DE2711753A1

DE2711753A1 - Stabilisierte fluessige coenzympraeparate

Info

Publication number: DE2711753A1
Application number: DE19772711753
Authority: DE
Inventors: Ivan E Modrovich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-03-17
Filing date: 1977-03-17
Publication date: 1977-09-22
Also published as: US4153511A; SE7703077L; CH626401A5; JPS52134087A; SE449622B; CA1092035A; JPS5635160B2; DE2711753C2

Description

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17. März 1977

Stabilisierte flüssige Coenzympräparate

Die Erfindung betrifft die Stabilisierung labiler Coenzyme in flüssigen Medien.

Kürzlich wurde festgestellt, daß schätzungsweise 25$ aller in den USA durchgeführten diagnostischen in-vitro-Tests nicht zuverlässig sind. Unzuverlässige Tests können aber eine unnötige medizinische Behandlung, Unterlassung einer erforderlichen Behandlung und Verdienstausfall zur Folge haben. Wegen ihrer hohen Spezifität haben Bestimmungen von Enzymen in den letzten Jahren wesentlich an Bedeutung gewonnen, und dieser Trend scheint weiter zu bestehen. Damit genaue und konsistente Ergebnisse erzielt werden, sind aber an die Qualitätskontrolle strenge Maßstäbe anzulegen. Diese Notwendigkeit ergibt sich aus der Tatsache, daß Zusammensetzung und Wirkungsmechanismus von Enzymen weltgehend unbekannt sind. Qegenwärtig liegt die weitaus größte Schwierigkeit für den Hersteller von Enzympräparaten darin, daß seine Produkte instabil sind. Die derzeit in Anwendung befindlichen Methodologien erfordern die Verwendung zahlreicher labiler Ingredenzien, und es ist wahrscheinlicher, daß diese Zahl zu- als abnimmt.

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Die derzeit angewandten Verfahren zum Stabilisieren des Reaktionsvermögens von Enzymen und Coenzymen bestehen darin, daß man sie entweder durch Gefriertrocknen oder durch Trockenmischen, wie es für die Tablettierung getrockneter Pulver hauptsächlich in der pharmazeutischen, diagnostischen oder verwandten Industrien angewandt wird, in eine feste Matrix einschließt, oder daß man die chemische Struktur des Enzyms durch Einschließen in eine feste Matrix immobilisiert. Trotz der Sophistik, die die Beschreibung dieser Verfahren beinhaltet, sind sie weder praktisch durchführbar noch erwünscht und sind zudem aufwendig. Der Hersteller muß das Wasser entfernen und ein Teilprodukt liefern, wobei er auf einen Teil des Qualitätskontrollzyklus bei der Verdünnung und Anwendung des Endproduktes verzichten muß. Die Laboratorien sind gezwungen, die hohen Kosten für Verpackung, Abfall an Reagenz, Gefriertrocknen und Trockenmischen zu tragen, und der Wert des Produktes wird weiter durch Art und Größe der Verpackung beschränkt.

Außerdem ist es schwierig, Produkte mit gleichmäßiger Beschaffenheit herzustellen. Beispielsweise wird für die meisten gefriergetrockneten Kontrollsera eine Variationsbreite des Enzymgehaltes von Flasche-zu-Flasche von - 1O# vom Mittelwert angegeben.

Für die klinische Diagnostik werden diagnostische Reageneien verwendet, um beispielsweise die folgenden Bestandteile, jedoch nicht ausschließlich diese, in biologischen Flüssigkeiten nachzuweisen und quantitativ zu bestimmen:

1. Glutamat-oxalacetat-transaminase (SGOT)

2. Glutamat-pyruvat-transaminase (SGPT)

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3. Lactat-dehydrogenase (LDH)

4. Creatin-phosphokinase (CPK)

5· α-Hydroxybuterid-dehydrogenase (α-HBD)

6. Glucose (via Hexokinase-G-6-PDH)

Diese Reagenzien reagieren in ähnlicher Weise, enthalten einige gemeinsame labile Ingredienzien und gehen einige gleiche Reaktionen ein. Das folgende Reaktionsschema ist als Modell zu verstehen, das die Art der ablaufenden Umsetzungen veranschaulicht:

Reaktionsschema 1. -- Allgemeines Modell

Enzym 1
(1.) Substrat(e) Produkt(e)

