyen ratones, ratas, pollos, camellos, conejos y cabras (y versiones inactivadas de los mismos), aunque se da preferencia a ratones para la produccion del hibridoma. Ademas, puede utilizarse un animal huesped no humano que expresa un repertorio del anticuerpo humano para producir esencialmente anticuerpos humanos frente a un antfgeno humano con especificidad dual. Los animales no humanos de esta clase incluyen animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que soportan los transgenes de inmunoglobulina humana (ratones hu-PBMC SCID quimericos) y quimeras de irradiacion humanas/de raton que se describen en mayor detalle posteriormente.

Segun una forma de realizacion, el animal inmunizado con un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo es un marnffero no humano, preferentemente un raton, que es transgenico debido a los genes de inmunoglobulina humana de manera que el mairnfero no humano realiza anticuerpos humanos tras una estimulacion antigenica. Normalmente, los transgenes de inmunoglobulina para cadenas pesadas y ligeras con configuracion de lmea germinal humana se introducen dentro de tales animales que han sido alterados de manera que sus lugares de cadena pesada y ligera endogenos son inactivos. Si tales animales se estimulan con antfgeno (por ejemplo, con un antfgeno humano), se producen anticuerpos derivados de las secuencias de inmunoglobulina humana (es decir, anticuerpos humanos). Es posible hacer a partir de los linfocitos de tales animales anticuerpos monoclonales humanos por medio de la tecnologfa de hibridoma estandarizada. Para una descripcion adicional de los ratones transgenicos con inmunoglobulinas humanas y su uso en la produccion de anticuerpos humanos, veanse, por ejemplo, los documentos US 5.939.598, WO 96/33735, WO 96/34096, WO 98/24893 y WO 99/53049 (Abgenix Inc.), y los documentos US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016, US 5.770.429, US 5.814.318, US 5.877.397 y WO 99/45962 (Genpharm Inc.); vease asimismo MacQuitty, J.J. y Kay, R.M. (1992) Science 257:1188; Taylor, L.D. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368:856-859; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding, F.A. y Lonberg, N. (1995) Ann. M Y. Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild, D. M. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851; Mendez, M. J. et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Green, L.L. y Jakobovits, A. (1998) J. Exp. Med. 188:483495; Green, L.L. (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; Yang, X.D. et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66:401-410; Gallo, M.L. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:534-540.

De acuerdo con otra forma de realizacion, el animal, que se inmuniza con un oligomero de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo, puede ser un raton con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), que ha sido reconstituido con celulas sangumeas mononucleares perifericas humanas o celulas linfoide o precursores de las mismas. Tales ratones, que denominan ratones hu-PBMC SCID quimericos, producen respuestas de inmunoglobulina humana tras una estimulacion antigenica, como se ha demostrado. Para una descripcion adicional de estos ratones y su uso para generar anticuerpos, vease, por ejemplo, Leader, K.A. et al. (1992) Immunology 76:229-234; Bombil, F. et al. (1996) Immunobiol. 195:360-375; Murphy, W.J. et al. (1996) Semin. Immunol. 8:233241; Herz, U. et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113: 150-152; Albert, S.E. et al. (1997) J. Immunol. 159:13931403; Nguyen, H. et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41:901-907; Arai, K. et al. (1998) J. Immunol. Methods 217:79-85; Yoshinari, K. y Arai, K. (1998) Hybridoma 17:41-45; Hutchins, W.A. et al. (1999) Hybridoma 18:121-129; Murphy, W.J. et al. (1999) Clin. Immunol. 90:22-27; Smithson, S.L et al. (1999) Mol. Immunol. 36:113-124; Chamat, S. et al. (1999) J. Infect. Diseases 180:268-277; y Heard, C. et al. (1999) Molec. Med. 5:35-45.

De acuerdo con otra forma de realizacion, el animal, que se inmuniza con un oligomero de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo, es un raton que ha sido tratado con una irradiacion corporal total letal, luego se ha protegido de la radiacion con celulas de medula espinal a partir de ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID, por sus siglas en ingles) y trasplantados subsecuentemente con linfocitos humanos funcionales. Este tipo de quimera, denominado sistema Trimera, se utiliza para producir anticuerpos monoclonales humanos inmunizando los

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ratones con el antfgeno de interes y luego produciendo anticuerpos monoclonales utilizando tecnolog^a de hibridoma estandarizada. Para una descripcion adicional de estos ratones y de su uso para generar anticuerpos, vease, por ejemplo, Eren, R. et al. (1998) Immunology 93:154-161; Reisner, Y y Dagan, S. (1998) Trends Biotechnol. 16:242246; Ilan, E. et al. (1999) Hepatology 29:553-562; y Bocher, W.O. et al. (1999) Immunology 96:634-641.

Enfoques in vitro

Como una alternativa para producir tales anticuerpos por inmunizacion y seleccion, los anticuerpos pueden identificarse y aislarse cribando bibliotecas de inmunoglobulina combinatorias recombinantes con un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo para aislar miembros de la biblioteca de inmunoglobulina que se unen espedficamente al oligomero o derivado del mismo. Estan disponibles comercialmente equipos para generar y para cribar bibliotecas de expresion (por ejemplo, el sistema de anticuerpos de fagos recombinantes de Pharmacia, catalogo N.° 27-9400-01; y el kit de expresion en fagos SurfZAP® de Stratagene, catalogo N.° 240612). En muchas formas de realizacion, la biblioteca de expresion es una biblioteca scFv o una biblioteca Fab. La tecnica de expresion en fago para cribar bibliotecas de anticuerpo recombinante ha sido descrita adecuadamente. Ejemplos de metodos y compuestos que pueden utilizarse particularmente de manera ventajosa para generar y cribar bibliotecas de expresion de anticuerpo pueden encontrarse, por ejemplo, en McCafferty et al. documentos WO 92/01047, US 5.969.108 y EP 589 877 (describe en particular la expresion de scFV), Ladner et al. documentos US 5.223.409; US 5.403.484, US 5.571.698, US 5.837.500 y EP 436 597 (describe, por ejemplo, la fusion pIII); Dower et al. documentos WO 91/17271, US 5.427.908, US 5.580.717 y EP 527 839 (describe en particular la expresion de Fab); Winter et al. solicitud internacional WO 92/20791 y documento EP 368.684 (describe en particular la clonacion de secuencias para dominios de inmunoglobulina variables); Griffiths et al. documentos US 5.885.793 y EP 589 877 (describe en particular el aislamiento de anticuerpos humanos frente a antfgenos humanos utilizando bibliotecas recombinantes); Garrard et al. documento WO 92/09690 (describe en particular tecnicas de expresion de fago); Knappik et al. documento WO 97/08320 (describe la biblioteca de anticuerpo recombinante humana HuCal); Salfeld et al. documento WO 97/29131 (describe la produccion de un anticuerpo humano recombinante frente a un antfgeno humano (factor de necrosis tumoral humano alfa) asf como maduracion de afinidad in vitro del anticuerpo recombinante) y Salfeld et al. solicitud provisional estadounidense N.° 60/126.603 y las solicitudes de patente basadas en la misma (asimismo describe la produccion de anticuerpos humanos recombinantes frente al antfgeno humano (interleucina-12 humana) asf como la maduracion de afinidad in vitro del anticuerpo recombinante).

Descripciones adicionales para el cribado de bibliotecas del anticuerpo recombinante pueden encontrarse en publicaciones cientfficas tales como Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:35763580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982; McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554; y Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86.

Como una alternativa a utilizar los sistemas de expresion bacteriofagos, las bibliotecas de anticuerpo recombinantes pueden expresarse en la superficie de celulas de levadura o celulas bacterianas. En el documento WO 99/36569 se describen metodos para preparar y cribar bibliotecas que estan expresadas en la superficie de celulas de levadura. En el documento WO 98/49286 se describen en mayor detalle metodos para preparar y cribar bibliotecas que estan expresadas en la superficie de celulas bacterianas.

Una vez que se ha identificado un anticuerpo de interes de una biblioteca combinatorial, los ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo se afslan por medio de tecnicas biologicas moleculares estandarizadas, por ejemplo, por medio de amplificacion de PCR de ADN a partir del paquete de expresion (por ejemplo, el fago) que ha sido aislado durante el cribado de la biblioteca. Las secuencias de nucleotido de genes para cadenas de anticuerpo ligeras y pesadas, que pueden utilizarse para preparar cebadores de PCR, se conocen por el experto. Una multiplicidad de tales secuencias se describen, por ejemplo, en Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, Departamento de Salud y Servicios Sociales de los Estados Unidos, Publicacion NIH N.° 91-3242 y en la base de datos para secuencias de la lmea germinal humana BVASE.

Un tal anticuerpo o porcion de anticuerpo puede producirse expresando recombinantemente los genes para cadenas de inmunoglobulina ligeras y pesadas en una celula huesped. Para expresar recombinantemente un anticuerpo, una celula huesped se transfecta con uno o mas vectores de expresion recombinantes que transportan fragmentos de ADN que codifican las cadenas de inmunoglobulina ligera y pesada del anticuerpo, por lo que se expresan las cadenas ligeras y pesadas en la celula huesped y se secretan preferentemente en el medio en el cual se cultivan las celulas huespedes. Los anticuerpos pueden aislarse a partir de este medio. Los metodos de ADN recombinantes estandarizados se utilizan para obtener genes para cadenas de anticuerpos ligeras y pesadas, para insertar estos genes dentro de vectores de expresion recombinantes y para introducir los vectores en celulas huespedes. Los metodos de esta clase se describen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds.). Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en el document US 4.816.397 de Boss et al.

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Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmented de VH y VL del anticuerpo de interes, estos fragmentos de ADN pueden manipularse ademas con tecnicas de ADN recombinantes estandarizadas, por ejemplo, para convertir los genes de regiones variables a genes para cadenas de anticuerpo de longitud total, a genes para fragmentos Fab o a un gen scFv. Estas manipulaciones comprenden unir un fragmento de ADN que codifica VL o VH operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra protema, por ejemplo, una region de anticuerpo constante o un enlazador flexible. El termino “operativamente enlazado” significara aqu que los dos fragmentos de ADN se enlazan uno del otro de tal manera que las secuencias de aminoacido codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el cuadro.

El ADN aislado que codifica la region de VH puede convertirse a un gen para una cadena pesada de longitud total enlazando operativamente el ADN que codifica la region VH con otra molecula de ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de regiones constantes de cadena pesada humana son suficientemente conocidos (vease, por ejemplo, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, Departamento de Salud y Servicios Sociales de los Estados Unidos, Publicacion NIH N.° 91-3242) y pueden obtenerse fragmentos de ADN que abarcan estas regiones por medio de amplificacion de PCR estandarizada. La region constante de la cadena pesada puede ser una region constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgE, IgM o IgD, siendo preferentemente una region constante de IgG1 o IgG4. Para obtener un gen de un fragmento Fab de la cadena pesada, el ADN que codifica VH puede enlazarse operativamente a otra molecula de ADN que codifica unicamente la region CH1 constante de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la region VL puede convertirse a un gen para una cadena ligera de longitud total (asf como un gen para una cadena ligera Fab) enlazando operativamente el ADN que codifica VL a otra molecula de ADN que codifica la region CL constante de la cadena ligera. Las secuencias de genes de la region constante de la cadena ligera humana son suficientemente conocidos (vease Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, Departamento de Salud y Servicios Sociales de los Estados Unidos, Publicacion NIH N.° 91-3242) y pueden obtenerse fragmentos de ADN que abarcan estas regiones por medio de amplificacion de PCR estandarizada. La region constante de la cadena ligera puede ser una region kappa o lambda constante, siendo preferente una region kappa constante.

Para generar un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL pueden enlazarse operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, la secuencia de aminoacido (Gly4-Ser)3 de manera que las secuencias de VH y VL se expresan como una protema de cadena sencilla continua, con las regiones VL y VH que se enlazan entre sf a traves del enlazador flexible (vease Bird et al. (1988) Science 242:423-425; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554).

Los dominios sencillos VH y VL con especificidad para un oligomero de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo pueden aislarse a partir de bibliotecas de dominios sencillos por los metodos descritos anteriormente. Dos cadenas de dominios sencillos de VH (con o sin CH1) o dos cadenas de VL o un par de una cadena VH y una cadena VL con la especificidad deseada pueden utilizarse para eliminar oligomeros de acuerdo con la invencion o derivados de los mismos del cuerpo.

Para expresar los anticuerpos o partes de anticuerpo recombinantes, los ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o total pueden insertarse dentro de vectores de expresion para enlazar operativamente los genes a secuencias de control transcripcionales y translacionales. En este contexto, el termino “operativamente enlazado” significara que un gen de anticuerpo se liga en un vector de tal manera que las secuencias de control transcripcionales y translacionales dentro del vector cumplen su funcion pretendida para la regulacion de la transcripcion y traslacion del gen de anticuerpo.

El vector de expresion y las secuencias de control de expresion se eligen para ser compatibles con la celula huesped de expresion utilizada. El gen para la cadena de anticuerpo ligera y el gen para la cadena de anticuerpo pesada pueden insertarse en vectores separados o ambos genes se insertan dentro del mismo vector de expresion, siendo este el caso usual. Los genes de anticuerpo se insertan dentro del vector de expresion por medio de metodos estandarizados (por ejemplo, ligacion de sitios de desdoblamiento de restriccion complementaria en el fragmento genetico de anticuerpo y el vector, o ligacion de extremos romos, si no se presenta ningun sitio de desdoblamiento de restriccion). El vector de expresion puede trasportar ya secuencias para regiones constantes de anticuerpo antes de la insercion de las secuencias para las cadenas ligeras y pesadas. Por ejemplo, un enfoque es convertir las secuencias de VH y VL a genes de anticuerpo de longitud total insertandolos en vectores de expresion que codifican ya las regiones constantes de cadena pesada o ligera, por lo que se enlaza operativamente el segmento de VH al o los segmentos CH dentro del vector, y tambien se enlaza operativamente el segmento VL al segmento CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresion recombinante puede codificar un peptido de senal el cual facilita la secrecion de la cadena de anticuerpo a partir de la celula huesped. El gen para la cadena de anticuerpo puede clonarse dentro del vector, por lo que se enlaza al peptido de senal en el marco del termino N del gen para la cadena de anticuerpo. El peptido de senal puede ser un peptido de senal de inmunoglobulina o un peptido de senal heterologo (es decir, un peptido de senal de una protema sin inmunoglobulina). Ademas de los genes para la cadena de anticuerpo, los vectores de expresion pueden presentar secuencias reguladoras que controlan la expresion de los genes para la cadena de anticuerpo en una celula huesped. El termino “secuencia reguladora” debena incluir

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promotores, potenciadores y elementos de control de expresion adicionales (por ejemplo, senales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o traslacion de los genes para la cadena de anticuerpo. Las secuencias reguladoras de esta clase se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expresion Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). El experto conoce que el diseno del vector de expresion el cual incluye la seleccion de secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped que se trasforma, la resistencia de expresion deseada de la protema, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para una expresion en celulas huesped de mairnfero incluyen elementos virales que resultan en una expresion de protema fuerte en celulas de mamnfero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador de CMV), el virus de simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardfo principal de adenovirus (AdMLP, por sus siglas en ingles)) y polioma. Para una descripcion adicional de elementos reguladores virales y secuencias de los mismos, veanse, por ejemplo los documentos US 5.168.062 de Stinski, US 4.510.245 de Bell et al. y US 4.968.615 de Schaffner et al.

Aparte de los genes para la cadena de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes pueden presentar secuencias adicionales tales como aquellas que regulan la replicacion del vector en celulas huespedes (por ejemplo, puntos de inicio de replicacion) y genes marcadores seleccionables. Los genes marcadores seleccionables facilitan la seleccion de celulas huespedes dentro de las cuales se ha introducido el vector (veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses N.° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, es comun que el gen marcador seleccionable haga resistente a una celula huesped dentro de la cual se ha insertado el vector frente a principios activos tales como G418, higromicina o metrotrexato. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen para la hidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en celulas huespedes de DHFR con seleccion/amplificacion de metrotrexato) y el gen neo (para la seleccion G418).

