CN108409852B - 性激素结合球蛋白保存液以及其应用 - Google Patents

性激素结合球蛋白保存液以及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种性激素结合球蛋白的保存液及其制备方法和用于检测性激素结合球蛋白的检测剂和试剂盒，属于体外诊断试剂技术领域。所述保存液包括缓冲液、性激素、ⅡA族和/或ⅡB族离子、渗透剂、动物血清、表面活性剂和蛋白质类稳定剂，其中，所述性激素在所述保存液中的浓度为1‑10μM，所述ⅡA族和/或ⅡB族离子在所述保存液中的浓度为10‑60mM。所述检测剂和试剂盒均含有本发明保存液。本发明性激素结合球蛋白的保存液能使得溶解于保存液中的性激素结合球蛋白二聚体结构及生物活性保持稳定。所述检测剂和试剂盒能够保证性激素结合球蛋白的检测准确度，且方便快捷。

Description

性激素结合球蛋白保存液以及其应用
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体的是涉及一种性激素结合球蛋白保存液以及保存液的应用。
背景技术
性激素受脑垂体和下丘脑的调节，下丘脑、脑垂体及性腺激素之间存在相互联系、相互制约的复杂关系，它们参与控制和调节生殖活动，称为下丘脑-垂体-性腺轴。雄激素以睾丸合成和分泌的睾酮为主，属类固醇激素；另外，肾上腺皮质、女性的卵巢也能分泌少量的雄激素。雄激素的主要生理作用是促进男性生殖器官的形成和第二性征的发育，促进睾丸曲细精管的发育和精子发生和成熟。在女性体内，雄激素与雌激素共同决定体毛、腋毛和阴毛的分布。雄激素还可以促进人体内蛋白质的代谢，促进骨骼、肌肉的生长发育；另外，较大剂量的雄激素可以刺激骨髓的造血功能，特别是红细胞的生成。
雌激素是一类女性激素，主要由卵巢和胎盘产生，雌激素也属类固醇激素；另外，肾上腺皮质、肝脏、乳房、男性的睾丸也可产生少量雌激素。人体内的雌激素包括雌酮、雌二醇、雌三醇。雌激素的主要生理作用是促进女性生殖器官的形成、第二性征的发育和女性妊娠的发生和发展。雌激素也可以促进人体蛋白质代谢，促进骨骼、肌肉的生长发育；此外，雌激素可以降低血管通透性，降低血清胆固醇含量。
人体血液循环中的性激素，大部分以与蛋白结合的形式存在。人体内结合性激素的蛋白可分为非特异结合性激素的蛋白和特异性结合性激素的蛋白两大类。非特异性结合性激素的蛋白中最主要的是白蛋白，白蛋白与性激素的亲和力较低，但因其数量很大、结合容量大，因而生理作用也比较重要。特异性结合性激素的蛋白即为性激素结合球蛋白(SexHormone-binding Globulin，SHBG)。SHBG是一种运输性激素载体，负责为性激素进行血液运输，调控血液中具有生物活性的性激素浓度，影响其生物利用度。SHBG的分子量约为95kDa，是由2个大小基本相同的亚单位组成的同源二聚体。SHBG由人的肝脏合成，其在人体内的半衰期约为7天。
人体内的SHBG含量可以通过雄激素/雌激素的平衡、甲状腺激素、胰岛素和营养因子等因素进行调节。SHBG的浓度会因雌激素而增加，因雄激素而减少。所以，SHBG血清浓度水平会受雌二醇的促进以及受睾酮的抑制。因此与男性相比，SHBG在女性体内的血清浓度更高；此外，孕妇也会因其雌激素产量增加而具有更高的SHBG血清浓度。
SHBG的体外诊断检测技术主要为化学发光免疫分析技术。SHBG试剂盒配套使用的校准品、质控品是在检测过程中获取工作曲线与进行质量控制的重要组成部分。目前SHBG体外诊断试剂盒中常用的校准品、质控品有干粉和液体两种形态。干粉形态的校准品、质控品采取真空冷冻干燥的方法进行制备；液体形态的校准品、质控品采取稀释液配制而成。
其中，干粉形态的SHBG校准品、质控品制备是一个非常复杂的物理化学变化过程，在真空冷冻干燥过程中，电解质浓度的改变、溶液pH值的变化以及生产和贮存过程中的温度变化都会对制备的校准品、质控品质量产生影响。理想的SHBG冻干品应该具有血清基质，无传染性，添加剂少，瓶间差小，效期长，复溶后稳定期长的特性。利用真空冷冻干燥法制备的冻干品，避免了SHBG蛋白在液态下稳定性差、容易变质、不易保存等缺点，但冻干品存在固有不足，如真空冷冻干燥的过程复杂耗时，瓶间差、批间差难以控制，制备成本相对较高；冻干后的校准品、质控品使用繁琐，可用次数少，测试结果不够准确，复溶后保存条件苛刻、稳定性欠佳；而且冻干品稳定性亦受溶剂质量、溶剂量、保存温度及时间等多种因素的影响，导致检测结果变异系数增大；冻干品使用时需要复溶及分装，复溶时尽可能由固定实验人员使用同一加样器进行操作，且需轻轻摇匀内容物，切忌振摇；因此SHBG校准品、质控品的冻干保存存在诸多方面的缺陷及不足。
液态的SHBG校准品、质控品的制备及使用过程简单，避免了冻干、复溶及分装等繁琐的步骤，能有效克服以上各环节造成的各种误差，因此从经济和使用便捷性方面考虑，市场更青睐可长期稳定保存的液体校准品、质控品。但是目前SHBG的校准品、质控品中的抗原多用来源于人血液中的纯化的SHBG蛋白，且SHBG的结构为依靠非键相互作用聚合的二聚体结构。因此，SHBG在液态稀释液保存过程中易受多种蛋白质、离子、pH值、温度、化学反应、微生物活动及自身稳定性等因素的影响从而极易裂解为两个亚单位，导致检测结果出现较大偏差，严重影响了检测的准确性、灵敏度和特异性，而且，现有的SHBG蛋白是采用普通的液态稀释液稀释，如目前发现为数不多的SHBG化学发光试剂盒的校准品采用含山羊蛋白稳定剂的磷酸盐缓冲液稀释，使用中发现，其稳定性不佳。因此，研究开发一种能够提高SHBG液态稳定性和延长SHBG液态稳定保存时间的保存液是SHBG检测领域一直希望解决的难题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种性激素结合球蛋白的保存液，以解决现有性激素结合球蛋白液态稳定性差而导致的保存困难的技术问题。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测性激素结合球蛋白的校准品和质控品和试剂盒，以解决现有性激素结合球蛋白液态校准品和质控品中由于性激素结合球蛋白不稳定而导致检查结果不准确的技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了一种性激素结合球蛋白的保存液。所述性激素结合球蛋白的保存液包括缓冲液、性激素、ⅡA族和/或ⅡB族离子、渗透剂、动物血清、表面活性剂和蛋白质类稳定剂，其中，所述性激素在所述保存液中的浓度为1-10μM，所述ⅡA族和/或ⅡB族离子在所述保存液中的浓度为10-60mM。