^ PH

(2.) Produkt/Substrat + NAD-NADH₂

Enzym 2 _v

. — NADH₉-NAD+Produkt pH ^d

Katalysator

(3.) NHDH₂ + Chromogen * Chromogen + NAD

(oxidiert) (reduziert)

Alle oben aufgeführten enzymatischen Umsetzungen folgen diesem allgemeinen Schema, wobei die Reaktion (2.) gewöhnlich als die Kupplungsreaktion bezeichnet wird, die Reaktionen (2.) oder (3·) die Meßreaktionen sind, und die Reaktion (1.) als die Primärreaktion bezeichnet werden kann. Für die Messung sind jedoch nicht alle drei Reaktionen erforderlich; vielmehr können sie auf zwei oder eine beschränkt werden. Im Falle der UV-Bestimmung von Lactat-dehydrogenase (LDH)-Aktivität kommt nur die Reaktion (2.) in Betracht:

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Reaktionsschema 2. — LDH

LDH Pyruvat + NADH₂ NAD + Lactat

Andererseits können auch mehr als die drei angegebenen Reaktionen ablaufen, wie im Falle der Creatin-phosphokinase (CPK)

ReaktionsBchema j?« — CPK

CPK_x (1.) GP + ADP ATP + Creatin

HK_V (2.) ATP + Glucose^ Glucose-6-Phos. + ADP

G-6-PDH (3.) Olucose-6-Phos. +NAD NADH_g

PMS _%

(4.) NADH₀ + INT INT + NAD ² (ox) (red)

Symbole;

CP - Creatin-phosphat

ADP - Adenosin-5'-diphosphat

ATP = Adenosin-trlphosphat

HK = Hexokinase

NAD = Nicotinamid-adenin-dinucleotid

NADHp = Nicotinamid-adenin-dinucleotid, reduziert

0-6-PDH = Glucose-6-phosphat-dehydrogenase

INT - Tetrazoliuraealz

PMS « Phenazin-methosulfat

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In diesem Fall können die Reaktionen (2.) und (3.) als die Kupplungsreaktionen, die Reaktionen (3.) oder (4.) als die Meßreaktionen, und die Reaktion (1.) als die Primärreaktion angesehen werden.

Bezüglich des Reaktionsschema 1. - Allgemeines Modell ist offensichtlich und allgemein bekannt, daß die Anwendung der Reaktionsfolge die quantitative analytische Bestimmung entweder der Reaktionssubstrate/Produkte oder der katalysierenden Enzyme ermöglicht.

Die quantitative Bestimmung dieser Bestandteile in biologischen Flüssigkeiten ist eine allgemein anerkannte und häufig angewandte Maßnahme bei der Diagnose und der Behandlung von Krankheiten von Menschen und Tieren.

Enzyme sind hochmolekulare komplexe Proteine, deren chemische Struktur gewöhnlich nicht bekannt ist. Sie werden derzeit durch ihre katalytische Aktivität und extreme Substratspezifität klassifiziert. Enzyme können als biologische Katalysatoren, die eine Umsetzung eines einzelnen Substrats oder eine Umsetzung einer Gruppe ähnlicher Substrate zu katalysieren vermögen, definiert werden.

Coenzyme sind organische Substanzen von niedrigerem Molekulargewicht und definierter Struktur, deren Reaktionen oder Interaktionen für spezifische Enzymnachwelse oder -reaktionen notwendig sind. Sie werden katalysiert und unterliegen dabei einer irreversiblen Änderung ihrer Struktur und/oder atomaren Zusammensetzung. Coenzyme sind für die klinische Erprobung sehr wertvoll. Einige haben starke Extinktion, ihre Reaktionen mit dem Substrat sind stöchiometrlsch und Entstehen oder Verschwin-

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den der absorbierenden Form kann daher fotometrisch verfolgt werden. Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) und seine reduzierte Form (NADHp) werden für viele wichtige klinische Versuche, wie die oben erwähnten SGOT-SPGT- und LDH-Untersuchungen verwendet. NAD und NADH_? haben ein Molekulargewicht von etwa 700 und sind sehr komplexe organische Moleküle. NADHp absorbiert stark bei J>kO nm, während NAD bei dieser Wellenlänge nicht absorbiert.

