CN110412294B9 - 蛋白稳定液、蛋白校准品、试剂盒及检测蛋白校准品稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蛋白稳定液、蛋白校准品、试剂盒及检测蛋白校准品稳定性的方法。其中，该蛋白稳定液包括基础稀释液以及阴离子表面活性剂和/或多元醇，基础稀释液包括蛋白缓冲液。通过在维持蛋白结构基本稳定的蛋白缓冲液的基础上，添加阴离子表面活性剂和/或多元醇，阴离子表面活性剂能够破坏蛋白质与蛋白质之间的氢键等非共价键，解聚蛋白质聚合体，从而防止蛋白质之间的团聚，增加蛋白质的分散性，避免蛋白质在溶液中因长期保存发生聚集变性而失去其特定的功效；而多元醇类物质，能够改善蛋白微环境的极性，在蛋白表面形成水化膜，提高亲水性，抑制其团聚。而且，二者联用后的协同作用能进一步抑制蛋白团聚。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂领域，具体而言，涉及一种蛋白稳定液、蛋白校准品、试剂盒及检
测蛋白校准品稳定性的方法。
背景技术
蛋白质作为一类生物大分子，在医药，科研，医疗等领域得到广泛的应用。蛋白质的稳
定性是其应用需要关注的重要性能之一，也是其产品质量的重要组成部分。然而，诸多因素
会影响蛋白质保存的稳定性，主要有团聚作用、氧化作用、极端pH、重金属离子和机械力等。
大量的蛋白质由于其稳定性较差，从而影响其广泛的应用。因此，蛋白质在保存过程中需注
意以上因素的影响。
经研究发现，部分蛋白质，尤其是与神经系统相关的蛋白质如β淀粉样蛋白、α-突触核蛋
白等，由于其分子内存在高度疏水区域，且易形成β片层结构(β片层结构又称β折叠(β-pleated
sheet)。β折叠是蛋白质的一种二级结构，在β折叠中，两条以上氨基酸链(肽链)，或同一条
肽链之间的不同部分形成平行或反平行排列，形成β折叠。β折叠中，蛋白质相邻肽链主链的
N-H和C＝O之间形成有规则的氢键，在β-折叠中，所有的肽键都参与链间氢键的形成，氢键
与β-折叠的长轴呈垂直关系，β折叠靠键间氢键维持稳定)，容易发生团聚，形成聚集体，影
响其稳定性，从而制约了对该类蛋白的研究与应用。
为了提高此类蛋白的稳定性，现有技术中也有报道将其制备成冻干粉以提高稳定性，但
这些方法仍未解决此类蛋白在液体状态时的稳定性。因此，仍需要对现有技术进行改进，以
提高此类易形成β片层结构的蛋白在液体环境中的稳定性。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种蛋白稳定液、蛋白校准品、试剂盒及检测蛋白校准品稳
定性的方法，以解决现有技术中此类易形成β片层结构的蛋白在液体环境中容易团聚而不稳
定的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种蛋白稳定液，该蛋白稳定液包
括：基础稀释液，基础稀释液包括蛋白缓冲液；以及阴离子表面活性剂和/或多元醇。
进一步地，阴离子表面活性剂为磺酸盐阴离子表面活性剂、硫酸盐阴离子表面活性剂、
羧酸盐阴离子表面活性剂或磷酸盐阴离子表面活性剂；优选地，磺酸盐表面活性剂的结构为
R-SO3-M所示，其中，R为碳原子数为10～15的烃基，M为碱金属中的一种；更优选地，磺
酸盐表面活性剂为十二烷基磺酸钠；优选地，硫酸盐阴离子表面活性剂的结构为R-O-SO3-M
所示，R为碳原子数为10～15的烃基，M为碱金属中的一种；更优选地，硫酸盐阴离子表面
活性剂为十二烷基硫酸钠；优选地，羧酸盐阴离子表面活性剂的结构为R-COO-M所示，其中
R为碳原子数为10～22的烃基，M为碱金属中的一种；更优选地，羧酸盐阴离子表面活性剂
为硬脂酸钠；优选地，磷酸盐阴离子表面活性剂的结构为R-O-PO3-M所示，R为碳原子数为
10～15的烃基，M为碱金属中的一种；更优选地，磷酸盐阴离子表面活性剂为单十二烷基磷酸
钠。
进一步地，阴离子表面活性剂在蛋白稳定液中的质量含量为0.005％～0.1％，优选为
0.005％～0.01％。
进一步地，多元醇为碳原子数为3～12的多元醇；优选地，多元醇为甘露醇、甘油、海藻