本发明的再一方面，提供了一种检测剂。所述检测剂包括本发明性激素结合球蛋白的保存液和分散在所述保存液中的性激素结合球蛋白抗原。
本发明的又一方面，提供了一种用于检测性激素结合球蛋白的试剂盒。所述试剂盒包括本发明检测试剂或包括本发明性激素结合球蛋白的保存液。
本发明的还一方面，提供了本发明检测试剂或本发明用于检测性激素结合球蛋白的试剂盒的应用方法。所述本发明检测试剂或本发明用于检测性激素结合球蛋白的试剂盒在性激素结合球蛋白临床检测中的应用。
与现有技术相比，本发明性激素结合球蛋白的保存液通过所含的性激素作为性激素结合球蛋白的结合底物蛋白，并在ⅡA族和/或ⅡB族离子、蛋白质类稳定剂、表面活性剂以及其他助剂组分的协同作用下，使得溶解于保存液中的液态性激素结合球蛋白二聚体结构稳定，生物活性的稳定，使得其能够在液态下稳定保存，且保存时间长。
本发明性激素结合球蛋白的保存液的制备方法能够使得各组分分散均匀，形成的分散体系稳定，从而保证了制备的性激素结合球蛋白的保存液性能的稳定性，使得各组分能够对性激素结合球蛋白起到协同作用，提高性激素结合球蛋白在制备的性激素结合球蛋白的保存液中的结构和生物活性的稳定性。
本发明检测剂由于是采用本发明性激素结合球蛋白的保存液溶解性激素结合球蛋白形成的溶液，因此，所述检测剂的性激素结合球蛋白结构稳定，生物活性高，从而使得所述检测剂中性激素结合球蛋白的浓度保持稳定。
本发明用于检测性激素结合球蛋白的试剂盒由于包括本发明性激素结合球蛋白的保存液或包括本发明检测剂，因此，其含有性激素结合球蛋白的试剂中性激素结合球蛋白结构和活性稳定性高，使得所述试剂中性激素结合球蛋白的浓度稳定，从而使得所述试剂盒检测性激素结合球蛋白时结果准确，而且方便快捷。
本发明检测试剂或本发明试剂盒在性激素结合球蛋白临床检测中的应用能够实现目标物性激素结合球蛋白高准确度的检测。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例与附表，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
专用名称的解释：
性激素结合球蛋白：(Sex Hormone-binding Globulin，SHBG)，为特异性结合性激素的蛋白，又称为睾酮-雌二醇结合球蛋白(Testosterone-estradiol Binding Globulin，TeBG)。
由于人SHBG是一种同源二聚体蛋白，两个单体分子内有二硫键，但是两个单体之间不发生共价连接。在SHBG合成时，两个单体分子可能以共翻译的模式合成或单体分子独立折叠然后进行二聚化。二聚体的形成不依赖于化学键，而主要靠分子间的弱相互作用，所以SHBG二聚体在液体下极其不稳定，易解开二聚体结构，导致失活、降解。SHBG每个单体分子含373个氨基酸，含有一个层粘连蛋白G样结构域的串联重复序列。针对所述SHBG的结构特点和特性，一方面，本发明实施例提供了一种性激素结合球蛋白的保存液(下文统一简称SHBG保存液)。所述SHBG保存液由包括缓冲液、性激素、ⅡA族和/或ⅡB族离子、渗透剂、动物血清、表面活性剂和蛋白质类稳定剂等组分实际构成。
所谓的“实际构成”是指不含后述可任意添加成分(防腐剂、离子调节剂、pH调节剂等添加到通常制剂中的成分)以外的成分。
将含有所述实际构成组分的所述SHBG保存液溶解SHBG后，对SHBG稳定性和生物活性进行如下文的检测方法检测发现，该些组分之间能够产生协同作用，能够使得溶解在其中的SHBG二聚体保持结构稳定，生物活性高，使SHBG能够在液态下稳定保存。而且发现所述SHBG保存液中所含的性激素和ⅡA族和/或ⅡB族离子对SHBG二聚体结构稳定性和生物活性影响尤为明显，经过进一步研究发现，所含的性激素能够有效结合在SHBG的N端的1-194氨基酸残基区域，具体是所述性激素与SHBG的结合主要依赖疏水相互作用与氢键。这样，所述性激素构成了SHBG的结合蛋白底物，与所述SHBG结合，起到稳定SHBG二聚体结构稳定的作用。为了有效提高SHBG二聚体结构的稳定性和其生物活性，在所述SHBG保存液中，所述性激素在所述保存液中的浓度为1-10μM，该浓度范围的性激素能够提高与其他组分之间的协同作用，提高所述性激素与SHBG的结合，从而提高SHBG二聚体结构的稳定性。
在一实施例中，所述性激素包括睾酮、二氢睾酮(DHT)、脱氢表雄酮(DHEA)、雄烯二酮、雌二醇(E2)、雌酮、雌三醇(E3)中的至少一种。选用的该些性激素能够有效与SHBG形成稳定的氢键，从而提高SHBG的二聚体结构的稳定性，其中，SHBG与睾酮的亲和力高，而与雌二醇的亲和力稍低一些，如二氢睾酮与SHBG的结合易形成氢键，所以二氢睾酮与SHBG有高亲和力，因此，所述性激素优选选用睾酮、二氢睾酮等。在具体实施例中，所述性激素的浓度可以但不仅仅是1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM等中的任一具体浓度。其中，1μM表示为1μmol/L，下文μM也均是μmol/L缩写。
所述SHBG保存液所含的ⅡA族和/或ⅡB族离子能够结合在SHBG的每个单体所含的离子结合位点，如与SHBG的位于N端的层粘连蛋白G样结构域中的离子结合位点结合。这样，所述ⅡA族和/或ⅡB族离子与SHBG的离子结合位点结合，有效提高SHBG二聚体结构的稳定性。为了充分发挥所述ⅡA族和/或ⅡB族离子组分的作用，所述ⅡA族和/或ⅡB族离子在所述保存液中的浓度为10-60mM。该浓度范围的ⅡA族和/或ⅡB族离子能够有效与性激素及其他组分之间的协同作用，提高所述性激素与SHBG的结合，从而提高SHBG二聚体结构的稳定性。