NADH₂ ist in wäßriger Lösung oder in trockener Form in feuchter Umgebung außerordentlich instabil. Selbst im gefrorenen Zustand muß NADHp frei von Feuchtigkeit gehalten werden. Die Stabilität ist bei alkalischem pH besser, während bei saurem pH NADH₂ sich sehr rasch innerhalb von Minuten zersetzt. Weder der exakte Mechanismus noch die Endprodukte sind von besonderer Bedeutung, abgesehen davon, daß zersetztes NADHp nicht langer als Coenzym wirkt und auch den Extinktionskoeffizienten bei JkO nm nicht mehr besitzt. Die typische Handelsform ist ein mit einem Entwässerungsmittel getrocknetes oder gefriergetrocknetes und unter Stickstoff aufbewahrtes Produkt. NADHp ist bekanntlich unlöslich in organischen Lösungsmitteln.

Aufgabe der Erfindung ist die Behandlung labiler Coenzyme derart, daß sie für lange Zeit stabil werden, ohne daß ihre coenzymatische Reaktivität oder ihr fotometrisches Absorptionsvermögen Mdet. Gemäß der Erfindung werden Reagenzien verwendet, deren Qualität während der Herstellung, Verpackung, Lagerung und Verwendung genau überwacht werden kann. Die sich aus der Notwendigkeit, starke und sperrige Verpackungen zu verwenden, ergebenden Schwierigkeiten werden ebenso beseitigt wie die hohen Kosten von Verpackung, Gefriertrocknung und Abfall an Reagenzien. Flüssige Enzym- und Coenzympräparate zeichnen sich durch Flexi-

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-ι-

billtät der Anwendung aus, und die Bestandteile können leicht und mit vernachlässigbaren Kosten abgetrennt werden, so daß auch die Flexibilität hinsichtlich des Auslösens der gewünschten Umsetzung, nachdem alle Nebenreaktionen unterbunden sind, gut ist.

Die stabilisierten Coenzyme gemäß der Erfindung wurden bewertet, indem sie mit frischen Reagenzien verglichen wurden. Die Untersuchungen ergeben eine Beziehung von 1:1 zwischen gealterten flüssigen und frischen Reagenzien von vergleichbarer Empfindlichkeit und Präzision. Die Bereitstellung von Coenzymreagenzien in stabiler flüssiger Form verbessert die colorimetrische Anwendbarkeit der derzeitigen NAD/NADH-Kupplungsmethodologien, hauptsächlich weil die Abtrennung von Ingredienzien leicht durchführbar ist. Stabile flüssige Reagenzien sind insbesondere dann von Vorteil, wenn der Verbrauch von NADH die Grundlage der Messung bildet und das Farbreagenz von NADH und dem Reaktionsmedium abgetrennt werden muß. Bei der Ultraviolettmethode bietet das flüssige Präparat den Vorteil besserer Homogenität und Abfüllung sowie Flexibilität der Verwendung, verglichen mit gefriergetrockneten oder Trockenmediumpräparaten.

In der Enzymdiagnostik bedeutet die Stabilisierung von Enzymreagenzien in einer gebrauchsfertigen Flüssigkeit einen außerordentlichen Fortschritt hinsichtlich der Befriedigung der Bedürfnisse von Kliniklabors und den Forderungen von Überwachungsgremien an die Zuverlässigkeit von Tests. Die Flexibilität von flüssigen Enzymsystemen gewährleistet ihre Anwendbarkeit bei automatisierter Instrumentation ebenso wie bei manuell durchgeführten Tests.

Die Stabilisierung labiler Coenzyme gemäß der Erfindung erfolgt

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durch Auflösen der Coenzyme in organischen Lösungsmitteln. Nach der Auflösung wird wenigstens 1# Vol./Vol. an einem inerten hygroskopischen Feststoff zugesetzt, und der Behälter wird verschlossen. Die Suspension wird für wenigstens 1 Stunde, gewöhnlich für 1 bis 2 Tage, unter gelegentlichem Mischen bei Raumtemperatur gehalten, um Wasser bis zu einem Gehalt von nicht mehr als 0,05# von dem Gemisch abzutrennen. Die Lösung kann dann in bernsteinfarbene Glasflaschen, die wenigstens 1# Vol.AoI. an einem hygroskopischen Mittel enthalten, abgefüllt werden. Die Flaschen werden dann luftdicht verschlossen und unter Kühlen gelagert. Die LagerungsStabilität kann unter diesen Bedingungen mit bis zu k Jahren angenommen werden, ohne daß ein merklicher Abbau erfolgt.

