CN111909922B

CN111909922B - 一种高稳定性的肌酸激酶保护基质

Info

Publication number: CN111909922B
Application number: CN202010596159.XA
Authority: CN
Inventors: 胡卫江
Original assignee: Jiaxing Yourui Biotechnology Co ltd; Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University Zhejiang
Current assignee: Jiaxing Yourui Biotechnology Co ltd; Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University Zhejiang
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2040-06-28
Also published as: CN111909922A

Abstract

本发明公开了一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，含有以下成分：缓冲液4wt%~10wt%；动物血清5wt%~15wt%；ADP 1wt%~2wt%；BSA 1wt%~2wt%；镁盐0.1wt%~1.0wt%；糖类0.1wt~1wt%；醇类0.1wt~1wt%；肌酸激酶40~900IU/L；余量为去离子水。本发明的一种高稳定性的肌酸激酶保护基质将肌酸激酶置于含有缓冲液、动物血清、ADP、BSA等的溶液中，溶液中的各个组分共同配合作用下，给肌酸激酶营造一种稳定的微环境，使得肌酸激酶在这种微环境下能够长期保持稳定。本发明的一种液态的高稳定性的肌酸激酶保护基质可用于制备肌酸激酶试剂盒的标准物质、校准品或质控品，改变传统的标准物质、校准品或质控品只能使用冻干粉的状况，使用起来更加方便。

Description

一种高稳定性的肌酸激酶保护基质

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其是，本发明涉及一种高稳定性的肌酸激酶保护基质。

背景技术

肌酸激酶（Creatin Kinase，CK）是由M（肌肉）型和B（脑）型两种单体亚单位组成的二聚酶。M型和B型结合形成三种CK同工酶：CK-BB、CK-MB、CK-MM。肌酸激酶大量存在于心肌、骨骼肌和脑等组织，是一个与细胞内能量转运、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。其中，CK-BB主要存在于大脑、前列腺、肠、肺；骨骼肌中存在大量的CK-MM和少量的CK-MB；而心肌组织虽以CK-MM为主，但CK-MB所占比例远较其他组织高。

肌酸激酶可用于心肌梗塞的早期诊断、各种肌肉疾病的诊断以及制备磷酸肌酸等。目前，临床上常用肌酸激酶试剂盒来检测肌酸激酶的活性，检测时需要配合使用含有肌酸激酶的校准品和质控品，校准品和质控品是用标准物质配制的。校准品用于对测量系统进行校准，从而建立起测量结果的计量学溯源性。质控品用于控制测量的精密度、准确度。临床工作中，检测结果的准确性一方面取决于仪器系统本身；另一方面取决于所使用的校准品和质控品性质的稳定性。因此，稳定的校准品和质控品是保证检测结果准确的前提。目前，肌酸激酶检测使用的校准品或质控品多为干粉或冻干粉状态，使用时还要使用稀释剂进行稀释，使用非常不方便。目前，尚没有液体状态的校准品或质控品，因为肌酸激酶在溶液中不稳定，不能在2~8℃下长期储存，容易变性失活。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高稳定性的肌酸激酶保护基质。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，含有以下成分：

缓冲液 4wt%~10wt%；

动物血清 5wt%~15wt%；

ADP 1wt%~2wt%；

BSA 1wt%~2wt%；

氯化钙 0.1wt%~1.0wt%；

镁盐 0.1wt%~1.0wt%；

糖类 0.1wt~1wt%；

醇类 0.1wt~1wt%；

肌酸激酶 40~900IU/L；

余量为去离子水。

优选地，本发明的一种高稳定性的肌酸激酶保护基质还包括氯化钠，所述氯化钠含量为0.05wt%~1wt%。

优选地，所述缓冲液为以下任意一种：PIPES缓冲液、Tris-HAc缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液。