糖或山梨醇；优选地，多元醇在蛋白稳定液中的质量含量为5％～50％，更优选为10～40％，
进一步优选为15～30％。
进一步地，基础稀释液还包括BSA、防腐剂及电解质中的任意一种或多种。
进一步地，蛋白稳定液中还包括目的蛋白；优选地，目的蛋白选自如下蛋白中的任意一
种：β淀粉样蛋白及α-突触核蛋白；优选地，蛋白缓冲液的pH值为6.0-8.5的蛋白缓冲液；更
优选地，蛋白缓冲液为pH值为6.0-8.5的PBS缓冲液。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种蛋白校准品，该蛋白校准品
包含目的蛋白及目的蛋白的稳定液，目的蛋白的稳定液为上述任一种不含目的蛋白的蛋白稳
定液，或者，蛋白校准品为上述含目的蛋白的蛋白稳定液。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括蛋白校
准品，蛋白校准品为上述任一种蛋白校准品。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测蛋白校准品稳定性的方法，
该方法包括：将上述蛋白校准品与硫磺素T混合后进行荧光检测；或者通过检测标记物与上
述蛋白校准品直接或间接的免疫结合来进行免疫检测，其中，检测标记物带有可检测标记。
进一步地，上述方法为通过检测标记物与上述的蛋白校准品直接或间接的免疫结合来进
行免疫检测，其中，免疫检测通过样本分析仪进行检测；优选地，检测标记物为鲁米诺、异
鲁米诺、异鲁米诺衍生物、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
应用本发明的技术方案，通过在维持蛋白结构基本稳定的蛋白缓冲液的基础上，添加阴
离子表面活性剂和/或多元醇，阴离子表面活性剂能够破坏蛋白质与蛋白质之间的氢键等非共
价键，解聚蛋白质聚合体，从而防止蛋白质之间的团聚，增加蛋白质的分散性，避免蛋白质
在溶液中因长期保存发生聚集变性而失去其特定的功效；而多元醇类物质，能够改善蛋白微
环境的极性，在蛋白表面形成水化膜，提高亲水性，抑制其团聚。而且，二者联用后的协同
作用能进一步抑制蛋白团聚。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实
施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例1至3及对比例1的蛋白校准品在37℃下经硫磺素ThT
荧光强度检测的稳定性结果图；以及
图2示出了根据本发明的实施例1至3及对比例1的蛋白校准品在2～8℃下经硫磺素ThT
荧光强度检测稳定性结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
蛋白稳定液：即能够维持蛋白稳定性的溶液，也就是说，相对于未经蛋白稳定液稳定的
蛋白而言，溶于蛋白稳定液中的蛋白的活性保持的时间较长。
如背景技术提到的，现有技术中针对含有β-片层结构的蛋白，由于存在分子间的氢键而
在液体中容易发生团聚现象，从而致使蛋白的结构和性能发生改变。为了改善这一状况，在
本申请一种典型的实施方式中，提供了一种蛋白稳定液，该蛋白稳定液包括：基础稀释液以
及阴离子表面活性剂和/或多元醇，其中，基础稀释液包括蛋白缓冲液。
如上述，易形成β片层结构的蛋白，分子间因为β折叠而形成聚集体，如β淀粉样蛋白，
α-突触核蛋白质，在液态环境中，容易发生聚集，失去其特定的生物学功能。本申请所提供的
蛋白稳定液，通过在维持蛋白结构基本稳定的蛋白缓冲液的基础上，添加阴离子表面活性剂
和/或多元醇，阴离子表面活性剂能够破坏蛋白质与蛋白质之间的氢键等非共价键，解聚蛋白
质聚合体，从而防止蛋白质之间的团聚，增加蛋白质的分散性，避免蛋白质在溶液中因长期
保存发生聚集变性而失去其特定的功效；而多元醇类物质，能够改善蛋白微环境的极性，在
蛋白表面形成水化膜，提高亲水性，抑制其团聚。而且，二者联用后的协同作用能进一步抑
制蛋白团聚。
上述蛋白稳定液中，阴离子表面活性剂的作用是用来破坏蛋白质与蛋白质之间因β片层