一实施例中，所述ⅡA族离子/ⅡB族离子可以包括钙离子、镁离子、锌离子中的至少一种。选用的该些金属离子，能够有效与SHBG离子结合区域结合，从而促进SHBG单体二聚化，以促进SHBG二聚体的形成，并提高SHBG二聚体结构的稳定和生物活性。纯化的人SHBG蛋白在普通稀释液的液态保存过程中结合性激素的能力发生迅速且不可逆的减弱，添加该些金属离子与性激素(如DHT、E2、E3)有助于稳固SHBG的二聚体结构，从而保护结合性激素结合位点的完整，同时添加该些金属离子特别是钙离子与所述性激素(如DHT、E2、E3)可以有效提高SHBG抵抗如因热灭活等因素引起的活性下降的作用。在具体实施例中，所述ⅡA族和/或ⅡB族离子的浓度可以但不仅仅是10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM等中的任一具体浓度。
另外，所述SHBG保存液在上述性激素和ⅡA族和/或ⅡB族离子组分实施例的基础上，所述SHBG保存液包含的其他实际构成的组分如缓冲液、渗透剂、动物血清、表面活性剂和蛋白质类稳定剂等组分在所述SHBG保存液中的浓度或者含量可以是该些相应组分在本领域常规试剂中常规的浓度。为了提高各组分之间的协同作用，提高溶解在SHBG保存液中的SHBG结构和生物活性的稳定性，一实施例中，所述缓冲液、渗透剂、动物血清、表面活性剂和蛋白质类稳定剂在所述保存液中的浓度分别如下：
Figure BDA0001573199260000061
其中，在一实施例中，所述SHBG保存液所含的所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种。选用的该些缓冲液pH稳定，因此，能够保证所述SHBG保存液溶液体系pH的稳定，从而保证各组分溶解并均匀分散，同时保证如蛋白质类稳定剂、性激素、动物血清等组分的生物活性。在具体实施例中，所述缓冲液可以选用偏碱性的缓冲液，如pH 7.0-8.2选用的缓冲液，所述缓冲液浓度可以但不仅仅是50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM等中的任一浓度。其中，1mM表示为1mmol/L，下文mM也均是mmol/L缩写。
所述SHBG保存液所含的渗透剂能够与其他组分协同作用，降低SHBG的聚集及降解，并维持SHBG的二聚体结构和构象，提高SHBG或进一步提高性激素、蛋白质类稳定剂等蛋白热变性过程的转换温度，延缓蛋白结构域去折叠的进程，从而达到稳定蛋白结构和生物活性。一实施例中，所述渗透剂包括多元醇和多元醇的衍生物、氨基酸和氨基酸衍生物中的至少一种。在另一实施例中，所述渗透剂包括氨基酸或氨基酸衍生物中的至少一种和多元醇或多元醇的衍生物的至少一种的混合物；其中，氨基酸或氨基酸衍生物中的至少一种在所述保存液中的浓度为0.3-1.0M，所述多元醇或多元醇的衍生物中的至少一种在所述保存液中的浓度为0.2-1.5M。其中，M表示为mol/L，下文M也均是mol/L缩写。在具体实施例中，所述多元醇包括甘油、甘露醇、山梨醇中的至少一种，所述多元醇的衍生物包括蔗糖、海藻糖中的至少一种；所述氨基酸包括甘氨酸、精氨酸、脯氨酸中的至少一种；所述氨基酸衍生物可以是该些氨基酸如甘氨酸、精氨酸、脯氨酸等的相应的衍生物或牛磺酸中的至少一种。选用的该些渗透剂能够明显使得溶解在所述SHBG保存液中SHBG以及蛋白质类稳定剂和性激素等特别是SHBG减少蛋白的聚集及降解，维持蛋白特别是SHBG结构和构象的稳定性和生物活性。
所述SHBG保存液所含的动物血清中含有稳定蛋白结构特别是SHBG二聚体结构的物质，其能够在所述SHBG保存液其他组分的协同作用下，提高SHBG二聚体结构的稳定性和生物活性。一实施例中，所述动物血清包括山羊血清、牛血清、马血清中的至少一种。在具体实施例中，所述动物血清的浓度可以但不仅仅是5％V/V、7％V/V、9％V/V、10％V/V、12％V/V、13％V/V、14％V/V、15％V/V等中的任一浓度。
所述SHBG保存液所含的表面活性剂由于其分子结构特性，一部分是亲水基团，这是表面活性剂的亲水极性部分；另一部分是疏水基团或者亲油基团，这是非极性部分，因此，其具备能够有效吸附在溶液的界面上、显著的降低界面张力的能力和效率，具有优良的润湿、乳化、分散及渗透等特性，从而赋予可复性抗原蛋白的作用，可提高对SHBG的特异性识别能力；在乳化蛋白时，不破坏蛋白如SHBG的结构，可减少对蛋白质如SHBG之间原有的相互作用的破坏。所述表面活性剂可以是阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂和非离子型表面活性剂，优选选用非离子型表面活性剂，如一实施例中，所述非离子表面活性剂包括Tween-20(聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸单酯)、Tween-80(聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯)、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、Triton X-114(聚氧乙烯辛烷基苯酚醚)、NP-40(乙基苯基聚乙二醇)中的至少一种。该些非离子表面活性剂具有优异的可复性抗原蛋白的作用，显著提高对SHBG对特异性识别能力，提高蛋白如SHBG结构的稳定性，避免对蛋白如SHBG的结构造成破坏。在具体实施例中，所述表面活性剂的浓度可以但不仅仅是0.1％V/V、0.2％V/V、0.3％V/V、0.4％V/V、0.5％V/V等中的任一浓度。
所述SHBG保存液所含的蛋白质类稳定剂能够有效提高所述SHBG保存液中蛋白的浓度，从而使得其与所述SHBG保存液所含的其他组分的协同，提高所述SHBG保存液对溶解于其中的SHBG二聚体结构抵抗由于溶液的温度、表面张力的变化以及遇到降解酶酶解，从而提高液态SHBG在所述SHBG保存液中的稳定性和生物活性。一实施例中，所述蛋白质类稳定剂包括BSA、酪蛋白、明胶中的至少一种。选用的该些蛋白质类稳定剂能够与其他组分协同作用，提高对SHBG的保护，从而提高液态SHBG在所述SHBG保存液中的稳定性和生物活性。在具体实施例中，所述蛋白质类稳定剂的浓度可以是0.5％W/V、0.7％W/V、0.9％W/V、1.0％W/V、1.2％W/V、1.4％W/V、1.5％W/V、1.7％W/V、2％W/V等。