Para la expresion de las cadenas ligeras y pesadas, el o los vectores de expresion que codifican tales cadenas ligera y pesada se transfectan en una celula huesped por medio de tecnicas estandarizadas. Las diversas formas del termino “transfeccion” debenan comprender una multiplicidad de tecnicas usualmente utilizadas para introducir ADN exogeno dentro de una celula huesped procariotica o eucariotica, por ejemplo, electroporacion, precipitacion de fosfato de calcio, transfeccion de DEAE-dextrano y similares. Aunque es teoricamente posible expresar los anticuerpos ya sea en celulas huespedes procarioticas o eucarioticas, se da preferencia para expresar los anticuerpos en celulas eucarioticas y, en particular, en celulas huespedes de marnffero, ya que la probabilidad de que se componga y secrete un anticuerpo correctamente plegado e inmonologicamente activo es mas elevada en tales celulas eucarioticas y en particular celulas de mamnfero que en celulas procarioticas. Se ha informado de que la expresion procariotica de genes del anticuerpo es inefectiva para la produccion de rendimientos elevados de anticuerpo activo (Boss, M.A. y Wood, C.R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Las celulas huespedes de mamnfero que son preferentes para la expresion de anticuerpos recombinantes incluyen celulas CHO (incluyendo celulas CHO dhfr descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:42164220, que se utilizan con un marcador seleccionado de DHFR, como se describe, por ejemplo, en R.J. Kaufman y P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), celulas de mieloma NSO, celulas COS y celulas SP2. Si se introducen vectores de expresion recombinantes que codifican los genes del anticuerpo dentro de celulas huespedes del mamnfero, los anticuerpos se producen cultivando las celulas huespedes hasta que se expresa el anticuerpo en las celulas huespedes o, preferentemente, el anticuerpo se secreta dentro del medio de cultivo en donde crecen las celulas huesped. Los anticuerpos pueden aislarse a partir del medio de cultivo utilizando metodos para la purificacion de protema estandarizados.

Es posible asimismo utilizar celulas huespedes para producir partes de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moleculas scFv. Variaciones de las maneras de proceder descritas anteriormente pertenecen evidentemente a la invencion. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una celula huesped con aDn que codifica ya sea a la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo. Si se presentan cadenas ligeras o pesadas, las cuales no son necesarias para unirse al antfgeno de interes, entonces el ADN que codifica tal cadena ligera o tal cadena pesada o ambas puede eliminarse parcial o completamente por medio de la tecnologfa de ADN recombinante. Las moleculas que se expresan por tales moleculas de ADN truncadas se incluyen asimismo en los anticuerpos. Ademas, es posible producir anticuerpos bifuncionales en donde una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo y la otra cadena pesada y la otra cadena ligera tienen especificidad para un antfgeno diferente del antfgeno de interes, reticulando un tal anticuerpo a un segundo anticuerpo por medio de metodos qmmicos estandarizados.

En un sistema preferido para la expresion recombinante de un tal anticuerpo o parte que une el antfgeno del mismo, un vector de expresion recombinante, que codifica tanto la cadena de anticuerpo pesada como la cadena de anticuerpo ligera, se introduce dentro de las celulas CHO dhfr por medio de transfeccion mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresion recombinante, los genes para las cadenas de anticuerpo ligeras y pesadas estan en cada caso operativamente enlazadas a los elementos del promotor de AdMLP/potenciador de CMV reguladores para efectuar trascripcion fuerte de los genes. El vector de expresion recombinante transporta tambien un gen de DHFR el cual puede utilizarse para seleccionar celulas CHO transfectadas con el vector utilizando la seleccion/amplificacion de metrotrexato. Las celulas huespedes trasformadas seleccionadas se cultivan de manera

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que se expresan las cadenas de anticuerpo pesadas y ligeras, y el anticuerpo intacto se afsla a partir del medio de cultivo. Las tecnicas biologicas moleculares estandarizadas se utilizan para preparar el vector de expresion recombinante, para transfectar las celulas huespedes, para seleccionar los transformantes, para cultivar las celulas huesped y para obtener el anticuerpo a partir del medio de cultivo. De este modo, comprende un metodo para sintetizar un anticuerpo recombinante cultivando una celula huesped en un medio de cultivo adecuado hasta que esta sintetizado un anticuerpo recombinante. El metodo puede comprender ademas aislar el anticuerpo recombinante a partir del medio de cultivo.

Como una alternativa para cribar las bibliotecas de anticuerpos recombinantes por expresion en fago, pueden utilizarse otros metodos conocidos por el experto para cribar bibliotecas combinatoriales grandes para identificar los anticuerpos. En un tipo de un sistema de expresion alternativo, la biblioteca de anticuerpo recombinante se expresa en forma de fusiones de protema ARN, como se describe en el documento WO98/31700 de Szostak y Roberts, y en Roberts, R.W. y Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. En este sistema, por la traslacion in vitro de los ARNm sinteticos que transportan en su extremo 3' puromicina, un antibiotico aceptor de peptidilo, se genera una fusion covalente entre un ARNm y el peptido o protema codificado por este. De este modo, un ARNm espedfico de una mezcla compleja de ARNms (por ejemplo, una biblioteca combinatorial) puede concentrarse mediante las propiedades del peptido o protema codificada (por ejemplo, del anticuerpo o una parte del mismo), tal como la union del anticuerpo o parte del mismo a un oligomero de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo. Las secuencias de acido nucleico que codifican anticuerpos o partes del mismo, las cuales se obtienen cribando tales bibliotecas, pueden expresarse por medios recombinantes en la manera descrita anteriormente (por ejemplo, en celulas huespedes de mairnferos) y pueden, ademas, someterse a maduracion de afinidad adicional ya sea cribando en rondas adicionales de fusiones de peptido de ARNm, introduciendose mutaciones dentro en la o las secuencias originalmente seleccionadas, o utilizando otros metodos para la maduracion de afinidad in vitro de los anticuerpos recombinantes en la manera descrita anteriormente.

Combinaciones de enfoques in vivo e in vitro

Los anticuerpos pueden asimismo producirse utilizando una combinacion de enfoques in vivo e in vitro tales como metodos en donde un oligomero de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo se deja primero actuar sobre un repertorio del anticuerpo en un animal huesped in vivo para estimular la produccion de anticuerpos o derivados de union o de oligomero, y luego se efectua la seleccion de anticuerpo adicional y/o maduracion de anticuerpo (es decir, optimizacion) con ayuda de una o mas tecnicas in vitro. Segun una forma de realizacion, un metodo combinado de esta clase puede comprender en primer lugar inmunizar un animal no humano (por ejemplo, un raton, una rata, un conejo, un pollo, un camello, una cabra o una version transgenica de los mismos o un raton quimerico) con el oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo para estimular una respuesta del anticuerpo frente al antfgeno, y luego preparar y cribar una biblioteca de anticuerpo de expresion en fago utilizando secuencias de inmunoglobulina de linfocitos que han sido estimulados in vivo por la accion del oligomero o el derivado. La primera etapa de este modo de proceder combinado puede llevarse a cabo en la manera descrita anteriormente junto con los enfoques in vivo, mientras la segunda etapa de este modo de proceder puede llevarse a cabo en la manera descrita anteriormente junto con los enfoques in vitro. Los metodos preferidos para hiperinmunizar animales no humanos con cribado in vitro subsecuente de las bibliotecas de expresion en fago preparadas a partir de linfocitos estimulados incluyen aquellos descritos por BioSite Inc., veanse, por ejemplo, los documentos WO 98/47343, WO 91/17271, US 5.427.908 y US 5.580.717.

Segun otra forma de realizacion, un metodo combinado comprende en primer lugar inmunizar un animal no humano (por ejemplo, un raton, una rata, un conejo, un pollo, un camello, una cabra o una version transgenica y/o inactivada de los mismos, o un raton quimerico) con un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo para estimular una respuesta de anticuerpo frente al oligomero o derivado del mismo, y seleccionar los linfocitos que producen los anticuerpos con la especificidad deseada cribando hibridomas (preparados, por ejemplo, de los animales inmunizados). Los genes para los anticuerpos o anticuerpos de dominios unico se afslan a partir de los clones seleccionados (por medio de metodos de clonacion estandarizados tales como la reaccion de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa) y se someten a maduracion de afinidad in vitro para mejorar por consiguiente las propiedades de union del anticuerpo seleccionado o los anticuerpos seleccionados. La primera etapa de este modo de proceder puede llevarse a cabo en la manera descrita anteriormente junto con los enfoques in vivo, mientras que la segunda etapa de este modo de proceder puede llevarse a cabo en la manera descrita anteriormente junto con los enfoques in vitro, en particular utilizando metodos de maduracion de afinidad in vitro, tales como aquellos que estan descritos en los documentos WO 97/29131 y WO 00/56772.

En un metodo combinado adicional, los anticuerpos recombinantes se generan a partir de linfocitos aislados individuales utilizando un modo de proceder que se conoce por el experto como metodo de anticuerpo de linfocitos seleccionados (SLAM) y el cual se describe en los documentos US 5.627.052, WO 92/02551 y Babcock, J.S. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7884. En este metodo, un animal no humano (por ejemplo, un raton, una rata, un conejo, un pollo, un camello, una cabra o una version transgenica de los mismos, o un raton quimerico) se inmuniza en primer lugar in vivo con un oligomero de acuerdo con la invencion o un derivado del mismo para estimular una respuesta inmune frente al oligomero o derivado, y luego se seleccionan celulas individuales que secretan anticuerpos de interes utilizando un ensayo de placa hemolftica espedfica de antfgenos. Con este fin, el

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oligomero o derivado del mismo, o moleculas relacionadas estructuralmente de interes, pueden acoplarse a eritrocitos de oveja, utilizando un enlazador tal como biotina, por lo que se puede identificar celulas individuales que secretan anticuerpos con especificidad adecuada utilizando el ensayo de placa hemolftico. Siguiendo la identificacion de las celulas que secretan anticuerpos de interes, los ADNc para las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas se obtienen a partir de las celulas por PCR de transcriptasa inversa, y estas regiones variables pueden expresarse entonces en asociacion con las regiones de inmunoglobulina constantes adecuadas (por ejemplo, regiones constantes humanas) en celulas huespedes de mairnfero tales como celulas COS o CHO. Las celulas huespedes transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas derivadas a partir de los linfocitos seleccionados in vivo pueden entonces someterse a analisis in vitro adicional y a seleccion in vitro separando, por ejemplo, las celulas transfectadas para aislar celulas que expresan anticuerpos con la especificidad deseada. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas pueden ademas manipularse in vitro.

Analogamente a los modos de proceder descritos anteriormente, es tambien posible preparar anticuerpos que presentan especificidad para un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo y para moleculas sinteticas estructuralmente relacionadas. Estos comprenden

i) proporcionar un antfgeno que comprende una caractenstica estructural compartida por el oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo y las moleculas sinteticas estructuralmente relacionadas;

ii) dejar actuar el antfgeno sobre un repertorio del anticuerpo; y

iii) seleccionar a partir del repertorio un anticuerpo que se une a dos moleculas estructuralmente relacionadas, mediante lo cual se obtiene el anticuerpo con la especificidad deseada.

Los anticuerpos espedficos de oligomeros obtenibles por los metodos anteriores forman un aspecto de la presente invencion igual que el uso de los mismos para preparar un medicamento para el tratamiento de trastornos de demencia asociados a p-amiloides o para preparar una composicion para diagnosticar trastornos de demencia asociados a p-amiloides.

Los anticuerpos se obtenibles de acuerdo a la invencion incluyen en particular antisueros que pueden obtenerse por los metodos anteriores. Estos pueden ser sueros completos, es decir, sangre obtenida a partir del huesped despues de separar los componentes celulares y coagulables, o fracciones de este suero en las que en particular la fraccion de inmunoglobulina concentrada y preferentemente la fraccion de inmunoglobulina que reconoce el oligomero esta enriquecida. Las fracciones de esta clase pueden obtenerse con los metodos descritos anteriormente junto con la purificacion del anticuerpo.

Los antisueros son policlonales, es decir, contienen anticuerpos de diferente especificidad, usualmente de diferentes clases y subclases, normalmente estan sustituidos todos los isotopos de cadena L y se reconocen varios epitopes de protema.

Si se utilizan distintos oligomeros de acuerdo con la invencion como inmunogenos, los antisueros son usualmente de reaccion cruzada.

Segun otro aspecto, los anticuerpos obtenibles de acuerdo con la invencion incluyen tambien anticuerpos monoclonales, en particular anticuerpos quimericos y humanizados, asf como fragmentos de union de oligomero de los mismos.

La presente invencion se relaciona a protemas y en particular a anticuerpos que se unen espedficamente a un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo, es decir, anticuerpos con especificidad para un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo. La presente invencion se relaciona tambien a partes de estas protemas o anticuerpos, en particular a partes de union de antfgeno del mismo, es decir, partes de protema o de anticuerpo que se unen a un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo.

El anticuerpo se elige preferentemente de manera que presenta cineticas de union determinadas (por ejemplo, afinidad elevada, disociacion baja, velocidad completamente baja, actividad de neutralizacion fuerte) para la union espedfica a un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo.

De este modo, se da preferencia a protemas y, en particular, a anticuerpos con una afinidad para el oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo en el intervalo de Kd=10'6-10'12 M. Se da preferencia particular a protemas de afinidad elevada y, en particular, a anticuerpos que se unen con una afinidad mayor que Kd=10-8 M, con una afinidad mayor que Kd=10-9 M, con una afinidad mayor que Kd=10-10 M o con una afinidad mayor que Kd=10'11 M.

Segun otro aspecto, se da preferencia a aquellas protemas y, en particular, a anticuerpos que unen otras formas Ap(1-42), en particular la protema Ap(1-42) monomerica y/o la protema Ap(1-40) monomerica con afinidad comparativamente inferior, en particular con afinidad mas baja que Kd=10-8 M.

Por consiguiente, se da preferencia sobre todo a aquellas protemas y, en particular, a anticuerpos que unen el oligomero o derivado del mismo con afinidad mas elevada que la protema Ap(1-42) monomerica y/o la protema

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Ap(1-40) monomerica. Se da preferencia particular a las relaciones de afinidad de 10, 100 o 1000.

Segun otro aspecto, los anticuerpos pueden elegirse de manera que unen el oligomero o derivado del mismo con una constante de velocidad Koff de 0,1 s'1 o menor. Se da preferencia incrementada a las constantes de velocidad

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Koff de 1 x 10 o menor, 1 x 10 s' o menor, 1 x 10 s' o menor, o 1 x 10 s' o menor, en el orden indicado.

Ademas, los anticuerpos pueden elegirse de manera que inhiban la actividad, en particular la actividad neurotoxica, de oligomeros de acuerdo con la invencion o derivados de los mismos con un 1C50 de 1 x 10"6 M o menor. Se da preferencia incrementada a las constantes de inhibicion IC50de 1 x 10"7 M o menor, 1 x 10"8 M o menor, 1 x 109 M o menor, 1 x 10"10 M o menor, o 1 x 10"11 M o menor, en el orden indicado.

Los anticuerpos son preferentemente anticuerpos aislados. Segun otro aspecto, los anticuerpos son anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales y recombinantes. Segun una multiplicidad de formas de realizacion, el anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoacido derivada completamente de una especie sencilla, tal como un anticuerpo humano o un anticuerpo de raton. Segun otras formas de realizacion, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimerico o un anticuerpo de injerto de CDR u otra forma de un anticuerpo humanizado.

