DE19627075A1

DE19627075A1 - Modifizierte Lactatdehydrogenase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE19627075A1
Application number: DE1996127075
Authority: DE
Inventors: Johnny Staepels; Rainer Dipl Chem Dr Schmuck; Thomas Dipl Biol Dr Botz
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1996-07-05
Filing date: 1996-07-05
Publication date: 1998-01-15
Also published as: WO1998001545A1

Description

Die Erfindung betrifft eine modifizierte alkalistabile Lactatdehydrogenase, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Testreagenzien, insbesondere zur Lactat- und Alanin-Aminotransferasebestimmung

Lactatdehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27 und EC 1.1.1.28) ist eine Oxidoreduktase (MG 100.000-150.000), die in verschiedenen Organen (Leber, Herz) und in Muskeln von Säugern sowie in verschiedenen Mikroorganismen, wie z. B. Lactobacillus, Bacillus stearothermophilis und Pedio coccus vorkommt und die Gleichgewichtsreaktion

Pyruvat + NADH + H⁺ ↔ Lactat + NAD⁺

katalysiert, wobei NAD⁺ und NADH Nikotinamid-adenin dinucleotid in seiner oxidierten bzw. reduzierten Form bedeutet. Diese Reaktion ist im anaeroben Stoffwechsel (z. B. im arbeitenden Muskel und bei Milchsäurebakterien), zur Regenerierung des in der Glycolyse benötigen NAD⁺ von Bedeutung. LDH findet in der enzymatischen Analyse in ge koppelten optischen Tests Verwendung, z. B. zur Bestimmung von Lactat gemäß obigem Reaktionsschema, wobei die Um setzung von Lactat zu Pyruvat bevorzugt im alkalischen pH-Bereich < 8,5 durchgeführt wird, die Umsetzung von Pyruvat zu Lactat dagegen bei einem pH-Wert < 8,0 statt findet. Zum anderen ist LDH von Bedeutung zur Bestimmung von Alanin-Aminotransferase (EC 2.6.1.2, ALAT, alte Be zeichnung GPT) im Serum, Plasma oder Blut nach dem Reaktionsschema.

In den derzeitigen kommerziellen Testreagenzien zur Be stimmung von GPT wird in einem Reagenz (R1) ein Gemisch aus LDH und NADH als Lyophilisat bzw. Granulat angeboten, in einer getrennten Lösung ist das α-Ketoglutarat als Startreagenz (R2) enthalten. Das LDH und NADH enthaltende Lyophilisat oder Granulat R1 wird erst kurz vor der Mes sung im Testpuffer gelöst. Da die GPT-Bestimmung bei einem pH-Wert von 7,5 bis 7,8 durchgeführt wird, NADH aber erst oberhalb eines pH-Wertes von 8,5 in Lösung über einen längeren Zeitraum stabil ist, ist die Haltbarkeit der rekonstituierten Lösung sehr begrenzt.

Daneben erfordert die Herstellung solcher Reagenzien einen erhöhten Kosten- und Materialaufwand, der durch Lyophilisations- oder Granulierschritte unter Verwendung von für die Funktion des Reagenzes an sich nicht rele vanten galenischen Hilfsstoffen sowie durch einen zusätz lichen Packmittelbedarf bedingt ist. Das in dieser Form angebotene Reagenz entspricht nicht mehr dem aktuellen Standard, auch sind beim Rekonstituieren des Lyophilisats Handlingsfehler nicht ausgeschlossen.

Andererseits werden die Kombinationsmöglichkeiten der Testreagenzien zur Bestimmung von GPT dadurch einge schränkt, daß die LDH-Präparate eine α-Ketoglutarat-DH- Nebenaktivität aufweisen, und somit die LDH nicht zusam men mit dem α-Ketoglutarat in einem Reagenz untergebracht werden kann. Weiter ist das α-Ketoglutarat bei einem pH- Wert < 8,5 aufgrund von Hydrolyse instabil, wogegen die NADH erst oberhalb dieses pH-Wertes im Flüssigreagenz über einen längeren Zeitraum genügend stabil ist.