优选地，所述糖类为以下至少一种：蔗糖、海藻糖、葡萄糖。

优选地，所述醇类为以下至少一种：羟基乙醇、甘油、PEG6000、PEG8000。

优选地，所述镁盐为以下至少一种：醋酸镁、硫酸镁、氯化镁。

优选地，所述动物血清为小牛血清或羊血清。

优选地，本发明的一种高稳定性的肌酸激酶保护基质还包括生物素-乙二胺，所述生物素-乙二胺的含量为0.05wt%~0.5wt%。

优选地，所述一种高稳定性的肌酸激酶保护基质的pH值为6.8~7.5。

与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：

本发明的一种高稳定性的肌酸激酶保护基质将肌酸激酶置于含有缓冲液、动物血清、ADP、BSA等的溶液中，溶液中的各个组分共同配合作用下，给肌酸激酶营造一种稳定的微环境，使得肌酸激酶在这种微环境下能够长期保持稳定。

本发明的一种液态的高稳定性的肌酸激酶保护基质可用于制备肌酸激酶试剂盒的标准物质、校准品或质控品，改变传统的标准物质、校准品或质控品只能使用冻干粉的状况，使用起来更加方便。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

本发明实施例提供一种液态的高稳定性的肌酸激酶保护基质，含有以下成分：

缓冲液 4wt%~10wt%；

动物血清 5wt%~15wt%；

ADP 1wt%~2wt%；

BSA 1wt%~2wt%；

镁盐 0.1wt%~1.0wt%；

糖类 0.1wt~1wt%；

醇类 0.1wt~1wt%；

肌酸激酶 40~900IU/L；

余量为去离子水。

其中，缓冲液可以选择以下任意一种：PIPES缓冲液、Tris-HAc缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液。缓冲液可以维持整个保护基质体系pH值的稳定，为肌酸激酶的稳定存储提供一个稳定的液态环境。使用不同的缓冲液体系，肌酸激酶在其中稳定存储的浓度也有所不同，肌酸激酶的适合存储浓度在400~900IU/L范围内。通过缓冲液控制本发明的一种高稳定性的肌酸激酶保护基质的pH值为6.8~7.5。

ADP可以与保护基质中的肌酸激酶形成络合物，进而使得肌酸激酶保持稳定。BSA，即为牛血清白蛋白，通过在保护基质中添加BSA，可以提高保护基质中含有的蛋白质的浓度，防止肌酸激酶分解或者发生非特异性吸附，使得肌酸激酶更加稳定存在液体环境中。

糖类可以选为以下至少一种：蔗糖、海藻糖、葡萄糖。糖类的分子结构上含有很多羟基，可以和肌酸激酶的蛋白分子结构中的酰氨基发生相互作用，使得肌酸激酶更稳定。此外，糖类分子结构上的羟基可以与肌酸激酶相互作用，使得肌酸激酶与水溶剂化，两者之间形成氢键，改变肌酸激酶分子折叠的驱动力，降低肌酸激酶分子的自由能，使得肌酸激酶更加稳定存储。

醇类可以选为以下至少一种：羟基乙醇、甘油、PEG6000、PEG8000。甘油可以增加液态体系的黏度，增加分子表面水化层，减少肌酸激酶肽链间的碰撞，一致肌酸激酶分子间相互聚集，进而使得肌酸激酶在液态中可以保持分子结构的天然构象，使得肌酸激酶更加稳定。而PEG6000、PEG8000这种大分子结构的醇类，加入到液态体系中后，一方面可以对液态体系进行增稠，减少液体体系中分子碰撞的机率，使得肌酸激酶分子稳定存在；另一方面，其分子结构上的羟基也可以和肌酸激酶的蛋白分子结构中的酰氨基发生相互作用，使得肌酸激酶更稳定。羟基乙醇分子中同时含有羟基和碳氮三键官能团，这些功能基团可以和保护基质中蛋白质分子相互作用，进而保持肌酸激酶的稳定性。

镁盐可以选为以下至少一种：醋酸镁、硫酸镁、氯化镁。镁离子可以与肌酸激酶的带电基团相结合，抑制氧气等其他物质与肌酸激酶分子的结合，进而提高肌酸激酶分子的稳定性。

氯化钙可以增强保护基质中蛋白质分子在pH为6.8~7.5的液体中的稳定性。

动物血清为小牛血清或羊血清。动物血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、无机物等物质，在液态体系中可以为肌酸激酶提供一个稳定的存储环境。本发明实施例中使用的动物血清购于上海远慕生物科技有限公司。

优选地，本发明的一种高稳定性的肌酸激酶试剂保护基质还包括氯化钠，氯化钠含量为0.05wt%~1wt%。氯化钠具有一定的防腐作用，添加氯化钠可以延长保护基质的保存时间。