结构而形成的分子间氢键，解聚蛋白质聚合体，增加蛋白分散性。因而，任何具有上述作用
的阴离子表面活性剂均适用于本申请。
在本申请一些优选的实施例中，阴离子表面活性剂根据亲水基团的种类不同，可以为磺
酸盐阴离子表面活性剂、硫酸盐阴离子表面活性剂、羧酸盐阴离子表面活性剂或磷酸盐阴离
子表面活性剂。
优选地，磺酸盐表面活性剂的结构为R-SO3-M所示，其中，R为碳原子数为10～15的烃
基，M为碱金属中的一种；更优选地，磺酸盐表面活性剂为十二烷基磺酸钠(SLS)。
优选地，硫酸盐阴离子表面活性剂的结构为R-O-SO3-M所示，R为碳原子数为10～15的
烃基，M为碱金属中的一种；更优选地，硫酸盐阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)。
优选地，羧酸盐阴离子表面活性剂的结构为R-COO-M所示，其中R为碳原子数为10～15
的烃基，M为碱金属中的一种，更优选地，所述羧酸盐阴离子表面活性剂为硬脂酸钠。
优选地，磷酸盐阴离子表面活性剂的结构为R-O-PO3-M所示，R为碳原子数为10～15的
烃基，M为碱金属中的一种；更优选地，磷酸盐阴离子表面活性剂为单十二烷基磷酸钠。
不同的阴离子表面活性剂在水中解离后生成憎水性阴离子，上述不同的阴离子表面活性
剂具有不同的物化性质，其分散、乳化、湿润及渗透性能力均有差别，造成其抑制蛋白团聚、
稳定蛋白的能力有所差异。根据抑制蛋白团聚、稳定蛋白的能力，优选采用磺酸盐表面活性
剂。更优选十二烷基磺酸钠。
上述蛋白稳定液中，阴离子表面活性剂的具体用量可以根据种类的不同及具体所欲稳定
的目的蛋白的不同而有所不同。在一种优选的实施例中，上述阴离子表面活性剂在蛋白稳定
液中的质量含量为0.005％～0.1％，优选为0.005％～0.01％。浓度过高可能会影响所欲稳定的蛋
白的效价。
对于上述多元醇的具体种类无特殊限定，只要能够起到上述作用即可。在一些优选的实
施例中，多元醇为碳原子数为3～12的多元醇；更优选，多元醇为甘露醇、甘油、海藻糖或山
梨醇，进一步优选为甘油。
上述多元醇在蛋白稳定液中的质量含量根据具体种类的不同而略有差异。具体地，比如
可以是6％、8％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、25％、28％、32％、36％、41％、
45％等。在一种优选的实施例中，上述蛋白稳定也中，多元醇的质量含量为5％～50％，更优
选为10～40％，进一步优选为15～30％。
上述蛋白稳定液中，基础稀释液除了包含维持蛋白基本稳定的蛋白缓冲液外，还可以包
括BSA、防腐剂及电解质中的任意一种或多种，以增强该基础稀释液对蛋白的存储稳定效果。
上述各成分的在基础稀释液中的具体浓度及含量可以根据实际需要进行合理调整和设置。在
一些优选的实施例中，基础稀释液中还含有BSA，优选BSA的浓度为2～5g/L。在另一些优选
的实施例中，基础稀释液含有防腐剂，防腐剂可以为ProClin 300或叠氮钠中的一种，更优选
地，防腐剂的浓度为0.1～0.5g/L。在某些优选的实施例中，上述基础稀释液中还可以同时含有
电解质。具体地，电解质可以为氯化钾、氯化钠、氯化镁及乙酸钠中的一种；更优选地，电
解质的浓度为10～30g/L。
本申请所提供的上述蛋白稳定液根据实际应用场景的不同，可以单独存储备用，也可以
同时还包含目的蛋白作为目的蛋白的存储液进行使用。本申请所提供的蛋白稳定液除适用于
上述含有β-片层结构而在溶液中因分子间氢键而发生团聚的蛋白外，也适用于其他具有类似
性能的蛋白。
在一种优选的实施例中，上述蛋白稳定液中还包括目的蛋白；优选地，目的蛋白选自如
下与神经系统相关的蛋白质中的任意一种：β淀粉样蛋白及α-突触核蛋白。
上述β淀粉样蛋白是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经β-和γ-分泌酶
的蛋白水解作用而产生的39-43个氨基酸的片段。根据切割位点的不同β淀粉样蛋白包括但不
限于Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-43等。以Aβ1-42为例，Aβ1-42在溶液中其构象能由α螺旋转变