在上述各实施例的基础上，所述SHBG保存液还可以含有可以根据需要适当的添加防腐剂和离子调节剂以及其他常用的辅助成分中的至少一种。其中，如所述防腐剂存在时，能够避免所述SHBG保存液受到微生物的污染，从而保护所述SHBG保存液的稳定性。一实施例中，所述防腐剂在所述保存液中的浓度为0.09-1.5％W/V。在具体实施例中，所述防腐剂包括NaN3、Proclin300、硫柳汞、庆大霉素中的至少一种，如所述防腐剂包括NaN3与Proclin300，且所述NaN3在所述SHBG保存液中的浓度为0.09-0.2％W/V，所述Proclin300在所述SHBG保存液中的浓度为0.5-1.5％W/V。
另一实施例中，所述离子调节剂在所述保存液中的浓度为0.2-0.8M。在具体实施例中，所述离子调节剂包括氯化钠、氯化钾中的至少一种。
另一方面，基于上文所述的SHBG保存液，本发明实施例提供了一种检测剂，具体是用于检测性激素结合球蛋白的检测剂。所述检测剂包括上文所述性激素结合球蛋白的保存液和分散在上文所述保存液中的性激素结合球蛋白抗原。其中，性激素结合球蛋白抗原在所述保存液中的浓度可以根据实际应用需要进行灵活调整。另外，根据所述检测剂的应用，可以将所述检测剂作为SHBG检测用校准品和质控品。当所述检测剂作为SHBG检测用校准品和质控品时，因此，所述SHBG抗原在所述检测剂中的浓度是被标明也即是明确的，且其浓度可以根据检测的需要进行调整。如所述SHBG抗原在所述校准品中的浓度可以但不仅仅为14.957nmol/L或167.191nmol/L。如所述SHBG抗原在所述质控品中的浓度可以但不仅仅为30nmol/L或70nmol/L。
因此，所述检测剂具体如用于检测SHBG的校准品和质控品由于是采用上文所述SHBG保存液溶解SHBG抗原形成的具有稳定浓度的溶液，因此，所述检测剂能够以液态稳定保存如在室温(20℃-25℃)下保存，且有效保证所述SHBG的稳定性，从而提高其室温液态下的生物活性，从而提高了所述校准品和质控品的准确度。另外，所述检测剂可以直接在室温下将SHBG抗原溶解于所述SHBG保存液中，形成含有液态SHBG的检测剂，从而实现液态SHBG的如室温下稳定的液态保存，还可以在37℃下稳定的液态保存，当然可以在冷藏温度(如2℃-8℃，或以下)稳定的液态保存。因此，所述检测剂可以如同上文所述的SHBG保存液能够直接在室温下配制形成，无需真空冷冻干燥程序，也即是所述检测剂可以不经过真空冷冻干燥程序进行配制形成。
经检测，上文所述“稳定的”，是指代在冷藏温度(2℃-8℃)下至少放置1年；在室温(20℃-25℃)下至少放置4周；在37℃至少放置7天，而降解率在15％以内，优选10％以内，更优选5％以内。
又一方面，本发明实施例用于检测SHBG的试剂盒。所述用于检测SHBG的试剂盒包括的试剂有：上文所述的本发明实施例SHBG保存液，或者上文所述的本发明实施例用于检测SHBG的检测剂。所述SHBG保存液或所述检测剂的规格如体积可以根据试剂盒的规格灵活设定。当所述试剂盒直接包括上文所述的SHBG保存液时，其在使用时，可以直接将SHBG抗原溶解于所述SHBG保存液用于配制用于检测SHBG所需要用的检测剂，如校准品、质控品等试剂等。
其中，所述检测剂或利用所述SHBG保存液在检测时配制的检测剂中所含的所述SHBG抗原浓度也可以根据检测的需要进行灵活调整。如在一实施例中，所述试剂盒所含的检测剂或利用所述SHBG保存液在检测时配制的检测剂作为校准品、质控品时，校准品设置低浓度校准品和高浓度校准品，在具体实施例中，所述低浓度定准品的浓度可以但不仅仅为14.957nmol/L，所述高浓度定准品的浓度可以但不仅仅为167.191nmol/L。所述质控品设置质控品1和质控品2，在具体实施例中，所述质控品1的浓度可以但不仅仅为30nmol/L，所述质控品2的浓度可以但不仅仅为70nmol/L。
当然，所述试剂盒还包括用于检测SHBG的其他必要的试剂，如化学发光免疫分析法相关试剂，具体的如抗SHBG单抗或多抗包被磁性微球后配制的磁性微球试剂和发光标记物标记SHBG单抗或多抗后配制的发光标记物试剂。其中，所述发光标记物试剂可以是ABEI标记试剂。
利用所述用于检测SHBG的试剂盒检测样品中SHBG的方法可以按照如下的双抗体夹心法进行：
(1)第一次孵育：样本(校准品、质控品)、缓冲液、磁性微球一起孵育，样本(校准品、质控品)中的SHBG与包被在磁性微球表面的抗SHBG单克隆抗体结合，孵育后，通过磁分离清洗去除未结合的物质；
(2)第二次孵育：加入发光标记物进行孵育，ABEI标记的抗SHBG单克隆抗体与已经结合于磁性微球的SHBG反应，孵育后，通过磁分离清洗去除未结合的物质；
(3)加入全自动免疫检验系统用底物液，启动化学发光反应，产生光信号。通过光电倍增管测出的相对光强度(RLU)与样本(校准品、质控品)中的SHBG浓度成一定正相关比例关系。
因此，所述用于检测性激素结合球蛋白的试剂盒由于含有所述SHBG保存液，或包括所述用于检测SHBG的校准品和所述用于检测SHBG的质控品中的一种或两种，因此，其检测性激素结合球蛋白时结果准确，而且方便快捷。
另外，采用所述用于检测SHBG的试剂盒检测样品中的SHBG含量可以按照常规化学发光免疫分析法进行操作。
基于上文所述的SHBG保存液、检测剂以及试剂盒的基础上，本发明实施例还提供了上文本发明实施例检测试剂或上文本发明试剂盒在SHBG临床检测中的应用。如一实施例中，当上文本发明实施例检测试剂在SHBG临床检测中的应用时，其可以作为用于校准品或质控品。
当上文本发明实施例试剂盒在SHBG临床检测中的应用时，所述试剂盒所含的上文所述检测剂用于校准品或质控品，或所含的上文所述的SHBG保存液用于配制用于检测SHBG的检测剂，具体用于校准品或质控品。
因此，上文本发明实施例检测试剂或上文本发明试剂盒在SHBG临床检测中的应用能够实现目标物高准确度的检测。
现结合具体实例，对本发明实施例SHBG保存液以及其应用进行进一步详细说明。
1.SHBG保存液实施例
实施例11