Bedingt durch die pH-Inkompatibilität der LDH und der Co- Faktoren könnte die Herstellung von ausschließlichen Flüssigreagenzien derzeit nur durch die Bereitstellung drei verschiedener Reagenzien (LDH, α-Ketoglutarat und NADH als Einzelreagenzien) realisiert werden, die der Nutzer vor der Anwendung zur vereinigen hat, da die meisten Analysenautomaten lediglich die Pipettierung von zwei verschiedenen Reagenzien erlauben. Auch diese ge brauchsfertigen Lösungen besitzen nur eine sehr begrenzte Haltbarkeit.

Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein Testreagenz zu entwickeln, das eine gebrauchsfertige Lösung aus LDH und NADH umfaßt und über einen Zeitraum von mindestens 12 Monaten lagerstabil ist. Aus NADH-Stabilitätsgründen setzt dies voraus, daß auch die verwendete LDH bei einem pH-Wert < 8,5 in Lösung ausreichend stabil ist, so daß die Funktionsfähigkeit des Flüssigreagenzes über diesen Haltbarkeitszeitraum erhalten bleibt. Aufgabe der Erfin dung war es deshalb auch, eine bei pH-Werten < 8,5 in Lösung bei Kühlschranktemperaturen alkalistabile LDH zur Verfügung zu stellen.

Es wurde gefunden, daß die Aufgabe der Erfindung mit einer modifizierten LDH gelöst werden kann, die zum einen kovalent an ein wasserlösliches aktiviertes Polysaccharid gebunden ist und gleichzeitig intramolekular vernetzt ist. Im Sinne der Erfindung sind wasserlösliche Poly saccharide, Dextrane, Stärken, Zucker oder synthetische Zuckerpolymere. Bevorzugt wird die LDH an Dextrane ge bunden.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß die LDH an ein mit 1-Cyano-4-dimethyl amino-pyridiniumbromid (CDAP-Br) aktiviertes Dextran kovalent gebunden und gleichzeitig intramolekular ver netzt wird. Die intramolekulare Vernetzung erfolgt erfin dungsgemäß bevorzugt über Triethanolamin.

Modifizierte, bei pH-Werten < 8,5 alkalistabile LDH ist bisher nicht bekannt. Die in der Literatur beschriebenen Modifizierungen durch Vernetzung mit Glutaraldehyd (Bio technology and Applied Biochemistry, 9 (1987) 389-400), durch Acetamidierung (Biochimica et Biophysica Acta, 484 (1977) 1-8) oder als Dextran-Konjugat zusammen mit Hexamethylendiamin (J. Fac. Agric. Kyushu Univ., 38 (1993) 1-2, 111-117) liefern nicht die erfindungsgemäße Alkalistabilität der LDH.

Die LDH für die Erfindung wird aus einem Säugetierorgan, bevorzugt aus Herz und insbesondere bevorzugt aus Schweineherz gewonnen. Es zeigte sich, daß die mikro biellen LDH′s - obwohl sie generell etwas stabiler sind als die Enzyme aus Säugetierorganen - eine um den Faktor 10 höhere Michaelis-Konstante Km gegen Pyruvat und NADH besitzen, was für die Transaminasebestimmung nachteilig ist. Die erfindungsgemäße LDH besitzt einen, dem entspre chenden Enzym aus Säugetierorganen analogen vorteilhaften niedrigen km-Wert.

Die LDH-Isolierung aus Schweineherz erfolgt nach an sich bekannten Methoden, so z. B. nach Jaenicke, R. und R. Rudolph, FEBS Symp. 49, 351-367 (1977) und Storey, K.B., Comp. Biochem. Physiol., 56, 181-187 (1977).