El termino “anticuerpo” debena referirse a moleculas de inmunoglobulina que estan formadas por 4 cadenas polipeptfdicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L). Las cadenas se enlazan usualmente una a la otra a traves de uniones de disulfuro. Cada cadena se compone de una region variable de la cadena pesada (abreviada aqrn como HCVR o VH) y una region constante de la cadena pesada. La region constante de la cadena pesada se forma portres dominios CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera se compone de una region variable de la cadena ligera (abreviada aqrn como LCVR o VL) y una region constante de la cadena ligera. La region constante de la cadena ligera se forma por un dominio CL. Las regiones VH y VL pueden dividirse ademas en regiones hipervariables que se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en ingles) y se intercalan con regiones conservadas que se denominan regiones estructurales (FR, por sus siglas en ingles). Cada region VH y VL se forma por tres CDR y cuatro FR que se disponen desde el termino N al termino C en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

El termino “parte de union a antfgeno” de un anticuerpo (o simplemente “parte de anticuerpo”) se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo con especificidad para un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo, teniendo el o los fragmentos la capacidad, al igual que antes, de unir espedficamente el oligomero o derivado del mismo. Los fragmentos de un anticuerpo completo han demostrado ser capaces de llevar a cabo la funcion de union a antfgeno de un anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de union en el sentido del termino “parte de union a antfgeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, es decir, un fragmento monovalente compuesto de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, es decir, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados uno al otro en la region bisagra por un puente de disulfuro; (iii) un fragmento Fd compuesto de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv compuesto de los dominios FL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) que consta de un dominio VH o de VH, CH1, CH2, dH3 o VH, CH2, CH3; y (vi) una region que determinante de la complementariedad aislada (CDR). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, a saber, VL y VH, se codifican por genes separados, estos pueden ademas enlazarse uno al otro utilizando un enlazador sintetico y metodos recombinantes, haciendo posible prepararlos como una cadena de protema sencilla en donde las regiones VL y VH se combinan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (ScFv); veanse, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 85:5879-5883). El termino “parte de union a antigeno” de un anticuerpo debena comprender tambien tales anticuerpos de cadena sencilla. Otras formas de anticuerpos de cadena sencilla tales como “diacuerpos” se incluyen asimismo aqrn. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespedficos en donde los dominios de VH y VL estan expresados en una cadena del polipeptido sencilla, pero que utiliza un enlazador el cual es demasiado corto para que los dos dominios puedan combinarse en la misma cadena, mediante lo cual se obliga a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de diferente cadena y a formar dos sitios de union a antfgeno (veanse, por ejemplo, Holliger, P., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.M., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Ademas, un anticuerpo o parte de union a antfgeno del mismo puede ser parte de una molecula de inmunoadhesion mas grande que se forma por asociacion covalente o no covalente del anticuerpo o parte del anticuerpo con una o mas protemas o peptidos adicionales. Relevantes a tales moleculas de inmunoadhesion son el uso de la region de nucleo de la estreptavidina para preparar una molecula scFv tetramerica (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cistema, un peptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para producir moleculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las partes del anticuerpo tales como fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse a partir de anticuerpos completos utilizando tecnicas convencionales tales como la digestion con papama o pepsina. Ademas, los anticuerpos, partes del anticuerpo y moleculas de inmunoadhesion pueden obtenerse utilizando tecnicas de ADN recombinantes estandarizadas. Un “anticuerpo aislado con especificidad para un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo” significa un anticuerpo con especificidad para un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo, que esta esencialmente libre de otros anticuerpos con diferentes

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especificidades de antfgeno, es dedr, en particular un anticuerpo que esta libre de anticuerpos que se unen espedficamente a otras formas de la protema Ap(1-42), como se ha descrito anteriormente.

El termino “anticuerpo neutralizante” significa un anticuerpo cuya union a un antigeno determinado resulta en la inhibicion de la actividad biologica del antigeno. Esta inhibicion de la actividad biologica del antigeno puede evaluarse midiendo uno o mas indicadores para la actividad biologica del antfgeno, utilizando un ensayo in vitro o in vivo adecuado.

El termino “anticuerpo monoclonal” significa un anticuerpo derivado de un hibridoma (por ejemplo, un anticuerpo secretado por un hibridoma preparado por medio de tecnologfa de hibridoma tal como los metodos de hibridoma estandarizados segun Kohler y Milstein). Un anticuerpo, el cual se deriva a partir de un hibridoma con especificidad para un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo se denomina, por lo tanto, anticuerpo monoclonal.

El termino “anticuerpo recombinante” se refiere a anticuerpos que se producen, expresan, generan o afslan con medios recombinantes, tales como anticuerpos que se expresan utilizando un vector de expresion recombinante transfectado en una celula huesped; anticuerpos que estan aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos combinatorial recombinante; anticuerpos que estan aislados a partir de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico por genes de inmunoglobulina humana (vease, por ejemplo, Taylor, LD., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 29:6287-6295); o anticuerpos que se producen, expresan, generan o afslan de cualquier otra manera en donde las secuencias geneticas de inmunoglobulina determinadas (tales como secuencias geneticas de inmunoglobulina humana) se ensamblan con otras secuencias de ADN. Los anticuerpos recombinantes incluyen, por ejemplo, anticuerpos quimericos, de injerto de CDR y humanizados.

El termino “anticuerpo humano” se refiere a anticuerpos cuyas regiones variables y constantes corresponden o se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la lmea germinal humana, como se describe, por ejemplo, por Kabat et al. (vease Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. Fifth Edition, Departamento de Salud y Servicios Sociales de los Estados Unidos, Publicacion NIH N.° 91-3242). Sin embargo, los anticuerpos humanos pueden contener residuos de aminoacido que no estan codificados por secuencias de inmunoglobulina de lmea germinal humana (por ejemplo, mutaciones que han sido introducidas por mutagenesis sitio-espedficas o aleatorias in vitro o por mutacion somatica in vivo), por ejemplo, en los CDR y en particular en CDR3. Los anticuerpos recombinantes humanos tienen regiones variables y pueden tambien contener regiones constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de la lmea germinal humana (vease Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, Departamento de Salud y Servicios Sociales de los Estados Unidos, Publicacion NIH No. 91-3242). Segun formas de realizacion determinadas, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a una mutagenesis in vitro (o a una mutagenesis in vivo somatica, si se utiliza un animal transgenico por secuencias Ig humanas) de manera que las secuencias de aminoacido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que aunque se relacionan a, o se derivan de las secuencias de VH y VL de la lmea germinal humana, no existen de manera natural in vivo dentro del repertorio de la lmea germinal del anticuerpo humano. Segun formas de realizacion determinadas, los anticuerpos recombinantes de esta clase son el resultado de una mutagenesis selectiva o retromutacion, o de ambas.

El termino “retromutacion” se refiere a un metodo el cual comprende reemplazar algunos o todos los aminoacidos somaticamente mutados de un anticuerpo humano con los residuos de lmea germinal correspondientes de una secuencia del anticuerpo de lmea germinal. Las secuencias para las cadenas ligeras y pesadas de un tal anticuerpo humano se comparan de manera separada con las secuencias de lmea germinal en la base de datos VBASE para identificar las secuencias con la homologfa mas elevada. Las impresiones en los anticuerpos humanos se revierten a la secuencia de lmea germinal mutando a las posiciones de nucleotido definidas que codifican tales aminoacidos de desviacion. Debena investigarse La importancia directa o indirecta de cada aminoacido identificado de esta manera como candidato para una retromutacion para la union de antfgeno, y no debena incorporarse un aminoacido que imparte una propiedad deseada del anticuerpo deseado despues de la mutacion en el anticuerpo humano final. Para mantener el numero de aminoacidos para una retromutacion tan bajo como sea posible, aquellas posiciones de aminoacido, que aunque se desvfan de la secuencia de lmea germinal mas cercana, son identicos a la secuencia de aminoacido correspondiente de una segunda secuencia de lmea germinal pueden permanecer sin cambio, siempre que la segunda secuencia de lmea germinal sea identica y co-lineal con la secuencia del anticuerpo humano en al menos 10 y preferentemente en 12 aminoacidos en ambos lados del aminoacido en cuestion. Las retromutaciones pueden llevarse a cabo en cualquier etapa de la optimizacion de anticuerpo.

El termino “anticuerpo quimerico” se refiere a anticuerpos que contienen secuencias para la region variable de las cadenas ligeras y pesadas a partir de una especie, pero en donde las secuencias de una o mas regiones de CDR de VH y/o VL han sido reemplazadas con secuencias CDR de otra especie, tales como anticuerpos que presentan regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de raton, en donde uno mas de las CDR del raton (por ejemplo, CDR3) han sido reemplazadas con secuencias de CDR humanas.

El termino “anticuerpo humanizado” se refiere a anticuerpos que contienen secuencias de la region variable de las cadenas pesadas y ligeras a partir de una especie no humana (por ejemplo, de raton, rata, conejo, pollo, camello,

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cabra), pero en donde al menos una parte de la secuencia VH y/o VL ha sido modificada para ser mas “similar a la humana”, es decir, ser mas similar a secuencias variables de la lmea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo de injerto CDR en donde las secuencias de CDR humanas han sido insertadas dentro de secuencias VH y VL no humanas para reemplazar las secuencias CDR no humanas correspondientes.

Un modo de medir la cinetica de union de un anticuerpo es por medio de resonancia de plasmon superficial. El termino “resonancia de plasmon superficial” se refiere a un fenomeno optimo por el cual las interacciones bioespedficas pueden analizarse detectando cambios en las concentraciones de protema con una matriz biosensora, utilizando, por ejemplo, el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, vease Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Jonson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Jonson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

El termino “Koff” se refiere a la constante de velocidad desacelerada para la disociacion de un anticuerpo a partir del complejo de anticuerpo/antigeno.

El termino “Kd” se refiere a la constante de disociacion de una interaccion de anticuerpo-antigeno determinada.

La afinidad de union de los anticuerpos puede evaluarse utilizando inmunoensayos in vitro estandarizados tales como analisis ELISA o BIAcore.

Aparte de los anticuerpos, la protema puede ser una molecula derivada del receptor de celula T o un dominio de receptor derivado del receptor de celula T o una protema de fusion del dominio de receptor con una parte Fc de una inmunoglobulina.

La presente invencion se relaciona tambien a agentes farmaceuticos (composiciones) que contienen una tal protema y en particular un tal anticuerpo asf como, opcionalmente, un portador farmaceuticamente aceptable. Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion pueden ademas contener al menos un agente terapeutico adicional, por ejemplo, uno o mas agentes terapeuticos adicionales para el tratamiento de una enfermedad para cuyo alivio son utiles los anticuerpos. Si, por ejemplo, el anticuerpo se une a un oligomero de acuerdo con la invencion, la composicion farmaceutica puede contener ademas uno o mas agentes terapeuticos adicionales que son utiles para el tratamiento de enfermedades en donde la actividad del oligomero es importante.

Los portadores farmaceuticamente adecuados incluyen todos los solventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacteriales y antifungicos, agentes de retraso de absorcion e isotonicos y similares, siempre y cuando sean fisiologicamente compatibles. Los portadores farmaceuticamente aceptables, incluyen, por ejemplo, agua, solucion salina, solucion salina regulada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asf como combinaciones de los mismos. En muchos casos, se da preferencia a utilizar con agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, o cloruro de sodio. Los portadores farmaceuticamente adecuados pueden contener ademas cantidades pequenas de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservadores o tampones, que incrementan la durabilidad o eficacia de los anticuerpos.

Las composiciones farmaceuticas pueden ser adecuadas, por ejemplo, para la administracion parenteral. Aqrn, los anticuerpos se preparan preferentemente como soluciones inyectables con un contenido de anticuerpo de 0,1 - 250 mg/ml. Las soluciones inyectables pueden prepararse en forma lfquida o liofilizada como forma de dosificacion en un vidrio flint o vial, una ampolla o una jeringa llena. El tampon puede contener L-histidina (1-50 mM, preferentemente 5-10 mM) y presenta un pH de 5,0 - 7,0, preferentemente de 6,0. Los tampones adecuados adicionales, incluyen, sin limitarse a, tampones de succinato de sodio, de citrato de sodio, de fosfato de sodio o de fosfato de potasio. Puede utilizarse cloruro de sodio para ajustar la tonicidad de la solucion a una concentracion de 0 - 300 mM (preferentemente 150 mM para una forma de dosificacion lfquida). Los crioprotectores para una forma de dosificacion liofilizada pueden incluir, por ejemplo, sacarosa (por ejemplo, del 0 - 10 %, preferentemente del 0,5 - 10%). Otros crioprotectores adecuados son trehalosa y lactosa. Los materiales de relleno para una forma de dosificacion liofilizada pueden incluir, por ejemplo, manitol (por ejemplo, del 1 - 10 %, preferentemente del 2 - 4 %). Los estabilizadores, por ejemplo, L-metionina (por ejemplo, 51 - 50 mM, preferentemente 5 - 10 mM) pueden utilizarse tanto en formas de dosificacion lfquidas como liofilizadas. Otros materiales de relleno adecuados adicionales son glicina y arginina. Pueden utilizarse asimismo tensioactivos, por ejemplo, polisorbato 80 (por ejemplo, del 0 - 0,05 %, preferentemente del 0,005 - 0,01 %). Otros agentes tensioactivos adecuados son polisorbato 20 y tensioactivos BRIJ.

Las composiciones pueden tener una multiplicidad de formas. Estas incluyen formas de dosificacion lfquidas, semisolidas y solidas, tales como soluciones lfquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pfldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del tipo de administracion pretendido y de la aplicacion terapeutica. Normalmente, se da preferencia a composiciones en forma de soluciones inyectables o infusibles, por ejemplo, composiciones que son similares a otros anticuerpos para la inmunizacion pasiva de seres humanos. La ruta de administracion preferida es parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutanea, intraperitonial, intramuscular). De acuerdo con una forma de realizacion preferida, el anticuerpo se

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administra por infusion o inyeccion intravenosa. De acuerdo con otra forma de realizacion preferida, el anticuerpo se administra por inyeccion intramuscular o subcutanea.

Las composiciones terapeuticas deben normalmente ser esteriles y estables bajo las condiciones de preparacion y almacenamiento. Las composiciones pueden formularse como solucion, microemulsion, dispersion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para concentraciones de principio activo elevadas. Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse introduciendo el principio activo (es decir, el anticuerpo) en la cantidad requerida dentro de un disolvente adecuado, cuando sea apropiado con uno o una combinacion de los ingredientes anteriormente mencionados, como se requiere, y luego filtrando de manera esteril. Las dispersiones se preparan usualmente introduciendo el compuesto activo dentro de un vetuculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y, cuando sea apropiado, otros ingredientes requeridos. En el caso de un polvo liofilizado esteril para preparar soluciones inyectables esteriles, el secado al vado y secado por pulverizacion representan metodos de preparacion preferidos, con los que se obtiene un polvo del ingrediente activo y, cuando sea apropiado, de ingredientes deseados adicionales a partir de una solucion filtrada previamente esteril. La propiedad de flujo correcta de una solucion puede mantenerse utilizando, por ejemplo, un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo, en el caso de las dispersiones, el tamano de partfcula requerida o utilizando agentes tensioactivos. Una absorcion prolongada de composiciones inyectables puede lograrse adicionalmente introduciendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Los anticuerpos pueden administrarse por una multiplicidad de metodos conocidos por el experto, aunque el tipo preferido de administracion para muchas administraciones terapeuticas es la inyeccion subcutanea, inyeccion intravenosa o infusion. El experto apreciara que la ruta y/o tipo de administracion dependen del resultado deseado. Segun formas de realizacion determinadas, el compuesto activo puede prepararse con un portador que protege el compuesto contra la liberacion rapida, tal como, por ejemplo, una formulacion con liberacion controlada, que incluye implantes, apositos transdermicos y sistemas de liberacion microencapsulados. Pueden utilizarse polfmeros biocompatibles biologicamente degradables tales como vinilacetato de etileno, poliantudridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Los metodos para formar tales formulaciones se conocen bien por el experto, vease, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Segun formas de realizacion determinadas, un anticuerpo puede administrarse oralmente, por ejemplo, en un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. El anticuerpo (e ingredientes adicionales, si se desean) puede tambien incluirse en una capsula de gelatina dura o blanda, comprimirse en comprimidos o anadirse directamente al alimento. Para la administracion terapeutica oral, los anticuerpos pueden mezclarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos deglutibles, comprimidos bucales, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes y similares. Si se pretende administrar un anticuerpo a traves de una ruta diferente de la parenteral, puede ser necesario elegir un recubrimiento a partir de un material que evite su inactivacion.

Los anticuerpos son capaces, preferentemente, de neutralizar, tanto in vitro como in vivo la actividad de los oligomeros de acuerdo con la invencion o derivados de los mismos. Los anticuerpos pueden utilizarse, por eso, para la inhibicion de la actividad de los oligomeros de acuerdo con la invencion o derivados de los mismos, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene los oligomeros o derivados de los mismos o en individuos humanos u otros mairnferos en los cuales se presentan los oligomeros o derivados de los mismos. Por eso, otro aspecto de la invencion se relaciona con un metodo para inhibir la actividad de los oligomeros de acuerdo con la invencion o derivados de los mismos, cuyo metodo comprende dejar a un tal anticuerpo actuar sobre un oligomero o derivado del mismo. A este respecto, la actividad puede inhibirse, por ejemplo, in vitro. Por ejemplo, el anticuerpo puede anadirse a un cultivo celular que contiene o se sospecha que contiene el oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo, para inhibir la actividad del oligomero o derivado del mismo en el cultivo. Alternativamente, la actividad del oligomero o derivado del mismo puede inhibirse en un individuo in vivo.

