JPS62118887A - クレアチンキナーゼ用対照及び標準血清の製法及び該血清 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はジスルフィド変性による、溶液の形のクレアチ
ンキナーゼの安定化法並びに安定化クレアチンキナーゼ
の使用法に関する。

従来技術 クレアチンキナーゼの測定は臨床化学分析において重要
である。この種の分析の対照及びクレアチンキナーゼ活
性の測定用自動分析装置の較正のために、既知クレアチ
ンキナーゼ活性含量を有する対照及び標準血清（Ｋｏｎ
ｔｒｏｌｌ−ｕｎｄＫｉｃｈｓｅｒｅｎ　）を提供する
ことは必要である。このことは対照もしくは標準血清中
の成分が所定の時間の間安定であり、かつこの時間の間
クレアチンキナーゼ活性があまシ変化しないということ
が前提である。更に、対照もしくは標準血清中に含有さ
れるクレアチンキナーゼは患者材料中に含有されるクレ
アチンキナーゼと同じ挙動を示すということも重要であ
る。

対照もしくは標準血清は通常人崩消、動物庇清又は牛崩
清アルブミンを基礎として構成される。良好な測定性及
び′８確性及び最適な装置較正を得るために、クレアチ
ンキナーゼ含量を外来クレアチンキナーゼ活性の添加に
より高めなければならない。

この外来クレアチンキナーゼ活性は対照庇清中で不安定
であるということはすでに公矧である。従って、対照崩
消中でのクレアチンキナーゼ活性を安定化するための実
験は多くなされている。酵素固有の不安定性のために、
酵素を含有する対照及び標準血清を貯蔵安定性改良のた
めに凍結乾燥させることは通常行なわれる。使用のため
には凍結乾燥対照及び標準血清を再構成する。一般に、
この再構成し、凍結乾燥物質から得られた溶液は比較的
短かい安定性を有し、この安定性はそれぞれのパラメー
ターにより約２４時間〜約５日間である。冷蔵庫温度で
の貯蔵は多くの場合前提である。一般に行なわれるよう
に、自動分析装置で同時、もしくは短時間の間隔で多く
のパラメーターに関して対照もしくは較正を行なう場合
、史に多くの制限がある。

この場合にはこの対照もしくは椋準血消七使用すること
のできる時間は最も短かい安定性を有するパラメーター
により決定される。

冷蔵庫貯蔵、すなわち温度２〜８°Ｃにおいて、液体媒
体中での長期安定性は少なくとも１年であるのがよい。

しかしながら今日まで、この出】題は解決さｆＬず、従
って浴液の形で存在し、ただちに使用可能であシ、かつ
充填物を開側した後も長時間、すなわち数週間冷蔵庫中
での貯蔵において安定である対照もしくは標準血清に対
する要求がある。

従って、再構成した対照もしくは標準血清の使用可能期
間を延長するための実験及び対照もしくは標準血清パラ
メーターの安定性を、凍結乾燥がもはや必斐でなくなる
まで改良するための実験が多くなされている。

こうして、Ｉ＃にチオ化合物の添加によりクレアチンキ
ナーゼを酸化から、こうして活性損失から守ることが実
験されている。チオール化合物の添加の欠点は、チオー
ル化合物は還元剤として、例えばＨ２Ｏ２の測定のため
の程色及応に影響を与えることにより分析法を妨げるの
でこのチオール化合物を含有する血清中で多くのパラメ
ーターを同時に測定することができないということであ
る〇 ヨーロッパ特許公開第００４５１２２号公報は、対照も
しくは標準血清中のクレアチンキナーゼ安定性の改良の
ために、好適な変性試薬、例えばジスルフィドによる酵
素の反応性８Ｈ−基の可逆的な変性が次式により可逆的
に変性することを記載している。

酵素サブユニット−８Ｈ＋Ｒ−８−８−１４（酵素サブ
ユニット）　−８−８−Ｒ＋Ｒ−８Ｈこのようにして酵
素の反応性日Ｈ−基は酸化及び他の崩渭阻害物質からｇ
ＩＡ＠される。