Gemäß einer anderen DurchfUhrungsform wird das in einer Menge von 1# Vol./Vol. anwesende hygroskopische Mittel von der Suspension entfernt, zweckmäßig indem man die Flüssigkeit in einen anderen Behälter umfüllt und das hygroskopische Mittel abfiltriert, wonach der Behälter luftdicht verschlossen und unter Kühlen aufbewahrt wird. Die Lagerungsstabilität kann unter diesen Bedingungen wiederum mit bis zu 4 Jahren angenommen werden, ohne daß ein merklicher Abbau erfolgt.

Überraschenderweise ist das Coenzym NADHp gut löslich und stabil in dem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, obwohl Lösungsmittel wie 1,2-Propandiol hygroskopisch sind. Offensichtlich solvatisieren die Lösungsmittelmoleküle das Coenzym wirksam und schützen es gegen Wasser, und das Lösungsmittel wirkt als Übertragungsmedium, das das adsorbierte Wasser an das feste hygroskopische Mittel überführt, wo es irreversibel gebunden wird. Auch nach Entfernung des hygroskopischen Mittels wurde gefunden, daß nach öffnen des Behälters relativ wenig Wasser angezogen wird.

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so daß es keinen beträchtlichen Abbau bewirkt.

Das organische Lösungsmittel soll die folgenden Eigenschaften haben:

1. niedriger Wassergehalt (Spuren < 0

2. neutrales oder alkalisches pH;

3. flüssig bei Raum- oder Kühlschranktemperatur;

4. reagiert nicht anders mit NADH₂ als unter Ausbildung elektrostatischer (d.h. Wasserstoff-) Bindungen;

5. mischbar mit Wasser;

6. niedrige freie Solvolyseenergie (normale Resonanz).

Nioht-reaktive organische Lösungsmittel mit neutralem oder alkalischem pH, wie Alkohole und insbesondere flüssige Polyole mit 2 bis 4 Hydroxylgruppen und 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie Glycerin, Äthylenglykol, Propylenglykol oder Butandiol, sind bevorzugt. Propylenglykol, 1,2-Propandiol besitzt alle diese Eigenschaften und ist das Lösungsmittel der Wahl.

Der inerte hygroskopische Peststoff hält den Wassergehalt auf dem gewünschten niedrigen Wert, d.h. unter 0,5# und vorzugsweise unter 0,1Ji. Der hygroskopische Peststoff muß ein wirksames Wasseradsorbenz, nicht-reaktiv mit dem Coenzym und von neutralem oder alkalischem pH sein. Er ist vorzugsweise ein hygroskopisches Mittel mit großer Oberfläche, wie ein natürliches oder synthetisches Molekularsieb mit einer Teilchengröße von 1 bis 9*4 mm (2 - 16 mesh) und 1st in einer Menge von wenigstens 1ji Vol./Vol., insbesondere von 5 bis 20# Vol./Vol. anwesend. Die QrOBe der Oberfläche ist wesentlich, weil das Material Wasser in den Poren adsorbiert.

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Molekularsiebe sind Zeolithe oder ähnliche Materialien, deren Atome in einem Kristallgitter derart angeordnet sind, daß eine große Anzahl kleiner Hohlräume untereinander durch enge öffnungen oder Poren von genau einheitlicher Größe verbunden sind. Normalerweise enthalten diese Hohlräume Wassermoleküle; beim Erwärmen wird dieses Wasser jedoch abgetrieben, ohne daß es zu einer Änderung in dem verbleibenden Kristallgitter kommt. Das Netzwerk von Hohlräumen und Poren kann 50# des Gesamtvolumens des Kristalls einnehmen. Molekularsiebe haben eine starke Neigung, Wasser zu reabsorbieren.

Einige natürliche Zeolithe haben in begrenztem Ausmaß Molekularsiebeigenschaften. Synthetische Zeolithe sind in verschiedenen Größen (Porenöffnungen 3, k, 5 und 10 Ängström-Einheiten im Durchmesser) mit hohem Absorptions- und Regenerationsvermögen auch bei ihrer Verwendung bei erhöhten Temperaturen erhältlioh.