De este modo, otro aspecto de la presente invencion incluye un metodo para inhibir la actividad de oligomeros de acuerdo con la invencion o derivados de los mismos en un individuo que sufre de una enfermedad en la cual esta implicada la protema p-amiloide y es importante en particular la actividad del oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo. El metodo comprende la administracion de al menos un tal anticuerpo al individuo con la finalidad de inhibir la actividad del oligomero o derivado del mismo al cual se une el anticuerpo. El individuo es preferentemente un ser humano. Un anticuerpo puede administrarse a un individuo humano para propositos terapeuticos. Ademas, un tal anticuerpo puede administrarse a un marnffero no humano para propositos veterinarios o en el contexto de un modelo animal para una enfermedad determinada. Tales modelos animales pueden ser utiles para evaluar la eficacia terapeutica de los anticuerpos (por ejemplo, probar dosificaciones y transcursos temporales de administracion).

Las enfermedades en las cuales los oligomeros de acuerdo con la invencion o derivados de los mismos desempenan un papel incluyen en particular enfermedades en cuyo origen y/o desarrollo esta implicado un oligomero de acuerdo con la invencion o derivado del mismo. Estos son en particular aquellas enfermedades en las cuales oligomeros de acuerdo con la invencion o derivados de los mismos son evidentes o presumiblemente responsables de la patofisiologfa de la enfermedad o representan un factor que contribuye al origen y/o desarrollo de

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la enfermedad. Por consiguiente, se incluyen aqu tales enfermedades en donde la inhibicion de la actividad de los oligomeros de acuerdo con la invencion o derivados de los mismos puede aliviar smtomas y/o progresion de la enfermedad. Tales enfermedades pueden verificarse, por ejemplo, por una concentracion incrementada de oligomeros de acuerdo con la invencion o derivados de los mismos en un fluido biologico de un individuo que sufre de una enfermedad determinada (por ejemplo, una concentracion incrementada en suero, plasma, CSF, orina, etc). Esto puede detectarse, por ejemplo, utilizando un tal anticuerpo. Los oligomeros de acuerdo con la invencion y derivados de los mismos desempenan un papel determinante en la patologfa asociada con una multiplicidad de enfermedades en donde estan implicados elementos neurodegenerativos, deficiencias cognitivas, elementos neurotoxicos y elementos inflamatorios.

Los anticuerpos pueden administrarse junto con uno o mas agentes terapeuticos adicionales que son utiles en el tratamiento de las enfermedades descritas anteriormente.

Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion contienen usualmente una cantidad terapeuticamente activa o una cantidad profilacticamente activa de al menos un tal anticuerpo. Dependiendo del tratamiento deseado, por ejemplo, si se desea un tratamiento terapeutico o profilactico, pueden elegirse y adaptarse programas de dosificacion. Por ejemplo, puede administrarse una dosis unica, varias dosis separadas distribuidas en el tiempo o una dosificacion incrementada o disminuida, segun los requerimientos de la situacion terapeutica. Es particularmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unica para facilitar la administracion y para asegurar la uniformidad de la dosificacion.

Una cantidad terapeutica o profilacticamente activa de un tal anticuerpo puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,1 - 20 mg/kg y preferentemente 1 - 10 mg/kg, sin limitarse a esto. Estas cantidades pueden variar, por supuesto, dependiendo del tipo y severidad del estado que se mitiga.

En el contexto del uso diagnostico de los anticuerpos, la determinacion oligomerica espedfica cualitativa o cuantitativa sirve en particular para diagnosticar formas P(1-42) amiloides relevantes de enfermedad. En este contexto, la especificidad significa la posibilidad de poder detectar un oligomero determinado o mezcla oligomerica con suficiente sensibilidad. Los anticuerpos presentan ventajosamente sensibilidades de menos de 10 ng/ml por muestra, preferentemente de menos de 1 ng/ml por muestra y mas preferentemente de menos de 100 pg/ml por muestra. Por eso, se entiende que al menos la concentracion respectivamente indicada de oligomero por ml de muestra puede detectarse ventajosamente tambien concentraciones inferiores con los anticuerpos.

La determinacion se lleva a cabo inmunologicamente. Esta puede llevarse a cabo en principio utilizando cualquier metodo de ensayo analftico o diagnostico en donde se utilizan los anticuerpos., Se incluyen tecnicas de aglutinacion y de precipitacion, inmunoensayos, metodos inmunohistoqmmicos y tecnicas de inmunotrasferencia, por ejemplo, transferencia Western Blot o metodos de dot blot. Tambien se incluyen aqu metodos in vivo, por ejemplo, metodos de formacion de imagenes.

Resulta ventajoso el uso en inmunoensayos. Son adecuados tanto inmunoensayos competitivos, es decir, antfgeno y antfgeno etiquetado (trazador) compiten por la union del anticuerpo, como inmunoensayos tipo sandwich, es decir, la union de anticuerpos espedficos al antfgeno se detecta por un segundo anticuerpo usualmente etiquetado. Estos ensayos pueden ser tanto homogeneos, es decir, sin una separacion en fase solida y lfquida, como heterogeneos, es decir, las etiquetas unidas se separan a partir de las no unidas, por ejemplo, a traves de anticuerpos de union de fase solida. Los diversos formatos de inmunoensayo heterogeneos y homogeneos pueden asignarse a clases determinadas segun etiquetado y metodo de medicion, por ejemplo, RIA (radioinmunoensayos), ELISA (ensayo por inmunoadsorcion ligado a enzimas), FIA (inmunoensayo de fluorescencia), LIA (inmunoensayo de luminiscencia), TRFIA (FIA de resolucion temporal), IMAC (inmunoactivacion), EMIT (prueba inmune de enzima multiplicada), TIA (inmunoensayo turbidimetrico), I-PCR (inmuno-PCR).

Para la determinacion del oligomero, se da preferencia a inmunoensayos competitivos. A este respecto, el oligomero etiquetado (trazador) compite con el oligomero que se cuantifica de la muestra para la union al anticuerpo utilizado., A partir de la cantidad del trazador desplazado puede determinarse con ayuda de una curva estandar la cantidad de antfgeno, es decir, la cantidad de oligomero, en la muestra.

De las etiquetas disponibles para estos propositos, las enzimas han demostrado ser ventajosas. Por ejemplo, pueden utilizarse sistemas basados en peroxidasas, en particular la peroxidasa de rabano picante, la fosfatasa alcalina y la galactosidasa-D-p. Para estas enzimas estan disponibles sustratos espedficos cuya conversion puede verificarse, por ejemplo, fotometricamente. Sistemas de sustrato adecuados se basan en fosfato de p-nitrofenilo (p- NPP), fosfato/tetrazolio de nitroazul de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP/NPT), fosfato rojo rapido/naftol-AS-TS para la fosfatasa alcalina, acido 2,2-azinobis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonico) (ABTS), o-fenilendiamina (OFT), 3,3',5,5'- tetrametilbencidina (TMB), o-dianisidina, acido 5-aminosalidlico, acido 3-dimetilamino-benzoico (DMAB) y 3-metil-2- benzotiazolinhidrazona (MBTH) para peroxidasas; o-nitrofenil-p-D-galactosida (o-NPG), p-nitrofenil-p-D-galactosida y 4-metilumbelifenil-p-D-galactosida (MUG) para las p-D-galactosidasas. En muchos casos, estos sistemas de sustrato estan comercialmente disponibles en forma lista para utilizarse, por ejemplo, en forma de comprimidos que pueden contener ademas reactivos tales como tampones apropiados y similares.

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Los trazadores utilizados son oligomeros etiquetados. En este sentido, para la determinacion de un oligomero determinado puede etiquetarse el oligomero que se determina y utilizarse como trazador.

El acoplamiento de etiquetas a los oligomeros para preparar trazadores puede llevarse a cabo de una manera conocida per se. Las realizaciones anteriores para la derivatizacion de oligomeros de acuerdo con la invencion se refieren por analogfa. Ademas, esta disponible un numero de etiquetas apropiadamente modificadas para la conjugacion a protemas, por ejemplo, enzimas conjugadas con biotina, avidina, extravidina o estreptavidina, enzimas activadas con maleimida y similares. Estas etiquetas pueden hacerse reaccionar directamente con el oligomero o, si se requiere, con el oligomero derivado apropiadamente para dar el trazador. Si, por ejemplo, se utiliza un conjugado de peroxidasa de estreptavidina, entonces este requiere en primer lugar la biotinilacion del oligomero. Esto se aplica correspondientemente al orden inverso. Para este proposito tambien son conocidos metodos adecuados por el experto.

Si se elige un formato de inmunoensayo heterogeneo, el complejo de anticuerpo-antfgeno puede separarse uniendolo al soporte, a traves de un anticuerpo anti-idiotfpico acoplado a tal soporte, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el IgG de conejo. Los soportes, especialmente placas de microtitulacion que estan recubiertas con anticuerpos apropiados, se conocen y estan en parte comercialmente disponibles.

Otro aspecto de la presente invencion son conjuntos de inmunoensayo con al menos un anticuerpo descrito anteriormente y componentes adicionales. En este caso, se trata de una combinacion, usualmente como unidad de envasado, de medios para llevar a cabo una determinacion oligomerica de acuerdo con la invencion. Para el proposito de manejo tan facil como sea posible, se proporcionan preferiblemente estos medios en una forma esencialmente lista para usarse. Una disposicion ventajosa ofrece el inmunoensayo en forma de un kit. Un kit comprende usualmente varios recipientes para la disposicion separada de componentes. Todos los componentes pueden proporcionarse en dilucion lista para usarse, como concentrado para dilucion o como sustancia seca o liofilizado para disolver o suspender; algunos o todos los componentes pueden estar congelados o almacenarse a temperatura ambiente hasta su uso. Los sueros estan preferentemente congelados ultrarrapidamente, por ejemplo, a -20 °C, de manera que en estos casos un inmunoensayo tiene que mantenerse preferentemente a temperaturas de congelacion antes del uso.

Componentes adicionales suministrados con el inmunoensayo dependen del tipo del inmunoensayo. Usualmente, la protema estandar, el trazador que puede o no puede requerirse y el suero control se suministran junto con el antisuero. Ademas, pueden estar incluidos incluso placas de microtitulacion, preferentemente recubiertas con anticuerpo, tampones, por ejemplo para probar, para lavar o para la conversion del sustrato, y el sustrato de enzima.

Los principios generales de inmunoensayos y la generacion y uso de anticuerpos como auxiliares en el laboratorio y el hospital pueden encontrarse, por ejemplo, en Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow, E., Lane, D., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988).

Ademas, son tambien de interes sustancias que inhiben la agregacion de los oligomeros de acuerdo con la invencion o aceleran la desagregacion de los mismos. Tales sustancias representan particularmente posibles agentes terapeuticos para el tratamiento de las enfermedades de demencia asociadas a p amiloide anteriormente tales como, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer.

La presente invencion por lo tanto se relaciona tambien a un metodo para caracterizar una sustancia o una mezcla de sustancia, cuyo metodo comprende

i) proporcionar la sustancia o la mezcla de sustancia de una manera adecuada;

ii) dejar a la sustancia o la mezcla de sustancia actuar sobre al menos un oligomero de acuerdo con la invencion, derivado del mismo o una composicion; y

iii) determinar si la sustancia o partes determinadas de la mezcla de sustancia se unen al oligomero, o derivado del mismo o al menos un oligomero o derivado del mismo presente en la composicion.

Este metodo puede tambien llevarse a cabo en mezclas de origen biologico, por ejemplo, preparacion celular y extractos celulares, para identificar companeros de union naturales con afinidad de los oligomeros de acuerdo con la invencion, por ejemplo, antfgenos superficiales celulares, en particular receptores, y ligandos solubles, por ejemplo, protemas y mediadores determinados.

Ademas de la union simple de las sustancias, interacciones adicionales con e influencias sobre los oligomeros de acuerdo con la invencion pueden tambien ser objeto del metodo. De este modo, es posible determinar en particular si

- la sustancia es capaz de modular, en particular inhibir, la agregacion de la protema p-amiloide a los oligomeros de acuerdo con la invencion;

- la sustancia es capaz de modular, en particular promover, la desagregacion de los oligomeros de acuerdo con la invencion;

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- los oligomeros de acuerdo con la invencion provocan modificaciones funcionales en un companero de union, por ejemplo, poseen un efecto agomstico, parcialmente agomstico, antagomstico o agomstico inverso en un receptor.

Estos metodos son usualmente metodos de cribado in vitro que pueden utilizarse para seleccionar de una multiplicidad de diversas sustancias aquellas que parecen ser mas prometedoras con respecto a una aplicacion futura. Es posible, por ejemplo, establecer bibliotecas de sustancias extensas mediante qmmica combinatoria que comprenden una gran cantidad de principios activos potenciales. Puede automatizarse la seleccion de bibliotecas de sustancia combinatorias para con actividad deseada. Los robots de cribado sirven para analizar eficientemente los ensayos individuales que se disponen preferentemente en placas de microtitulacion. De este modo, la presente invencion se refiere tambien a metodos de cribado, es decir, tanto metodos de cribado primarios como secundarios, en donde se aplica preferentemente al menos uno de los metodos descritos posteriormente. Si se aplican varios metodos, estos pueden aplicarse a una y la misma muestra con un desfase de tiempo o simultaneamente, o a diferentes muestras de una sustancia que se prueba.

Una tecnologfa particularmente efectiva para llevar a cabo tales metodos es el ensayo de proximidad por centelleo, abreviado SPA, por sus siglas en ingles, que se conoce en el campo del cribado de principios activos. Los kits y componentes para llevar a cabo este ensayo pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, en Amersham Pharmacia Biotech. En principio, los receptores de union de membrana o solubilizados se inmovilizan en pequenas fluoromicroesferas que contienen una sustancia de centelleo. Si, por ejemplo, un radioligando se une a los receptores inmovilizados, la sustancia de centelleo se estimula para la emision de luz, debido a la proximidad espacial entre la sustancia de centelleo y el radioligando.

Otra tecnologfa particularmente efectiva para llevar a cabo los metodos de esta clase es la tecnologfa de FlashPlateR conocida en el campo del cribado de principios activos. Los kits y componentes para llevar a cabo este ensayo pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, en NENR Life Science Products. Este principio se basa asimismo en placas de microtitulacion (de 96 o 384 pocillos) recubiertas con sustancia de centelleo.

La presente invencion se refiere a sustancias o parte de las mezclas de sustancias que son identificables segun este metodo como una union de ligando al oligomero, o derivado del mismo o al menos un oligomero o derivado del mismo presente en una composicion correspondiente asf como al uso del mismo para preparar un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a amiloide p, en particular demencia o para preparar una composicion para diagnosticar enfermedades asociadas a amiloide p, en particular demencia.

Los ejemplos siguientes debenan ilustrar la invencion, sin limitar su alcance.