一种SHGB保存液，其具体配制方法为：向烧杯中依次加入50ml的山羊血清，1mlTween-20，102ml甘油，6.66g CaCl2，17.55g NaCl,75.07g甘氨酸，5g BSA，1g NaN3，1.5gProclin 300后加入500ml 0.12M三羟甲基氨基甲烷(TRIS)溶解搅拌，后加入5ml 1mM N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解的二氢睾酮母液，加入稀盐酸调整溶液的pH值至7.4，最后再加水稀释至1L。
该保存液的组分为：
Figure BDA0001573199260000111
实施例12
一种SHGB保存液，其具体配制方法同实施例1，仅0.5％v/v 1mM二氢睾酮的母液替换为0.5％v/v 1mM雌二醇的母液。
实施例13
一种SHGB保存液，其具体配制方法同实施例1，该保存液的组分为：
Figure BDA0001573199260000112
Figure BDA0001573199260000121
实施例14
一种SHGB保存液，其具体配制方法同实施例1，该保存液的组分为：
Figure BDA0001573199260000122
实施例15
一种SHGB保存液，其具体配制方法同实施例1，该保存液的组分为：
Figure BDA0001573199260000123
实施例16
一种SHGB保存液，其具体配制方法同实施例1，该保存液的组分为：
Figure BDA0001573199260000124
Figure BDA0001573199260000131
实施例17
一种SHGB保存液，其具体配制方法同实施例1，该保存液的组分为：
Figure BDA0001573199260000132
对比例11-对比例110分别提供了一种SHBG保存液，各所述SHBG保存液所含的组分和各组分的含量以及具体种类分别如下文表1中SHBG保存液所示。
2.用于检测SHBG的检测剂以及试剂盒实施例
实施例21-实施例27
本实施例21-27分别提供了一种用于检测SHBG的试剂盒，其包括如下组分：
(1)抗SHBG单抗包被的磁性微球溶液，其中磁性微球的浓度为1mg/mL，包被于磁性微球上的抗SHBG单抗的浓度为10μg/mL；
(2)ABEI标记的抗SHBG单抗溶液，其中ABEI浓度为3.125ng/mL，已被ABEI标记的抗SHBG单抗的浓度为62.5ng/mL；
(3)校准品：
低浓度校准品，含有SHBG纯化蛋白的溶液，且所述SHBG纯化蛋白抗原是分别溶解于上述实施例11-17的保存液中，且所述SHBG纯化蛋白抗原的浓度为14.957nmol/L；
高浓度校准品，含有SHBG纯化蛋白的溶液，且所述SHBG纯化蛋白抗原是分别溶解于上述实施例11-17的保存液中，且所述SHBG纯化蛋白抗原的浓度为167.191nmol/L；
(4)质控品：
质控品1，含有SHBG纯化蛋白的溶液，且所述SHBG纯化蛋白抗原是分别溶解于上述实施例11-17的保存液中，且所述SHBG纯化蛋白抗原的浓度为30.0nmol/L；
质控品2，含有SHBG纯化蛋白的溶液，且所述SHBG纯化蛋白抗原是分别溶解于上述实施例11-17的保存液中，且所述SHBG纯化蛋白抗原的浓度为70.0nmol/L；
对比例21-210
本对比例21-210分别提供了一种用于检测SHBG的试剂盒，其包括如下组分：
(1)抗SHBG单抗包被的磁性微球溶液，其中磁性微球的浓度为1mg/mL，包被于磁性微球上的抗SHBG单抗的浓度为10μg/mL；
(2)ABEI标记的抗SHBG单抗溶液，其中ABEI浓度为3.125ng/mL，已被ABEI标记的抗SHBG单抗的浓度为62.5ng/mL；
(3)校准品：
低浓度校准品，含有SHBG纯化蛋白的溶液，且所述SHBG纯化蛋白抗原是分别溶解于上述对比例11-110的保存液中，且所述SHBG纯化蛋白抗原的浓度为14.957nmol/L；
高浓度校准品，含有SHBG纯化蛋白的溶液，且所述SHBG纯化蛋白抗原是分别溶解于上述对比例11-110的保存液中，且所述SHBG纯化蛋白抗原的浓度为167.191nmol/L；
(4)质控品：
质控品1，含有SHBG纯化蛋白的溶液，且所述SHBG纯化蛋白抗原是分别溶解于上述对比例11-110的保存液中，且所述SHBG纯化蛋白抗原的浓度为30.0nmol/L；
质控品2，含有SHBG纯化蛋白的溶液，且所述SHBG纯化蛋白抗原是分别溶解于上述对比例11-110的保存液中，且所述SHBG纯化蛋白抗原的浓度为70.0nmol/L；
试剂盒的分析性能评估及校准品、质控品热稳定性研究
使用深圳市新产业生物医学股份有限公司生产的全自动化学发光测定仪Maglumi2000Plus进行性能评估及热稳定性研究。
1.研究内容和方法：
1)试剂盒性能评估
将上述实施例21-27提供的用于检测SHBG的试剂盒和对比例21-210提供的用于检测SHBG的试剂盒(化学发光免疫分析法)分别按照下述方法进行评估：
试剂盒先进行定标，试剂盒定标后得到工作曲线，再进行分析灵敏度、准确度、线性等性能指标的评估。
A.分析灵敏度评估样本为零浓度校准品，零浓度校准品即为各实施例及对比例中的校准品、质控品所含的相应保存液。使用本实施例提供的试剂盒，按照上述测定方法对此样本检测20次，计算其RLU均值及标准差(SD)，将均值RLU+2SD值代入工作曲线计算，得到的浓度即为分析灵敏度，分析灵敏度接受标准为不大于0.200nmol/L。分析灵敏度检测结果如表2所示。
B.线性评估样本为各实施例及对比例提供的保存液与SHBG校准品配制而成。将浓度为250.0nmol/L的SHBG校准品和实施例及对比例提供的保存液进行等浓度间隔稀释得到6个不同浓度水平的样本。对每一浓度的样本重复测定3次，计算测试结果均值，将测定浓度的平均值与理论浓度用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，r接受标准为不小于0.9900。线性检测结果如表3所示。
C.准确度评估样本为各实施例及对比例提供的保存液与SHBG校准品配制而成。将浓度约为180.0nmol/L(允许偏差为±20％)的SHBG校准品(A)加入到实施例及对比例提供的保存液(B)中，所加入的A与B之间的体积比例为1：9。重复测定3次后，记录测定结果平均值，根据下列公式计算回收率，回收率接受标准为在90％～110％范围内。准确度检测结果如表4所示。