为β折叠，表现为富含β折叠构象。对于Aβ1-42单体，由于分子内的氢键和盐桥作用，其C
端会折回到中心疏水区域，使这两个区域的疏水氨基酸紧密接触，形成反平行的β片层结构，
不同单体之间的β片层结构可通过氢键或疏水作用力等分子间作用力形成聚集，通过破坏分
子间的β片层结构或阻碍分子间的β片层结构的形成，可抑制Aβ1-42的聚集。
上述α-突触核蛋白是位于中枢神经系统神经突触前膜末梢的不定形的小分子可溶性蛋白
质，由140个氨基酸残基组成。α-突触核蛋白的氨基酸序列通常被分成3个区域：N端(aa1～60)
含有KTKEGV重复序列；中部NAC(non amyloid component)区(aa61～95)；C末端(aa96～140)
主要由酸性氨基酸组成。其中NAC区(aa61～95)，与AD中β淀粉样蛋白的疏水区有着较高的
同源性。该区域的疏水性较强，由35个氨基酸组成，含有2个非典型的α-螺旋，具有形成β-
片层结构的趋向，极易发生聚集。
根据上述不同目的蛋白的物化性质的不同，可以合理选择合适的缓冲液。不同的蛋白具
有不同的等电点，选择的缓冲液的pH要避免与蛋白等电点相同。同时根据蛋白的一般性质，
在极端的酸性或碱性环境下都是不稳定的，因而，缓冲液的pH值应尽量避免过高或过低。对
于具体的缓冲体系并无特殊要求，可以是有机酸盐缓冲液或无机酸盐缓冲液或两种搭配的缓
冲液。具体适用于本申请的缓冲液包括但不限于HEPES缓冲液，PBS缓冲液，组氨酸-盐酸缓
冲液，Tris-HCl缓冲液，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
具体地，Aβ1-42的等电点为5.31，Aβ1-40的等电点为5.31，Aβ1-43的等电点为5.31，α-
突触核蛋白的等电点为4.67，当环境溶液的pH值与所欲稳定的蛋白的等电点相近时，蛋白呈
电中性，其在溶液中的溶解度最小，容易聚集沉淀，造成蛋白的不稳定。此外，溶液的pH过
酸或过碱均存在蛋白结构被破坏的风险。因而，在选择上述目的蛋白的缓冲液时，通常应尽
量避免缓冲液的pH值与蛋白的等电点接近或过酸或过碱。
在申请一种优选的实施例中，选择pH值为6.0-8.5的蛋白缓冲液。对缓冲液的具体种类
并无特殊限定，只要满足上述pH值范围要求即可。在本申请另一种优选的实施例中，蛋白缓
冲液为应用广泛的pH值为6.0-8.5的PBS缓冲液，更优选地，PBS缓冲液的浓度为10～100
mmol/L。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种蛋白校准品，该蛋白校准品包含目的蛋
白及目的蛋白的稳定液，目的蛋白的稳定液为前述的不含目的蛋白的蛋白稳定液，或者，蛋
白校准品为上述直接含有目的蛋白的蛋白稳定液。采用本申请的蛋白稳定液的蛋白校准品，
存储稳定性好，蛋白结构稳定，活性保持稳定，因而能够直接以溶液形状进行应用，进而避
免了现有技术中蛋白在液体中难以保持稳定，而制成冻干粉反复冻融的繁琐步骤，也避免了
冻融过程中对蛋白结构和活性的破坏。更优选地，本申请的蛋白校准品中目的蛋白的浓度小
于等于10ng/mL。
为方便检测，在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括蛋
白校准品，该蛋白校准品为上述蛋白校准品。本申请的试剂盒具有检测步骤简单，不必反复
冻融的繁杂操作，而且不同批次间也容易把控质量，使得批次生产的试剂盒产品稳定性高。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种检测蛋白校准品稳定性的方法，该方法
包括：将上述蛋白校准品与硫磺素T混合后进行荧光检测，或者通过检测标记物与将上述蛋
白校准品直接或间接地结合来进行免疫检测，其中，检测标记物带有可检测标记。
上述方法中，将上述蛋白校准品与硫磺素T混合后进行荧光检测的原理如下：ThT是一
种硫磺色素，是一种苯并噻唑类的小分子化合物，能够与β折叠结构特异性结合，β折叠结构