En los dibujos muestra:

La Figura 1 La Figura 2

La Figura 3 La Figura 4 La Figura 5 La Figura 6 La Figura 7 La Figura 8 La Figura 9

La Figura 10

una SDS PAGE de una preparacion de oligomero A de la Ap(1-42) (senda A); preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) (senda B); de protemas estandares (protemas marcadoras moleculares, senda C);

una SDS PAGE de una preparacion del oligomero A de la Ap(1-42) (senda A); preparacion del oligomero A-CL de la Ap(1-42) (senda A'); preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) (senda B); preparacion del oligomero B-CL de la Ap(1-42) (senda B'); de protemas estandares (protemas marcadoras moleculares, senda C);

una SDS PAGE de una preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) de biotina (senda A); de protemas estandares (protemas marcadoras moleculares, senda B);

una SDS PAGE de una preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) de fluorescema (senda A); de protemas estandares (protemas marcadoras moleculares, senda B);

una cromatograffa de permeacion de gel de una solucion que contiene liofilizado de la Ap(1-42) en comparacion con una preparacion que contiene los oligomeros B de la Ap(1-42); una NATIVA PAGE de una preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) (senda A), de protemas estandares (protemas marcadoras moleculares, senda B);

la union de (A) protema de la Ap(1-42) monomerica y (B) los oligomeros A de la Ap(1-42) asf como (C) oligomeros B de la Ap(1-42) a la superficie de la lmea celular de nueroblastoma humano IMR-32; el efecto neurotoxico en % despues del tratamiento de neuronas corticales de raton con oligomeros B de la Ap(1-42), correspondiendo la barra de error al 95 % del intervalo de confianza; una SDS PAGE de una preparacion de la Ap(1-42) tratada con tripsina (senda 2), quimiotripsina (senda 3), termolisina (senda 4); elastasa (senda 5), papama (lmea 6) o no tratada (senda 7); asf como de protemas estandares (protemas marcadoras moleculares, senda 1);

dot blot para la reactividad de 100 pmoles (fila A); 10 pmoles (fila B); 1 pmol (fila C); 0,1 pmoles (fila D) o 0,01 pmoles (fila E); de la preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) del ejemplo 6b (columna 1); del monomero de la Ap(1-42) tratado con HFIP del ejemplo 1a (columna 2); de la preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) desdoblado con termolisina del ejemplo 15a (columna 3); de la preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) reticulado con glutaraldetndo del ejemplo 14a (columna

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La Figura 11

La Figura 12 La Figura 13

La Figura 14 La Figura 15

4); de ADDL preparado de acuerdo con M.P. Lambert et al., J. Neurochem. 79, 595-605 (2001) a 4 °C o a temperatura ambiente o a 37 °C (columnas 5, 6 o 7); de la Ap(1-42) disuelta en el 0,1 % de NH4OH (columna 8); de una preparacion de fibrillas de la Ap(1-42) del ejemplo 27 (columna 9); y de APP diluido en PBS de la empresa Sigma (columna 10) con a) el anticuerpo 6E10 monoclonal; b) el antisuero policlonal (d1) del ejemplo 25d; c) el antisuero policlonal (c1) del ejemplo 25c; d) el antisuero policlonal (a1) del ejemplo 25a; y e) el antisuero policlonal (a2) del ejemplo 25a; una SDS PAGE de una preparacion del oligomero B de la Ap(20-42) del ejemplo 15a (senda B), de una preparacion del oligomero B de la Ap(12-42) del ejemplo 15b (senda C), de una preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) del ejemplo 6b (senda A); asf como de protemas estandares (protemas marcadoras moleculares, senda D);

una cromatograffa de permeacion de gel de la preparacion del oligomero B Ap(1-42) del ejemplo 6b en comparacion con la preparacion del oligomero Ap(1-42) B-CL del ejemplo 14a; una representacion esquematica de la protema Ap(1-42) monomerica (izquierda); del oligomero de la Ap(1-42) (12-meros, A); y del oligomero Ap(12-42) (12-meros, C) y el oligomero de la Ap(20-42) (12- meros, B) obtenibles por desdoblamiento proteolttico;

el potencial post-sinaptico excitatorio (fEPSP) dependiendo del tiempo de accion de oligomeros B de la Ap(1-42) sobre cortes de hipocampo;

una imagen inmunofluorescente que muestra la union de oligomeros B de la Ap(1-42) a neuronas de ratas hipocampales (a) en comparacion con la fluorescencia no unida espedficamente (b).

A menos que se establezca de otra manera, las concentraciones de los oligomeros de acuerdo con la invencion se expresan en moles del polipeptido de la Ap(1-42) monomerico. El termino protema p-amiloide(1-42) corresponde al termino protema p(1-42) amiloide. A menos que se establezca de otra manera, las protemas (polipeptidos) utilizados son de origen humano.

Ejemplo 1

a) Preparacion de una suspension madre de la Ap(1-42) humana

Se disuelven 2 mg de la protema p-amiloide (1-42) humana (abreviado: Ap(1-42); material peptido-sintetico, liofilizado, empresa Bachem, Alemania) en 800 pl de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol y se incuban en un tubo Eppendorf a 37 °C durante 30 minutos. Despues se evapora hasta sequedad en un concentrador al vado (Speed Vac). El residuo se recoge con 88 pl de DMSO, resultando en 5 mM de suspension madre de Ap(1-42). Esto puede conservarse a -20 °C.

b) Preparacion de una suspension madre de la Ap(1-42) de rata

Se disuelven 2 mg de la protema p-amiloide(1-42) de rata (abreviado: Ap(1-42) de rata); material peptido-sintetico, liofilizado, empresa Bachem, Alemania) en 800 pl de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol y se incubaron en un tubo Eppendorf a 37 °C durante 30 minutos. Despues se evapora hasta sequedad en un concentrador al vado (Speed Vac). El residuo se recoge con 88 pl de DMSO, resultando en una suspension madre de Ap(1-42) 5 mM. Esto puede conservarse a -20 °C.

Ejemplo 2

a) Preparacion de los oligomeros de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 15 kDa y 20 kDa [Oligomeros A de la Ap(1-42]; uso de SDS

Se mezclan 60 pl de la solucion madre del ejemplo 1a con 690 pl del tampon de PBS (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 7,4) y se ajustan con 75 pl de solucion de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 2 % a un contenido de SDS del 0,2 %. Despues se incuba durante 5 horas a 37 °C y se centrifuga durante 10 minutos a 10 000 g. Esta preparacion del oligomero A de la Ap(1-42) (aproximadamente 400 pM de la Ap(1-42)) puede conservarse a -20 °C.

b) Preparacion de los oligomeros de la Ap(1-42) de rata con pesos moleculares de 15 kDa y 20 kDa [oligomeros A de la Ap(1-42) de rata]; uso de SDS

Se mezclan 60 pl de la solucion madre del ejemplo 1b con 690 pl del tampon de PBS (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 7,4) y se ajustan con 75 pl de solucion de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 2 % a un contenido de SDS del 0,2 %. Despues se incuba durante 5 horas a 37 °C y se centrifuga durante 10 minutos a 10 000 g. Esta preparacion del oligomero A de la Ap(1-42) de rata (aproximadamente 400 pM de la Ap(1-42) de rata) puede conservarse a -20 °C.

c) Preparacion de los oligomeros de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 15 kDa y 20 kDa [oligomeros A de la Ap(1-42)]; uso de acido laurico

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Se mezclan 60 |jl de la solucion madre del ejemplo 1a con 690 |jl del tampon de PBS (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 7,4) y se ajustan con 75 jl de solucion de acido laurico al 5 % a un contenido de acido laurico del 0,5%. Despues se incuba durante 5 horas a 37 °C y se centrifuga durante 10 minutos a 10 000 g. Esta preparacion del oligomero A de la Ap(1-42) (aproximadamente 400 jM de la Ap(1-42)) puede conservarse a -20 °C.

d) Preparacion de los oligomeros de Ap(1-42) con pesos moleculares de 15 kDa y 20 kDa [oligomeros A de Ap(1- 42)]; uso de acido oleico

Se mezclan 60 jl de la solucion madre del ejemplo 1a con 690 jl del tampon de PBS (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 7,4) y se ajustan a un contenido de 0.5% con 75 jl de solucion de acido oleico al 5 % a un contenido de acido oleico del 0,5 %. Despues se incuba durante 5 horas a 37 °C y se centrifuga durante 10 minutos a 10 000 g. Esta preparacion del oligomero A de la Ap(1-42) (aproximadamente 400 jM de la Ap(1-42)) puede conservarse a -20 °C.

e) Preparacion de oligomeros de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 15 kDa y 20 kDa [oligomeros A de la Ap(1- 42)]; uso de lauroilsarcosina

Se mezclan 60 jl de la solucion madre del ejemplo 1a con 690 jl del tampon de PBS (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 7,4) y se ajustan al contenido de lauroilsarcosina de 0.5% con 75 jl de solucion de lauroilsarcosina al 5 % a un contenido de lauroilsarcosina del 0,5 %. Despues se incuba durante 5 horas a 37 °C y se centrifuga durante 10 minutos a 10 000 g. Este oligomero A de la Ap(1-42) (aproximadamente 400 jM de la Ap(1- 42) puede conservarse a -20 °C.

Ejemplo 3

a) Metodo alternativo para preparar los oligomeros de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 15 kDa y 20 kDa [oligomeros A de la Ap(1-42)]

Se tima 1 mg de la protema p-amiloide(1-42) humana (abreviado: Ap(1-42); material de peptido sintetico, liofilizado, empresa Bachem, Alemania) en 220 jl de 10 mM de solucion HCl acuosa y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los componentes insolubles se eliminan por centrifugacion a 10 000 g durante 5 minutos. El sobrenadante (1 mM de la Ap(1-42)) contiene la protema Ap(1-42) y se procesa posteriormente como sigue:

Se mezcla 1 jl del sobrenadante con 9 jl del tampon de PBS y 1 jl de solucion SDS al 2 % y se incuba a 37 °C durante 16 horas. La preparacion del oligomero A de la hAp(1-42) (100 jM) puede conservarse a -20 °C.

b) Metodo alternativo para preparar oligomeros de rata de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 15 kDa y 20 kDa [oligomeros A de la Ap(1-42) de rata]

Se toma 1 mg de la protema p-amiloide(1-42) de rata (abreviado: Ap(1-42) de rata; material del peptido sintetico, liofilizado, empresa Bachem, Alemania) en 220 jl de 10 mM de solucion HCI acuosa y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los componentes insolubles se eliminan por centrifugacion a 10 000 g durante 5 minutos. El sobrenadante (1 mM de Ap(1-42) de rata)) contiene la protema p(1-42) amiloide de rata y se procesa posteriormente como sigue:

Se mezcla 1 jl del sobrenadante con 9 jl del tampon de PBS y 1 jl de solucion SDS al 2 % y se incuba a 37 °C durante 16 horas. La preparacion del oligomero A de Ap(1-42) de rata (100 jM) puede conservarse a -20 °C.

Ejemplo 4

a) Metodo alternativo para preparar oligomeros de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 15 kDa y 20 kDa [oligomeros A de Ap(1-42)]

Se disuelve 1 mg de la protema p-amiloide(1-42) (abreviado: Ap(1-42); material del peptido sintetico, liofilizado, empresa Bachem, Alemania) en 44 jl del 1 % de SDS/H2O (5 mM de Ap(1-42)). Se mezclan 5 jl de la solucion con 40 jl de PBS y 5 jl del 2 % de SDS y se incuban a 37 °C durante 16 horas. Los componentes insolubles se eliminan por centrifugacion a 10 000 g durante 5 minutos. La preparacion del oligomero A de la Ap(1-42) asf obtenida (500 jM de la Ap(1-42)) puede conservarse a -20 °C.

b) Metodo alternativo para preparar oligomeros de Ap(1-42) de rata con pesos moleculares de 15 kDa y 20 kDa [oligomeros A de Ap(1-42) de rata]

Se disuelve 1 mg de la protema p-amiloide de rata (abreviado: Ap(1-42) de rata); material de peptido sintetico, liofilizado, empresa Bachem, Alemania) en 44 jl del 1 % de SDS/H2O (5 mM de Ap(1-42) de rata). Se mezclan 5 jl

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de la solucion con 40 |jl de PBS y 5 |jl del 2 % de SDS y se incuban a 37 °C durante 16 horas. Los componentes insolubles se eliminan por centrifugacion a 10 000 g durante 5 minutes. La preparacion del oligomero A de la Ap(1- 42) de rata (500 jM de la Ap(1-42) de rata)) as^ obtenido puede conservarse a -20 °C

Ejemplo 5

a) Preparacion de los oligomeros de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 38 kDa y 48 kDa [oligomeros B de la Ap(1-42)]

Una solucion del oligomero A de la Ap(1-42) obtenida de acuerdo con el ejemplo 2a se diluye con 2,475 ml de agua (el 0,05 % de contenido de SDS, 0,1 mM de la Ap(1-42)) y se incuba a 37 °C durante 20 horas. Las alteuotas de esta preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) pueden congelarse a -80 °C y almacenarse para estudios adicionales.

b) Preparacion de los oligomeros de la Ap(1-42) de rata con pesos moleculares de 38 kDa y 48 kDa [oligomeros B de la Ap(1-42) de rata]

Una solucion del oligomero A de la Ap(1-42) de rata obtenida de acuerdo con el ejemplo 2b se diluye con 2,475 ml de agua (el 0,05 % de contenido de SDS, 0,1 mM de la Ap(1-42) de rata)) y se incuba a 37 °C durante 20 horas. Las alteuotas de esta preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) de rata pueden congelarse a -80 °C y almacenarse para estudios adicionales.

c) Preparacion alternativa de los oligomeros de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 38 kDa y 48 kDa [oligomeros B de la Ap(1-42)]

Una solucion del oligomero A de la Ap(1-42) obtenida de acuerdo con el ejemplo 2c se diluye con 2,475 m de agua (el 0,125% de contenido de acido laurico, 0,1 mM de la Ap(1-42)) y se incuba a 37 °C durante 20 horas. Las alteuotas de esta preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) pueden congelarse a -80 °C y almacenarse para estudios adicionales.

d) Preparacion alternativa de los oligomeros de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 38 kDa y 48 kDa [oligomeros B de la Ap(1-42)]

Una solucion del oligomero A de la Ap(1-42) obtenido de acuerdo con el ejemplo 2d se diluye con 2,475 ml de agua (el 0,125% de contenido de acido oleico, 0,1 mM de la Ap(1-42)) y se incuba a 37 °C durante 20 horas. Las alteuotas de esta preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) pueden congelarse a -80 °C y almacenarse para estudios adicionales.

e) Preparacion alternativa de los oligomeros B de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 38 kDa y 48 kDa [oligomeros B de la Ap(1-42)]

Una solucion del oligomero A de la Ap(1-42) obtenido de acuerdo con el ejemplo 2e se diluye con 2,475 ml de agua (el 0,125% de contenido de laurilsarcosina, 0,1 mM de la Ap(1-42)) y se incuba a 37 °C durante 20 horas. Las alteuotas de esta preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) pueden congelarse a -80 °C y almacenarse para estudios adicionales.

f) Preparacion de los oligomeros B de la Ap(1-42) libres de SDS con pesos moleculares de 38 kDa y 48 kDa [oligomeros B de la Ap(1-42)]

Se mezclan 10 jl de una preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) preparado segun el ejemplo 6b con 250 jl de una mezcla de acido acetico/metanol/agua en la relacion del 4 %/33 %/63 % y se incuban a 0 °C en hielo durante 30 minutos. Despues de la centrifugacion (10 000 g durante 10 minutos), el sobrenadante se elimina y el residuo de protema precipitado se toma en 200 jl de tampon (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 7,4). La preparacion obtenida en esta manera contiene los oligomeros B de la Ap(1-42) disuelta en forma libre de y puede almacenarse a -20 °C.

Ejemplo 6

a) Dialisis y concentracion de los oligomeros de Ap(1-42) con pesos moleculares de 38 kDa y 48 kDa [oligomeros B de la Ap(1-42)]

Una preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) de acuerdo con el ejemplo 5a se mezcla con 30 ml de tampon de PBS que contiene el 0,1 % de Pluronic® F68 (empresa BASF) y se concentra a 3 ml en el Centriprep YM, 30 kD, de la empresa Amicon Los residuos que pueden presentarse se eliminan por centrifugacion (10 000 g durante 5 minutos). Se elimina el sobrenadante. Las alteuotas de esta preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) pueden

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congelarse a -80 °C y almacenarse para estudios adicionales.

b) Preparacion de un concentrado de los oligomeros B de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 38 kDa y 48 kDa [oligomeros B de la Ap(1-42)]

Se concentran 72,6 ml de una preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) obtenida de acuerdo con el ejemplo 5a en 2 ml por un tubo Centriprep YM (Amicon). El concentrado se elimina por centrifugacion a 10 000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se elimina y se dializa a 6 °C en un tubo de dialisis contra 1 l de tampon (5 mM de fosfato de sodio, 35 mM de cloruro de sodio, pH 7,4) durante 16 horas. El dialisato se elimina por centrifugacion a 10 000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se elimina y puede almacenarse a -80 °C para estudios adicionales.

Ejemplo 7

Preparacion de la suspension madre de biotina-Ap(1-42)

Se disuelven 0,5 mg de la protema de biotina-p-amiloide(1-42) (abreviado: biotina-Ap(1-42); material del peptido sintetico; liofilizado, AnaSpec) en 200 pl de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol y se incuban en un tubo de Eppendorf a 37 °C durante 30 minutos. Despues se evapora hasta sequedad en un concentrador de vado (Speed Vac). El residuo se toma con 20,5 pl de DMSO, produciendo una suspension madre de 5 mM de biotina-Ap(1-42). Esta puede conservarse a -20 °C.

