DE2250886A1 - Reagensformulierungen zur untersuchung biologischer proben, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung - Google Patents

Description

Reagenaformulierungen zur Untersuchung biologischer Px-oben, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der klinischen Diagnosetests und insbesondere neue Reagentien und Methoden zur Durchführung biologischer Untersuchungen mit Körperflüssigkeiten.

Ein Gegenstand der Erfindung ist eine Reagensformulierung zur Durchführung von klinischen diagnostischen Tests mit biologischen Proben, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein festes, wasserlösliches, im wesentlichen wasserfreies, lagerbeständiges Gemisch darstellt, welches-" /

mindestens ein Reagens, das dazu imstande ist, bei einer Testreaktion unter Bewirkung einer meßbaren Veränderung in einem Testsystem teilzunehmen» und ·

' ein stickstoffhaltiges, nicht-ionogenes Polyoxyälkylen-Netztüittel, welches eine Struktur hat, die derjenigen entspricht, wenn Äthylendiamin in Gegenwart.eines Katalysators aufeinanderfolgend mit Propylenoxyd und Äthylenoxyd umgesetzt wird, ν/ο·ΐ>ei die Polyoxypropylen-Ketten des Netzmittels ein

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■* . ORIGINAL INSPECTED

mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 750 und etwa 6750 besitzen,

enthält.

Ein weitere^· Gegenstand der Erfindung i.sfc ein Verfahren zur Herstellung einer festen, wasserlöslichen, im wesentlichen wasserfreien, lagorbeständigen Reagensformulierung zur Durchführung von klinischen diagnostischen Tests mit biologischen Proben, das dadurch gekonnzeichnet ist, daß wan

(1) mindestens ein Reagens, das dazu imstande ist, bei einer Testreaktion unter Bewirkung einer meßbaren Veränderung in einem Testsystem teilzunehmen, mit einem festen, stickstoffhaltigen, nicht-ionogenen Polyoxyalkylen-Netzmittel,

welches eine Struktur hat, die derjenigen entspricht, wenn Äthylendiamin in Gegenwart eines Katalysators aufeinanderfolgend mit Propylenoxyd und Äjdiylenoxyd umgesetzt wird, wobei die Polyoxypropylen-Ketten des Netzmittels ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 750 und etwa 6750 besitzen, und einem Lösungsmittel für das Netzmittel vermischt, und daß man

(2) das Lösungsmittel unter Bildung eines im wesentlichen wasserfreien, freifließenden, wasserlöslichen, kornförmigen Feststoffs entfernt.

Schließlich ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von klinischen diagnostischen Tests mit biologischen Proben unter Verwendung einer Reagensformulierung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein festes, wasserlösliches, im wesentlichen wasserfreies, lagerbeständiges Gemisch, welches

mindestens ein Reagens, das dazu imstande ist, bei einer Testreaktion unter Bewirkung einer meßbaren Veränderung in einem Testsystem teilzunehmen, und

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ein stickstoffhaltiges, nicht-ionogenes^;Polyoxy-. alkylen-Netzmittel, welches eine Struktur hat, die derjenigen entSj) rieht,wenn Äthylendiamin in Gegenwart eines Katalysators aufeinanderfolgend mit Propylenoxyd und Äthylenoxyd umgesetzt wird, wobei die Polyoxypropylen-Ketten des Netzmittels ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 750 und etwa 6750 besitzen, enthält, ' ■

(1) in Wasser zur Bildung eines flüssigen'Reagens¹ auflöst,

(2) das flüssige Reagens mit einer Probe-unter Bildung eines Probe/Reagens-Testsystems vermischt, und daß man

(3) eine Veränderung in dem System mißt,welche von der Reaktion zwischen dem Reagens und der Probe herrührt.

Zur Bestimmung des Charakters von verschiedenen Körperflüssigkeiten ist eine große Vielzahl von Testreagentien und Verfahren verfügbar, um die Diagnose von bestimmten pathologischen Bedingungen zu unterstützen. Tests für die Bestimmung von verschiedenen Typen von biologischer Aktivität oder der Gegenwart und Menge von bestimmten biologisch aktiven Verbindungen ergeben Informationen, welche die Anwesenheit oder Abwesenheit von Krankheiten oder anderen physiologischen Störungen anzeigen. Bei diesen Tests wird die biologische Probe5, die analysiert v/erden soll, z.B. eine Probe einer Körperflüssigkeit, in. typischer Weise mit einer flüssigen Reagensformulierung vermischt, die ein Reagens enthält, welches dazu imstande ist, eine Reaktion zu. bewirken, die eine meßbare Veränderung in dem Probe/Reagens-System bewirkt. Oftmals ist die bei solchen Tests stattfindende Reaktion eine enzyraatische Reaktion. Bestimmte Tests sind tatsächlich so ausgestaltet, daß die Anwesenheit eines bestimmten Enzyms bestimmt wird. In solchen Fällen kann die Anwesenheit eines besonderen Enzyms und die Reagensformulierung ein Substrat enthalten, mit welchem das zu bestimmende Enzym sich umsetzt. In anderen Fällen

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kann die Bestimmung nach einem Material durchgeführt.werden* welches als ein reaktives Substrat bei einer enzymatisch katalysierten Reaktion bekannt ist. In jedem Fall enthält die Reagensformulierung üblicherweise ein Enzym, ein Coenzym oder beide. Da die katalytische Aktivität der meisten. Enzyme auf eine besondere Reaktion spezifisch ist, können.Test» reagentien formuliert werden, die wirksam sind, um spezifische biologische Komponenten oder Aktivitäten selbst in einer komplexen Körperflüssigkeit zu bestimmen, die eine große Anzahl von anderen Komponenten enthält, die den Erhalt einer chemisch reinen Analyse stören würden. Darüberhinaus haben viele der Komponenten, die bestimmt werden sollen,.hochkomplexe chemische Strukturen, die selbst in Abwesenheit von Verunreinigungen eine direkte chemische Analyse schwierig gestalten würden.

..Nachteiligerweise sind Enzyme und Coenzyme im allgemeinen ziemlich empfindliche Materialien, die leicht durch Erhitzen denaturiert v/erden können und die auch beim Lagern zersetzt werden. Viele der Substratmaterialien, die bei biologischen Testreagensformulierungen verwendet werden, sind gleichermaßen instabil. Flüssige Reagentien, die solche Komponenten enthalten, sind daher im allgemeinen nicht lagerungsfähig und sie müssen daher kurz vor dem Gebrauch bei dem klinischen Diagnosetest frisch hergestellt werden. Wegen der relativ großen Kosten von Enzymen und Coenzymen und der Geschicklichkeit, die erforderlich ist, um eine Reagensformullerung herzustellen, die diese Materialien enthält, die zum Erhalt genauer klinischer Diagnosetestergebnisse verwendet'werden, hat die Instabilität der flüssigen Formulierungen eine erhebliche Forschungsarbeit motiviert, um Reagentien in relativ lagerungsstabiler Form herzustellen. Ein Großteil dieser Arbeiten ist auf die Entwicklung von festen, trockenen und wasserlöslichen Formulierungen gerichtet gewesen, die zum Zeitpunkt des Tests in V/asser aufgelöst werden können,'um ein

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frisches, flüssiges Reagens zu erhalten, das für den Test geeignet ist.