Es wurde im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gefunden, daß, nachdem die Masse in Gegenwart des organischen Lösungsmittels sowie des inerten hygroskopischen Peststoffs stabilisiert worden ist, der hygroskopische Peststoff entfernt werden kann, ohne daß ansonsten die Stabilität der Masse beträchtlich beeinträchtigt wird. Allgemein wurde gefunden, daß die Masse wenigstens für etwa 2k Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart des hygroskopischen Feststoffs gelagert werden sollte. Während dieser Zeit werden Spuren von Wasser durch den hygroskopischen Feststoff absorbiert, und nach dessen Entfernung ist in der Masse im wesentlichen kein Wasser mehr verfügbar. Der Behälter kann auch gelegentlich geöffnet werden und obwohl dann Wasser aus der Luft in daa obere Ende dea Behälter· eintreten « kann, ist seine Menge relativ gering/« ao da£ ea'fceine wefclWtai<eM Zersetzung der labilen Komponenten dee "WKparats bewirkt.

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Allgemein soll der hygroskopische Feststoff für eine Zeit, die von der Menge an Wasser, die ursprünglich zur Zeit der Herstellung der Lösung in dieser anwesend war, abhängt, in Kontakt mit der stabilisierten Lösung gehalten werden. In vielen Fällen wurde gefunden, daß der hygroskopische Feststoff für etwa 3 bis 4 Tage mit der Lösung in Kontakt gehalten werden sollte. Diese Zeit kann verkürzt werden, indem man die Masse wenigstens bis zu dem Punkt, wo noch keine Zersetzung der labilen Komponenten erfolgt, erwärmt. D.h. es wurde gefunden, daß es möglich ist, die Massen auf eine Temperatur von etwa 6o°C zu erwärmen, ohne daß dies sich nachteilig auf die labilen Komponenten auswirkt. Der wesentliche Faktor ist, daß der hygroskopische Feststoff so lange in der Lösung verbleibt, bis diese nicht mehr als etwa 0,5# Vol.AoI. an Wasser enthält.

Das gemäß der Erfindung stabilisierte Präparat kann in Behälter geeigneter Größe eingebracht werden und dient dem Zweck der Bestimmung von Körperkomponenten. Durch Entfernung des hygroskopischen Mittels wird es nun möglich, präzise und genaue Mengen zu entnehmen, da das hygroskopische Mittel sonst etwas von dem Lösungsmittel selbst absorbieren würde oder wenigstens einen Teil des Lösungsmittels durch Oberflächenspannung an der Oberfläche des hygroskopischen Mittels verbleiben würde. Auf diese Weise ist es nun möglich, genaue Mengen in denjenigen Fällen, wo die Anwendung einer bestimmten Menge der Lösung ein kritischer und wesentlicher Faktor ist, zu entnehmen.

Es wurde auch gefunden, daß die oben beschriebenen Massen auch in Gegenwart anderer labiler Komponenten als der Enzyme stabilisiert werden können, wie oben beschrieben. So kann beispielsweise die stabilisierte Masse auch Coenzyme, wie beispielsweise NAD und NADH usw., enthalten, oder die verschiedenen

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Substrate, die mit den Massen verträglich sind. In Jedem Fall wurde gefunden, daß die Substrate und die Coenzyme gemäß der Erfindung zusammen mit den hier speziell beschriebenen Enzymen stabilisiert werden können.

Das Coenzym kann bis zu seiner Löslichkeitsgrenze anwesend sein und wird vorzugsweise wenn möglich konzentriert, da Propylenglykol ein starker Enzyminhibitor ist und die primäre oder enzymatische Kupplungsaktivität beeinträchtigen kann, wenn zuviel davon aus dem Coenzymreagenz in den Test getragen wird. Typische NADHp-Massen gemäß der Erfindung enthalten etwa 2 bis 15 g/l# insbesondere etwa 7 g/l. Hydratisiertes HADHp kann für eine raschere Auflösung in dem als Lösungsmittel verwendeten Polyol verwendet werden.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Beispiel 1