Ejemplo 8

Preparacion de los oligomeros de biotina-Ap(1-42) con pesos moleculares de 17 kDa y 22 kDa [oligomeros A de biotina-Ap(1-42)]

Se mezclan 2 pl de la suspension madre del ejemplo 7 con 23 pl de tampon de PBS (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 7,4) y se ajusta a un contenido del 0,2 % de SDS con 2,4 pl de solucion de SDS al 2 %. Despues se incuba durante 6 horas a 37 °C. Los componentes insolubles se eliminan por centrifugacion a 10 000 g durante 5 minutos. La preparacion del oligomero A de biotina-Ap(1-42) obtenida de esta manera puede conservarse a -20 °C.

Ejemplo 9

Preparacion de los oligomeros de la biotina-Ap(1-42) con pesos moleculares de 42 kDa y 52 kDa [oligomeros B de biotina-Ap(1-42)]

Se diluye una solucion del oligomero A de biotina-Ap(1-42) obtenida de acuerdo con el ejemplo 8 con 82 pl de agua (el 0,05 % de contenido de SDS, 0,1 mM de Ap) y se incuba a 37 °C durante 16 horas. Los componentes insolubles se eliminan por centrifugacion a 10 000 g durante 5 minutos. La preparacion del oligomero B de la biotina-Ap(1-42) puede congelarse a -20 °C y almacenarse para estudios adicionales (Figura 3).

Ejemplo 10

Preparacion de la suspension madre de fluorescema-Ap(1-42)

Se disuelven 0,5 mg de fluorescema-p-amiloide(1-42) (abreviado: fluorescema-Ap(1-42); material del peptido sintetico, liofilizado, AnaSpec) en 200 pl de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol y se incuban en un tubo de Eppendorf a 37 °C durante 30 minutos. Despues de evapora hasta sequedad en un concentrador de vado (Speed Vac). El residuo se toma con 20,5 pl de DMSO, produciendo 5 mM de suspension madre de fluorescema-Ap(1-42). Esta puede almacenarse a -20 °C.

Ejemplo 11

Preparacion de los oligomeros de fluorescema-Ap(1-42) con pesos moleculares de 17 kDa y 22 kDa [oligomero A de la fluorescema-Ap(1-42)]

Se mezclan 2 pl de la suspension madre del ejemplo 10 con 23 pl de tampon de PBS (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 7,4) y se ajusta a un contenido del 0,2 % de SDS con 2,4 pl de solucion SDS al 2 %. Despues se incuba durante 6 horas a 37 °C. Los componentes insolubles se eliminan por centrifugacion a 10 000 g durante 5 minutos. La preparacion del oligomero A de la fluorescema-Ap(1-42) obtenida de esta forma puede conservarse a - 20 °C.

Ejemplo 12

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Preparacion de los oligomeros de fluorescema-Ap(1-42) con pesos moleculares de 42 kDa y 52 kDa (oligomeros B de la fluorescema-Ap(1-42)]

Se diluye una solucion del oligomero A de la fluorescema-Ap(1-42) obtenida de acuerdo con el ejemplo 11 con 82 pl de agua (el 0,05 % de contenido de SDS, 0,1 mM de Ap) y se incuba a 37 °C durante 16 horas. La preparacion del oligomero B de la fluorescema Ap(1-42) puede congelarse a -80 °C y almacenarse para estudios adicionales (Figura 4).

Ejemplo 13

Reticulacion de los oligomeros A de la Ap(1-42) del ejemplo 2a [oligomeros A-CL de la Ap(1-42)]

Se diluyen 10 pl de una solucion del oligomero A de la Ap(1-42) preparada de acuerdo con el ejemplo 2a a 100 pl del contenido de Ap(1-42) con 7,5 pl de PBS, 0,2% de SDS. A esta solucion se anade 1 pl de solucion de 10 mM de glutardialdetndo recientemente preparado en agua, y se agita a TA durante 3 horas. El glutardialdetndo en exceso se satura agregando 1 pl de 10 mM de solucion de etanolamina en agua, pH 7,4, a la muestra y se agita durante 1 hora. La preparacion obtenida en esta forma contiene oligomeros A de la Ap(1-42) reticulados y se denomina preparacion de los oligomeros A-CL de la Ap(1-42).

Ejemplo 14

a) Reticulacion de los oligomeros B de la Ap(1-42) del ejemplo 5a [oligomeros B-CL de la Ap(1-42)]

Se mezclan 10 pl de una solucion del oligomero B de la Ap(1-42) preparada de acuerdo con el ejemplo 5a con 1 pl de 10 mM de la solucion de glutardialdetndo recientemente preparada en agua y se agita a TM durante 3 horas. El exceso de glutardialdetndo se satura agregando 1 pl de 10 mM de solucion de etanolamina en agua, pH 7,4, a la muestra y se agita durante 1 hora. La preparacion obtenida de esta manera contiene oligomeros B de la Ap(1-42) reticulada y se denomina preparacion de los oligomeros B-CL de Ap(1-42).

b) Procedimiento alternativo para reticular los oligomeros de la Ap(1-42) [oligomeros B-CL de la Ap(1-42)]

Se mezclan 72,6 ml de una solucion del oligomero B de la Ap(1-42) preparada de acuerdo con el ejemplo 5a con 7,26 ml de una solucion de 10 mM de glutardialdetndo recientemente preparada en agua y se agitan a TA durante 2 horas. El exceso de glutardialdetndo se satura agregando 726 pl de tampon (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, 500 mM de etanolamina, pH 7,4) a la muestra y se agita a TA durante 30 minutos. La mezcla de reaccion se concentra a 3 ml por un tubo Centriprep de 15 ml 30 kDa. El concentrado se elimina por centrifugacion a 10 000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se elimina y se dializa a 6 °C en tubo de dialisis contra 1 l de 5 mM de fosfato de sodio, 35 mM de Nacl, pH 7,4, durante 16 horas. El dialisato se elimina subsecuentemente y puede almacenarse a -80 °C para estudios adicionales. La preparacion obtenida de esta manera contiene oligomeros B de la Ap(1-42) reticulada y se denomina preparacion del oligomero B-CL de Ap(1-42).

Ejemplo 15

a) Preparacion de los oligomeros de la Ap(20-42) truncados a partir de los oligomeros B de la Ap(1-42) por desdoblamiento con termolisina:

Se mezclan 1,59 ml de una preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) preparada de acuerdo con el ejemplo 6b con 38 ml de tampon (50 mM de MES/NaOH, pH 7,4) y 200 pl de 1 mg/ml de solucion de termolisina (empresa Roche) en agua. La mezcla de reaccion se agita a TA durante 20 horas. Luego se anaden 80 pl de una solucion de 100 mM de EDTA, pH 7,4, en agua y se ajusta adicionalmente a un contenido de SDS del 0,01 % con 400 pl de la solucion SDS al 1 %. La mezcla de reaccion se concentra en aproximadamente 1 ml por un tubo de Centriprep de 15 ml 30 kDa. El concentrado se mezcla con 9 ml de tampon (50 mM de MES/NaOH, el 0,02 % de SDS, pH 7,4) y de nuevo se concentra a 1 ml. El concentrado se dializa a 6 °C contra 1 l de tampon (5 mM de fosfato de sodio, 35 mM de NaCl) en un tubo de dialisis durante 16 horas. El dialisato se ajusta a un contenido de SDS del 0,1 % con una solucion de SDS al 2 % en agua. La muestra se elimina por centrifugacion a 10 000 g durante 10 minutos y el sobrenadante se elimina.

El material asf obtenido se analiza ademas (electroforesis de gel de poliacrilamida SDS; vease Figura 11); el analisis espetrometrico de masa de los oligomeros truncados producidos revela que el oligomero se compone de la Ap(1-42) truncada.

b) Preparacion de los oligomeros de la Ap(12-42) truncados a partir de los oligomeros B de la Ap(1-42), por desdoblamiento con endoproteinasa GluC:

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Se mezclan 2 ml de la preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) preparada de acuerdo con el ejemplo 6b con 38 ml de tampon (5 mM de fosfato de sodio, 35 mM de cloruro de sodio, pH 7,4) y 150 jl de una endoproteinasa GluC 1 mg/ml (empresa Roche) en agua. La mezcla de reaccion se agita durante 6 horas a TA. A continuacion se anaden 150 jl adicionales de una endoproteinasa GluC 1 mg/ml (empresa Roche) en agua. La mezcla de reaccion se agita a TA durante otras 16 horas. Despues se anaden 8 jl de una solucion de 5 M de DIFP. La mezcla de reaccion se concentra en aproximadamente 1 ml por 15 ml del tubo Centriprep 30 kDa. El concentrado se mezcla con 9 ml del tampon (5 mM de fosfato de sodio, 35 mM de cloruro de sodio, pH 7,4) y se concentra otra vez a 1 ml. El concentrado se dializa a 6 °C contra 1 l del tampon (5 mM de fosfato de sodio, 35 mM de NaCl) en un tubo de dialisis durante 16 horas. El dialisato se ajusta a un contenido de SDS del 0,1 % con una solucion de SDS al 1 % en agua. La muestra se elimina por centrifugacion a 10 000 g durante 10 minutos y el sobrenadante se elimina.

El material asf obtenido se analiza de nuevo (electroforesis de gel de poliacrilamida SDS; vease Figura 11). El analisis espectrometrico de masa del oligomero truncado producido revela que el oligomero se compone de la Ap(1- 42) truncada.

Caracterizacion de los oligomeros Ap(1-42)

Ejemplo 16

Electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (SDS PAGE)

El peso molecular bajo condiciones de desnaturalizacion se caracteriza analizando las preparaciones de los ejemplos 2a, 5a, 9, 12, 13 y 14a, todos los cuales contienen los oligomeros A y B, bajo condiciones de desnaturalizacion de acuerdo a condiciones estandares en un SDS PAGE de Tris-glicina al 4-20 %.

La evaluacion del SDS PAGE (Figura 1) revela que la protema Ap(1-42) de inicio presente aun en la preparacion del oligomero A aparece como una banda en aproximadamente 4 kDa, mientras los oligomeros A1 o A2 del ejemplo 2a, que estan denominados 1 y 2 en la Figura 1, son visibles en aproximadamente 15 kDa (banda mas debil) y en aproximadamente 20 kDa (banda principal).

En la preparacion del oligomero B puede detectarse comparativamente poca protema de partida Ap(1-42) (banda relativamente debil en aproximadamente 4 kDa). En contraste, los oligomeros B1 o B2 del ejemplo 5a, que estan denominados 3 y 4 en la Figura 1, aparecen en aproximadamente 38 kDa y aproximadamente 48 kDa (veanse las flechas). Los pesos moleculares correspondientemente mas elevados de aproximadamente 42 kDa y aproximadamente 52 kDa se originan de los oligomeros B derivados de biotina y fluorescema de los ejemplos 9 y 12 (Figuras 3, 4).

El analisis de las preparaciones que contienen los respectivos productos de reticulacion A-CL y B-CL (ejemplos 13 y 14a; Figura 2) muestra que las dos muestras mantienen esencialmente su grado de oligomerizacion (vease senda A y la senda B con B'). El comportamiento de migracion ligeramente diferente comparado a los oligomeros A y B pueden explicarse por una capacidad de union SDS ligeramente alterada y por la modificacion de los grupos amino del termino N o del residuo de lisina.

El analisis de los oligomeros Ap(20-42) truncados (del Ejemplo 15a) muestra que la doble banda 38/48 kDa (Figura 11, senda A) se convierte a una doble banda 28/38 kDa (Figura 11; senda B) por el desdoblamiento proteolftico del peptido N terminal con termolisina. De manera similar, el analisis de los oligomeros de la Ap(1-42) truncados (del ejemplo 15b) muestra que la doble blanda 38/48 kDa (Figura 11; senda A) se convierte a una doble banda 33/40 kDa (Figura 11; anillo C) por desdoblamiento proteolftico del peptido N-terminal con endoproteasa Glu-C.

Ejemplo 17

Cromatograffa de permeacion de gel

Para estudiar el comportamiento de peso molecular bajo condiciones no desnaturalizadas en mayor detalle, se lleva a cabo una cromatograffa de permeacion de gel (GPC, por sus siglas en ingles) a manera de un proceso FPLC utilizando una columna Superose 12 HR10/30. La GPC se activa a 4 °C.

La columna se equilibra con 5 volumenes de columna de tampon de PBS (velocidad de flujo 0,5 ml/min, deteccion de UV, 214 nm) y se calibra primero utilizando estandares de protema. Subsecuentmente, se analiza la preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) del ejemplo 5a (Figura 5, inferior) y, en comparacion, la misma concentracion del liofilizado de la Ap(1-42) recientemente pesado y disuelto en PBS, despues de eliminar por centrifugacion los componentes insolubles a 10 000 g durante 5 minutos (Figura 5, superior).

La evaluacion revela que la preparacion del oligomero B de la protema Ap(1-42) presenta una fraccion de protema caracterizada por un pico principal en el intervalo de peso molecular de alrededor de aproximadamente 50 kDa.

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Como bajo condiciones de desnaturalizacion en la SDS PAGE, esta fraccion de la protema difiere significativamente de la protema Ap(1-42) monomerica caracterizada por un pico principal del intervalo del peso molecular de alrededor de aproximadamente 16 kDa.

Para estudiar el comportamiento de peso molecular de los oligomeros B de la Ap(1-42) del ejemplo 6b asf como los oligomeros B-CL de la Ap(1-42) del ejemplo 14a bajo condiciones no desnaturalizadas, se lleva a cabo una cromatograffa de permeacion de gel (GPC) a manera de proceso de FPLC utilizando una columna Superose 12 HR120/30 a temperatura ambiente. La columna se equilibra con 5 volumenes de columna de tampon de PBS (velocidad de flujo 0,5 ml/min, deteccion de UV, 214 nm) y se calibra primero utilizando estandares de protema. Subsecuentemente, el oligomero B de la Ap(1-42) del ejemplo 6b se diluye a 1 mg/ml con tampon de PBS asf como se diluye y analiza el oligomero B-CL de la Ap(1-42) del ejemplo 14a a 1 mg/ml con tampon de PBS (Figura 12).

La evaluacion revela que la preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) con contenido de SDS reducido presenta una fraccion de protema caracterizada por un pico principal en el intervalo de peso molecular de alrededor de aproximadamente 100 kDa. En comparacion a esto, la preparacion del oligomero B-CL de la Ap(1-42) con contenido de SDS reducido presenta una fraccion de protema caracterizada por un pico principal en el intervalo de peso molecular de alrededor de aproximadamente 60 kDa.

Ejemplo 18

Electroforesis de gel de poliacrilamida nativa (NATIVE PAGE) de los oligomeros B de la Ap(1-42) del ejemplo 5a

El peso molecular bajo condiciones nativas se caracteriza analizando las preparaciones que contienen los oligomeros B del ejemplo 5a bajo condiciones no naturalizadas en un gel de Tris-glicina al 4-20 %.

El detergente presente en las preparaciones se neutraliza por el detergente no ionico Triton X-100. Con este fin, se pipetea 1 pl (el 4 % de Triton X-100) a 10 pl de la preparacion del ejemplo 5a e se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos. Subsecuentemente, se mezclan 10 pl con el mismo volumen de tampon de muestra nativo (4 ml de 1M de Tris, pH 6,8, 8 ml de glicerol, 1 ml de azul de bromofenol en 50 ml de H2O) y se lleva a cabo la electroforesis (tampon de activacion: 7,5 g, de Tris, 36 g de glicina a 2,5 l de H2O).

La evaluacion de NATIVA PAGE revela que la Ap(1-42) del peptido de partida presente aun en la preparacion del oligomero B aparece como banda en aproximadamente 28 kDa (senda A, indicada con 1), mientras que las bandas principales de la preparacion del ejemplo 5a son visibles en un peso molecular aparente de 64-90 kDa (senda A, indicada con 2) (Figura 6).

Es importante que los pesos moleculares puedan asignarse a los oligomeros de acuerdo con la invencion, en particular los oligomeros B, tambien en metodos analfticos de peso molecular nativo tal como cromatograffa de permeacion de gel (vease el ejemplo 17) o la electroforesis de gel nativo (vease el ejemplo 18).