Eine trockene Reagensformulierung, die für die Verwendung zur Herstellung von flüssigen Reagentien für routinemäßige klinische diagnostische Tests zufriedenstellend ist, sollte einer Anzahl von Kriterien genügen. Sie muß ohne weiteres in einem Lösungsmittel löslich sein* das mit der biologischen Probe verträglich ist, gewöhnlich Wasser. Sie sollte dazu imstande sein, proteinhaltige Materialien in der Probe aufzulösen. Darüberhinaus sollte sie ohne weiteres in geeignete Packungen abpackbar sein und sicll in dem Lösungsmittel rasch auflösen, um ein flüssiges Reagens mit geeigneter Stärke für einen gegebenen Test oder eine gegebene Testreihe zu ergeben.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, verbesserte trockene» wasserlösliche Reagerisformulierungen für die Durchführung von klinischen Diagnosetests zur Verfügung zu stellen, welche ohne weiteres granuliert und in Granulatform transportiert oder gelagert werden können. Insbesondere soll nach der Erfindung bezweckt werden, solche Reagensformulierungen in freifließender, kornförmiger Form mit konsistenten Schüttdichten herzustellen, so daß diese für einmvolumetrisehen Abpack- · oder Tablettierungsbetrieb mit konsistenten Gewichtsmengen geeignet sind. Weitere Zwecke der Erfindung schließen die Zurverfügungstellung von trockenen Reagensformuiierungen mit einer hohen Kapazität zur Solubilisierung von Proteinen, die Zurverfügungstellung von solchen Formulierungen mit einem hohen LagerungsStabilitätsgrad, die Zurverfügungstellung von Methoden zur Herstellung der trockenen Reagensformulierungen der Erfindung und die Zurverfügungstellung von Methoden zur Vornahme von klinischen Diagnosetests mit solchen Reagensforraulierungen ein.

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Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Reagensformulierung zur Durchführung von klinischen Diagnostiktests mit biologischen Proben. Die Reagensformulierung enthält ein festes, wasserlösliches, im v/esentlichen wasserfreies, lagerbeständiges Gemisch, das ein Reagens, welches dazu imstande ist, bei einer Testreaktion teilzunehmen, um eine meßbare Veränderung in einem Testsystem zu ergeben, und ein festes, stickstoffhaltiges Polyoxyalkylen-nicht ionogenes-Netzmittel enthält. Das Netzmittel hat eine Struktur, die derjenigen entspricht, welche erhalten wird, wenn Äthylendiamin aufeinanderfolgend mit Propylenoxyd und Äthylenoxyd in Gegenwart eines Katalysators umgesetzt wird, wobei die Polyoxypropylen-Ketten des Netzmittels ein mittleren Molekulargewicht zwischen etwa 750 und etwa 6750 haben·

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung von klinischen diagnostischen Tests mit biologischen Proben, bei welchem die obengenannte Reagensformulierung verwendet wird. Dieses Verfahren besteht darin, daß man die Reagensformulierung in Wasser auflöst, um ein flüssiges Reagens herzustellen, das flüssige Reagens mit einer Probe zur Bildung eines Probe/Reagens-Testsysteras vermischt und daß man eine Veränderung in dem System mißt, welche von · der Reaktion zwischen dem Reagens und der Probe herrührt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren zur Herstellung der neuen Reagensformulierung. Bei diesem Verfahren geht man so vor, daß man ein Reagens» das dazu imstande ist, bei einer Testreaktion unter Bewirkung einer meßbaren Veränderung in dem Testsystem teilzunehmen, ein nicht-ionogenes stickstoffhaltiges Polyoxyalkylen-Netzmittel des oben angegebenen Charakters und ein Lösungsmittel für das Netzmittel vermischt und daß man das Lösungsmittel unter Bildung eines im wesentlichen wasserfreien, wasserlöslichen, freifließenden, kornförmigen Feststoffs entfernt.

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Die Zeichnung zeigt die Molekularstruktur von verschiedenen handelsüblichen,, nicht-ionogenen Netzmitteln, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sind. Die Koordinaten jedes Punkts des Gitters entsprechen der Kettengröße der hydrophilen Polyoxyäthylen- und hydrophoben Polyoxypropylen-Teile eines jeweiligen Netzmittels. Die in dem Gitter ange~ gebenen Grenzlinien trennen die Flächen, die Netzmittel einschließen, die verschiedene physikalische Zustände.einnehmen.

Zur Erleichterung der- Herstellung von flüssigen Reagentien aus festen Formulierungen in dem klinischen Laboratorium ist es sehr anzustreben, die festen Formulierungen in geeigneten gleichförmigen Mengen abzupacken. Somit können z.B. die festen Formulierungen, mit der richtigen Menge des Reagens in jeder Kapsel oder Tablette zur Vornahme eines einzelnen Tests eingekapselt oder tablettiert werden. Alternativ kann auch eine Vieltes^abpackung hergestellt werden, wobei die richtige Menge des flüssigen Reagens hergestellt wird, um eine spezifische Anzahl von Tests durchzuführen.

Wenn eine feste Reagensformulierung in gleichförmigen Mengen abgepackt wird, dann ist die Genauigkeit der Abmessung der festen Materialien in jede Kapsel, Tabletter oder Vieltestabpackung wichtig. Die Dosierungseinrichtung, die zur Abgabe der festen Materialien für die Abpackungs- und Tablettierungsvorgänge verwendet wird, arbeitet jedoch fast immer auf volumetrischer Grundlage. Wenn daher das feste Material nicht freifließend ist und eine konsistente Schüttdichte hat, dann kann es nicht in konsistenten Gewichtsmengen für jede Abpackungs-, Kapselungs- oder Tablettierungsstation, die mit herkömmlichen Einrichtungen arbeiten, geliefert werden.

Zur Bildung einer festen Formulierung in freifließender Form mit konsistenter Schüttdichte wird vorzugsweise vor dem Abpacken eine Granulierung vorgenommen. Die Granulierung wandelt

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©in pulverförmiges Material in ein Material ti»,, dfs aus kleinen Agglomeraten mit relativ gleichförmiger Größe besteht. ',In ge« eignetcr Weise hergestellt, ist das Granulat freifließend, hat eine konsistente Schüttdichte und kann bei de®.. AbpacJiungsvor-« gangen leicht in Dosierungseinrichtungen gehandhabt.werden. Zur Granulierung eines pulverförmigen Materials wird das Pulver in typischer Weise mit einem Bindemittel, gelöst in einem flüchtigen Lösungsmittel, vermischt, naß gesiöpt, zur Entfernung des Lösungsmittels getrocknet und nach der Trocknungsstufe trockengesiebt. Zusätzlich zu dem Bindemittel wird normalerweise eine Schmiersubstanz in die Granulierungsiijasse eingearbeitet, um die Fließeigenschaften der Körner weiter zu steigern, insbesondere unter den Kompressionsspannuaigeri der Tablettierungsvorgänge.