6,65 g/l NADHp wurden in einem geschlossenen bernsteinfarbenen Glasbehälter in spektrographisch reinem 1,2-Propandiol gelöst. Nach vollständiger Auflösung wurden 1O# Vol./Vol. Molekularsieb (4,7 mm, 4 mesh) zugesetzt, und der Behälter wurde geschlossen und unter gelegentlichem Mischen 24 Stunden bei Raumtemperatur gehalten, um den Wassergehalt des Gemisches auf unter 0,01$ zu senken. Die Lösung wurde fUr den Versand in weitere bernsteinfarbene Glasflaeohen, die frische Molekularsiebe (4,7 mm, 4 mtsh, 1OJf Vol. AoI.) enthielten, gefüllt. Diese Behälter wurden luftdicht verschlossen und unter Kühlen gelagert. Ein Arrheniusdiagramm, das das Temperaturstabilitätsprofil von NADHp In diesem Medium darstellt, läßt eine Lagerungsstabilität von bis zu 4 Jahren ohne merklichen Abbau erkennen. Die Werte wurden bei 3 Lage rungs temperature η von 60⁰C,

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Raumtemperatur (etwa 25⁰C) und Kühl tempera türen von etwa -8⁰C erhalten. (Der Mittelwert von 4⁰C wurde angewandt.) Der maximal zulässige Verlust beträgt weniger als 10# nach 36O Tagen Lagerung bei 27⁰C.

Wenn Propylenglykol ohne Stabilisierung in Oegenwart des hygroskopischen Mittels und anschließende Abtrennung verwendet wird, zersetzt sich das MADHp ziemlich rasch bei der Verwendung, wenn der Behälter geöffnet und geschlossen wird.

In diesem Beispiel 1 blieben die Molekularsiebe bei der Lagerung in der Masse. Im folgenden Beispiel 2 wurden die Molekularsiebe nach der Stabilisierung der Masse entfernt und gelangten nicht in die luftdicht verschlossenen Behälter. Trotzdem wurde die Stabilität der Masse nicht wesentlich beeinträchtigt.

Beispiel 2

6,65 g/l NADH« wurden in einem geschlossenen bernsteinfarbenen Glasbehälter in spektrometriecn reinem 1,2-Propandiol gelöst. Nach vollständiger Auflösung wurden 10Ji Vol./Vol. Molekularsiebe (4,7 mm, 4 mesh) zugesetzt, und der Behälter wurde geschlossen und unter gelegentlichem Rühren 24 Stunden bei Raumtemperatur gehalten, um den Wassergehalt des Gemisches auf unter 0,01$ zu senken. Die überstehende Lösung wurde für den Versand in kleine klare Glasflaschen abgefüllt. Diese wurden luftdicht verschlossen und unter Kühlen gelagert. Eine Arrheniusauftragung, die das Temperaturstabilitätsprofil von NADH₂ in diesem Medium wiedergibt, zeigt eine LagerungsStabilität von bis zu 4 Jahren ohne merklichen Abbau. Die Werte wurden bei 3 Lagerungstemperaturen von 50⁰C, Raumtemperatur (ungefähr 25⁰C) und KUhltemperaturen von 2 bis 8⁰C erhalten. (Der

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Mittelwert von 4⁰C wurde verwendet.) Der maximal zulässige Verlust beträgt weniger als 1O# nach }6o Tagen Lagerung im Dunklen bei 27t.

Wenn das Propylenglykol ohne vorherige Stabilisierung in Gegenwart des hygroskopischen Mittels verwendet wird, zersetzt sich NADHp ziemlich rasch bei seiner Verwendung, wenn der Behälter geöffnet und geschlossen wird.

Beispiel 3

Die Masse von Beispiel 2 wird nach Entfernung von überschüssigem Wasser durch den hygroskopischen Feststoff zusammen mit einem Coenzym NADH in einer Menge von Je 20 Mikroliter in einzelne kleine Testflaschen aus klarem Glas eingebracht. Eine dicht passende Schraubkappe wurde auf das offene obere Ende dieser Flaschen aufgebracht. Diese Testabfüllungen erwiesen sich als hoch wirksam bei ihrer Verwendung für einzelne Bestimmungen von SGOT, SGPT, LBDH und LDH-P, wenn man lediglich das entsprechende geeignete Substrat zusetzte.