Figure BDA0001573199260000151
式中：
R——回收率；
V——加入A液体积；
V0——血清样本B的体积；
C——血清样本B加入A液后的测定浓度；
C0——血清样本B的测定浓度；
CS——A液的浓度。
2)校准品、质控品的稳定性研究
将上述实施例21-27提供的用于检测SHBG的试剂盒和对比例21-210提供的用于检测SHBG的试剂盒(化学发光免疫分析法)所含的低浓度校准品、高浓度校准品、质控品1和质控品2分别在2～8℃和37℃下的热稳定性，热稳定试验连续跟踪8天，每天每个样本重复测定2次，检测结果如表5所示。
稳定性接受标准为4℃环境中处理7天后，RLU相对偏差(偏差1)在±15％范围内；37℃环境中处理7天后，RLU相对偏差(偏差2)在±15％范围内；处理7天后，2℃～8℃和37℃环境中RLU相对偏差(偏差3)在±15％范围内。
Figure BDA0001573199260000161
Figure BDA0001573199260000162
Figure BDA0001573199260000163
其中，偏差1至偏差3中的i＝1、2、3、…、6、7。
2.试剂盒性能评估结果和校准品、质控品的稳定性研究结果：
1)试剂盒性能评估：其中，试剂盒灵敏度分析结果如表2所示，试剂盒线性相关性结果如表3所示，试剂盒准确度分析结果如表4所示。其中，
实施例21试剂盒的分析灵敏度为0.161nmol/L，准确度评估中回收率为97.75％，线性评估中相关系数r为0.9972。因此，实施例21试剂盒的性能指标良好。
实施例23试剂盒的分析灵敏度为0.139nmol/L，准确度评估中回收率为96.14％，线性评估中相关系数r为0.9974。因此，实施例23试剂盒的性能指标良好。
实施例24试剂盒的分析灵敏度为0.173nmol/L，准确度评估中回收率为94.56％，线性评估中相关系数r为0.9862。因此，本实施例24试剂盒的性能指标，如线性变差。实施例24试剂盒所含的校准品的保存液中的性激素组分浓度较高；因此，说明本发明实施例提供的保存液中性激素组分浓度过高会影响试剂盒的分析性能。也即是添加一定浓度的性激素有助于改善试剂盒的分析性能。
实施例25试剂盒的分析灵敏度为0.117nmol/L，准确度评估中回收率为89.50％，线性评估中相关系数r为0.9741。因此，实施例25试剂盒的性能指标，如准确度、线性变差。实施例25试剂盒所含的校准品的保存液中的钙离子浓度较低；因此，说明本发明实施例提供的保存液中钙离子浓度过低会影响试剂盒的分析性能。也即是添加一定浓度的钙离子有助于改善试剂盒的分析性能。
对比例21试剂盒的分析灵敏度为0.253nmol/L，准确度评估中回收率为85.75％，线性评估中相关系数r为0.9890。因此，本对比例21试剂盒的性能指标，如分析灵敏度、准确度变差。对比例21试剂盒所含的校准品的保存液为不含性激素组分的保存液；因此，说明保存液中添加一定浓度的性激素有助于改善试剂盒的分析性能。也即是在本发明实施例提供的保存液所含的性激素组分能够提高SHBG的稳定性和生物活性。
对比例22试剂盒的分析灵敏度为0.367nmol/L，准确度评估中回收率为88.09％，线性评估中相关系数r为0.9793。因此，本对比例22试剂盒的性能指标，如分析灵敏度、准确度变差。对比例22试剂盒所含的校准品的保存液为不含金属离子如钙离子组分的保存液，因此，说明保存液中添加一定浓度的钙离子有助于改善试剂盒的分析性能。也即是在本发明实施例提供的保存液所含的钙离子能够提高SHBG的稳定性和生物活性。
对比例27试剂盒的分析灵敏度为0.271nmol/L，准确度评估中回收率为88.82％，线性评估中相关系数r为0.9655。本对比例27试剂盒的性能指标，如分析灵敏度、准确度变差。对比例27试剂盒所含的校准品的保存液为不含性激素与金属离子如钙离子的保存液；因此，说明保存液中添加一定浓度的性激素与金属离子如钙离子有助于改善试剂盒的分析性能。也即是在本发明实施例提供的保存液所含的性激素与金属离子如钙离子能够协同地提高SHBG的稳定性和生物活性。
对比例210试剂盒的分析灵敏度为0.311nmol/L，准确度评估中回收率为83.17％，线性评估中相关系数r为0.9843。因此，本对比例210试剂盒的性能指标，如分析灵敏度、准确度变差。对比例210试剂盒所含的校准品的保存液为不含性激素、金属离子如钙离子、渗透剂、动物血清、表面活性剂、蛋白类稳定剂组分的保存液；因此，说明保存液中添加一定浓度的性激素、金属离子如钙离子、渗透剂、动物血清、表面活性剂、蛋白类稳定剂有助于改善试剂盒的分析性能。也即是在本发明实施例提供的保存液所含的性激素、金属离子如钙离子、渗透剂、动物血清、表面活性剂、蛋白类稳定剂具有协同作用，能够提高SHBG的稳定性和生物活性。
2).试剂盒校准品和质控品稳定性的效果验证：各实施例中试剂盒校准品和质控品稳定性验证结果如表5所示。其中，
实施例21试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃与37℃保存下SHBG活性变化的数据可知，实施例21试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下总体趋势稳定，37℃下的7天最大降解率为5.38％。因此，有效说明了实施例11提供的保存液有助于SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
实施例22试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃与37℃保存下SHBG活性变化的数据可知，实施例22试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下总体趋势稳定，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为4.37％和10.89％。因此，有效说明了实施例12提供的保存液有助于SHBG纯化蛋白液态的稳定保存，且保存液中的性激素为二氢睾酮时的稳定性保存效果要优于雌二醇。