Wie bereits ausgeführt, sollen feste Formulierungen, die als Reagent!en für die Vornahme von klinischen Diagnosetests mit biologischen Proben geeignet sind, bestimmte weitere Eigenschaften haben. Da sie in V/asser aufgelöst werden, um ein flüssiges Reagens zu ergeben, sollten alle Komponenten mit Einschluß des Bindemittels leicht wasserlöslich sein. Da viele der Tests enzymatische Reaktionen und/oder proteinhaltige Substrate vorsehen, sollten die Formulierungen Detergens-Eigenschaften haben, um die Proteine aufzulösen bzw. zu solubilisieren.

Es wurde nun gefunden, daß die obigen Ziele erreicht werden können und daß wirksame klinische Reagensformulierungen für die Bestimmung von bestimmten biologischen Eigenschaften von Körperflüssigkeiten in freifließender, kernförmiger Form durch die Verwendung von besonderen stickstoffhaltigen Polyoxyalkylen-nicht-ionogenen-Netzmitteln hergestellt werden können. Die unter Verwendung dieser Netzmittel granulierten Testformulierungen sind für Präzisionsabpackungs- und.Tablettierungsvorgänge geeignet. Aufgrund ihres freifließenden Cha-

_ Q: „

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rakters und der gleichbleibenden Schüttdichte können sie entweder zu Abpackungs- oder Tablettierungsvorgängen mit gleichbleibenden Gewichtsmengen durch eine volumetrische Dosierung zugeführt werden. Daher können klinische Testreagentien, die an einer Zentralstelle außerhalb des klinischen Laboratoriums hergestellt worden sind, dazu verwendet werden, um flüssige Testreagentien für den klinischen Gebrauch herzustellen, ohne daß durch den klinischen Chemiker oder einen Techniker Abwägungs-Analyse- oder andere Vorgänge notwendig sind.

Die Stickstoff enthaltenden Netzmittel, die für die Formulierungen der Erfindung geeignet sind, besitzen die einzigartige mehrfache Fähigkeit, daß sie als Bindemittel, Schmiermittel und als Löslichkeitsmacher für das Protein wirken. Darüberhinaus sind sie selbst wasserlöslich, wodurch die Auflösung, der Reagensformulierungen in Wasser zur Bildung von klinischen flüssigen Reagentien beschleunigt wird. Diese Netzmittel werden unter dem Warenzeichen "Tetronic" von Wyandotte Chemical Corporation vertrieben. Sie werden normalerweise durch eine aufeinanderfolgende Umsetzung zuerst von Propylenoxyd und sodann von Äthylenoxyd mit Äthylendiamin in Gegenwart eines alkalischen oder sauren Katalysators hergestellt. Normalerweise werden diese Netzmittel bei erhöhten Temperaturen unter Verwendung von alkalischen Katalysatoren wie Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Natriumalkoxyd, quaternären Ammoniumbasen und dergl. hergestellt. Es sind auch andere Methoden zur Herstellung dieser Netzmittel verfügbar.

Die Eigenschaften und der physikalische Zustand von nichtionogenen Netzmitteln mit Strukturen, weldhe denen entsprechen, die sich von Äthylendiamin, Propylenoxyd und Äthylenoxyd herleiten, variieren mit der Länge der Polyoxypropylen- und Polyoxyäthylen-Ketten. Wie die Zeichnung zeigt, hängt der physikalische Zustand dieser Netzmittel zum großen Teil von dem Verhältnisgewicht des Netzmittels ab, welches durch"

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die Polyoxyäthylen-Ketten gebildet wird. Der physikalische Zustand wird aber auch durch das mittlere Molekulargewicht der Polyoxypropylen-Teile beeinflußt. Die Polyoxypropylen-Ketten sind hydrophob, während die Polyoxyäthylen-Ketten hydrophil sind. Somit sind die Netzmittel, die Polyoxypropylen-Einheiten mit niedrigem Molekulargewicht haben, stärker wasserlöslich als diejenigen, die Polyoxypropylen-Einheiten mit höherem mittlerem Molekulargewicht haben. Die auf der Vorderseite des Gitters bzw. Netzes angegebenen Zahlen entsprechen den Jeweiligen Gliedern der Tetronic-Reihe. Jede Zahl befindet sich an einem Punkt des Gitters bzw. Netzes, dessen Koordinaten den Polyoxyäthylen- und Polyoxypropylen-Kettengrößen des jeweiligen Produkts entsprechen, das durch die Zahl handelsüblich angegeben ist.

Für die Formulierungen gemäß der Erfindung kann im wesentlichen jedes Netzmittel verwendet werden» dessen Struktur durch die Koordinaten eines Punkts definiert ist, welcher in dem Gitter bzw. Netz der Zeichnung liegt. Es wird jedoch bevorzugt, daß das Netzmittel fest oder mindestens halbfest ist. Ein größerer Teil der festen Netzmittel kann zufriedenstellend in eine Reagensformulierung eingearbeitet werden. Somit kann eine größere Binde- und Schmierfähigkeit erhalten werden, ohne daß die anderen Eigenschaften der Formulierung nachteilig beeinflußt werden. Zweckmäßigerweise werden in die Reagensformulierungen 2,5 bis 5 Gew.% der bevorzugten festen Netzmittel eingearbeitet. Wenn flüssige Formulierungen verwendet werden, dann ist es nicht immer möglich, mehr als 2 oder 3 Gew.% Netzmittel einzuarbeiten, ohne daß der Formulierung ein etwas wachsartiger Charakter verliehen wird. Die Verwendung von 2 bis 3 Gew.% eines flüssigen Tetronic-Netzmittels ergibt ein geeignetes Produkt, doch sind die Binde- und Schmierfähigkeiten des Netzmittels bei einem solchen Wert noch nicht immer vollkommen ausgenützt. Körner mit den am meisten gewünschten

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Eigenschaften werden erhalten, wenn man feste oder halbfeste' Netzmittel verwendet»

Da die trockenen Reagensformulierungen dieser Erfindung in Wasser zur Verwendung für klinische diagnostische Tests aufgelöst werden, ist es weiterhin anzustreben, daß die Netzmittelkomponente die Auflösung des Granulats beschleunigt. Es wird somit bevorzugt, daß das Netzmittel so hydrophil wie möglich ist, d.h. daß das Molekulargewicht des hydrophoben Polyoxypropylen-Anteils des Netzmittels relativ niedrig ist. Somit sind die bevorzugten Netzmittel für die Verwendung für die Formulierungen gemäß der Erfindung diejenigen, die im physikalischen Zustand sowohl fest als auch halbfest sind und die relativ hydrophil sind. Feste Netzmittel wie Polyoxyäthylen-Ketten mit einem mittleren Molekulargewicht von weniger als etwa 4000 werden besonders bevorzugt, wobei die am meisten bevorzugten Netzmittel solche sind, deren Polyoxypropylen-Ketten ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 2750 und etwa 3750 besitzen und deren gewichtsprozentualer Anteil von Polyoxyäthylen-Einheiten zwischen etwa 70 und etwa B0% liegt. Zwei besondere Netzmittel, deren Gewichts- und Struktureigenschaften in die letztgenannten Grenzen fallen, sind diejenigen,, die unter den Warenzeichen "Tetronic 707" und "Tetronic 9QS¹* vertrieben werden. "Tetronic 707" hat ein PolyoXypropylenhydrophobes Molekulargewicht in der Gegend von 2750· und einen Anteil an Polyoxyäthylen-Einheiten von etwa 70!$« "Tetronic: 908" hat ein Polyoxypropylen-Molekulargewicht von etwa 3750 und einen Anteil von Polyoxyäthylen-Einheiten von etwa 80 Gew.%* Gute Ergebnisse werden auch mit Netzmitteln erhalten, deren Polyoxypropylen-Ketten ein mittleres Molekulargewicht zwischen 750 und 4000 besitzen, "wobei der Anteil der Polyoxyäthylen-Einheiten zwischen etwa 35 Gew.?6 und etwa 6.5 Gew.?& liegt. Andere Netzmittel innerhalb des, Gitters bzw. Netzes der Zeichnung, sind ziemlich zufriedenstellend,, aber weniger wirksam als diejenigen, die durch die rechte untere ■ Ecke des Gitters veranschaulicht werden«