更なる可能性は西ドイツ国特許公開 第２８５６９８８号公報に記載されておシ、該方法にお
いては凍結乾燥対照又は標準血清をエチレングリコール
又は同族体約２０〜４０チの水溶液で列構成する。エチ
レングリコールは対照及び標準血清マトリックスの凝固
点を、該生成物を一２０℃で液体で貯蔵することができ
るようになるまで低下させる。この形で、酵素及び他の
パラメーターは生成物中で数ケ月以上安定である。低温
冷蔵庫から取シ出した後、該生成物を加温するとすぐに
使用できる。エチレングリコールは優れた殺菌剤である
ので、対照及び標準血清は冷蔵庫貯蔵において数週間安
定である。この方法で構成された生成物はデシジョン拳
コントロール（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　）
という市版名で売られている。しかしながらこの方法は
１大な欠点を有する。高含量のエチレングリコールによ
り、生成物は患渚崩清と同様に挙動しない。エチレング
リコールの高い粘度は対照及び標準血清のピペット採取
における挙動を変えるので、分析誤差が生じることがあ
る。史に、種々の分析的検出法はエチレングリコールの
添加により妨害される。この生成物はなおいくつかの欠
点を有するので、対照又は標準血清として一般的に使用
することができない。

その他の提案としては１アドバンシズ・イン・ビオケミ
カル・エンジニアリング（Ａａｖａｎｃｅａｉｎ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉａａｌ　１ｍｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　）　
”　、スプリンガー出版（Ｓｐｒ：Ｌｎｇｅｒ−’Ｖｅ
ｒｌａｇ　）　、第１２巻、１９７９年、第８３〜９０
頁に記載さｎておシ、ｒＩＩ索を炭化水素に結合させる
ことにより安定化する。しかしながら、この安定化は不
十分である。

更に、ヨーロッパ特許公開第００４９４７５号公報から
安定化のために、酵素を、官能基単位として鐸水物を有
するポリマーに共有結合させることが公知である。この
方法の欠点は、安定化反応の後、酵素のはじめの活性の
わずか約５〜１０チのみが保持されるということである
。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は冷蔵庫の温度で少なくとも１年間活性の
損失なしに貯蔵することができ、かつ充填容器を開封す
る際にも安定化のために凍結乾燥することなしに長時間
安定性であるようにクレアチンキナーゼを安定化するこ
とのできる方法を見い出すことである。史に、安定化さ
れたクレアチンキナーゼは液体の形で存在し、ただちに
使用可能であるのがよい。更に、本発明の目的は安定化
の際に活性がほぼ低下しないようにクレアチンキナーゼ
を安定化することである。

問題点を解決するための手段 この目的はクレアチンキナーゼを任意の順序で、 ＆）ジスルフィド又はチオスルホネートのモル過剰量と
反応させ、かつ ｂ）担体として水溶性炭化水素のモル過剰量と反応させ
ることを特徴とするジスルフィド変性によるクレアチン
キナーゼの安定化法により達せられる。

対照及び標準血清中のクレアチンキナーゼを２安定価工
程、すなわちジスルフィド交換によるＳＲ基の保護及び
水溶性炭化水素への固定による酵素安定化により、対照
もしくは標準血清中の酵素を液体の形で４〜８℃で重大
な活性低下なしに長期間貯蔵用能となるように安定化す
ることができるということが見い出された。溶液の形の
クレアチンキナーゼを添加物なしに安定化することがで
きるという点に本発明方法の大きな利点がある。こうし
て、公知法の欠点は克服された。

本発明によるクレアチンキナーゼの安定化法は次にあげ
た、任意の順序で適用すべき工程からなる： ａ）人又は動物組織から単離したクレアチンキナーゼを
ジスルフィド又はチオスルフォネートの過剰量と反応さ
せる。この際遊離したクレアチンキナーゼのＳＨ基はジ
スルフィドもしくはチオスルホネートと混合ジスルフイ
ドの形成下に反応する。この保護基は該当する対照又は
標準崩清を使用する時、公知薬剤を添加することにより
再び容易に切断され、酵素の活性は再び示される。

ｂ）クレアチンキナーゼを水溶性炭化水素の過剰量と反
応させる、有利に炭化水素を公知法で活性化する。この
活性化炭化水素にクレアチンキナーゼは共有結合する。

両方の工程ａ】及び１：ｌ）の順序は任意である。

しかしながら、はじめに８Ｈ基をジスルフィド又はチオ
スルホネートと反応させることにより保護し、引き続き
このように得られたクレアチンキナーゼジスルフィドを
活性化炭化水素と反一応させることが有利である。

本発明による方法に関しては種々の動物釉のクレアチン
キナーゼプレパ＼−トを使用することができる。こうし
てクレアチンキナーゼは家兎筋肉、豚筋肉、豚心揄、オ
ランウータンー骨格筋肉、ニワトリ筋肉、牛心臓又は他
のものから得られ九。本発明方法において家兎筋肉又は
ニワトリ筋肉からの又は豚心臓又は牛心臓からのクレア
チンキナーゼが有利である。