Durch die erfindungsgemäße Modifizierung von LDH aus Schweineherz mit aktiviertem Dextran und Triethanolamin als Neutralisationsbase wird eine LDH erhalten, die in Lösung eine Langzeitstabilität von mindestens 12 Monaten bei einem pH-Wert < 8,5 besitzt und im Vergleich zu unmo difizierter LDH aus Mikroorganismen oder Säugetierorganen eine um ein Vielfaches höhere Restaktivität aufweist. Insbesondere hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäße LDH in einem pH-Wert-Bereich von ca. 9,0 bis 10,0 eine akzeptable Stabilität aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Her stellung modifizierter alkalistabiler Lactatdehydroge nase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in an sich be kannter Weise eine wäßrige, ein aktiviertes Polysaccharid enthaltende Lösung zunächst mit einem Vernetzungsmittel inkubiert und anschließend mit einer Lactatdehydrogenase- Lösung versetzt und inkubiert wird. Gemäß der Erfindung wird das Polysaccharid in Wasser gelöst, die Lösung ge kühlt (vorzugsweise auf Temperaturen zwischen 1°C bis 10°C) und anschließend das Polysaccharid durch Zugabe des Aktivierungsmittels aktiviert. Sofort nach Auflösung des Aktivierungsmittels wird die Lösung des Vernetzungs mittels zugegeben und unter Kühlung inkubiert. Zur wei teren Umsetzung mit der LDH-Lösung wird das kalte Reak tionsgemisch dann auf Umgebungstemperatur erwärmt.

Die erfindungsgemäß hergestellte, modifizierte LDH ist aufgrund ihrer Alkalistabilität zur Verwendung in Test reagenzien hervorragend geeignet. Insbesondere kann die erfindungsgemäß modifizierte LDH in Testreagenzien zur Bestimmung von Lactat bzw. von Reaktionsfolgeprodukten, die über den Schritt der Lactatbildung führen, und in Testreagenzien zur Bestimmung von Alanin-Aminotransferase Verwendung finden.

Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch Testreagen zien, die eine erfindungsgemäß modifizierte, alkalista bile LDH neben üblichen Puffern und gegebenenfalls an deren Hilfs- und Zusatzstoffen enthalten. Insbesondere läßt sich mit der erfindungsgemäßen modifizierten LDH ein Flüssigreagenz zur Verfügung stellen, das eine lager stabile wäßrige Lösung mit einem pH-Wert < 8,5, bevorzugt ca. 9,0 bis 10,0, umfaßt, die die erfindungsgemäß modifi zierte LDH und NADH enthält. Diese Lösung ist ohne die aufwendige Lyophilisation und Granulierung auch nach 12 Monaten voll einsatzfähig. Insbesondere zur Bestimmung von Alanin-Aminotransferase kann damit ein Flüssigrea genzkonzept realisiert werden, das zum einen eine ge brauchsfertige alkalistabile Lösung mit LDH und NADH umfaßt und zum anderen das α-Ketoglutarat als Einzelrea genz in einem Puffer mit einem für die GPT optimalen pH- Wert von 7,5 bis 7,8 zur Verfügung stellt. Damit wird ein gebrauchsfertiges Testreagenz zur Bestimmung von Alanin- Aminotransferase zur Verfügung gestellt, das zwei Flüs sigreagenzien umfaßt, die keine weiteren Arbeitsschritte zum Herstellen von Testlösungen vom Anwender erfordern, wodurch Handlingsfehler vermieden werden.

Anschließend soll die Erfindung an Beispielen näher er läutert werden, ohne sie darauf einzuschränken.

Beispiel 1 Bindung der Lactatdehydrogenase an Dextran

2,0 g Dextran T40 (Fa. Roth) werden in 40 ml dest. Wasser gelöst und auf 2 bis 6°C gekühlt. Unter Rühren werden 667 mg CDAP-Bromid zugegeben und gelöst. Anschließend wird sofort 8 ml einer 0,2 M Triethanolaminlösung zugege ben und 10 min bei 2 bis 6°C unter Rühren inkubiert. Der pH-Wert des kalten Reaktionsgemisches wird am Ende der Inkubation mit einer 1 M Kaliumdihydrogenphosphatlösung sofort auf 7,6 eingestellt und anschließend auf 20 bis 25°C erwärmt.

Die aktivierte Dextranlösung wird mit 50 ml einer LDH- Lösung in 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH = 7,6 (20 mg/ml Protein enthaltend, LDH aus Schweineherz) vereinigt und unter Rühren 2 h bei 20 bis 25°C inkubiert. Anschließend wird die Polymerisationsreaktion mit 2,5 ml einer 1 M Lysinhydrochloridlösung abgestoppt und das Reaktionsge misch gegen 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH = 7,6 dialy siert.