- HZ -

Zusätzlich zu dem vorteilhaften Effekt auf die Granulierung und Auflösung der trockenen klinischen Testreagensformulierungen hat sich gezeigt, daß Netzmittel des vorgenannten Charakters dazu wirksam sind, um Proteine aufzulösen bzw. zu solubilisieren. Wie oben angegeben, ist dies sehr vorteilhaft, da Enzyme und andere proteinhaltige Stoffe, die entweder von der Reagensformulierung oder der Probe herrühren, üblicherweise an den Testreaktionen teilnehmen. Durch die Solubilisierung bzw. Auflösung des Proteins dient das Netzmittel dazu, um den Fortschritt der Testreaktion zu erleichtern und somit die Wirksamkeit der Reagensformulierung zu erhöhen. Es wird daher ersichtlich, daß die Einarbeitung dieser Netzmittel in klinische Testformulierungen vielfache Vorteile hinsichtlich der Herstellung, der Abpackung» der Auflösung und der Verwendung der klinischen Reagensformulierungen mit sich bringt.

Es wurde weiterhin entdeckt, daß die trockenen klinischen Reagensformulierungen der vorliegender Erfindung ziemlich stabil sind und daß sie im allgemeinen gute Lagerungsbeständigkeiten besitzen. Obgleich der hohe Lagerungsstabilitätsgrad nicht genau einer besonderen Komponente oder Kombination von Komponenten zugeordnet werden ka,nn, erscheint es doch so, daß eine solche Stabilität eine allgemeine Eigenschaften von trockenen klinischen Reagensformulierungen ist, die die besonderen nicht-ionogenen stickstoffhaltigen Netzmittel gemäß der Erfindung enthalten. Somit stellt die Fähigkeit, eine Lagerungsstabilität zur Verfügung zu stellen, einen weiteren Aspekt der vielfachen Funktion dieser Netzmittelart in solchen Formulierungen dar.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Reagensformulierungen wird das Netzmittel mit einem flüchtigen Lösungsmittel und mindestens einem Reagens vermischt, welches dazu imstande ist, bei einer Testreaktion unter Bewirkung einer meßbaren Veränderung in einem Reagens/Probetestsystem teilzunehmen. Das Netz-

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mittel sollte bis zu der Menge löslich sein, die in dem verwendeten Lösungsmittel vorhanden ist. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Methylenchlorid,. Chloroform, Methanol, Benzol, Wasser, Methanol/Wasser und Chloroform/Methylenchlorid. Nach gründlichem Vermischen und geeigneter Größenklassifizierung wird das Lösungsmittel unter Bildung eines Granulats entfernt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Bestandteile der Formulierung in trockener, teilchenförmiger Form gründlich in einem mechanischen Mischer vermengt. Bei. laufendem Mischer wird eine Granulierungslösung zugegeben, die das Lösungsmittel und das Netzmittel, vorzugsweise ein.solches mit dem Ifarenzeichen Tetronic-707 oder Tetronic 908 enthält. Weiteres Lösungsmittel wird in dem Maße verwendet, wie es notwendig ist, um kornförmige Agglomerate der gewünschten Größe und Feuchtigkeit zu erhalten.

Das resultierende nasse Granulat wird durch ein grobes Sieb, beispielsweise mit einer lichten Maschenweite von 2,00 mm (10 mesh), gesiebt und sodann auf Böden in dünnen Schichten ausgebreitet und bei vermindertem Druck, beispielsweise 635 mm Hg (25" Hg) oder weniger getrocknet. Je nach der Wärmeempfindlichkeit der Formulierung wird das Trocknen normalerweise bei Raumtemperatur oder bei mäßig erhöhter Temperatur (bis zu etwa 37°C) durchgeführt. Im allgemeinen sollte die Tiefe der nassen Körner in den Böden nicht über 1,27 bis 1,90 cm (1/2 bis 3/4 inch) hinaus gehen*.

Nach beendigtem Trockenzyklus wird das getrocknete Granulat durch ein feineres Sieb, beispielsweise mit einer lichten Maschenweite von 0,84 bis 0,59 mm (20 bis 30 mesh),wieder gesiebt, gründlich durchgemengt und in Behälter verpackt, die im wesentlichen feuchtigkeitsundurchlässig sind. Da die Komponenten der Reagensformulierung häufig wasser empfindlich sind,-

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sollte die Formulierung nicht einer relativen Feuchtigkeit von mehr als etwa 5% nach Entnahme aus dem Trockner* ausgesetzt werden. #

Die Reagensformulierungen der Erfindung sind so ausgebildet, daß sie in kleinen, gleichförmigen Packungen abgepackt werden können. So kann beispielsweise eine genügende Menge der Reagensformulierung für eine einzige Analyse tablettiert oder in einer Kapsel abgepackt v/erden. Die Reagensformulierungen sind auch so ausgebildet, daß sie in solchen Behältern wie Folienstreifenpaketen unter Verwendung von automatischen Abpackvorrichtungen abgepackt werden können. Hierbei kann eine genügende Menge der Reagensformulierung,um die geeignete vorgewählte Testzahl wie 10, 25 oder 50 Tests durchzuführen, genau in einem einzigen Folienpaket abgepackt werden. Der Verbraucher löst dann lediglich den Gehalt der Vieltestpackung la einem * vorgewählten Wasservolumen auf und verwendet einen geeigneten aliquoten Teil des resultierenden flüssigen Reagens für die Durchführung der Versuchsreihen zur Bestimmung der gewünschten biologischen Substanz oder Eigenschaften.

In manchen Fällen, je nach Natur der Komponenten und ihrer Verträglichkeit können alle Reagentien, die für eine einzige Analyse oder Bestimmung notwendig sind, in einer einzigen Formulierung eingeschlossen werden. In anderen Fällen können es Unverträglichkeiten und/oder andere Erwägungen zweckmäßig machen, bestimmte Reagentien abzutrennen, in welchem Falle zwei oder mehr Reagensformulierungen gemäß der Erfindung hergestellt werden.