实施例23试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃与37℃保存下SHBG活性变化的数据可知，实施例23试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃条件下总体趋势稳定、在37℃条件下有变差的趋势，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为7.01％和11.63％。因此，有效说明了实施例13提供的保存液中的1μM的二氢睾酮的母液可有效稳定保存SHBG纯化蛋白，但保存效果略差于实施例11的保存液。
实施例24试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃与37℃保存下SHBG活性变化的数据可知，实施例24试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下总体趋势稳定，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为8.53％和13.2％。因此，有效说明了实施例14提供的保存液中的10μM的二氢睾酮的母液有助于SHBG纯化蛋白液态的稳定保存，但保存效果略差于实施例11的保存液。
实施例25试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃与37℃保存下SHBG活性变化的数据可知，实施例25试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下总体趋势稳定，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为9.19％和13.08％。因此，有效说明了实施例15提供的保存液有助于SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
实施例26试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃与37℃保存下SHBG活性变化的数据可知，实施例26试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下总体趋势稳定，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为7.16％和11.07％。因此，有效说明了实施例16提供的保存液有助于SHBG纯化蛋白液态的稳定保存
实施例27试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃与37℃保存下SHBG活性变化的数据可知，实施例27试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下总体趋势稳定，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为5.42％和11.35％。由此说明了实施例16-17提供的保存液所含的渗透剂为单个的甘油或者甘氨酸时，其保存稳定性效果不如实施例11提供的保存液所含的渗透剂为甘油和甘氨酸两者共存时的效果。
对比例21试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下随着保存时间的延长，稳定性恶化，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为15.37％和34.59％。因此，反面说明了本发明实施例提供的保存液所含的性激素组分有助于SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
对比例22试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下随着保存时间的延长，稳定性恶化，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为17.37％和28.12％。因此，反面说明了本发明实施例提供的保存液所含的金属离子如钙离子组分有助于SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
对比例23试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下随着保存时间的延长，稳定性恶化，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为10.62％和19.63％。因此，反面说明了本发明实施例提供的保存液所含的渗透剂组分有助于SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
对比例24试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下随着保存时间的延长，稳定性恶化，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为10.15％和13.77％。因此，反面说明了本发明实施例提供的保存液所含的动物血清组分有助于SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
对比例25试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下随着保存时间的延长，稳定性恶化，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为11.22％和18.34％。因此，反面说明了本发明实施例提供的保存液所含的表面活性剂组分有助于SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