本発明による方法の工程ａ）を実施する際、クレアチン
キナーゼとジスルフイド又はチオスルホネートと反応さ
せる。ジスルフィドとしてハ有利にシスチン、ホモシス
チン、又はシスチン誘導体、ペニシリナミンジスルフィ
ド及び／又はビス−（２−ビリジルーＮ−オキシド）−
ジスルフィドを使用する。シスチン誘導体としテハ有利
にシスチンメチルエステル及びシスタミンを使用する。

ジスルフィド交換をＦｆｆ素対ジスルフィド１：５〜１
：２０のモル比Ｃ８Ｈ＆に関して）で使用する。

同様に、チオスルホネートとの反応も好適である。この
際、チオスルホネートとしてはメタンチオスルホン酸−
日一メチルエステルヲ使用する。チオスルホネートを酵
素対チオスルホネート１　：　０．５〜１　：　５のモ
Ａｚ比（ＳＨ基に関してンで使用する。

クレアチンキナーゼとジスルフィド又はチオスルホネー
トとの反応においては酵素は有利に０．０１〜１ｍ　ｍ
ｏｂ　／）溶液の濃度で存在する。

特に有利であるのは０．０５〜Ｑ、５　ｍ　ｍｏｌ　／
ｌの酵素濃度である。

本発明方法の工程ｂ）Ｉ／ｃおいては、クレアチンキナ
ーゼもしくはクレアチンキナーゼジスルフィドを水溶性
炭化水素に共有結合させる。

有利々炭化水素はデキストランである。しかしながら、
非常に良好な結果は他の水溶性炭化水素、例えば特に溶
Ｍ性デンプンでも達せられる。例えばエビハロゲンヒＦ
リンとの反応により得られた単及び二糖類の高分子ポリ
マー（例えばＦｉｃｏｌｌ■）も非常に好適であるとさ
れている。

最も有利な実施形においては、クレアチンキナーゼもし
くはクレアチンキナーゼジスルフィドは分子量４０００
〜５０００００の水溶性デキストランに共有結合される
。

クレアチンキナーゼと担体との反応において担体として
使用した炭化水素は水中に溶けて存在する。水溶液中の
担体の濃度は有利に１〜１０％の範囲である。

炭化水素を自体公知法で活性化する。活性化は有利に炭
化水素とトリクロルトリアジン、ブロムシアン又は１−
シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウム−テトラフ
ルオロボレートとの反応により行なわれる。凸性剤対炭
化水素の比は両方の成分の重量に関して１：５〜１：１
０の範囲が有利である。次いで、この活性化炭化水素を
クレアチンキナーゼと反応させる。

この際、酵素対炭化水素の比を、重量に関して１：１０
〜１：３０の範囲で使用するのが有利である。

本発明による両方の工程を実施することにより得らｎた
クレアチンキナーゼ誘導体はこの形で溶液中全く安定化
添加物なしに長期間、すなわち少なくとも１年間、４〜
８℃で、すなわち冷蔵庫中で保存することができ、この
際酵素の活性はほとんど変化しない。

ＳＨ基がジスルフィド交換により保鰻さねている、溶急
炭化水素に結合したクレアチンキナーゼの安定性を史に
改良するために、特に有利な実施形においては、酵素を
含有する溶液を充填し、引き続き不活性保眼ガスで覆う
。不活性保護ガスとしては９素が有利に使用される。一
定の炭酸塩／炭准水素塩−目標値が所望である場合、保
護ガスとして窒素及びＣＯ２からの浬合物を使用するの
が有利である。

本発明により安定化したクレアチンキナーゼ誘導体は対
照又は標準血清の製造に使用さｎる。

クレアチンキナーゼ活性の測定のためには、酵素のＳＨ
基保ｔのために導入したジスルフィド橋を再び切断しな
ければならない。このことは自体公知法でチオール化合
物の添加により行なわれる。り１／アチンキナーゼ活性
の公知測定法においては一般にチオール化合物が添加さ
１、このチオール化合物は試料中に酸化されているか又
は抑制された形で存在するクレアチンキナーゼ酵素の凋
活跣化に働らく。試薬中に含有されるチオール化合・ノ
吻は、本発明により得らまた安定なりレアチンキナーゼ
誘導体をテスト実施のためめ所定の時間内（Ｃ活性鵠導
体に完全に変換するために十分である。この際チオール
化合物としては有利にＮ−アセチルシスティンを使用す
る。

