DE19627075A1 - Modifizierte Lactatdehydrogenase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents
Modifizierte Lactatdehydrogenase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre VerwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine modifizierte alkalistabile
Lactatdehydrogenase, ein Verfahren zu ihrer Herstellung
und ihre Verwendung in Testreagenzien, insbesondere zur
Lactat- und Alanin-Aminotransferasebestimmung
Lactatdehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27 und EC 1.1.1.28)
ist eine Oxidoreduktase (MG 100.000-150.000), die in
verschiedenen Organen (Leber, Herz) und in Muskeln von
Säugern sowie in verschiedenen Mikroorganismen, wie z. B.
Lactobacillus, Bacillus stearothermophilis und Pedio
coccus vorkommt und die Gleichgewichtsreaktion
Pyruvat + NADH + H⁺ ↔ Lactat + NAD⁺
katalysiert, wobei NAD⁺ und NADH Nikotinamid-adenin
dinucleotid in seiner oxidierten bzw. reduzierten Form
bedeutet. Diese Reaktion ist im anaeroben Stoffwechsel
(z. B. im arbeitenden Muskel und bei Milchsäurebakterien),
zur Regenerierung des in der Glycolyse benötigen NAD⁺ von
Bedeutung. LDH findet in der enzymatischen Analyse in ge
koppelten optischen Tests Verwendung, z. B. zur Bestimmung
von Lactat gemäß obigem Reaktionsschema, wobei die Um
setzung von Lactat zu Pyruvat bevorzugt im alkalischen
pH-Bereich < 8,5 durchgeführt wird, die Umsetzung von
Pyruvat zu Lactat dagegen bei einem pH-Wert < 8,0 statt
findet. Zum anderen ist LDH von Bedeutung zur Bestimmung
von Alanin-Aminotransferase (EC 2.6.1.2, ALAT, alte Be
zeichnung GPT) im Serum, Plasma oder Blut nach dem
Reaktionsschema.
In den derzeitigen kommerziellen Testreagenzien zur Be
stimmung von GPT wird in einem Reagenz (R1) ein Gemisch
aus LDH und NADH als Lyophilisat bzw. Granulat angeboten,
in einer getrennten Lösung ist das α-Ketoglutarat als
Startreagenz (R2) enthalten. Das LDH und NADH enthaltende
Lyophilisat oder Granulat R1 wird erst kurz vor der Mes
sung im Testpuffer gelöst. Da die GPT-Bestimmung bei
einem pH-Wert von 7,5 bis 7,8 durchgeführt wird, NADH
aber erst oberhalb eines pH-Wertes von 8,5 in Lösung über
einen längeren Zeitraum stabil ist, ist die Haltbarkeit
der rekonstituierten Lösung sehr begrenzt.
Daneben erfordert die Herstellung solcher Reagenzien
einen erhöhten Kosten- und Materialaufwand, der durch
Lyophilisations- oder Granulierschritte unter Verwendung
von für die Funktion des Reagenzes an sich nicht rele
vanten galenischen Hilfsstoffen sowie durch einen zusätz
lichen Packmittelbedarf bedingt ist. Das in dieser Form
angebotene Reagenz entspricht nicht mehr dem aktuellen
Standard, auch sind beim Rekonstituieren des Lyophilisats
Handlingsfehler nicht ausgeschlossen.
Andererseits werden die Kombinationsmöglichkeiten der
Testreagenzien zur Bestimmung von GPT dadurch einge
schränkt, daß die LDH-Präparate eine α-Ketoglutarat-DH-
Nebenaktivität aufweisen, und somit die LDH nicht zusam
men mit dem α-Ketoglutarat in einem Reagenz untergebracht
werden kann. Weiter ist das α-Ketoglutarat bei einem pH-
Wert < 8,5 aufgrund von Hydrolyse instabil, wogegen die
NADH erst oberhalb dieses pH-Wertes im Flüssigreagenz
über einen längeren Zeitraum genügend stabil ist.
Bedingt durch die pH-Inkompatibilität der LDH und der Co-
Faktoren könnte die Herstellung von ausschließlichen
Flüssigreagenzien derzeit nur durch die Bereitstellung
drei verschiedener Reagenzien (LDH, α-Ketoglutarat und
NADH als Einzelreagenzien) realisiert werden, die der
Nutzer vor der Anwendung zur vereinigen hat, da die
meisten Analysenautomaten lediglich die Pipettierung von
zwei verschiedenen Reagenzien erlauben. Auch diese ge
brauchsfertigen Lösungen besitzen nur eine sehr begrenzte
Haltbarkeit.
Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein Testreagenz zu
entwickeln, das eine gebrauchsfertige Lösung aus LDH und
NADH umfaßt und über einen Zeitraum von mindestens 12
Monaten lagerstabil ist. Aus NADH-Stabilitätsgründen
setzt dies voraus, daß auch die verwendete LDH bei einem
pH-Wert < 8,5 in Lösung ausreichend stabil ist, so daß
die Funktionsfähigkeit des Flüssigreagenzes über diesen
Haltbarkeitszeitraum erhalten bleibt. Aufgabe der Erfin
dung war es deshalb auch, eine bei pH-Werten < 8,5 in
Lösung bei Kühlschranktemperaturen alkalistabile LDH zur
Verfügung zu stellen.
Es wurde gefunden, daß die Aufgabe der Erfindung mit
einer modifizierten LDH gelöst werden kann, die zum einen
kovalent an ein wasserlösliches aktiviertes Polysaccharid
gebunden ist und gleichzeitig intramolekular vernetzt
ist. Im Sinne der Erfindung sind wasserlösliche Poly
saccharide, Dextrane, Stärken, Zucker oder synthetische
Zuckerpolymere. Bevorzugt wird die LDH an Dextrane ge
bunden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
besteht darin, daß die LDH an ein mit 1-Cyano-4-dimethyl
amino-pyridiniumbromid (CDAP-Br) aktiviertes Dextran
kovalent gebunden und gleichzeitig intramolekular ver
netzt wird. Die intramolekulare Vernetzung erfolgt erfin
dungsgemäß bevorzugt über Triethanolamin.
Modifizierte, bei pH-Werten < 8,5 alkalistabile LDH ist
bisher nicht bekannt. Die in der Literatur beschriebenen
Modifizierungen durch Vernetzung mit Glutaraldehyd (Bio
technology and Applied Biochemistry, 9 (1987) 389-400),
durch Acetamidierung (Biochimica et Biophysica Acta, 484
(1977) 1-8) oder als Dextran-Konjugat zusammen mit
Hexamethylendiamin (J. Fac. Agric. Kyushu Univ., 38
(1993) 1-2, 111-117) liefern nicht die erfindungsgemäße
Alkalistabilität der LDH.
Die LDH für die Erfindung wird aus einem Säugetierorgan,
bevorzugt aus Herz und insbesondere bevorzugt aus
Schweineherz gewonnen. Es zeigte sich, daß die mikro
biellen LDH′s - obwohl sie generell etwas stabiler sind
als die Enzyme aus Säugetierorganen - eine um den Faktor
10 höhere Michaelis-Konstante Km gegen Pyruvat und NADH
besitzen, was für die Transaminasebestimmung nachteilig
ist. Die erfindungsgemäße LDH besitzt einen, dem entspre
chenden Enzym aus Säugetierorganen analogen vorteilhaften
niedrigen km-Wert.
Die LDH-Isolierung aus Schweineherz erfolgt nach an sich
bekannten Methoden, so z. B. nach Jaenicke, R. und R.
Rudolph, FEBS Symp. 49, 351-367 (1977) und Storey, K.B.,
Comp. Biochem. Physiol., 56, 181-187 (1977).
Durch die erfindungsgemäße Modifizierung von LDH aus
Schweineherz mit aktiviertem Dextran und Triethanolamin
als Neutralisationsbase wird eine LDH erhalten, die in
Lösung eine Langzeitstabilität von mindestens 12 Monaten
bei einem pH-Wert < 8,5 besitzt und im Vergleich zu unmo
difizierter LDH aus Mikroorganismen oder Säugetierorganen
eine um ein Vielfaches höhere Restaktivität aufweist.
Insbesondere hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäße
LDH in einem pH-Wert-Bereich von ca. 9,0 bis 10,0 eine
akzeptable Stabilität aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Her
stellung modifizierter alkalistabiler Lactatdehydroge
nase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in an sich be
kannter Weise eine wäßrige, ein aktiviertes Polysaccharid
enthaltende Lösung zunächst mit einem Vernetzungsmittel
inkubiert und anschließend mit einer Lactatdehydrogenase-
Lösung versetzt und inkubiert wird. Gemäß der Erfindung
wird das Polysaccharid in Wasser gelöst, die Lösung ge
kühlt (vorzugsweise auf Temperaturen zwischen 1°C bis
10°C) und anschließend das Polysaccharid durch Zugabe des
Aktivierungsmittels aktiviert. Sofort nach Auflösung des
Aktivierungsmittels wird die Lösung des Vernetzungs
mittels zugegeben und unter Kühlung inkubiert. Zur wei
teren Umsetzung mit der LDH-Lösung wird das kalte Reak
tionsgemisch dann auf Umgebungstemperatur erwärmt.