本身是没有荧光的，与ThT特异性结合之后能发出极强荧光，因而能指示β折叠结构的存在，
β折叠结构越多，其荧光强度越高。比如，当Aβ1-42蛋白聚集时，其β折叠结构变多，荧光
强度增加。
在一种具体的实施例中，上述荧光检测的方法为：取30μL样品(Aβ1-42的含量为10
ng/mL)混合30μL ThT溶液，ThT的终浓度为1μmol/L，采用多功能酶标仪检测，其中检测
参数设置为激发光440nm/发射光490nm检测并记录数据。
上述方法中，利用免疫检测原理可以对蛋白标准品中的蛋白的效价进行检测。其表征的
是溶液中具有特定功能的有效蛋白质的量(例如具有免疫反应性的蛋白的量，蛋白聚集后，
蛋白的抗原表位被遮蔽，使其在免疫检测中表现效价降低)。
上述的免疫检测的具体方法不做特别的限定，常见的可以是夹心法、间接法、竞争法、
捕获法。溶液中具有特定功能的有效蛋白质的量可以通过检测标记物所携带的检测标记进行
表征；优选地，检测标记物为发光标记物；更优选的，检测标记物为鲁米诺、异鲁米诺、异
鲁米诺衍生物、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；免疫检测中还包含带有可检测信号的抗体或
带有可检测信号的抗原。根据选择的具体检测原理的不同，可检测信号可以标记在与可识别
目的蛋白的抗体上，也可以标记在抗原上。
优选的，上述免疫检测可以通过样本分析仪(如半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪)
进行检测。更优选地，发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物、辣根过氧化物酶
或碱性磷酸酶。
在一种更优选的实施例中，效价检测方法为：将公司自产Aβ1-42/Aβ1-40/α-突触核蛋白
捕获抗体包被磁球，Aβ1-42/Aβ1-40/α-突触核蛋白检测抗体标记ABEI，制成检测试剂盒，利
用Maglumi系统检测处理不同时间的发光强度。并计算偏差，偏差＝(某刻的光强度-初始光
强度)/初始光强度*100％。偏差的绝对值越大，表明溶液中目的蛋白的含量减低，即表明目
的蛋白不稳定。目的蛋白在37℃下保存一周内根据效价测试所测得的光强度偏差不超过30％；
进一步优选，不超过20％；再进一步优选不超过15％；更进一步优选不超过10％。目的蛋白
在2-8℃保存一年内根据效价测试所测得的发光强度偏差不超过35％；进一步优选不超过25％；
再进一步优选不超过15％；更进一步优选不超过10％。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
一、样品准备
Aβ1-42单体的制备：将1mg Aβ1-42粉末溶于200μL冷却的六氟异丙醇(HFIP)中，室温
孵育60min使Aβ1-42充分溶解，然后放置在冰上5～10min后移至通风橱内，打开瓶盖以便
HFIP挥发。风干后形成透明的Aβ1-42，溶解于50μL二甲基亚矾(DMSO)，制成Aβ1-42母液，
将该母液稀释液到对应的蛋白保存液中，使其终浓度为10ng/mL。
ThT母液：1000μmol/L母液使用PBS(10mM，pH＝7.4)配制，避光保存，上述溶液用PBS
(10mM，pH＝7.4)稀释并于4℃储存。
二、溶液配制
1)基础稀释液：基础稀释液中组分的浓度除特别标注外，均为质量体积分数。
①基础稀释液1：含有0.5％BSA，10mM PBS pH 7.4，含0.15M NaCl，含0.2％ NaN3。
②基础稀释液2：含有0.5％BSA，20mM HEPES pH 7.2，含0.15M NaCl，含0.2％ NaN3。
③基础稀释液3：含有0.5％BSA，20mM组氨酸加入盐酸调节pH 6.0，含0.15M NaCl，
含0.2％ NaN3。
④基础稀释液4：含有0.5％BSA，50mM Tris加入盐酸调节pH 8.5，含0.15M NaCl，含
0.2％ NaN3。
2)蛋白稳定液的配制：在上述基础稀释液的基础上，分别按照表1所示的配方，配制各
实施例和对比例的蛋白稳定液。各配方中所添加的物质的浓度分别根据是固体还是液体有所