クレアチンキナーゼ測定のための対照又は標準血清の製
造において、好適なマトリックスが違択さｎる。通常、
人崩清、動物崩潰又は純粋な蛋白溶液をベースとする対
照及び標準用血清を常法で構成する。このマトリックス
に本発明ニヨ）製造した、安定化クレアチンキナーゼ誘
導体を使用目的に好適な活性で添加する。更に、対照血
清の製造のために常用の添加物、例えば保存剤及び／又
は抗生物質を添加する。対照又は標準血清はこの形で４
〜８℃で貯蔵することができる。対照又は標準血清を沫
結乾燥させ、次いで使用するために水で再構成すること
もできる。

対照又は標準血清の製造用マトリックスとして人崩渭又
は動物血清を使用する場合、血清中に内因的に含有され
る酵素活性を好適な処置によりネ活性化することは有利
である。この際、血清中の残留活性を、後に対照又は標
準血清中に所望な活性の３チ以下となるように低下させ
ることが特に有利である。

対照又は標準血清の製造のためには純粋な蛋白質溶液を
使用するのが特に有利であり、この組成は対照又は伸率
用材料の所望の利用目的により調節される。釉々の異な
る測定のための標準として使用することのできる、全般
的に使用可能な対照血清の製造のためには、すべての生
な酵素、基質及び代謝産物を蛋白質溶液に添加する。脂
質は好適な脂質フラクションの添加により増加する。

対照又は標準血清を液状で長時間貯蔵すべき時、血清を
菌による汚染に対して十分に保存するのが特に有利であ
る。このためには、有利に貯蔵のための瓶中に充填する
前に該浴液を録画又は少なくとも僅少菌数に濃過するが
、この際、孔径≦０．２μｍの蓼過膜を使用する。次い
で、加液に保存剤を添加する。特に、ナトリウムアジド
を使用するのが有利である。抗生物質、例エバクロラム
フェニコール、デンタマイシン及び／又はペニシリンは
崩消の保存に好適である。

本発明のもう１つの訴題は、クレアチンキナーゼをその
ジスルフィド又はチオスルホネートとの反応生成物の形
で、かつ水溶性炭化水素に結合させて含有するクレアチ
ンキナーゼ測定用対照又は標準血清である。

対照もしくは標準血清が活性５０〜１０００Ｕ／、ｙ（
２５℃）のクレアチンキナーゼを含有しているのが有利
である。１５０〜６００　Ｕ／ｌｘｌの活性を有するク
レアチンキナーゼを使用するのが特に有利である。

本発明により安定化したクレアチンキナーゼは、酵素ク
レアチンキナーゼがジスルフィド又はチオスルホネート
との反応生成物の形で、かつ水溶性炭化水素に結合して
存在することを特徴とする。この本発明によるクレアチ
ンキナーゼは特にクレアチンキナーゼの測定のための対
照及び標準血清を製造するために好適である。

安定化した可溶性クレアチンキナーゼ誘導体を有する本
発明によＩ）製造した対照もしくは標準血清は４〜８℃
で少なくとも１年は安定である。本発明による該血清は
液状で冷蔵庫温度においても、凍結乾燥した形において
も貯蔵することができる。凍結乾燥した対照もしくは標
準血清は水又は好適な希釈剤での再構成の後も長時間安
定である。

実施例 次に実施例につき本発明の詳細な説明する。

本発明により得られたクレアチンキナーゼ誘導体を熱負
荷実験により判定した。このためには対照又は標準液体
試料を十分に開じ、５５°Ｃで貯蔵する。６５℃で１．
２．６及び６週間貯蔵した後、活性を測定し、負荷の開
始時でのクレアチンキナーゼ活性と比較する。３５℃で
貯蔵した試料の検出が３週間後、なお少なくとも９０チ
を示すならば、対照及び標準血清の酵素活性は冷Ｒ庫で
の貯蔵に関して少なくとも１年間は安定であることを示
す。

例１ Ａ）安定クレアチンキナーゼ誘導体の製法家兎筋肉−ク
レアチンキナーゼ１６４ｍＷを１ノあたシシスチン２ｍ
　ｍｏｂを含有する炭酸塩緩衝液（１０ｍＭ、　ｐＨ８
，０ン２０ｄＩＣ治かし、室温で１時間数置する。炭酸
塩緩衝液（１０ｍＭ。

ｐＨ８，０）に対して透断を行なう。

デキストランＴ４０　６＆を水４０＋ａｊ中に溶かし、
水浴中で士Ｏ℃に冷却する。低温冷却したジメチルホル
ムアミド１０ｄ中に２．４．６−トリクロルー１．５．
５−）リアジン６００〜を溶かし、配合物に務加する。