对比例26试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下随着保存时间的延长，稳定性恶化，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为9.58％和24.65％。因此，反面说明了本发明实施例提供的保存液所含的蛋白稳定剂组分有助于SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
对比例27试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下随着保存时间的延长，稳定性恶化，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为18.18％和45.66％。因此，反面说明了本发明实施例提供的保存液所含的性激素、金属离子如钙离子组分有协同作用，促进SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
对比例28试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下随着保存时间的延长，稳定性恶化，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为19.31％和42.24％。因此，反面说明了本发明实施例提供的保存液所含的性激素、金属离子如钙离子、动物血清组分有协同作用，促进SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
对比例29试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下随着保存时间的延长，稳定性恶化，其低浓度校准品在37℃下的7天最大降解率为52.13％。因此，反面说明了本发明实施例提供的保存液所含的性激素、金属离子如钙离子、渗透剂、表面活性剂组分有协同作用，促进SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
对比例210试剂盒所含的校准品与质控品在2-8℃和37℃条件下随着保存时间的延长，稳定性恶化，其低浓度校准品在2-8℃和37℃下的7天最大降解率为27.89％和65.29％。因此，反面说明了实施例提供的保存液所含的性激素、金属离子如钙离子、渗透剂、动物血清、表面活性剂、蛋白稳定剂组分有协同作用，共同促进SHBG纯化蛋白液态的稳定保存。
以上所述的实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0001573199260000211
Figure BDA0001573199260000221
Figure BDA0001573199260000231
Figure BDA0001573199260000241
Figure BDA0001573199260000251
Figure BDA0001573199260000261
Figure BDA0001573199260000271
Figure BDA0001573199260000281
Figure BDA0001573199260000291
Figure BDA0001573199260000301

Claims (7)

1.一种性激素结合球蛋白的保存液，其特征在于：用于保存性激素结合球蛋白，所述保存液包括缓冲液、性激素、ⅡA族离子、渗透剂、动物血清、表面活性剂和蛋白质类稳定剂，其中，所述性激素在所述保存液中的浓度为1-10μM，所述ⅡA族离子在所述保存液中的浓度为10-60mM；
所述ⅡA族离子为钙离子；
所述性激素包括睾酮、二氢睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、雌二醇、雌酮、雌三醇中的至少一种；
所述渗透剂为多元醇和多元醇的衍生物、氨基酸和氨基酸衍生物中的至少一种，所述多元醇为甘油、甘露醇、山梨醇中的至少一种，所述多元醇的衍生物为蔗糖、海藻糖中的至少一种，所述氨基酸为甘氨酸、精氨酸、脯氨酸中的至少一种，所述氨基酸的衍生物为牛磺酸；
所述动物血清为山羊血清、牛血清、马血清中的至少一种；
所述蛋白质类稳定剂为BSA、酪蛋白、明胶中的至少一种；
所述表面活性剂为非离子表面活性剂；
所述缓冲液包括T ris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种；
所述缓冲液、渗透剂、动物血清、表面活性剂和蛋白质类稳定剂在所述保存液中的浓度分别如下：
Figure FDA0003039520910000011
Figure FDA0003039520910000021
2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于：所述渗透剂包括氨基酸或氨基酸衍生物中的至少一种与多元醇或多元醇的衍生物中的至少一种的混合物；其中，所述氨基酸或氨基酸衍生物中的至少一种在所述保存液中的浓度为0.3-1.0M，所述多元醇或多元醇的衍生物在所述保存液中的浓度为0.2-1.5M。
3.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于：所述非离子表面活性剂包括Tween-20、Tween-80、Triton X-100、Triton X-114、NP-40中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于：还包括防腐剂和离子调节剂中的至少一种，其中，所述防腐剂在所述保存液中的浓度为0.09-1.5％W/V，所述离子调节剂在所述保存液中的浓度为0.2-0.8M。
5.一种检测剂，其特征在于：包括权利要求1-4任一项所述的性激素结合球蛋白的保存液和分散在所述保存液中的性激素结合球蛋白抗原。
6.根据权利要求5所述的检测剂，其特征在于：所述检测剂作为性激素结合球蛋白检测用校准品和质控品。
7.一种用于检测性激素结合球蛋白的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求5-6任一项所述的检测剂或包括权利要求1-4中任一项所述的保存液。
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