不同。当添加的物质为固体时，所添加的浓度表示质量/体积分数；当添加的物质为液体时，
所添加的浓度表示体积/体积分数。
表1：
三、对各实施例和对比例的蛋白稳定液进行性能检测
作为蛋白稳定液，其中的一个应用场景是作为诊断试剂的校准品，诊断试剂的有效期一
般设置为一年，因此考察2-8℃下的长期稳定性，同时考虑到试剂在运输过程中，环境温度并
不会一直维持在2-8℃，因此设置一个高温加速稳定性实验。
A：高温加速稳定性检测过程：将各实施例与各对比例的目的蛋白(如Aβ1-42)的单体
母液，分别添加到基础稀释液，使其终浓度为10ng/mL，将溶液存放于37℃，不同时间点取
样，分别取第0天，第1天，第2天，第3天，第4天，第5天，第6天，第7天的含目的
蛋白的溶液，进行荧光强度检测和效价检测。
B：长期稳定性检测过程：
上述各实施例和各对比例溶液分别存放于2～8℃，在第0个月，第1个月，第3个月，第
5个月，第7个月，第9个月，第11个月，第12个月取出，进行荧光强度检测和效价检测。
具体的光强度检测和效价检测方法如下：
1)硫磺素ThT荧光强度检测
检测方法：取30μL样品(Aβ1-42的含量为10ng/mL)混合30μL ThT溶液，ThT的终浓
度为1μmol/L，采用多功能酶标仪检测，其中检测参数设置为激发光440nm/发射光490nm检
测并记录数据。
2)免疫检测效价
效价检测方法：将公司自产目的蛋白Aβ1-42/Aβ1-40/α-突触核蛋白捕获抗体包被磁球，
Aβ1-42/Aβ1-40/α-突触核蛋白检测抗体标记ABEI，制成检测试剂盒，利用Maglumi系统检测
发光强度，考察目的蛋白处理不同时间的光强度，计算不同时间的发光强度。该方法通过抗
原抗体反应检测溶液中的目的蛋白单体含量，光强降低，表明溶液中目的蛋白单体含量降低，
即表明目的蛋白在溶液中不稳定。
偏差＝(某刻的光强度-初始光强度)/初始光强度*100％。
四、检测结果
利用实施例1-3及对比例1对本申请的各种组分对蛋白稳定性的影响进行了考察，通过硫
磺素ThT荧光强度检测和效价检测来进行检测，检测结果见图1-图2及表2-表11。
(一)蛋白聚集程度检测
表2：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | |
| 37℃稳定性 | 相对荧光强度 | 相对荧光强度 | 相对荧光强度 | 相对荧光强度 |
| 第0天 | 115 | 120 | 111 | 143 |
| 第1天 | 165 | 189 | 118 | 357 |
| 第2天 | 208 | 234 | 124 | 569 |
| 第3天 | 254 | 288 | 127 | 789 |
| 第4天 | 304 | 312 | 126 | 833 |
| 第5天 | 357 | 343 | 128 | 921 |
| 第6天 | 382 | 411 | 124 | 1011 |
| 第7天 | 423 | 452 | 128 | 1069 |
| 长期稳定性 | 相对荧光强度 | 相对荧光强度 | 相对荧光强度 | 相对荧光强度 |
| 第0月 | 111 | 113 | 109 | 143 |
| 第1月 | 130 | 163 | 111 | 426 |
| 第3月 | 188 | 202 | 117 | 612 |
| 第5月 | 208 | 241 | 116 | 758 |
| 第7月 | 246 | 293 | 120 | 885 |
| 第9月 | 302 | 333 | 122 | 985 |
| 第11月 | 346 | 374 | 126 | 1022 |
| 第12月 | 389 | 423 | 133 | 1235 |
从表2及图1和图2可以看出，实施例1至3中，在37℃条件和2～8℃条件下，对比例1
中荧光强度明显增加，表明目的蛋白发生了聚集；实施例1和实施例2随着温育时间的延长，
相对荧光强度增加明显放缓，少量的目的蛋白发生了聚集，表明添加多元醇或阴离子表面活
性剂两者之一即能改善蛋白聚集的现象；实施例3中，其相对荧光强度基本不增加，目的蛋