ｐ１４佃を０．５ＮＮａＯＨを添加することにより５．
ＯＫａ節し、保持する。反応の終了後、すなわちＰＩ（
変化がおこらなくなった時、活性化デキストランをその
都度容積２倍過剰量の低温冷却アセトンで沈殿させるこ
とにより精袈する。アセトン沈殿をその都度氷水で溶か
す。

クレアチンキナーゼ溶液（１ｄあた９蛋白質約８．６１
１１９ン部分址をトリクロルトリアジン活性化デキスト
ラン溶液（１７，２１ｎ９／ｄ　Ｊ同容積と混合する。

該溶液を２４時間室温で放置する。

その・鎌、グリシン緩衝液（ＩＭ、ｐＨ８，０Ｊ１０容
量−を添加し、該溶液を新たに１夜放置する。

比較のために、８Ｈ基が保護されていない、新たｒＣ製
造した家兎筋肉−クレアチンキナーゼ溶液を、前記のよ
うに直接活性化デキストランＴ４０に結合する。ここで
も蛋白質対デキストランの比は１：２である。

杓活性化司能なりレアチンキナーゼ活性の収量は次のよ
うである：シスチンとの反応によるＳＨ−保騙後９２チ
及びシスチンによるＳＨ−保護及びデキストランＴ４０
への固定の後ろ４％。

Ｂ）対照及び標準血清の製造 対照加消のためのマトリックスは６％十鹿沼アルブミン
溶液である。全般的な対照もしくは標準血清の製造のた
めにはすべての主要な酵素（例えば、α−アミラーゼ、
ＡＰ、　ＧＯＴ％ＧＦＴ　。

ｒ−ＧＴ、　ＬＤＨ，ＨＢＤＨ，リパーゼ）、基質（脂
質又は脂質７ラクシヨン）、代謝物質（例えば、アルブ
ミン、クレアチニン、グルコース、尿素、尿酸、コレス
テリン、燐脂質、トリグリセリド〕及び電解質（例えば
、Ｎａ、に、Ｏａ、Ｌｉ、Ｆｅ。

Ｍｇ、Ｃ１、燐酸塩）を該蛋白質溶液に添加する。

脂質？好適な脂質フラクションを添加することにより増
量する。対照又は積率ｍ渭のｐＨ（ｉＪを約７．０　Ｋ
關節する。

菌による汚染のない液状で対照又は標′ｆｓ鹿消を長期
間保存するためには、対照崩清マトリックスを孔径肌２
μのフィルター膜で濾過して菌を僅かにし、１）あた９
ナトリウムアジＦ　２５０■及び１Ｊあたシダ９ンタマ
イシン１００■を添加して保存する。

該対照薄情マド１１ツクスにそれぞれ次のものを添加す
る； ＆）！兎筋肉クレアチンキナーゼ、天然ｂ）家兎筋肉ク
レアチンキナーゼ、５Ｉ（Ｓをシスチンで保製、 ０）　　）リクロルトリアジン活性デキストランＴ４０
に共有結している、ＳＨ基を保護していない家兎筋肉タ
レアチンキナーゼ、 ｄ）　　ＳＨ基をシスチンで保護し、トリクロルトリア
ジン活性化デキストランＴ４Ｄに共有結合している家兎
筋肉クレアチンキナーゼ。

すべての崩清に関して、クレアチンキナーゼ活性を約５
００　Ｕ／ｌに調節する。こｎら４つの対照もしくは標
準鹿沼に関して、熱負荷の安定性実ｙＩｌ！：と行なう
。個々の溶液を小さい瓶中に５−まで充填し、十分に密
閉し、３５℃で液状で貯蔵する。クレアチンキナーゼ活
性全毎週、５〜６週間の量測定し、負荷の最初のクレア
チンキナーゼ活性と比較する。

クレアチンキナーゼ活性を臨床化学に関するドイツ協会
（ｄｉｅ　ｄｅｕｔｓｃｈａ　（）ｅｓｅｌｌａａｈａ
ｆｔ　ｆｕｒｋＬｉｒａｉｓｃｈｅ　Ｏｈｅｍｉｅ　）
の推奨する最適ｆ７ｊＡｓ法（０１１ｎ、Ｏｈｅｍ、第
２２巻、１９７６年、第６５０〜６６２ｊｊ）により２
５℃で測定する。

４つの対照崩清の負荷試駆の結果を第１図中にまとめる
。前記４つのクレアチンキナーゼプレバレートの負荷後
の活性度（％）を、負荷後ｔり活性度を負荷前の出発活
性度で割、ｊ５．１００をかげたもの（％）として表わ
す。