Despues de complejar el SDS, los oligomeros B a los cuales pueden asignarse en la SDS PAGE pesos moleculares de aproximadamente 38 y 48 kDa se detectan en la electroforesis de gel nativa como banda en el intervalo de peso molecular de aproximadamente 64-90 kDa con respecto a las protemas estandares seleccionadas. Tras este metodo no puede esperarse proporcionar una lectura exacta del peso molecular, ya que el comportamiento de migracion de los oligomeros se determina sustancialmente por sus cargas intrmsecas, ademas de su tamano. Sin embargo, el resultado puede conducir a la conclusion de que se presenta una especie oligomerica definida.

Ejemplo 19

a) Estabilidad de los oligomeros B de la Ap(1-42) en distintas concentraciones de protema en tampones fisiologicos

Los oligomeros B de la Ap(1-42) obtenidos segun el ejemplo 6b se prueban para estabilidad en tampon de PBS bajo las siguientes condiciones.

Se diluyen 5 mg/ml con PBS en 2 x etapas de dilucion hasta 0,08 mg/ml. Todas las soluciones obtenidas se incuban a temperatura ambiente durante 24 horas. A continuacion, se analizo el patron de banda en una SDS PAGE en comparacion con una preparacion de control congelada. El patron de banda es identico en todas las muestras.

b) Estabilidad de los oligomeros B de la Ap(1-42) a distintas temperaturas y despues de diferentes penodos de tiempo en tampones fisiologicos.

Los oligomeros B de la Ap(1-42) obtenidos segun el ejemplo 6b se diluyen a 0,5 mg/ml con tampon de PBS y se incuban a temperatura ambiente durante 24 horas o 96 horas o a 37 °C. A continuacion, se analizo el patron de banda en una SDS PAGE. El patron de banda es identico en todas las muestras.

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Proteolisis de los oligomeros B de la Ap(1-42) mediante distintas proteasas (tripsina, quimiotripsina, termolisina, elastasa, papama)

Las almuotas de la preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) obtenida segun el ejemplo 6b se diluyen a 0,5 mg/ml con tampon (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 7,4) y se incuban en cada caso con 1/50 de la cantidad en peso de las soluciones de proteasa indicadas en la Figura 9 bajo las siguientes condiciones a 37 °C y pH 7,4 durante 20 horas. Se analiza entonces 1 |jg de las almuotas de mezclas reactivas en una SDS-PAGE (Figura 9).

La SDS PAGE muestra que, a partir de la preparacion de los oligomeros B de la Ap(1-42), todas las proteasas revierten la doble banda a aproximadamente 38/48 kDa a una doble banda kDa en aproximadamente 32/28 kDa bajo las condiciones de proteolisis limitada elegida.

Ejemplo 21

Estabilidad de los oligomeros B de la Ap(1-42) en plasma de rata

Se incuban 4 jl de la preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) preparada segun el ejemplo 6b con 76 jl de plasma de rata a temperatura ambiente durante 0 h, 1 h, 2 h, 4 h y 8 h. Las incubaciones se detienen congelando en hielo seco.

Subsecuentemente, todas las muestras se analizan en una SDS PAGE, despues de la adicion del tampon de muestra SDS. Despues se realiza una evaluacion de la estabilidad a traves de la tincion de los oligomeros B de Ap(1-42) en Western blot. Para la deteccion se utilizo el anticuerpo 6E10 anti-Ap(1-42) (empresa Signet). Las bandas se hacen visibles por un anticuerpo IgG anti-raton acoplado a alcalifosfatasa y adicion del sustrato NBT/BCIP. Tanto el peso molecular como la intensidad del patron de banda observada permanecen casi sin cambios durante un penodo de 2 h, 4 h y 8 h.

Este resultado sugiere que los oligomeros B de la Ap(1-42) presentan una estabilidad de plasma elevada. De acuerdo a esta, la vida promedio biologica en el plasma esta en el intervalo de aproximadamente 8 horas o mas prolongada.

Ejemplo 22

Union de los oligomeros de biotina-Ap(1-42) con pesos moleculares de 17 kDa y 22 kDa [oligomeros A de biotina- Ap(1-42)] o de 42 kDa y 52 kDa [oligomeros B de la biotina-Ap(1-42)] a la superficie de las celulas neuronales humanas.

La union de la protema p-amiloide(1-42) humana y las dos preparaciones del oligomero A de la Ap(1-42) y el oligomero B de la Ap(1-42) a la lmea IMR-32 de celula de neuroblastoma humano (Numero ATCC: CCL-127) se estudia por medio de FACScan (Becton Dickinson). Se incuba una suspension de celulas IMR-32 (1,5 x 106 celulas/0,1 ml de PBS) con la protema p-amiloide(1-42) humana etiquetada con biotina (material de peptido sintetico, liofilizado, AnaSpec) y las preparaciones que contienen los oligomeros A o B etiquetados con biotina (ejemplos 8 o 9) a 37 °C durante 20 minutos. Las celulas se lavan subsecuentemente con tampon (PBS mas el 1 % de bSa) y se incuban a temperatura ambiente con fluorescema acoplada a isotiocianato de estreptavidina (empresa Sigma) durante 20 minutos. Despues de una etapa de lavado con tampon, la union a la superficie de las celulas IMR-32 se analizo por FACscan. La lmea sombreada muestra la fluorescencia de fondo en ausencia de los componentes etiquetados con biotina. La adicion de las preparaciones individuales resulto en un fuerte incremento de fluorescencia asociada a celulas y esta representada por la lmea gruesa. La union de los oligomeros A (Figura 7B) y B (Figura 7C) a las superficies celulares se diferencia claramente de la union de la protema p-amiloide (1-42) monomerica (Figura 7A). Los datos muestran los sitios de union espedficos para los oligomeros en superficies celulares humanas.

Ejemplo 23

Deteccion de los oligomeros B de la Ap(1-42) en homogenatos de cerebro de rata despues de la administracion icv

Se aplicaron 10 nmoles de una preparacion del oligomero B de Ap(1-42) obtenida segun el ejemplo 6b como bolo icv a ratas. Los cerebros se preparan despues de 15 minutos o despues de 120 minutos. Se preparan asimismo cerebros de animales de control no tratados. Para este proposito, en cada caso, se mezcla 1 g de cerebro de rata con 9 ml de tampon de interrupcion A (200 ml de fosfato de sodio 5 mM, 35 mM de NaCl, 300 mM de sacarosa, ajustado a pH 7,4, con 4 comprimidos del coctel inhibidor de proteasa Complete®, empresa Roche) en un tubo Falcon de 50 ml y se interrumpe bajo ultrasonido (Ultra Turrax) en hielo durante 2 minutos. La solucion se deja

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reposar durante 20 minutes, luego se agita brevemente y se divide en 8 x 1 ml de alteuotas (= homogenate).

Para llevar a cabo la deteccion cuantitativamente, se prepara primero una serie de estandares de la preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) en el intervalo de concentracion de 1,58 ng/pl - 0,005 ng/pl.

Ademas, como control positivo, se procesa tambien un homogenato a partir de un cerebro de control de una rata no tratada y se prepara una serie de estandares de la preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) en este homogenato de cerebro en la misma manera. Los homogenatos se centrifugan entonces en la ultracentrifugadora a 100 000 g durante 1 hora y los sobrenadantes se utilizan para los analisis subsecuentes.

A partir de la comparacion de los valores medidos en ambas series de estandares (PBS contra el sobrenadante de homogenato de cerebro de control), el contenido de oligomero B de la Ap(1-42) puede determinarse cuantitativamente como sigue, primero en el control positivo y luego, en comparacion con el mismo, tambien en la muestra de cerebro de las ratas tratadas.

1) Deteccion por dot blot

Se anade 1 pl de gotas de las muestras de serie estandares y de los extractos de muestra a partir de los animales tratados sobre papel de nitrocelulosa, y se detecta la Ap(1-42) utilizando el anticuerpo 6E10 (anti-Ap(1-42). La tincion se lleva a cabo utilizando una alcalifosfatasa acoplada a IgG anti-raton y por adicion del reactivo de tincion NBT/BCIP.

Aunque no es detectable ninguna Ap(1-42) (0,01 nmoles/g) en los extractos de cerebro de ratas no tratadas, aproximadamente 0,4 nmoles/g de la Ap(1-42) pueden detectarse en ratas sacrificadas 15 minutos despues del tratamiento comparando la intensidad de tincion con las concentraciones correspondientes del control positivo, y aproximadamente 0,2 nmoles/g pueden detectarse ademas por el mismo metodo en las ratas sacrificadas 120 minutos despues del tratamiento. Esto resulta en una vida media biologica promedio de aproximadamente 105 minutos de los oligomeros B de la Ap(1-42) aplicada exogenamente.

2) Deteccion por Western blot

Todas las muestras analizadas por dot blot se analizan asimismo en Western blot. La Western blot se desarrolla asimismo con mMAb 6E10 (anti-Ap(1-42); empresa Signet) y ademas con una alcalifosfatasa acoplada a IgG anti- raton y agregando el reactivo de tincion NBT/BCIP.

Las bandas reactivas anti-Ap(1-42) ocurren unicamente en el intervalo 38/48 kDa, lo cual corresponde al peso molecular aparente de los oligomeros B de la Ap(1-42), es decir, la estructura oligomerica se retiene todavfa con la administracion in vivo, aun despues de 2 horas.

Ademas, como en el metodo de dot blot, pueden estimarse las mismas concentraciones en los cerebros de ratas de 15 minutos (0,4 nmoles/g) asf como de las ratas de 120 minutos (0,2 nmoles/g) comparando las intensidades de tincion con bandas intensamente tenidas correspondientemente de los oligomeros B de Ap(1-42) en el control positivo.

Ejemplo 24

Accion neurotoxica de los oligomeros de la Ap(1-42) con pesos moleculares de 38 kDa y 48 kDa [oligomeros B de la Ap(1-42)] en neuronas corticales de raton

La preparacion y cultivo de neuronas corticales de murino se realiza como cultivo de mezcla con celulas gliales siguiendo el ejemplo de la bibliograffa (Choi et al. (1987) J. Neurosci, 7, 357-368). En embriones se liberan mecanicamente en los dfas 14-15 de desarrollo las cortezas de las meninges y regiones cerebrales mas profundas. Las celulas se separan una de la otra por incubacion durante 5-7 minutos en una solucion de tripsina al 0.05 % a 37 °C y se pipetea subsecuentemente varias veces a traves de una pipeta de Pasteur con abertura reducida. Despues de determinar el numero de celulas, se seleccionan 430 000 celulas en 0,5 ml de medio de mantenimiento (medio esencial mmimo con 0,8 mM de glutamina, 18 mM de glucosa, 23 mM de NaHCO3 y el 10 % de suero de caballo) por 2 cm2 en material de cultivo celular que se ha recubierto con poli-L-ornitina y laminina. El cultivo y las posteriores incubaciones de las celulas se realizan en un incubador de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5 % de CO2. Despues de 3-5 dfas en cultivo, la propagacion de las celulas gliales se interrumpe por una incubacion de 1 dfa con una mezcla de (+)-5-fluoro-2'-desoxiuridina/uridina (10 pM de cada una). Despues de 14 dfas en el cultivo, se estudia la accion toxica de los oligomeros B de la Ap(1-42). Para este proposito, las celulas se incuban en tampon de celulas de cerebro (120 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 15 mM de glucosa, 25 mM de HEpEs, pH 7,2) durante 15 minutos. Las celulas 1 control se incuban con 300 pM de L-glutamato en tampon de celulas de cerebro el mismo tiempo. La solucion madre del oligomero Ap se diluye con medio libre de suero (medio esencial mmimo con 0,8 mM de glutamina, 20 mM de glucosa, 26 mM de NaHCOa) en distintas concentraciones finales y se

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incuba durante 24 horas. Las celulas de control 1 tratadas con L-glutamato se incuban en paralelo en medio libre de suero. Otro grupo de celulas (celulas de control 2) se tratan solo con tampon de celulas de cerebro y medio libre de suero. Los sobrenadantes del cultivo celular se eliminan despues de 24 horas, las celulas restantes se destruyen por la incubacion de 20 minutos en agua destilada y la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) se determina enzimaticamente en ambas soluciones. Para la evaluacion, se determina la relacion de la actividad de LDH de los sobrenadantes de cultivo celular a la suma de las actividades de LDH del sobrenadante y las celulas restantes y se forma el promedio de las determinaciones cuadruples. Se llevan a cabo 3 experimentos, estando presente cada condicion experimental por cuadruplicado (n = 12). El promedio de las celulas tratadas con glutamato (celulas de control 1) se establece al 100 % de muerte neuronal, el promedio de las celulas que no se han tratado ni con L-glutamato ni con los oligomeros Ap (celulas de control 2) se establece al 0 % de muerte neuronal y los valores de las celulas tratadas con los oligomeros Ap se convierten de manera correspondiente. El promedio de neurotoxicidad de todas las determinaciones en las concentraciones utilizadas en cada caso muestra una accion toxica considerable de los oligomeros Ap(1-42) con pesos moleculares de 38 kDa y 48 kDa [oligomero B de la Ap(1- 42)], vease la Figura 8.

Ejemplo 25

Produccion de los anticuerpos

Los cocteles utilizados para la inmunizacion contienen en todos los casos adyuvantes (empresa Biogenes) con esencialmente los siguientes componentes:

95 %: de aceite de parafina

2,4%: de Tween 40

0,1%: de colesterol

0,1%: de lipopolisacarido

El adyuvante se mezcla con una solucion del antfgeno en una relacion 2:1 hasta que se obtiene una emulsion estable. La emulsion se inyecta y forma un deposito a partir del cual se libera continuamente el antfgeno.

a) Produccion de antisuero policlonal por inmunizacion de conejos con oligomeros B de la Ap(20-42) truncados del ejemplo 15a.

Se inmunizan 2 conejos con la preparacion del oligomero B de la Ap(20-42) no conjugado del ejemplo 15a de acuerdo a un protocolo estandar:

Dfa 1 Inmunizacion primaria y la toma de suero preinmune

Dfa 7 Primer estfmulo

Dfa 14 Segundo estimulo

Dfa 28 Tercer estimulo y sangrado

Dfa 35 Toma de sangre

Los antisueros se obtienen a partir de la sangre de conejo dejando reposar el ultimo a temperatura ambiente y la centrifugacion subsecuente a temperatura ambiente. El suero obtenido de esta manera se denomina suero (a1).

Se acoplan 2 mg de la preparacion del oligomero B de la Ap(20-42) del ejemplo 15a a LPH con glutardialdehudo bajo condiciones estandares y se inmunizan 2 conejos mas con este oligomero B de la Ap(20-42) conjugado de acuerdo a un protocolo estandar:

Dfa 1: Inmunizacion primaria y toma del suero preinmune

Dfa 7: Primer estfmulo

Dfa 14: Segundo estimulo

Dfa 28: Tercer estimulo y sangrado

Dfa 35: Toma de sangre

Los antisueros se obtienen a partir de la sangre de conejo dejando al ultimo permanecer a temperatura ambiente y la centrifugacion subsecuente a temperatura ambiente. El suero obtenido de esta manera se denomina suero (a2).

b) Produccion de antisueros policlonales por inmunizacion de conejos con oligomeros B de la Ap(12-42) truncados del ejemplo 15b.

Se inmunizan 2 conejos con la preparacion del oligomero B de la Ap(12-42) no conjugada del ejemplo 15b de acuerdo al protocolo estandar:

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Dfa 1: Inmunizacion primaria y toma de suero preinmune

Dfa 7: Primer estfmulo

Dfa 14: Segundo estfmulo

Dfa 28: Tercer estfmulo y sangrado

Dfa 35: Toma de sangre

Los antisueros se obtienen a partir de la sangre del conejo, dejando al ultimo permanecer a temperatura ambiente y la centrifugacion subsecuente a temperatura ambiente. El suero obtenido de esta manera se denomina suero (b1).

Se acoplan 2 mg de la preparacion del oligomero B de la Ap(12-42) del ejemplo 15b a LPH con glutardialdetudo bajo condiciones estandares y se inmunizan 2 conejos mas con este oligomero B de la Ap(12-42) conjugado de acuerdo a un protocolo estandar.