白未发生明显聚集，说明多元醇和阴离子表面活性剂二者联用对改善蛋白聚集效果更优。
(二)蛋白效价测试
1.阴离子表面活性剂及多元醇在蛋白稳定液中的作用，效价测试结果见表3。
表3：
从上表中实施例1和对比例1的比较可知，在基础稀释液的基础上添加SLS阴离子表面
活性剂，蛋白稳定性相对于对比例1有一定的改善。说明该阴离子表面活性剂能够增加目的
蛋白的分散性，破坏目的蛋白间的β片层结构，防止目的蛋白之间的聚集，另一方面还具有
助溶、湿润和降低溶液表面张力的作用，能避免蛋白在保存的过程中与容器的非特异性吸附。
由实施例2和对比例1的比较可知，在基础稀释液的基础上添加甘油也可增加目的蛋白
在液态环境中的稳定性，甘油作为多元醇，其在溶液中能降低表面张力，作用于蛋白表面，
稳定蛋白的构象。
由实施例3和对比例1的比较可知，同时在基础稀释液中添加甘油和SLS阴离子表面活
性剂，能够显著改善其在液体环境中的稳定性，说明阴离子表面活性剂和多元醇对蛋白的液
态保存稳定性具有协调作用，使其在溶液中长期稳定保存。
2.表面活性剂的含量的影响，检测结果见表4。
表4：
从上述表4中可以看出，当阴离子表面活性剂的量从0.005％变化到0.1％时，目的蛋白均
能稳定保存，当含量较高时，效价会变低，原因是当阴离子表面活性剂含量过高时，抗原抗
体反应效率受到抑制，其中，当SLS的含量选为0.01％时，其偏差最小，稳定性最好。
3.多元醇的含量对蛋白稳定性的影响，检测结果见表5和表6。
表5：
表6：
从上述表5和表6中可以看出，当甘油的含量为5％-50％时，蛋白在溶液中均能稳定存在。
当甘油的浓度达到40％以上时，反应效价随着甘油的浓度增加而逐渐下降，原因是甘油浓度
增加，体系的黏度增加，抗原抗体反应效率受到抑制。从实验的结果来看，当甘油的浓度为
20％时，稳定性效果最好。
4.表面活性剂的种类对蛋白稳定性的影响，检测结果见表7。
表7：
从表3中的实施例3，以及表7中实施例2不加阴离子表面活性剂、实施例12至14添加
不同于实施例3的阴离子表面活性剂可以看出，添加了阴离子表面活性剂的实施例3、12-14
相比未添加阴离子表面活性剂的实施例2，对蛋白的稳定性均有所提高。磷酸盐表面活性剂，
硫酸盐表面活性剂和羧酸盐表面活性剂对蛋白的稳定均具有一定的效果，其中，SLS效果最
佳。
5.多元醇的种类对蛋白稳定性的影响，检测结果见表8。
表8：
从表3中的实施例3，及表8中实施例15至17及不添加多元醇的实施例1可以看出，添
加不同的多元醇(甘油，甘露醇，海藻糖，山梨醇)对于蛋白在液态环境下稳定保存均具有
一定效果，且不同多元醇对于抗原抗体反应效价影响不同，从稳定性的数据来看，使用甘油
作为目的蛋白稳定液的组分，其稳定效果最佳。
6.蛋白的种类对蛋白稳定性的影响，检测结果见表9。
表9：
从表9中实施例18和实施例19以及对比例2和对比例3的数据可以看出，Aβ1-40蛋白
和α-突触核蛋白在该蛋白稳定液中也能稳定保存，Aβ1-40，Aβ1-42和α-突触核蛋白，其分子
结构中易形成β片层结构，在普通的液态条件下(如仅缓冲液中)，较易发生聚集，构象发生
变化，从而使其失去特定的生物学功能，例如聚集后遮蔽抗原表位，使其在免疫检测中表现
出低效价。在本发明的蛋白稳定液中，阴离子表面活性剂增加蛋白的分散性，防止蛋白β片
层结构的形成从而防止蛋白的聚集，同时添加的多元醇能稳定蛋白的构象，从而达到稳定保
存蛋白的目的。也就是说，本发明的蛋白稳定液适用于对上述三种蛋白具有类似结构的蛋白
的稳定存储。
7.缓冲液的种类对蛋白稳定性的影响，检测结果见表10。
表10：
从表10中可以看出，通过比较实施例3、实施例20、实施例21及实施例22可知，当基
础缓冲液换成20mM PH7.4的HEPES缓冲液，或者是换成20mM pH6.0组氨酸-盐酸缓冲液时
或50mM pH8.5 Tris-HCl缓冲液，其稳定性变化不大，表明在这几种基础稀释液组成的蛋白缓
冲液中，目的蛋白均能稳定保存。
8.蛋白在稳定液中的浓度对蛋白稳定性的影响，检测结果见表11。
表11：
从表11可以看出，当Aβ蛋白的浓度为0.1ng/mL或1ng/mL或10ng/mL时，其在蛋白稳