例２〜６ 例１に記載さｎているように実施する。シスチンのかわ
９に次のジスルフィドを例１におけると同様に、同じ濃
度（２ｍ　Ｍｏｌ　／ｌンで使用する。

シスタミン シスチンメチルエステル ホモシスチン ペニシラミンジスルフィド及びＷＸ＼ α−（２−ビリジルーＮ−オキシド）ジスルフィド。

個々の５Ｉ（−保圓クレアチンキナーゼ（ａＸ）　−プ
レバレートをトリクロルトリアジン（ＴＯＴ）　−デキ
ストランＴ４Ｑに個定し、対照もしくは標準液中に装入
した後、３週間負荷後の安定性をＳＨ−保獲成分として
のシスチンに比較して測定する。結果は次の表及び第２
図から明らかである。第２図は例中に記載したＯＫ一対
照もしくはａ準加液の負荷試験における安定性を示す。

シスチン　　　　　　　　　　　　　６７シスタミン　
　　　　　　　　　　　２７シスチンメチルエステル　
　　　　　　　　２６ホモシスチン　　　　　　　　　
　　６４ペニシラミンジスルフイド　　　　　　　　　
３０例７ 安定化ａＸの製造、しかしこの際８Ｈ保設を例１〜６に
記載したようにジスルフィド交換によるのではなく、チ
オスルホネートとの反応により行なう。

家兎筋肉−０Ｋ１７■をグリシン緩衝液（１０ｍＭ、　
ｐ）１７．８　）　２＊中に浴かし、メタンチオスルホ
ンＭ−８−メチルエステル浴液（グリシン緩衝液１Ｑｍ
Ｍ中２０　ｍｍ、　ｐ）１７．８　）　５０μノと０℃
で３０分間反応させる。

セファデックスＧ２５−カラムの精製を行ない、炭酸塩
緩衝液ｐｌ（８，０，１０ｎＭに対して透析し、得られ
たｃＫ−Ｍ導体を例１と同様にしてＴＯＴ−活性化デキ
ストランＴ４０に固定する。

６週間の負荷後、例１〜６により製造した対照／標準鹿
沼中のＯＫ−活性は５８％である。

例８〜１１ 種々の動物種のＯＫ−プレバレートを使用する。Ｅｌ　
Ｈ−Ｎ　ａｓデキストランへの固定及び対照又は標準穐
清の製造を例１により実施する。

液体対照血清を３５°Ｇで３週間貯蔵した後の開始時活
性度の検出は、使用したＯＫ−プレバレートにおいて次
のようである： ６５℃貯′＃、３週間後 ０に″諒　　　　　　の活性（チ） 家兎筋肉　　　　　　　　　　　　３７豚筋肉　　　　
　　　　　　　　５２ 豚心臓　　　　　　　　　　　　　５７オラン・ウータ
ン骨格筋　　　　　　４９ニワトリ筋肉　　　　　　　
　　　４２例１２ 天然もしくはＳＲ保穫された家兎筋肉−ＯＫを使用する
。

ＥｉＨ−保護は例１に示したように、シスチンとの反応
により行なわれる。

酵素の固定はＢｒ０Ｎ−活性化デキストランＴ４０で行
なうが、この際主にマーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ　）
により記載された標準法（活性化及び固定化）を使用す
る（　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｏｈｅｍ−１ｃａｌ　５ｏｃ
ｉｅｔｙ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　８ｅｒｉｅａ第１２３
巻（１９８０年）、第１２５〜１４０頁】。

Ｂｒ０Ｎ対デキストランの比は１：３である。蛋白質対
デキストランの比は１：６である。

再活性化可能なりレアチンキナーゼ活性の収率は次のよ
うである：ＳＨ保護酵素に関して（シスチンとの反応後
）９２％、８Ｈ−保護され、かつデキストランに固定さ
れた酵素に関して６２％及び天然で、デキストランに固
定された酵素６４％。

例１と同様にして、対照血清マトリックスにそｊぞれ次
のものを約５００　Ｕ／ｌ酢加する：ａ）家兎筋肉−Ｏ
Ｋ、天然 ｂ）シスチンによりＳＨ−保護された家兎筋肉０Ｋ ｃ）ＳＨ保護はされていないが、ＢｒＣＮ活性化デキス
トランＴ４０に固定された家兎筋肉−ＯＫ ｄ）シスチンによりＳＨ−保護され、かつＢｒＣｊＮ活
性化デキストランＴ４０に固定された家兎筋肉−ＯＫ 第２図は負荷試駆の結果を示す。

