DE3100076A1 - Verfahren zum stabilisieren von peroxidase in einem medium auf der basis von serumprotein und ein reagens zur durchfuehrung von immunochemischen bestimmungen, enthaltend so stabilisierte peroxidase - Google Patents

Verfahren zum stabilisieren von peroxidase in einem medium auf der basis von serumprotein und ein reagens zur durchfuehrung von immunochemischen bestimmungen, enthaltend so stabilisierte peroxidase

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren von Peroxidase in einem Medium auf der Basis von Serumprotein. Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung und Lagerung von bei enzymatischen Immuntests verwendeten Reagentien. Insbesondere eignet sich das erfindungsgemässe Verfahren zur Stabilisierung von Enzymen und Enzymkon jugaten, die zum Nachweis und zur Bestimmung von Immunoreaktanten, wie Antigenen, Antikörpern, bindenden Proteinen und Haptenen, verwendet werden.
In den US-PSen 3 911 096 und 3 928 553 ist die Verwendung von 8-Anilino-i-naphthalinsulfonsäure (ANS) als blockierendes Mittel zur Hemmung der Bindung von Trijodthyronin und/oder Thyroxin an Thyroxin bindendes Globulin beschrieben. Aus diesen Literaturstellen geht hervor, dass unter Verwendung eines blockierenden Mittels, wie ANS, nicht-extrahiertes Serum auf T- und/oder T^. ohne Störung durch T^-bindendes Globulin und Thyroxin bindendes Präalbumin getestet werden kann. Dieser Befund lässt sich theoretisch so begründen, dass die T-- und Tn-bindenden Stellen am bindenden Globulin un Präalbumin durch besetzt oder blockiert werden und T3 und/oder T4 in freier Form vorliegen und somit zum Nachweis durch einen Test zugänglich sind.
In der US-PS 4 169 012 ist ein Verfahren zum Stabilisieren von Peroxidase-Präparaten beschrieben, indem man Reagentien mit einem Gehalt an Peroxidase-Präparaten mit mehrwertigen Ionen der Gruppen 3 und 4 "des Periodensystems versetzt. Die nach diesem Verfahren stabilisierten Reagentien sollen dabei besonders für die Lyophilisation geeignet sein.
Aufgabe der Erfindung ist es, Reagentien mit einem Gehalt an Peroxidase oder Feroxidase-Konjugaten, die sich insbesondere in enzymatischen Immuntests zum Nachweis und zur Bestimmung von Immunoreaktanten eignen,zu stabilisieren.
1SÖ0SO/O41t
3740 - 3 "
Erfindungsgernäss wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass man ein Peroxidase-Reagens mit einer stabilisierend wirkenden Menge an 8-Anilino-i-naphthalinsulfonsäure (ANS) versetzt.
Es ist bekannt, dass Peroxidasen, unabhängig davon, ob sie an einen anderen Bestandteil gekuppelt sind (konjugiert) oder nicht, nicht sehr stabil sind, insbesondere in geringen Konzentrationen. Infolgedessen ist ihre Lagerstabilität relativ gering, was die technischen Einsatzinöglichkeiten verringert.
Peroxidasen sind Enzyme, die die Oxidation von bestimmten Verbindungen katalysieren. Während dieser Oxidation wirkt ein Peroxid, insbesondere Wasserstoffperoxid, als Protonenakzeptor für ein Donatormolekül. Peroxidasen lassen sich aus Pflanzen (z.B. Meerrettich-Peroxidase (HPO)), Wirbeltieren (z.B. Lactoperoxidase) und aus Mikroorganismen (z.B. Cytochromperoxidase aus Pseudomonas) erhalten.
Peroxidasen werden für verschiedenste Zwecke verwendet, darunter auch als nachweisbare Marker bei immunologischen Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Immunoreaktanten wie Haptenen, Antigenen oder Antikörpern. Die Verwendung von mit Peroxidase markierten Immunoreaktanten ist von besonderem Interesse, da die Aktivität oder Anwesenheit des Enzyms optisch nachweisbar ist und der Aktivitätsgrad durch kolorimetrische Verfahren bestimmt werden kann.
Testpackungen zur Durchführung von enzymatischen Immuntests enthalten im allgemeinen als wesentlichen Bestandteil eine bestimmte Menge eines an eine Peroxidase gekuppelten Immunoreaktanten.Da derartige Testpackungen versandt und vor ihrer Verwendung unterschiedlich lang gelagert werden müssen, ist es wichtig, dass die Enzymaktivität möglichst lang erhalten bleibt.