Zur Durchführung der klinischen diagnostischen Tests gemäß der Erfindung wird das flüssige Reagens, das durch Auflösen der trockenen Formulierung in einer vorgewählten Wassermenge hergestellt worden ist, mit der biologischen Probe in einem Vorgewählten volumetrlsehen oder Gewichtsverhältnis* vermischt.

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Unter Zuhilfenahme von geeigneten Instrumentierungen wird das resultierende Probe/Reagens-System hinsichtlich des Vorliegens, der Abwesenheit, der Natur und des Ausmaßes ·'. von physikalischen, chemischen oder biologischen Veränderungen untersucht. Solche Veränderungen werden gemessen, um die gewünschte Information für die klinische Diagnose zu liefern»

Beispiele für erfindungsgemäß hergestellte Reagensformulierungen, λ-relche zur Bestimmung von Haemoglobin, Blutharhstoffstickstoff, Gesamtprotein, Serumglutamiiisäure-oxalessigsäuretransaiainase, alkalische Phosphatase, Glucose, anorganischer Phosphor, Lactatdehydrogenase-L, Serumglutaminsäure-brenz-* traubensäure-transaminase, Harnsäur« (colorimetrisch) und Harnsäure (u.v.) geeignet sind, sind in Tabelle I zusammengestellt. Die bevorzugten Zusammensetzungen dieser Reagensformulierungen und Verfahren zu ihrer Herstellung sind in den anschließenden Beispielen beschrieben.

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Tabelle I

Seispiele für klinische Testreagensformulierungen

For- Formulierungsmulietyp rung

Trockene Bestandteile (Reagentien etc.) Granulie

slösung

Name/Formel

Tetronic Poly- CH₉CX (g) äthylen- *"
glykol (ml
^ 6000 (g)

Theoretische Ausbeute (gj

Nr.der

Tests

(Tausend)

ο co B

Reagensformulie- NAHCO3 rung für die Haemo-ICjFe (CN)₆ globinuntersuchung KCN

Mannit

alkalische Chlor- Matriumdichloriso· reagensformulier, cyanurat f.d. BUlT-Analyse LiOH

Mannit

chromogene Reagensformulier » f.d.BUN-Analyse

Katriumsalicylat

Natriumnitroferri"

cyanid

30

15
44

(si

200 300

200 100

(a) 250

(b) 100

1000

555 1250

30

10

a) gibt die als Träger für Tetroaic 707 verwendet« CH^Cl^-Menge wieder te) gibt die zur Erzielung einer optimalen Granulieruag verwendet© zusmtElie&e . Menge wieder

CX) CO

Tabelle

	. Beispiele für klinische Testrs	Trockene Bestandteile·	sagensformulierungen	579)	Granuli erungslö sung	CHQ	Cl9	100 200	Theoreti	Nr.der:	1
For	Fo rmuli erungs-	(Reagentien etc.)			Tetronic PoIy-				sche Aus	Tests
mulie	typ		500	707 (g) äthylen-		CmI)(I)	1500	beute (g)	(Tausend)
rung		Name/Formel Gew.(g)	750 2000	glvkol			250
			500	6000(ß)
.D	kornförmige En-	Urease/EDTA-Formu- j	15 6	\ U / f \	600	30
ο " ■'	zymfο rmuli er.f. d.BUN-Analyse	lierung(36 000 I.U.) J Mannit J		(j)
«ο Ε	Reagensformul.	Kupfer(II)-tartrat	100-		3850	50
00	f.d.Gesamt	(wasserfrei)
co	pro teinanalyse	Natriumtartrat(2H2O) LiOH
""S. ... O		RENEX-35

(1) (a) gibt die als Träger für Tetronic 707 verwendete CH₂Cl₂""^Men£^e

(b)' gibt die zur Erzielung, einer optimalen Granulierung verwendete zu-
■"- - sätzliche CHgClg-Menge wieder * "

P OO OO CD

Tabelle I

Beispiele für klinische TestreagensforrrAilleruri^en

For- Formulierungsinulietyp

rung

Trockene' Bestandteile (Reagentien etc.)

Name/Formel Gr&nuli erurigs ι ο si.mg

^_^ Tetronic PoIy-

Gew.(g) 707 (g) äthylen-

glykol

Theoreti- Nr.der sehe Aus- Tests beute(g) (Tausend)

ω
ο
to

Coenzyni-Formulierung f.d, GOT-Analyse

Substratformul. f.d.GOT-Analys e

L-Asparaginsäure I4DH-Formuüerung (enthaltend 6.0 mg MDH: 1,4 I.U.)

NADH-Formulierung (enth.0,5 mg NADH) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Bernsteinsäure. Natrium-cc-ketoglutarat Mannit

H Reduktionsförmul. Ascorbinsäure f.alkalische Sulfaminsäure Phosphatase-Analyse

80

1875)
187,5)

200)
765)

3250)
1600)

<(1)(a) und (b) haben die zuvor gegebene Bedeutung 25

150

800

525

25

500 200

fei

(a) 500

(b) 200

990 5000

50 50

ro

cn ο ι

ool cn

Tabelle I
Beispiele für klinische Testreagensforrnulierungen

For-

Formulierungsmulistyp rung

Trockene Bestandteile Granulierungslösung Theoreti_r(Reagentien etc.") . !Tetronic Poly- CH₀Cl₂ sehe Aus-Name/Formel Gew. (g)¹ 707 (g) äthylen- *~ beute(g)

glykol (ml)(i)

Nr.der

Tests

(Tausend)

O IO €30

OO O to

Molybdateormul. f.d.alkalische Phosphätase-Analys e

Substratformul. f.d.alkalische Phosphatase-Analyse

Chrömo g enfο rmul. f.d.Glucose-Analyse

Natriummolybdat

(<2#H20) Duponol ME.trocken.

475) 737,5)

Dinatrium-ß-glycero-

phosphat 500) Tris-(hydroxy-

methyl)-aminomethan 1500)

Bernsteinsäure . 12.5)

Duponol ME trocken 500)

o-Dianisidin«2HCl 7,!

Mannit 423, ι

.14,4 4,5

(a) 300

3
150

(a) 400

(b) ioo

(a) 150

(b) 1

25

1250

2600

50

50

30 ι

(1) (a) und (-b) haben die zuvor gegebene Bedeutung ro ro »

OO ι

OO

CD

Tabelle I Beispiele für klinische Testreagensfornulierungen

For- Fonaulierungsmulietyp rung'

Trockene Bestandteile (Reagentlen etc.) Name/Formel

Gew. (,g)

Granulierungslosung

Tetronic Poly- CH₂Cl₂ (g) äthylen-

glykol . (ml)(i) _ 6000(1;)

Theoretisehe Ausbeute (g)

Nr. der

Tests

(Tausend)

CiI O «Ο

L Pufferfonsuii©- HaH₂PO₄-H₂O

^ff^daiucos*" ^

Mannit

sprühgetrocknetes

Gummiarabikum

Enzymformulierung Glucoseoxydase, f.d.Glucose* stabilisiert Analyse Mannit

oxydase Hannit

(1) (a) und (b) haben die zuvor gegebene

(2) Lösungsmittel ist Wasser anstelle von

311,4)