例１３ 天然及びＳＨ−保設家兎筋肉一〇Ｋｆ使用する。ＳＨ−
株数を例１によりシスチンとの反応により行なう。

酵素の固定は、Ｔ、Ｊ、　マーシャル（Ｍａｒｇｈａｌ
ｌ、　）（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏ
ｃｉｅｔｙ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｓｅｒｉｅｓ　Ｈ１２
３巻、１９８０年、第１２５〜１４０頁）によりブキス
トランＴ４０で行なう。

このデキストランＴ４０はＪ、コーン（Ｋｏｈｎ　）及
びＭ、ウィルチェック（ＷｉｌＯＭｋ　）　（ＡＰＩ）
１゜Ｂｉｏａｈｅｍ、　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　）、第９巻
、１９８４年、第２８５〜３０５頁によ５０ＤＡＦ−Ｂ
Ｐ、で活性化さｎたものである。

例１と同様にして対照血清マトリックスにそｎぞれ次の
もの１約５００　Ｕ／ｌ添加する：ａ）家兎筋肉−ＯＫ
、天然、 ｂ〕　シスチンによ＃）ｓＨ−保掻さｎた家兎筋肉、ｃ
）ＳＨ−保護はされていないが、０ＤＡＰ−活性化デキ
ストランＴ４０に固定された家兎筋肉−ＯＫ。

（１３０ＤＡＰ−活性化デキストランＴ４０に固定され
たＳＨ−保護家兎筋肉−〇に０ 対照鹿沼瓶の１部を付加的に窒素（保欣ガス雰囲気）で
覆う。

第３及び第５ａ図は、他の例と向禄に対照血清を！１５
°Ｃで液体で貯蔵する際の負荷実験の結果を示す。第６
ａｈはａＫ−安定化への個々の処置の相乗作用を示す。

例１４ 例１３に記載したように実施する。ＳＨ保護家兎筋肉−
０Ｋ（シスチンによる８Ｈ−保護）を使用し、蛋白質対
デキストランの比を１：３〜１：２０で変化させる。

蛋白質対デキストラン比に依存する８Ｈ保膜され、デキ
ストランＴ４０に固定された酵素プレバレートの活性収
率を次の表中にまとめる。

蛋白質：デキストラン　　　活性度収率の比　　　　　
　　（開始時活性度％）１　　：３　　　　　　　　　
　６５ １　　：６　　　　　　　　　　５４ １：１０”　　　　　　　　　５５ １　　：２０　　　　　　　　　４８ 第４図は負荷実験の結果を示す。対朋鹿沼プレバレート
を空気雰囲気下に３５℃で液体で貯蔵する。

例１５及び１６ 独々の動物種のＯＫ−プレバレートを使用する。８　Ｈ
−保護及びデキストランの固定は例１３によフ実施する
。

空気雰囲気下に３５℃で液体の対照自消を３週間貯蔵し
た後、開始時活性の検出は個々の酵素に関して約７０チ
である。

活性度収率　　　３５℃で３週間後 ＯＫ−源 （開始時活性度の％）　　の活性度（％）家兎筋肉　　
　　６５　　　　　　７１豚心臓　　　　　５９　　　
　　　７２牛心臓　　　　　６１　　　　　　７１例１
７ 固定していない、天然家兎筋肉−ＯＫ、ＢＥ（−保護を
有する家兎筋肉−０Ｋ（シスチンで変換）及びＴＯＴ％
Ｂｒ０Ｎ及び０ＤＡＰにより水溶性デキストランＴ４０
に固定された、天然家兎筋肉−０ＩＣ，８Ｈ−保護を有
する家兎筋肉−ＯＫをそれぞれ新鮮人侮消１００ゴに溶
かす。ＯＫ−活性を３００〜６００　Ｕ／ｌに調節する
。

安定なａＸ−誘導体の製造は例１．１２．１３もしくは
１４により行なわれる。蛋白質：デキストランの比は１
：１０もしくは１：２０を使用する。

必要であれば、すべての主要な酵素、基質及び代謝産物
を回ａＫ添加し、′全般的”対照もしくは檄珈薄情が得
られる。

対照薄情のｐ）１値は２　ＮＨＣノで約６．０に調節す
る。

得られた溶液を透明に濾過し、瓶中に４ｄの量で充填し
、かつ凍結乾燥する。＠！結乾燥試料を冷蔵庫ｆＡ度で
貯蔵する。

試料の１部を３５℃で３過間保持する。安定性を試験す
るために、温度負荷及び温度非負荷試料中のＯＫ−活性
を水４ｗＩで再構成した後で測定する。

対照／標準崩消の…値は、水でプレバレートを再構成し
た後約７．０である。負荷試料中のＯＫｉ性（％）の検
出を非負荷試料と比較し第１表に記載した。

試料の１部を水で再構成した後、これに保存、のために
ナトリウムアジド２５０１ｎ９／ｌ及びｒフタマイシン
１００■／ｌｔ−添加Ｌ、３ｄ間４℃で貯蔵する。種々
の試料中のａＸ−活性を毎週測定し、貯蔵試料中のＯＫ
−活性の検出（％）を開始時の値に比較して第１表に示
す。