Die erfindungsgemäß hergestellte, modifizierte LDH ist
aufgrund ihrer Alkalistabilität zur Verwendung in Test
reagenzien hervorragend geeignet. Insbesondere kann die
erfindungsgemäß modifizierte LDH in Testreagenzien zur
Bestimmung von Lactat bzw. von Reaktionsfolgeprodukten,
die über den Schritt der Lactatbildung führen, und in
Testreagenzien zur Bestimmung von Alanin-Aminotransferase
Verwendung finden.
Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch Testreagen
zien, die eine erfindungsgemäß modifizierte, alkalista
bile LDH neben üblichen Puffern und gegebenenfalls an
deren Hilfs- und Zusatzstoffen enthalten. Insbesondere
läßt sich mit der erfindungsgemäßen modifizierten LDH ein
Flüssigreagenz zur Verfügung stellen, das eine lager
stabile wäßrige Lösung mit einem pH-Wert < 8,5, bevorzugt
ca. 9,0 bis 10,0, umfaßt, die die erfindungsgemäß modifi
zierte LDH und NADH enthält. Diese Lösung ist ohne die
aufwendige Lyophilisation und Granulierung auch nach 12
Monaten voll einsatzfähig. Insbesondere zur Bestimmung
von Alanin-Aminotransferase kann damit ein Flüssigrea
genzkonzept realisiert werden, das zum einen eine ge
brauchsfertige alkalistabile Lösung mit LDH und NADH
umfaßt und zum anderen das α-Ketoglutarat als Einzelrea
genz in einem Puffer mit einem für die GPT optimalen pH-
Wert von 7,5 bis 7,8 zur Verfügung stellt. Damit wird ein
gebrauchsfertiges Testreagenz zur Bestimmung von Alanin-
Aminotransferase zur Verfügung gestellt, das zwei Flüs
sigreagenzien umfaßt, die keine weiteren Arbeitsschritte
zum Herstellen von Testlösungen vom Anwender erfordern,
wodurch Handlingsfehler vermieden werden.
Anschließend soll die Erfindung an Beispielen näher er
läutert werden, ohne sie darauf einzuschränken.
2,0 g Dextran T40 (Fa. Roth) werden in 40 ml dest. Wasser
gelöst und auf 2 bis 6°C gekühlt. Unter Rühren werden
667 mg CDAP-Bromid zugegeben und gelöst. Anschließend
wird sofort 8 ml einer 0,2 M Triethanolaminlösung zugege
ben und 10 min bei 2 bis 6°C unter Rühren inkubiert. Der
pH-Wert des kalten Reaktionsgemisches wird am Ende der
Inkubation mit einer 1 M Kaliumdihydrogenphosphatlösung
sofort auf 7,6 eingestellt und anschließend auf 20 bis
25°C erwärmt.
Die aktivierte Dextranlösung wird mit 50 ml einer LDH-
Lösung in 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH = 7,6 (20 mg/ml
Protein enthaltend, LDH aus Schweineherz) vereinigt und
unter Rühren 2 h bei 20 bis 25°C inkubiert. Anschließend
wird die Polymerisationsreaktion mit 2,5 ml einer 1 M
Lysinhydrochloridlösung abgestoppt und das Reaktionsge
misch gegen 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH = 7,6 dialy
siert.
Das Dialysat wird mit 2,0 g Mannit versetzt, über einem
0,22 µ-Membranfilter keimarm filtriert und lyophilisiert.
Die Aktivitätsausbeute beträgt 45 bis 60%.
Der Km-Wert entsprach dem des nativen Enzyms.
30 U/ml LDH wird in 50 mM CAPSO-Puffer, pH = 9,4 gelöst,
1 h bei 60°C inkubiert und die Restaktivität des Enzyms
bestimmt:
30 U/ml LDH werden in 50 mM CAPSO, pH = 9,4 gelöst und 2
Wochen bei 35°C inkubiert.
30 U/ml LDH werden in einem 100 mM Tris-Puffer, pH 7,5
unter Zusatz von 500 mM Alanin (Puffer entspricht der
Empfehlung der IFCC für die Bestimmung GPT) bzw. 50 mM
CAPSO, pH = 9,4 gelöst und die Lösungen 30 min bei ver
schiedenen Temperaturen inkubiert. Die in nachfolgender
Tabelle angegebenen Werte der Thermostabilität entsprechen
der Temperatur, bei der die Restaktivität der LDH noch
< 90% beträgt.