190,8)

52,8)

30,0) 520)

15,0

15,0 3,0

(a) 40⁽²⁾

(b) 5-io⁽²⁾

U) 40$?^ (b) 10^u;

450

30

30

cn

Tabelle I Beispiele für klinische Testreagensformulierung'en

For- Forrauli erungs- Trockene" Bestandteile Gramilierungslösung

muli©- typ ■ (Reagentien etc.) rung ' ' · Name/Formel .Gew.(g) Tetronic Poly- CH₉Cl₉
(g) äthylen- · *
glykol (ml)(i)
6000(g)

Theoretische Ausbeute (g)

Nr.der

Tests

(Tausend)

Reduktionsforrniü f₉ d·anorganische Ehosp^or-Analyse

Molybdatformul.
£.d.anorganisehe Phosphor-Analyse

Co enzymformuli erung, f .d.Lactatdehydrogenase-Analyse

Ascorbinsäure SuIfaminsäure Duponol ME trocken

Tris-(hydroxymethyl) · aminomethan Duponol ICE trocken Natriummolybdat (<2% H₂O),

NAD modifiziert] (=225 g NAD) Mannit

1500) 470)

950) 1190)

fei

1000 500	4950
475 175	3000
500 250	1250

50

100

50

(1) (a) und (b) haben die zuvor gegebene Bedeutung

Tabelle I Beispiele- für klinische Testreagensformulierungen

For- Fornulierungs- Trockene Bestandteile Granulie run p;slö sung mulie- typ (Reagentien etc»)

rung Name/Formel

_____^ Tetronic Poly- CH^Cl-Gew.(g) 707 (g) äthylen-

glykol (ml)(1)
6000(g)

Theoretische Ausbeute (g)

Nr.der

Tests

(Tausend)

Ξ R. co

Lithiumlactat 2250) Tris-(hydroxymethyl)-

aminomethan

NaHCO₃

Renex

NADH-Formulierung

(0,4 mg NADH äquiv.)

IiDH-Formuli erung

(2 Einheiten LDH

äquiv.)

DL-Alanin 1200) 50,4 Natriumpho sphat, zweibasisch ; 585) Natriumphosphat ^. einbasisch 75)

(1) (a) und (b) haben die zuvor gegebene Bedeutung

Substrate onnul. f.d.Lactatdehydrogenase-Analyse

Coenzymformul. f.d.Serumglutamins äurebrenztraubensäure-transaniinas e-Analys e 25

(a) 500
001175

3200

50

(a) 200

(b) 70

15

K)

cn

CD OO

OO

CD

Tabelle I : ' ' . ' '' ·

Beispiele fur klinische Testreagensformulierungen

For- Fonnulierungs- Trockene Bestandteile GranulierungslSsung ... ',· Theoreti- Nr.der

mulie- typ ' (Reagentien etc.) · Tetronic Poly- CH«C1_P sehe Aus- Tests

rung ' ■ ■" Name/Formel -Gew.CU 707 (g) äthylen- beute(g) (Tausend)

glykol CmI)(1)

S Substrat£öraul*f. (vergl. Formulierung G oben) .

_ω d.Serumglutamin- · - >

ο säure-brenztrauben- ■ .

to säure-transaminase- j

<o Analyse - ^L ■ '■ . -

» .T Enzymformulie- Uricase-Formu- .

v. rting für Harn- lierung(0,05 -

ο säure-Analyse Einheiten äquiv*) ._-rp --_N .' „ / \ -jk ' ' ·? ς ♦

μ Glycin - 113,25) 4,50 (a) 25 7,5

^ω ' Ratrittmcarbonat, , _ΛΑ ■ '

** wasserfrei 39,75). . , (Ta)-IO

U Kupferreagensfor- Tris-(hydroxymethyl)- '_

imilier.f .d.Harn- aminomethan ^ 112,50) 7,05 · (a) 15 234 7,5 säure-Analyse Natriumbicarbonat 112,50) Ib/ 5

• Kupfersulfat,
wasserfrei 1,95)

(1) (a) imd (b) haben die zuvor gegebene Bedeutung

Tabelle I Beispiele für klinische Testreagensfornnilierungen

For- Formulierungsmulietyp rung

Trockene' Bestandteile (Reagentien etc.)

Name/Formel

Gew.

Granuli erungslö*sung
Tetronic PoIy-(g) äthylenglykql_

Sf-

Theoreti- Nr.der sehe Aus- Tests beute(g) (Tausend)

O GO OO

Neocuproinfor- Neoeuproin *HC1

mulierung f.d. Renex Harnsäure-Analyse

Leerformulierung Uricase Placebo

f.d.Harnsäure- Glycin

Analyse Natriumcarbonat

wasserfrei

5,25) 4,75 150)

19,50) 4_t5O 113_t25)

39,75)

83

30
10

25
10

160

177

7,5

7,5

(1) (a) und'(b-)-haben-die ztreor gsgebeae Bedetrtuag

* m co

„25 _ 22508B6

Beispiel 1

Haemoglobin-Reagensformulierunff und Analys e

Die Zusammensetzung der Reagensformulierung, die für die Haemoglobin-Analyse geeignet ist, ist als Formulierung A in Tabelle I angegeben.

Zur Herstellung dieser Formulierung wurden Natriurabicarbonat (300 g), gemahlenes Kaliumferricyanid (50 g) und Kaliümcyanid (30 g).zuerst in eine .Hobart-Kugel gegeben und mit einem Spatel aus rostfreiem Stahl vermischt» Sodann wurde Mannit (590 g) zugegeben und das resultierende Gemisch wurde 5 Minuten in dem Mischer durchbewegt. Bei weitergeführter Durehbewegung wurde eine Lösung von Tetronic 707 (30 g) in Methylenchlorid (200 ml) zugefügt. Sodann wurde eine weitere Menge von Methylenchlorid (300 ml) zugesetzt, um die richtige Granulierung zu erhalten. .

Das nasse Granulat wurde durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 2,00 mm (10 mesh) aus rostfreiem Stahl gesiebt und die naßgesiebten Materialien wurden in Trockenböden aus Pyrexglas mit den Abmessungen 20_r3 x 30,5 cm (8 χ 12 inch), mit einer Dichte zwischen etwa 1,27 cm (1/2 inch) und etwa 1,90 cm (3/4 inch) in Jedem Boden gebracht. Das Granulat wurde sodann in einem Vakuumofen 15 Stunden bei einer Temperatur von' 35⁰C und einem Druck von 635 mm (25") Hg getrocknet.

Die getrocknete Granulierung wurde aus dem Vakuumofen entnommen und in eine Umgebung gebracht, wo die relative Feuchtigkeit höchstens 5% betrug. Das getrocknete Granulat wurde sodann durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl mit einer lichten Maschenweite von 0,84 mm (20 mesh) gesiebt, wozu ein Erweka-Oszillator verwendet wurde. Das gesiebte, getrocknete Granulat wurde in einen P.K.-Mischer überführt und 5 Minuten gemischt.' Sodann wurde es in dichtabschließende Behälter abgepackt. Es wurden

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ungefähr 1000 g einer wasserlöslichen, im wesentlichen wasserfreien Reagensformulierung, die für 50 000 Tests ausreichend war, erhalten.