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Claims

Patentansprüche

1/ Verfahren zum Stabilisieren eines labilen Coenzyms, das im wäßrigen Medium instabil ist, dadurch Reke nnze i chne t , daß man

das Coenzym in einem nicht-reaktiven, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, das bei Raum- und Kühlschranktemperaturen flüssig ist, auflöst;

der Lösung unter Bildung einer Suspension wenigstens 1# eines inerten, teilchenförmigen hygroskopischen Feststoffes mit hoher Oberfläche zusetzt;

die Suspension rührt und so viel Wasser davon entfernt, daß der Restwassergehalt weniger als 0,5Ji beträgt; und

die Suspension abdichtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Coenzym NADHp oder hydratisiertes NADH₂ ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an NADH_? mehr als

2 g/l beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel die folgenden Eigenschaften hat:

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1. niedriger Wassergehalt (Spur - 0

2. neutrales oder alkalisches pH;

3. wenigstens bei Raumtemperaturen flüssig;"

H. reagiert nicht anders mit NADHp als unter Ausbildung elektrostatischer (d.h. Wasserstoff-) Bindungen;
5. mischbar mit Wasser;
6. freie Solvolyseenergie (standard free energy of
solvolyses) niedrig (normale Resonanz).

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel ein Polyol mit 2 bis 4 Hydroxylgruppen und 2 bis 10 Kohlenstoffatomen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel 1,2-Propandiol ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der hygroskopische Peststoff abgetrennt wird,nachdem der Restwassergehalt auf weniger als 0,5# gesunken ist.
8. Verfahren nach Anspruch J, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension in bestimmten Mengen für quantitative Bestimmungen in Behälter abgefüllt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch Rühren der Suspension so viel
Wasser abgetrennt wird, daß die Suspension nicht mehr als 0,1# Wasser enthält, bevor sie abgedichtet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das inerte hygroskopische Mittel ein

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Molekularsieb, das in einer Menge von etwa 5 bis 20$ Vol./Vol. anwesend ist, ist.
11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das inerte hygroskopische Mittel ein Molekularsieb ist, das in einer Menge von etwa 5 bis 2L% Vol./Vol. anwesend ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekularsieb eine Teilchengröße von 1 bis 9,4 mm (2 bis 16 mesh) hat.
13. Stabilisierte flüssige Coenzymmasse, bestehend aus einer Losung, die weniger als 0,5$ Wasser und labiles Coenzym, das in wäßrigem Medium instabil ist, in einem nicht-reaktiven, mit V/asser mischbaren organischen Lösungsmittel, das wenigstens bei Raumtemperaturen flüssig ist, enthält und von der Wasser über C,5# durch wenigstens ^% Vol./Vol. an einem inerten festen hygroskopischen Mittel entfernt wurde, wonach die Masse in einem Behälter abgedichtet wurde.
14. Stabilisierte flüssige Coenzymmasse nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel bei Raum- und Kühlschranktemperaturen flüssig ist.
15· Stabilisierte flüssige Coenzymmasse nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das feste hygroskopische Mittel ein teilchenförmiges hygroskopisches Mittel mit hoher Oberfläche ist.

zeichnet, daß das Coenzym NADH_? oder hydratisiertes
16. Masse nach Anspruch 13, dadurch gekennch
ist.

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17· Masse nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichne
2 g/l beträgt.

zeichnet, daß die Konzentration an NADH- mehr als
18. Masse nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel ein Polyol mit 2 bis 4 Hydroxylgruppen und 2 bis 10 Kohlenstoffatomen ist.
19. Masse nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel 1,2-Propandiol ist.
20. Masse nach Anspruch 19* dadurch gekennzeichnet, daß das hygroskopische Mittel ein Molekularsieb ist, das in einer Menge von 2 bis 20# Vol./Vol. anwesend ist und eine Teilchengröße von 1,0 bis 9*4 mm (2 bis 16 meeh) hat.
21. Masse nach Anspruch 13* dadurch gekennzeichnet, daß das hygroskopische Mittel in der Masse bleibt, wenn diese in dem Behälter abgedichtet wird.
22. Masse nach Anspruch I3* dadurch gekennzeichnet, daß das hygroskopische Mittel vor dem Abdichten der Masse in dem Behälter entfernt wird.

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