Dfa 1: Inmunizacion primaria y toma de suero preinmune

Dfa 7: Primer estfmulo

Dfa 14: Segundo estfmulo

Dfa 28: Tercer estfmulo y sangrado

Dfa 35: Toma de sangre

Los antisueros se obtienen de la sangre del conejo dejando al ultimo permanecer a temperatura ambiente y la centrifugacion subsecuente a temperatura ambiente. El suero obtenido de esta manera se denomina suero (b2).

c) Produccion de antisueros policlonales por inmunizacion de conejos con oligomeros B-CL de la Ap(1-42) del ejemplo 14a.

Se inmunizan 2 conejos con la preparacion de los oligomeros B-CL de la Ap(1-42) no conjugados del ejemplo 14a de acuerdo a un protocolo estandar:

Dfa 1 Dfa 7 Dfa 14 Dfa 28 Dfa 35

Inmunizacion primaria y toma de suero preinmune

Primer estfmulo

Segundo estfmulo

Tercer estfmulo y sangrado

Toma de sangre

Los antisueros se obtienen de la sangre del conejo dejando al ultimo permanecer a temperatura ambiente y la centrifugacion subsecuente a temperatura ambiente. El suero obtenido de esta manera se denomina suero (c1).

d) Produccion de antisueros policlonales por inmunizacion de conejos con la preparacion B del oligomero de la Ap(1- 42) del ejemplo 6b.

Se inmunizan 2 conejos con la preparacion de los oligomeros B de la Ap(1-42) no conjugada del ejemplo 6b de acuerdo a un protocolo estandar:

Dfa 1 Inmunizacion primaria y toma de suero preinmune

Dfa 7 Primer estfmulo

Dfa 14 Segundo estfmulo

Dfa 28 Tercer estfmulo y sangrado

Dfa 35 Toma de sangre

Los antisueros se obtienen a partir de la sangre del conejo dejando al ultimo permanecer a temperatura ambiente y la centrifugacion subsecuente a temperatura ambiente. El suero obtenido de esta manera se denomina suero (d1).

Se acoplan 2 mg de la preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) del ejemplo 6b a LPH, con glutardialdetudo bajo condiciones estandares y se inmunizan 2 conejos mas con esta preparacion del oligomero B de la Ap(1-42) conjugada de acuerdo a un protocolo estandar;

Dfa 1: Inmunizacion primaria y toma de suero preinmune

Dfa 7: Primer estfmulo

Dfa 14: Segundo estfmulo

Dfa 28: Tercer estfmulo y sangrado

Dfa 35: Toma de sangre

Los antisueros se obtienen a partir de la sangre del conejo dejando al ultimo permanecer a temperatura ambiente y la centrifugacion subsecuente a temperatura ambiente. El suero obtenido de esta manera se denomina suero (d2).

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La caracterizacion de los antisueros policlonales a partir de las inmunizaciones del ejemplo 25 es relativa a su reaccion cruzada con distintas formas Ap(1-42).

Para caracterizar los antisueros policlonales, las series de dilucion en el intervalo de 100 pmoles/pl-0,01 pmol/pl de las diversas formas Ap(1-42) se prepararon en PBS. En cada caso, 1 pl de la muestra se aplico a una membrana de nitrocelulosa; la deteccion se realizo utilizando los sueros de conejo correspondientes del ejemplo 25. Una deteccion que utiliza mMAb 6E10 (empresa Signet) se llevo a cabo como comparacion. La alcalifosfatasa acoplada a IgG anti- conejo (para la comparacion: una alcalifosfatasa acoplada a IgG anti-raton) se utilizo para tincion junto con la adicion del reactivo NTB/BCIP de tincion. La Figura 10 muestra las dot blot obtenidas de esta manera, que pueden evaluarse numericamente como sigue:

Antfgeno: 6E10 Suero (a1) Suero (a2) Suero (d1) Suero (c1)

Oligomero: 0,1 0,5 10 0,1 0,5

Monomero: 0,1 10 100 0,1 1

Fibrilla: 1 100 >100 0.5 1

APP: 0,01 >1 1 0,1 0,1

Ap(1-40)*: 0,1 100 n.d. 0,5 10

*no mostrado en la Figura 10

Los numeros en la tabla indican la cantidad minima de antigeno visible [en pmoles; en cada caso con base en el monomero excepto para APP] (lfmite de deteccion).

La comparacion de las reacciones inmunologicas con suero de conejo (a1) que se obtuvo por inmunizacion con el oligomero de la Ap(20-42) no conjugado del ejemplo 15a muestra claramente que los anticuerpos que estan dirigidos contra estos oligomeros reaccionan de forma cruzada unicamente debilmente con las otras formas tales como fibrillas, APP y monomeros. En contraste, es reconocible una reaccion cruzada claramente mas fuerte con el oligomero B de la Ap(1-42) (vease fila 1) y, ademas, una reaccion cruzada con el antfgeno CL estabilizado. Estos datos indican una estructura claramente diferente de la forma oligomerica presente aqrn, en comparacion con APP, monomero asf como la estructura de fibrilla. Los anticuerpos se unen a las estructuras espedficas del oligomero.

Las reacciones inmunologicas con suero de conejo (a2) que se obtuvo por inmunizacion con el oligomero de la Ap(20-42) conjugada del ejemplo 15a muestra asimismo que los anticuerpos que estan dirigidos contra estos oligomeros reaccionan de forma cruzada solo debilmente con las otras formas tales como fibrillas y monomero. En contraste, es reconocible una reaccion cruzada debil con el oligomero B de la Ap(1-42) (vease fila 1), y ademas, una reaccion cruzada con el antfgeno CL estabilizado asf como con APP. Estos datos indican una estructura asimismo claramente diferente de la forma oligomerica presente aqrn, en comparacion con monomero asf como la estructura de fibrilla.

En comparacion con esto, las reacciones inmunologicas con suero de conejo (d1) que se obtuvo por inmunizacion con el oligomero de la Ap(1-42) del ejemplo 6b, asf como suero de conejo (c1) que se obtuvo por inmunizacion con el oligomero B-CL de la Ap(1-42) del ejemplo 14a muestran que los anticuerpos que estan dirigidos contra estos oligomeros reaccionan de forma cruzada con las otras formas tales como fibrillas, APP y monomero comparablemente tan fuertemente como con los oligomeros B de la Ap(1-42) (vease fila 1). Estos anticuerpos muestran una reaccion inmune comparable a aquella de mMAb 6E10 (empresa Signet) y no se unen a estructuras espedficas de oligomero.

Correspondientemente, los ratones se inmunizaron con los oligomeros de la Ap(1-42) del ejemplo 6b y se establecieron anticuerpos monoclonales en una manera conocida per se. A este respecto, 2 de entre 10 anticuerpos monoclonales secretaron hibridomas cuyos perfiles de union son similares a aquellos del antisuero (a1), en particular con respecto a las reactividades evaluadas anteriormente.

Ejemplo 27

Preparacion de fibrillas de la Ap(1-42)

Se diluyen 100 pl de 2 mg/ml de la solucion de la Ap(1-42) en 0,1 % de NH4OH con 300 pl de tampon (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 7,4) a 0,5 mg/ml y se ajusta a un pH 7,4 con 0,1 M de HCl (100 pM de Ap(1- 42)). La muestra se incuba a 37 °C durante 24 horas y se elimina entonces por centrifugacion a 10 000 g durante 10 minutos. El residuo de protema obtenido se vuelve a suspender con 400 pl de tampon (20 mM de fosfato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 7,4). La preparacion de fibrillas de la Ap(1-42) obtenida en esta manera puede almacenarse a - 20 °C y se utiliza para estudios adicionales.

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Efectos de los oligomeros B-CL de la Ap(1-42) (del ejemplo 14b) en cortes de hipocampo

Se adaptaron cortes hipocampales transversales de 400 pM de grosor en una camara de corte de immersion a 34 °C bajo perfusion por solucion de Ringer gaseada (124 mM de NaCl, 4,9 mM de KCl, 1,3 mM de MgSO4, 2,5 mM de CaCl2, 1,2 mM de KH2PO4, 25,6 mM de NaHCO3, 10 mM de glucosa). Subsecuentemente, se estimulo el colateral de Schaffer con la ayuda de un electrodo de estimulacion monopolar y se derivo el potencial postsinaptico excitatorio (fEPSP, por sus siglas en ingles) en estrato radiatum. Los pulsos de prueba se dieron con el 30 % del nivel de estimulo que genera un fEPSP maximo. Para la induccion de la potenciacion a largo plazo, se aplicaron 100 pulsos tres veces cada 10 minutos, con pulsos sencillos que tienen un ancho de 200 ps (tetanos fuertes). La potenciacion resultante de los fEPSP se registro durante al menos 240 minutos. La inyeccion del oligomero B-CL del ejemplo 14b (500 nM) comenzo 20 minutos antes del primer tetano y se detuvo 10 minutos despues del ultimo tetano. La elevacion (inclinacion) de las fEPSP se determino y aplico respecto al tiempo.

La reproduccion de la Figura 14 muestra que el lavado de los oligomeros de la Ap(1-42) suprime la potenciacion a plazo largo en el hipocampo, sobre todo en la fase de mantenimiento. Por consiguiente, los oligomeros B-CL de la Ap(1-42) influencian el almacenamiento de informacion de celulas nerviosas (memoria celular).

Ejemplo 29

Union de los oligomeros B de la Ap(1-42) (del ejemplo 5b) a neuronas hipocampales primarias de rata

Se estudio la union de los oligomeros B de la Ap(1-42) de rata del ejemplo 5b a neuronas de rata hipocampales primarias. Las neuronas hipocampales se cultivaron en medio neurobasal con suplemento B27 en cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina y se utilizaron en el dfa 14 del cultivo. Los oligomeros se unieron a la membrana celular de las neuronas agregando 200 mM (concentracion de la Ap monomerica total) de oligomeros al medio de cultivo fresco e incubando a 37 °C durante 15 minutos. Despues de la eliminacion del medio que contiene Ap, se llevaron a cabo dos etapas de lavado con medio y se fijaron las celulas entonces en el 3,7 % de formaldeftido. Despues del lavado adicional de las celulas, se bloquearon los sitios de union no espedficos con el 10% de suero de burro normal en tampon de PBS a temperatura ambiente durante 90 minutos. Se aplico 6E10 (de raton) como el primer anticuerpo en una dilucion de 1:2000 a temperatura ambiente durante 2 horas. Las celulas se lavaron de nuevo e incubaron con el segundo anticuerpo (de burro) que esta dirigido contra raton y esta acoplado al tinte fluorescente Cy3, a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues que las celulas se habfan lavado de nuevo, los cubreobjetos con las neuronas se fijaron a un portaobjetos con medio de montaje. Las neuronas hipocampales con los oligomeros de Ap de union se representaron en el microscopio fluorescente. El control utilizado fue una mezcla en donde se omitio el primer anticuerpo 6E10. Este control muestra asf la fluorescencia no espedfica que no esta basada en Ap.

Como se ve en la reproduccion 15a, los oligomeros se unen a la superficie celular de las neuronas de una manera discontinua. En contraste a esto, el control sin el primer anticuerpo 6E10 muestra solamente una fluorescencia no espedfica baja por la union del segundo anticuerpo a las neuronas (reproduccion 15b).

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Oligomero de la P(1-42) amiloide truncado N-terminalmente soluble en solucion salina fisiologica a diferencia de formas fibrilares mas bien globulares que comprende fragmentos de Ap(X-42), en el cual X representa un numero de 10 a 24, pudiendo conseguirse el oligomero segun un metodo que comprende que:

(a) el detergente pueda actuar sobre una protema P(1-42) amiloide monomerica para formar un oligomero A de la Ap(1-42) soluble en solucion salina fisiologica mas bien globular a diferencia de formas fibrilares;

(b) el efecto del detergente se reduzca y el oligomero A de la Ap(1-42) se vuelva a incubar para formar un oligomero B de la Ap(1-42) soluble en solucion salina fisiologica mas bien globular a diferencia de formas fibrilares; y

(c) el oligomero B de la Ap(1-42) se trate con proteasa,

siendo el detergente un compuesto de la formula R-X, en el que el resto R representa opcionalmente alquilo ramificado con 6 a 20 atomos de carbono u opcionalmente alquenilo ramificado con 6 a 20 atomos de carbono, y el resto X representa un grupo acido o su sal, y

presentando el oligomero B de la Ap(1-42) un peso molecular aparente en la electroforesis en gel de SDS de aproximadamente 38 kDa y/o aproximadamente 48 kDa.
2. Oligomero segun la reivindicacion 1, representando X un numero de 10 a 22.
3. Oligomero segun la reivindicacion 1, estando seleccionado el fragmento de Ap(12-42), Ap(13-42), Ap(14-42), Ap(15-42), Ap(16-42), Ap(17-42), Ap(18-42), Ap(19-42), Ap(20-42).
4. Oligomero segun la reivindicacion 1, siendo el fragmento un fragmento de Ap(20-42).
5. Oligomero segun la reivindicacion 1, siendo el fragmento un fragmento de Ap(12-42).
6. Oligomero segun la reivindicacion 4, siendo la proteasa termolisina.
7. Oligomero segun una de las reivindicaciones 1 a 6, estando seleccionado X de -COO-M+, -SO3-M+ y -OSO3-M+ y M+ para un cation de hidrogeno o un cation organico o inorganico seleccionado de cationes de metales alcalinos y alcalinoterreos y cationes de amonio.
8. Oligomero segun la reivindicacion 7, siendo el detergente dodecilsulfato sodico.
9. Oligomero segun una de las reivindicaciones 1 a 8, estando el oligomero etiquetado, inmovilizado o reticulado.
10. Oligomero segun la reivindicacion 9, estando etiquetado el oligomero con etiquetas fluorescentes, etiquetas luminiscentes, etiquetas colorimetricas, etiquetas radioactivas o etiquetas magneticas.
11. Medio farmaceutico, por ejemplo, una vacuna, que contiene un oligomero segun una de las reivindicaciones 1 a 10, y opcionalmente un portador fisiologicamente digerible.
12. Oligomero segun una de las reivindicaciones 1 a 10 para el uso en el tratamiento de una amiloidosis, como la enfermedad de Alzheimer.
13. Oligomero segun una de las reivindicaciones 1 a 10 para el uso en un procedimiento de deteccion diagnostico in vitro o in vivo.
14. Metodo para la preparacion de un oligomero de la p(1-42) amiloide truncado N-terminalmente a diferencia de formas fibrilares mas bien globulares soluble en solucion salina fisiologica que comprende fragmentos de Ap(X-42), en el cual X representa un numero de 10 a 24, comprendiendo el metodo que:

(a) el detergente pueda actuar sobre una protema p(1-42) amiloide monomerica para formar un oligomero A de la Ap(1-42) soluble en solucion salina fisiologica mas bien globular a diferencia de formas fibrilares;

(b) el efecto del detergente se reduzca y el oligomero A de la Ap(1-42) se vuelva a incubar para formar un oligomero B de la Ap(1-42) soluble en solucion salina fisiologica mas bien globular a diferencia de formas fibrilares; y

(c) el oligomero B de la Ap(1-42) se trate con proteasa,

siendo el detergente un compuesto de la formula R-X, en el que el resto R representa opcionalmente alquilo ramificado con 6 a 20 atomos de carbono u opcionalmente alquenilo ramificado con 6 a 20 atomos de carbono, y el resto X representa un grupo acido o su sal, y

presentando el oligomero B de la Ap(1-42) un peso molecular aparente en la electroforesis en gel de SDS de aproximadamente 38 kDa y/o aproximadamente 48 kDa.
15. Metodo segun la reivindicacion 14, estando seleccionado X de -COO-M+, -SO3-M+ y -OSO3-M+ y M+ para un cation de hidrogeno o un cation organico o inorganico seleccionado de cationes de metales alcalinos y alcalinoterreos y cationes de amonio.

5 16. Metodo segun la reivindicacion 15, siendo el detergente dodecilsulfato sodico.
17. Metodo segun una de las reivindicaciones 14 a 16, estando seleccionada la proteasa de: tripsina, quimotripsina, termolisina, elastasa, paparna y endoproteinasa GluC.

10 18. Metodo segun una de las reivindicaciones 14 a 17 que, antes de la etapa (a), comprende ademas que pueda

actuar un agente de ruptura de puentes de hidrogeno, como HFIP, sobre la proterna Ap(1-42).