NAD⁺: β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid
NADH: β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid, reduziert
LDH: Lactatdehydrogenase
GPT: Glutamat-Pyruvat-Transaminase
ALAT: Alanin-Aminotransferase
α-KGDH: α-Ketoglutaratdehydrogenase
CDAP-Br: 1-Cyano-4-dimethylamino-pyridiniumbromid
CAPSO: 3-(Cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propansulfonsäure
IFCC: International Federation of Clinical Chemistry
NADH: β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid, reduziert
LDH: Lactatdehydrogenase
GPT: Glutamat-Pyruvat-Transaminase
ALAT: Alanin-Aminotransferase
α-KGDH: α-Ketoglutaratdehydrogenase
CDAP-Br: 1-Cyano-4-dimethylamino-pyridiniumbromid
CAPSO: 3-(Cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propansulfonsäure
IFCC: International Federation of Clinical Chemistry
Claims (12)
1. Modifizierte Lactatdehydrogenase, dadurch gekennzeich
net, daß sie kovalent an ein aktiviertes Polysaccharid
gebunden und gleichzeitig intramolekular vernetzt vor
liegt und bei pH-Werten < 8,5 alkalistabil ist.
2. Lactatdehydrogenase nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Polysaccharid ein mit 1-Cyano-4-di
methylamino-pyridiniumbromid aktiviertes Dextran ist.
3. Lactatdehydrogenase nach einem der Ansprüche 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß sie intramolekular über
Triethanolamin vernetzt ist.
4. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Lactat
dehydrogenase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Weise eine
wäßrige, ein aktiviertes Polysaccharid enthaltende
Lösung zunächst mit einem Vernetzungsmittel inkubiert
und anschließend mit einer Lactatdehydrogenase-Lösung
versetzt und inkubiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
als aktiviertes Polysaccharid durch 1-Cyano-4-di
methylamino-pyridiniumbromid aktiviertes Dextran ein
setzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, daß als Vernetzungsmittel Triethanol
amin eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch ge
kennzeichnet, daß die eingesetzte Lactatdehydrogenase
aus einem Säugetierorgan, vorzugsweise aus Schweine
herz, in an sich bekannter Weise gewonnen wird.
8. Verwendung einer modifizierten alkalistabilen Lactat
dehydrogenase nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Test-
Reagenzien.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
die modifizierte alkalistabile LDH nach einem der An
sprüche 1 bis 7 in Testreagenzien zur Bestimmung von
Lactat und zur Bestimmung von Alanin-Aminotransferase
eingesetzt wird.
10. Testreagenz enthaltend eine modifizierte alkalistabile
LDH nach einem der Ansprüche 1 bis 7 neben üblichen
Puffern und gegebenenfalls weiteren Hilfs- und Zusatz
stoffen.
11. Testreagenz nach Anspruch 10 umfassend eine wäßrige Lö
sung mit einem pH-Wert < 8,5, die eine modifizierte LDH
gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und NADH enthält.
12. Testreagenz zur Bestimmung von Alanin-Aminotransferase
nach einem der Ansprüche 10 oder 11, bestehend aus
einer Lösung gemäß Anspruch 11 und einer Pufferlösung
von α-Ketoglutarat mit einem pH-Wert von 7,5-7,8.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1996127075 DE19627075A1 (de) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | Modifizierte Lactatdehydrogenase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
PCT/EP1997/003413 WO1998001545A1 (de) | 1996-07-05 | 1997-07-01 | Modifizierte lactatdehydrogenase, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1996127075 DE19627075A1 (de) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | Modifizierte Lactatdehydrogenase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19627075A1 true DE19627075A1 (de) | 1998-01-15 |
Family
ID=7799001
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1996127075 Withdrawn DE19627075A1 (de) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | Modifizierte Lactatdehydrogenase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19627075A1 (de) |
WO (1) | WO1998001545A1 (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20230122876A1 (en) * | 2021-10-20 | 2023-04-20 | Fina Biosolutions, Llc | Chemical Reagents for the Activation of Polysaccharides in the Preparation of Conjugate Vaccines |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3540076A1 (de) * | 1985-11-12 | 1987-05-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur stabilisierung von creatinkinase |
US5196536A (en) * | 1989-09-08 | 1993-03-23 | Unisyn Fibertec Corporation | 2-Fluoro-1-methylpyridinium salt activated diols and polyols as cross-linkers |
-
1996
- 1996-07-05 DE DE1996127075 patent/DE19627075A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-07-01 WO PCT/EP1997/003413 patent/WO1998001545A1/de active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1998001545A1 (de) | 1998-01-15 |
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Legal Events
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