定液中均能稳定保存，表明在蛋白保存液中，不同浓度的蛋白均能稳定保存。
综合表3至表11的实验数据可见，与对比例相比，各实施例中目的蛋白在添加表面活性
剂和/或多元醇的基础稀释液中37℃下保存一周内，发光强度偏差均不超过30％，在2-8℃下
保存一年内，光强度偏差均不超过35％，可见添加表面活性剂和/或多元醇的稀释液能够提高
目的蛋白的稳定性。
从实施例1-24及对比例1-3的检测结果及描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现
了如下技术效果：本申请所提供的蛋白稳定液，通过在维持蛋白结构基本稳定的蛋白缓冲液
的基础上，添加阴离子表面活性剂和/或多元醇，阴离子表面活性剂能够破坏蛋白质与蛋白质
之间的氢键等非共价键，解聚蛋白质聚合体，从而防止蛋白质之间的聚合，增加蛋白质的分
散性，避免蛋白质在溶液中因长期保存发生聚集变性而失去其特定的功效；而多元醇类物质，
能够改善蛋白微环境的极性，在蛋白表面形成水化膜，提高亲水性，抑制其团聚。而且，二
者联用后的协同作用能进一步抑制蛋白团聚。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员
来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等
同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种试剂在制备用于β淀粉样蛋白或α-突触核蛋白的蛋白稳定液中的用途，其特征在于，所述蛋白稳定液包括：
基础稀释液，所述基础稀释液包括蛋白缓冲液；以及
阴离子表面活性剂和多元醇；
其中，所述多元醇为甘油，所述甘油的浓度为20%；
所述阴离子表面活性剂为十二烷基磺酸钠，所述十二烷基磺酸钠的浓度为0.01%；
所述基础稀释液选自以下方案中的一种：
（1）含有0.5%BSA，10 mM PBS pH 7.4，含0.15 M NaCl，含0.2% NaN3；或
（2）含有0.5%BSA，20 mM HEPES pH 7.2，含0.15 M NaCl，含0.2% NaN3；或
（3）含有0.5%BSA，20 mM 组氨酸加入盐酸调节pH 6.0，含0.15 M NaCl，含0.2% NaN3；或
（4）含有0.5%BSA，50 mM Tris加入盐酸调节pH 8.5，含0.15 M NaCl，含0.2% NaN3。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白稳定液中还包括目的蛋白；
所述目的蛋白为β淀粉样蛋白或α-突触核蛋白。
3.一种蛋白校准品，其特征在于，所述蛋白校准品包含目的蛋白及所述目的蛋白的稳定液，所述目的蛋白的稳定液为权利要求1所述的用途中的蛋白稳定液，所述目的蛋白为β淀粉样蛋白或α-突触核蛋白；或者，
所述蛋白校准品为权利要求2所述的用途中的蛋白稳定液。
4.一种试剂盒，所述试剂盒包括蛋白校准品，其特征在于，所述蛋白校准品为权利要求3所述的蛋白校准品。
5.一种检测蛋白校准品稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括：
将权利要求3所述的蛋白校准品与硫磺素T混合后进行荧光检测；或者
通过检测标记物与权利要求3所述的蛋白校准品直接或间接的免疫结合来进行免疫检测，其中，所述检测标记物带有可检测标记。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法为通过所述检测标记物与权利要求3所述的蛋白校准品直接或间接的免疫结合来进行所述免疫检测，其中，所述免疫检测通过样本分析仪进行检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测标记物为鲁米诺、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
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