优选地，本发明的一种高稳定性的肌酸激酶保护基质还包括生物素-乙二胺，生物素-乙二胺的含量为0.05wt%~0.5wt%。生物素-乙二胺的氨基可以与肌酸激酶分子上的羧基进行交联，进一步增强肌酸激酶在液态体系中的稳定性。

进一步地，还可以在液态保护基质中添加防腐剂成分，如Proclin300。防腐剂的添加量为0.01wt%~0.5wt%。添加防腐剂可以进一步提高肌酸激酶在液态体系中的稳定性。

本发明的一种高稳定性的肌酸激酶保护基质的制备采用常规生化试剂的制备方法即可，具体可将保护基质中的各种成分溶解、分散到去离子水中即可。

本发明的一种高稳定性的肌酸激酶保护基质将肌酸激酶置于含有缓冲液、动物血清、ADP、BSA等的溶液中，溶液中的各个组分共同配合作用下，给肌酸激酶营造一种稳定的微环境，使得肌酸激酶在这种微环境下能够长期保持稳定。本发明的一种液态的高稳定性的肌酸激酶保护基质可用于制备肌酸激酶试剂盒的标准物质、校准品或质控品，改变传统的标准物质、校准品或质控品只能使用冻干粉的状况，使用起来更加方便。

以下结合具体实施例做进一步说明。

实施例1

本发明实施例1提供一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，含有以下成分：pH=7.1的PIPES缓冲液4wt%；小牛血清 5wt%；BSA 1.8wt%；氯化钙 0.1wt%；醋酸镁 0.1wt%；ADP1.5wt%；海藻糖 0.3wt%；甘油 0.5wt%；肌酸激酶 60 IU/L；氯化钠 0.05 wt%；余量为去离子水。

实施例2

本发明实施例2提供一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，含有以下成分：pH=6.8的Tris-HAc缓冲液6wt%；小牛血清 8wt%；BSA 1.2wt%；氯化钙 0.5wt%；醋酸镁 0.5wt%；ADP1.2wt%；葡萄糖 0.5wt%；PEG6000 0.6wt%；肌酸激酶 200 IU/L；氯化钠 0.2 wt%；余量为去离子水。

实施例3

本发明实施例3提供一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，含有以下成分：pH=7.5的磷酸缓冲液6wt%；小牛血清 10wt%；BSA 1.5wt%；氯化钙 0.8wt%；硫酸镁 1.0wt%；ADP1.8wt%；葡萄糖 1.0wt%；PEG8000 0.5wt%；肌酸激酶 600 IU/L；氯化钠 0.5 wt%；余量为去离子水。

实施例4

本发明实施例4提供一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，含有以下成分：pH=7.2的甘氨酸缓冲液10wt%；羊血清 15wt%；EDTA 1.8wt%；硫酸镁 0.8wt%；吐温20 1.0wt%；蔗糖0.5wt%；羟基乙醇 1.0wt%；肌酸激酶 800 IU/L；氯化钠 0.9 wt%；余量为去离子水。

实施例5

本发明实施例5提供一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，含有以下成分：pH=7.1的PIPES缓冲液4wt%；小牛血清 5wt%；BSA 1.8wt%；氯化钙 0.1wt%；醋酸镁 0.1wt%；ADP1.5wt%；海藻糖 0.3wt%；甘油 0.5wt%；生物素-乙二胺0.1wt%；肌酸激酶 60 IU/L；氯化钠0.05 wt%；余量为去离子水。

实施例6

本发明实施例6提供一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，含有以下成分：pH=6.8的Tris-HAc缓冲液6wt%；小牛血清 8wt%；BSA 1.2wt%；氯化钙 0.5wt%；醋酸镁 0.5wt%；ADP1.2wt%；葡萄糖 0.5wt%；PEG6000 0.6wt%；生物素-乙二胺0.5wt%；肌酸激酶 200 IU/L；氯化钠 0.2wt%；余量为去离子水。