Es wurde gefunden, daß bei einer Lagerung bei 45⁰C die obige Formulierung mindestens 23 Wochen stabil war, was einer Stabilitätsperiode von 92 Wochen bei Raumtemperatur entspricht.

Gelöst in Wasser, ergibt die Formulierung A ein flüssiges Reagens, das für die Analyse von Bluthaemoglobin geeignet ist. Durch Einwirkung des gelösten Reagens werden"die Erythrozyten in dem Blut haemolysiert, wodurch Haemoglobin freigesetzt· wird, das zu Methaemoglobin oxydiert wird. Das Methaemoglobin wird in Cyanmethaemoglobin umgewandelt, dessen Bildung die optische Dichte des Reagens/Probe-Systems verändert. Die optische Dichte des Reagens/Probe-Systems wird bei 540 mn unter Verwendung eines geeigneten Spektrophotometers gemessen und gegen ein Leerreagens,gesetzt mit einer Durchlässigkeit von 100%, verglichen. Der Haemoglobingehalt wird sodann durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt.

Zur Herstellung eines flüssigen Reagens, das für 50 Tests ausreichend ist, wird die Formulierung A (1_t00 g) in destilliertem Wasser aufgelöst. Die resultierende Lösung wird auf 250 ml verdünnt und gründlich vermischt. Die auf diese Weise gebildete Reagenslösung ist bei Raumtemperatur 3 Monate lang stabil, wenn sie vor Licht geschützt wird.

Zur Durchführung des Haemoglobin-Tests wird ein Reagens/Probe-■ testsystem hergestellt, indem 20/ul von gut gemischtem Blut (gesammelt mit einem Antikoagulans) zu 5 ml der obigen Lösung der Formulierung A in einem sauberen Reagensglas gegeben werden. Der Inhalt des Reagensglases wird gründlich vermischt und bei Raumtemperatur mindestens 5 Minuten stehengelassen. Sodann wird die optische Dichte wie oben gemessen, um den Haemoglobingehalt zu bestimmen.

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Beispiel 2 Blutharnstoffstickstoff-Formulierungen und Analyse

Da bestimmte Komponenten der Gesamtzahl der Reagentien, die für den Blutharnstoffstickstoff (BUN)-Test benötigt werden, dazu neigen, in trockenem Zustand miteinander zu reagieren, werden drei getrennte Formulierungen vorgesehen, um die reagierenden Komponenten voneinander abzutrennen. Diese drei Formulierungen sind in der Tabelle I als Formulierungen B, C und D dargestellt. Vorgewählte Mengen der einzelnen dieser Formulierungen werden in getrennten Wassermengen aufgelöst,um flüssige Reagentien zur Verwendung beim BUN-Test. zu ergeben.

Zur Herstellung der alkalischen Chlorreagensformulierung B wurden Natriumdichlorisocyanurat, vertrieben unter dem Warenzeichen "ACL-60" von Monsanto Co., (120 g), wasserfreies Lithiumhydroxyd (240 g) und Mannitpulver (180 g) in einer Hobart-Kugel miteinander vermengt und zur Erzielung eines klinischen Gemisches durchbewegt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (15 g) in Methylenchlorid (200 ml) eingeführt. Weiteres Methylenchlorid (100 ml) wurde aufeinanderfolgend zugefügt, um den gewünschten Grad der Granulierung und der Nässe zu erzielen. Die nasse Granulierung*wurde gesiebt und getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wieder gesiebt und in der Weise des Beispiels 1 abgepackt.

Bei der Herstellung der chromogenen Reagensformulierung C wurde Natriumsalicylat (1200 g) und Natriumnitroferricyanid (4g) in einer Hobart-Kugel vermengt und zur Förderung einer innigen Vermischung durchbewegt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (44 g) und Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 6OOO (2 g) in Methylenchlorid (250 ml) zugesetzt. Nachfolgend wurde weiteres Methylenchlorid (ungefähr 100 ml) zugegeben, um den gewünschten Granulierungsgrad zu ergeben. Das nasse Granulat wurde gesiebt und getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1

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beschrieben wieder gesiebt und abgepackt.

Vor der Vermengung der Bestandteile der kornförmigen Enzymformulierung D wurde die lyophilisierte Urease/Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Komponente hergestellt. Zur Herstellung dieser Komponente wurde Dinatrium EDTA (24 g) und Tetranatrium-EDTA (15,12 g) in einem destillierten Wasser (etwa 900 ml) aufgelöst, wobei in der notwendigen Weise erhitzt wurde. Ein Kohlehydratpolymeres mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 1850, einem Dextrose-Äquivalent von 10 bis 13, einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5 und einem Zersetzungspunkt von, 227⁰C (440⁰F), vertrieben unter dem Warenzeichen Amisol von Corn Products Company (11 g), wurde zugegeben und die Lösung wurde auf etwa 4°C abgekühlt. Lyophilisiertes Ureasepulver mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 200 lU/mg, beispielsweise wie von Worthington Biochemical Corporation, Code Nr. URPC (10 000 internationale Einheiten) vertrieben, wurde in dieser Lösung aufgelöst. Die Lösung wurde durch Glaswolle oder Baumwolle filtriert, um Trübungen zu entfernen. Die geklärte Lösung wurde aufgeteilt und Jeder Teil wurde in einen von mehreren Gefriertrocknungsgefäßen gebracht. Die Teile wurden in dünnen Schichten gefroren, indem die Gefäße in einem Trockeneis/Alkoholbad bei -6O⁰C oder darunter rotiert wurden. Die gefrorenen dünnen Schichten wurden bei -60⁰C bis -7O⁰C bei einem Gesamtdruck von 5 m/u Hg über einen Zeitraum von 16 bis 24 Stunden lyophilisiert. Das resultierende lyophilisierte Pulver wurde unter einer Atmosphäre gesammelt, welche eine relative Feuchtigkeit von weniger als 5% hatte,und in einem Exsikkator bei 4⁰C gelagert. Die Analyse der spezifischen Urease-Aktivität des getrockneten Pulvers lag im Bereich von 2 bis 3 I.U./mg bei 37°C. Es wurde gefunden, daß das modifizierte Ureaseprodukt, das auf diese Weise hergestellt worden war, bei Raumtemperatur stabil ist und keine Kühlung benötigt.

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Die folgende beispielhafte Prozedur ergibt ungefähr 600 g einer kornförmigen Enzymformulierung, die 12 I.ü_e Urease/20 mg enthält, wobei eine lyophilisierte Urease/EDTA-Formulierung mit einer spezifischen Urease-Aktivität von 3»0 I.U./mg verwendet wird.

Zur Herstellung der kornförmigen Eazymformulierung D wurde klumpenfreies Mannit (459 g) und die wie oben hergestellte lyophilisierte Urease/EDTA-Formulierung mit einer Aktivität von 3,0 I.U./mg (120 g) in einer Hobart-Kugel miteinander vermischt und zur Förderung einer innigen Vermischung durchbewegt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (15 g) und Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 6000 (6 g) in Methylenchlorid (100 ml) zu dem Gemisch gegeben. Weiteres Methylenchlorid (ungefähr 200 ml) wurde sodann zugegeben, um den gewünschten Granulierungsgrad zu erhalten. Das nasse Granulat wurde sodann gesiebt und bei Raumtemperatur getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wieder gesiebt und abgepackt.