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明による実施例の結果を示すグラフ図で
ある。第１図は実施例１に記載したＯＫ一対照もしくは
標準通渭プレバレートの負荷試験における安定性を示し
、縦軸に活性度、横軸に６５℃における貯蔵期間（週ン
を示す。 第２図は実施例２に記載したａＸ一対照もしくは標準薄
情プレバレートの負荷試験における安定性を示し、第１
図同様縦軸に活性度、横軸に３５℃における貯蔵期間（
週）を示す。第３図は実施例１３に記載されたＯＫ一対
照もしくは標準崩清ゾレパレートの負荷試験における安
定性を示し、♀素被覆による影響を示している。 第３ａ図はＯＫ−安定化のための個々の処置の相乗作用
を示す。ＷＯは週間の略語である。第４図は例１４に記
載したＯＫ一対照もしくは標準薄情ゾレパレートの安定
性を示し、安定化ＯＫ−誘導体の製造の際に蛋白質対デ
キストランの比を変化させる（１　：３．１　：６．１
　：ＦＩＧ、１ 大ＣＫ　／　５Ｅ（−保護及びｐ　Ｃ７−ゾキストラ／
同定ＦＩＧ　、　２ 寛ＣＫ／３Ｆ（−保護及び固定Ｂ二ＣＮＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クレアチンキナーゼを任意の順序で、 ａ）ジスルフイド及び／又はチオスルホネートのモル過
   剰量と反応させ、かつ ｂ）担体として水溶性炭化水素のモル過剰量と反応させ
   ることを特徴とするジスルフイド変性によるクレアチン
   キナーゼの安定化法。 ２、ジスルフイドとしてシスチン、ホモシスチン、シス
   チンメチルエステル及び／又はシスタミンを使用する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、チオスルホネートとしてメタンチオスルホン酸−ｓ
   −メチルエステルを使用する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ４、酵素を０．１ｍｍｏｌ／ｌの濃度で使用する特許請
   求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の方
   法。 ５、炭化水素をトリクロルトリアジン、ブロムシアン又
   は１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウム−テ
   トラフルオロボレートで活性化する特許請求の範囲第１
   項から第４項までのいずれか１項記載の方法。 ６、酵素対炭化水素の比が重量に関して１：１０〜１：
   ３０である特許請求の範囲第１項から第５項までのいず
   れか１項記載の方法。 ７、炭化水素としてデキストランを使用する特許請求の
   範囲第６項記載の方法。 ８、分子量４０００〜５０００００のデキストランを使
   用する特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、家兎筋肉から単離されたクレアチンキナーゼをシス
   テインと反応させ、引き続き１−シアノ−４−ジメチル
   アミノ−ピリジニウム−テトラフルオロボレートで活性
   化した水浴性デキストランと反応させ、この際蛋白質対
   デキストランの比は１：２０である特許請求の範囲第１
   項から第８項までのいずれか１項記載の方法。 １０、安定化クレアチンキナーゼ溶液を不活性　保護ガ
   スで覆う特許請求の範囲第１項から第９項までのいずれ
   か１項記載の方法。 １１、不活性保護ガスとして窒素を使用する特許請求の
   範囲第１０項記載の方法。 １２、ジスルフイド又はチオスルホネートとの反応及び
   水溶性炭化水素との反応により得られたクレアチンキナ
   ーゼ誘導体を好適なマトリックスに添加し、かつ該溶液
   を場合により好適な保存剤及び／又は殺菌剤の添加によ
   り安定化することを特徴とするクレアチンキナーゼを測
   定するための対照及び標準血清の製法。 １３、クレアチンキナーゼをジスルフイド又はチオスル
   ホネートとの反応生成物の形で、かつ水溶性炭化水素に
   結合させて含有するクレアチンキナーゼ測定用対照又は
   標準血清。 １４、クレアチンキナーゼの活性が５０〜１０００Ｕ／
   ｌである特許請求の範囲第１６項記載の対照又は標準血
   清。