实施例7

本发明实施例7提供一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，含有以下成分：pH=6.8的Tris-HAc缓冲液6wt%；小牛血清 8wt%；BSA 1.2wt%；氯化钙 0.5wt%；醋酸镁 0.5wt%；ADP1.2wt%；葡萄糖 0.5wt%；甘油0.3wt%；PEG6000 0.3wt%；生物素-乙二胺0.5wt%；肌酸激酶200 IU/L；氯化钠 0.5 wt%；余量为去离子水。

实施例8

本发明实施例8提供一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，含有以下成分：pH=6.8的Tris-HAc缓冲液6wt%；小牛血清 8wt%；BSA 1.2wt%；氯化钙 0.5wt%；醋酸镁 0.5wt%；ADP1.2wt%；葡萄糖 0.5wt%；甘油0.3wt%；PEG6000 0.3wt%；生物素-乙二胺0.5wt%；Proclin3000.05wt%；肌酸激酶 200 IU/L；氯化钠 0.5 wt%；余量为去离子水。

实施例9

其与实施例1不同之处，在于添加的醇类为羟基乙醇。

实施例10

其与实施例1不同之处，在于添加的醇类为PEG6000。

实施例11

其与实施例1不同之处，在于添加的醇类为PEG8000。

对比例1

将肌酸激酶分散到去离子水中，肌酸激酶的含量为60 IU/L。

对比例2

将肌酸激酶分散到去离子水中，肌酸激酶的含量为200 IU/L。

对比例3

将肌酸激酶分散到去离子水中，肌酸激酶的含量为600 IU/L。

对比例4

将肌酸激酶分散到去离子水中，肌酸激酶的含量为800 IU/L。

测试本发明实施例1~实施例11及对比例1~对比例4制备的肌酸激酶保护基质在低温贮存下的稳定性。测试方法如下：将本发明实施例1~实施例11及对比例1~对比例4制备的肌酸激酶保护基质在4℃密封贮存7天，之后分别取各种保护基质40uL，各加入800uL的试剂Ⅰ（肌酸激酶液体双试剂，罗氏试剂），混匀后在37℃孵育5分钟，然后各加入200uL试剂Ⅱ（肌酸激酶液体双试剂，罗氏试剂），反应3分钟后连续监测2分钟内吸光度变化的速率，用辅酶Ⅱ的摩尔消光系数测定各个保护基质中肌酸激酶的活性，其中，以各个保护基质刚制备出来时的活性为100%，贮存保护基质以相对值表示。测定结果如表1所示。

从表1看到，实施例1~实施例4与对比例1~对比例4相比，肌酸激酶的水溶液在4℃贮存7天后的活性明显下降；而本发明实施例的肌酸激酶保护基质在4℃贮存7天后仍然具有相当高的活性，表明本发明的液态体系有助于肌酸激酶在液态贮存下的稳定性。实施例5、实施例6分别与实施例1、实施例2相比，表明在肌酸激酶的液态体系中添加生物素-乙二胺可以进一步增强肌酸激酶的稳定性。实施例7与实施例6相比，表明添加甘油与PEG的复合醇类比单一醇更利于肌酸激酶在液态体系中的稳定。实施例9、实施例10、实施例11与实施例1相比，表面添加单一醇类时，添加羟基乙醇的效果要优于添加其他醇类。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，其特征在于，含有以下成分：

缓冲液 4wt%~10wt%；

动物血清 5wt%~15wt%；

ADP 1wt%~2wt%；

BSA 1wt%~2wt%；

氯化钙 0.1wt%~1.0wt%；

镁盐 0.1wt%~1.0wt%；

糖类 0.1wt~1wt%；

醇类 0.1wt~1wt%；

肌酸激酶 40~900IU/L；

氯化钠 0.05wt%~1wt%；

余量为去离子水；

所述缓冲液为以下任意一种：PIPES缓冲液、Tris-HAc缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液；

所述糖类为以下至少一种：蔗糖、海藻糖、葡萄糖；

所述醇类为以下至少一种：羟基乙醇、甘油、PEG6000、PEG8000；

所述镁盐为以下至少一种：醋酸镁、硫酸镁、氯化镁；

所述动物血清为小牛血清或羊血清；

所述高稳定性的肌酸激酶保护基质的pH值为6.8~7.5。

2.如权利要求1所述的一种高稳定性的肌酸激酶保护基质，其特征在于，还包括生物素-乙二胺，所述生物素-乙二胺的含量为0.05wt%~0.5wt%。