Zur Zeit werden die Enzymkonjugate in einem immunologischen Reaktionsraedium mit einem Gehalt an etwa 10 Prozent fötalen Kälberserum gelagert. Es wurde festgestellt, dass Kälberserum die Stabilität des Konjugats erhöht, was sich aus einem Vergleich mit der Stabilität des Konjugats allein ergibt. Es wird angenommen, dass die Serummatrix zur Aufrechterhaltung der räumlichen Struktur des Enzyms beiträgt.
Paradoxerweise wurde auch festgestellt, dass Kälberserum zur Inaktivierung des Enzyms beiträgt, indem es abtrennbare Häminreste aus der Enzymstruktur entfernt. Diese Denaturierung von Peroxidase scheint auf Häminwechselwirkungen zwischen der Peroxidase und Hämin bindenden Proteinen des Kälberserums zurückzuführen zu sein.
Es wurde festgestellt, dass zur Verringerung der Anziehung und damit der Wechselwirkung zwischen Hämin und Serumproteinen eine Zugabe von ANS zum Reagensmedium die Stabilität von Peroxidase auf das 10- bis 20-fache verbessert wird. Es wird angenommen, dass ANS die Stabilität von Peroxidase verbessert, indem es mit Serumproteinen im Kälberserum reagiert und hämbindende Stellen besetzt.
Das Beispiel erläutert die Erfindung.
Beispiel
Handelsübliches fötales Kälberserum wurde vereinigt und 1 Stunde bei 550C einer Wärmebehandlung unterzogen, um jegliche endogene peroxidative Aktivität zu entfernen. Sodann wurde das Serum zur Entfernung an Ausfällungen durch eine Filterschicht filtriert. Das Filtrat wurde mit 0,1 iri Trispuffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl auf eine Endkonzentration von 10 Prozent Serum verdünnt. Das Serumpräparat wurde sodann in 2 Flaschen gegossen. Ein Fläschchen wurde mit 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure in einer Konzentration von 0,01 Prozent versetzt. Sodann wurden beide gepufferten Serumlösungen mit Meerrettich-Peroxidase, konjugiert mit IgG durch Per-
3740 -S-
jodatoxidation, versetzt. Beide Lösungen wurden durch ein 0,45 ρ Sterilfilter filtriert und in Aliquotanteilen auf 5 ml fassende sterile Fläschchen verteilt. Die Fläschchen wurden sodann bei 4° oder 45°C aufbewahrt.
Der Inhalt der einzelnen Flaschen wurde nach 0, 8, 20 und Tagen jeweils auf die Enzymaktivität untersucht. Die Enzymaktivität wurde spektrophotometrisch bei 415 nm mit einem bichromatischen Analysengerät bestimmt. Eine 5-minütige Geschwindigkeitsanalyse wurde durchgeführt, indem man 10 yl der Enzymlösung mit 250 μΐ einer Substratlösung mit einem Gehalt an Phosphat-Tris-Puffer vom pH-Wert 6, Wasserstoffperoxid und 3 mg/ml o-Phenylindiamin vermischte. Die Stabilität wurde bestimmt, indem man die prozentuale Enzymaktivität bei 45 C Lagertemperatur im Vergleich zur entsprechenden Enzymaktivität bei einer Lagertemperatur von 4 C berechnete. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Relative Enzymaktivität
Stabilisator 0 Tage 7,5 Tage 19,5 Tage 43 Tage
keiner 100% 7,5% 2,4% 0% 0,01% ANS 100%. 77% 66% 43%
Ende der Beschreibung
— 5 —
130050/041?

Claims (2)

Patentansprüche
1. Verfahren zum Stabilisieren von Peroxidase in einem Medium auf der Basis von Serumprotein, dadurch gekennzeichnet, dass man das Medium mit einer wirksamen Menge an 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure versetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
man 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure in einer Konzentration von etwa 0,001 bis etwa 0,5 Prozent verwendet.
3- Verfahren zum Stabilisieren von Meerrettich-Peroxidase in fötalem Kälberserum, dadurch gekennzeichnet, dass man das Medium mit einer wirksamen Menge an 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure versetzt.
Reagens zur Durchführung von immunochemischen Bestimmungen, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mit 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure stabilisierter Peroxidase in einem Medium auf der Basis von Serumprotein.
130050/0417
DE3100076A 1980-01-07 1981-01-03 Verfahren zum Stabilisieren von Peroxidase in einem Medium auf der Basis von Serumprotein und ein Reagens zur Durchführung von immunochemischen Bestimmungen, enthaltend so stabilisierte Peroxidase Expired DE3100076C2 (de)

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