Das Dialysat wird mit 2,0 g Mannit versetzt, über einem 0,22 µ-Membranfilter keimarm filtriert und lyophilisiert. Die Aktivitätsausbeute beträgt 45 bis 60%.

Der Km-Wert entsprach dem des nativen Enzyms.

Beispiel 2 Stabilität von LDH in CAPSO-Puffer bei 60°C

30 U/ml LDH wird in 50 mM CAPSO-Puffer, pH = 9,4 gelöst, 1 h bei 60°C inkubiert und die Restaktivität des Enzyms bestimmt:

Beispiel 3 Stabilität von LDH in CAPSO-Puffer bei 35°C

30 U/ml LDH werden in 50 mM CAPSO, pH = 9,4 gelöst und 2 Wochen bei 35°C inkubiert.

Beispiel 4 Thermostabilität von LDH

30 U/ml LDH werden in einem 100 mM Tris-Puffer, pH 7,5 unter Zusatz von 500 mM Alanin (Puffer entspricht der Empfehlung der IFCC für die Bestimmung GPT) bzw. 50 mM CAPSO, pH = 9,4 gelöst und die Lösungen 30 min bei ver schiedenen Temperaturen inkubiert. Die in nachfolgender Tabelle angegebenen Werte der Thermostabilität entsprechen der Temperatur, bei der die Restaktivität der LDH noch < 90% beträgt.

Abkürzungsverzeichnis

NAD⁺: β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid
NADH: β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid, reduziert
LDH: Lactatdehydrogenase
GPT: Glutamat-Pyruvat-Transaminase
ALAT: Alanin-Aminotransferase
α-KGDH: α-Ketoglutaratdehydrogenase
CDAP-Br: 1-Cyano-4-dimethylamino-pyridiniumbromid
CAPSO: 3-(Cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propansulfonsäure
IFCC: International Federation of Clinical Chemistry

Claims

1. Modifizierte Lactatdehydrogenase, dadurch gekennzeich net, daß sie kovalent an ein aktiviertes Polysaccharid gebunden und gleichzeitig intramolekular vernetzt vor liegt und bei pH-Werten < 8,5 alkalistabil ist.

2. Lactatdehydrogenase nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß das Polysaccharid ein mit 1-Cyano-4-di methylamino-pyridiniumbromid aktiviertes Dextran ist.

3. Lactatdehydrogenase nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie intramolekular über Triethanolamin vernetzt ist.

4. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Lactat dehydrogenase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Weise eine wäßrige, ein aktiviertes Polysaccharid enthaltende Lösung zunächst mit einem Vernetzungsmittel inkubiert und anschließend mit einer Lactatdehydrogenase-Lösung versetzt und inkubiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als aktiviertes Polysaccharid durch 1-Cyano-4-di methylamino-pyridiniumbromid aktiviertes Dextran ein setzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Vernetzungsmittel Triethanol amin eingesetzt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß die eingesetzte Lactatdehydrogenase aus einem Säugetierorgan, vorzugsweise aus Schweine herz, in an sich bekannter Weise gewonnen wird.

8. Verwendung einer modifizierten alkalistabilen Lactat dehydrogenase nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Test- Reagenzien.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierte alkalistabile LDH nach einem der An sprüche 1 bis 7 in Testreagenzien zur Bestimmung von Lactat und zur Bestimmung von Alanin-Aminotransferase eingesetzt wird.

10. Testreagenz enthaltend eine modifizierte alkalistabile LDH nach einem der Ansprüche 1 bis 7 neben üblichen Puffern und gegebenenfalls weiteren Hilfs- und Zusatz stoffen.

11. Testreagenz nach Anspruch 10 umfassend eine wäßrige Lö sung mit einem pH-Wert < 8,5, die eine modifizierte LDH gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und NADH enthält.

12. Testreagenz zur Bestimmung von Alanin-Aminotransferase nach einem der Ansprüche 10 oder 11, bestehend aus einer Lösung gemäß Anspruch 11 und einer Pufferlösung von α-Ketoglutarat mit einem pH-Wert von 7,5-7,8.