Bei der Lagerung bei einer Temperatur von 45⁰C zeigte sich, daß die auf diese Weise hergestellten Formulierungen über mindestens 21 Wochen stabil sind, was einer Stabilitätsperiode von 84 Wochen bei Raumtemperatur entspricht.

Gelöst in getrennten Portionen Wasser, ergeben die Formulierungen B, D und C flüssige Reagentien, die für die Bestimmung von Blutharnstoffstickstoff geeignet sind. Die Urease der Formulierung D hydrolysierte spezifisch Harnstoff zu Ammoniumcarbonat, das nachfolgend durch Zugabe von Alkali in der Formulierung B zersetzt wird, wodurch Kohlendioxyd und Ammoniak erhalten werden. In Gegenwart des Katalysators, Natriumnitroferricyanld, der chromogenen Reagensformulierung C setzt sich der Ammoniak mit dem Phenolderivat der Formulierung C und aktivem Chlor von der Formulierung B unter Bildung eines emeraldgrünen Farbkom-

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plexes um. Die Intensität der Färbung wird colorimetrisch bei 650 nm geraessen und sie ist dem vorhandenen Harnstoff proportional.

Vor der Vornahme des Tests werden die Formulierung· B (0,925 g)i die Formulierung C (6,25 g) und die Formulierung D (1,0 g) jeweils in Wasser in getrennten Behältern aufgelöst. Die Lösung der Formulierung D wird auf 50 ml verdünnt, während die Lösungen der Formulierungen B und C jeweils auf 25 ml verdünnt werden. Sämtliche verdünnten Lösungen werden gründlich vermischt. Die Lösung der Formulierung D ist einen Monat unter Kühlung stabil. Die Lösungen der Formulierungen B und D sind drei Monate stabil, wenn sie in Bernsteinflaschen unter Kühlung gehalten werden. Die resultierenden Lösungen sind dazu ausreichend, um 50 Tests durchzuführen.

Bei der Vornahme des Tests werden 1,00 ml der verdünnten Lösung der Formulierung D und 0,005 ml (5 lambda) Serum in Reagensglas gegeben, gut gemischt und 5 Minuten bei 37⁰C inkubiert, um eine enzymatisch^ Hydrolyse zu bewirken. Die Lösung der Formulierung C (0,5 ml) wird sodann unter sorgfältigem Mischen zugesetzt, worauf unmittelbar die Lösung der- Formulierung B (0,50 ml) zugegeben wird, und gründlich mit anderen Komponenten der Lösung vermengt wird. Die Inkubierung wird weitere 10 Minuten zur Entwicklung der Farbe bei 37⁰C fortgeführt. Am Ende dieses Zeitraums wird destilliertes Wasser (2,00 ml) zugesetzt und die optische Dichte bei 650 nm wird abgelesen, wozu ein Spektrophotometer verwendet wird. Das Ergebnis wird mit der optischen Dichte eines Reagensleeransatzes mit 100% Durchlässigkeit verglichen. Der Harnstoffwert in der Probe wird sodann unter Bezugnahme auf eine Standardkurve bestimmt.

Beispiel 3 Gesamtproteinformulierung und Analyse

Die Reagensformulierung, die bei der Bestimmung von Gesamt-

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protein in einer biologischen Probe verwendet wird, ist als Formulierring E in Tabelle I angegeben.

Bei der Herstellung der Formulierung E wurden wasserfreies Kupfer(II)-tartrat (500 g), dihydratisiertes Natriumtartrat (750 g), Lithiumhydroxyd (2000 g) und ein Netzmittel, bestehend aus einem Polyoxyäthylenätherälkohol und Harnstoff, vertrieben unter dem Warenzeichen Renex 35 von Atlas Chemical Industries, (500 g) miteinander vermischt und in einem Hobart-Kugelmischer gründlich durchbewegt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 700 (100 g) in Methylenchlorid (1500 ml) zugegeben. Es wurde weiteres Methylenchlorid (250 ml) zugesetzt, um den gewünschten Granulierungsgrad und den gewünschten Naßgrad zu erzielen. Die nasse Granulierung wurde gesiebt und getrocknet. Das resultierende getrocknete Granulat wurde wieder gesiebt und abgepackt, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Bei der Lagerung bei einer Temperatur von 45⁰C zeigte sich, daß die vorgenannte Formulierung über mindestens 4 Wochen stabil ist, was einer Stabilität bei Raumtemperatur von 16 Wochen entspricht.

Aufgelöst in Wasser, ergibt die Formulierung E ein flüssiges Reagens, das zur Untersuchung von Körperflüssigkeiten auf das Gesamtprotein geeignet ist. Die Biuretreaktion von Proteinen mit dem alkalischen Kupfer(II)-tartrat-bestandteil der Formulierung E führt zur Bildung einer vi'oletten Farbe.

Zur Herstellung des flüssigen Reagens wird die Formulierung E (1,925 g) in destilliertem Wasser aufgelöst und die.Lösung wird auf 100 ml verdünnt und gründlich vermischt. Diese Reagenslösung ist mindestens drei Monate bei Raumtemperatur stabil und sie röicht aus, um 25 Tests durchzuführen*

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Bei der Durchführung des Gesamtprotein-Tests wird ein Reagens/ Probesystem hergestellt, indem 50/Ul Serum zu 4,0 ml der Lösung der Formulierung" E in einem Reagensglas gegeben werden. Der Inhalt wird gründlich vermischt und 15 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Sodann wird die optische Dichte bei 540 nin unter Verwendung eines Spektrophotometers abgelesen und mit einem Reagensleeransatz einer Durchlässigkeit von 100% verglichen. Der Gesamtproteingehalt wird sodann unter Bezugnahme auf eine Standardkurve bestimmt.

Beispiel 4

Serumglutaminsäure-oxalessigsäure-Transaminaseformulierungen und Analyse

Für den Serumglutaminsäure-oxalessigsäure-Transaminase(SGOT)-Test werden zwei getrennte Formulierungen hergestellt. Die zwei Formulierungen, die verwendet werden, sind in der Tabelle I als Formulierungen F und G zusammengestellt. Vorgewählte Mengen dieser Formulierungen werden in getrennten Teilen Wasser aufgelöst, um flüssige Reagentien zur Durchführung des SGOT-Tests herzustellen.

Vor der Vermischung der Konstituenten der Coenzymformulierung F werden die modifizierten Malatdehydrogenase- und reduzierten Nicotinamidadenindinucleotid-Komponenten hergestellt.

Die modifizierte Malatdehydrogenase wurde von gelben Spalterbsen hergeleitet. Die Erbsen wurden unter Verwendung einer Mühle oder einer Mikromühle zu einem feinen Pulver vermählen. Eine gesättigte Lösung von Kaliumchlorid wurde bei Raumtemperatur hergestellt, indem Kaliumchlorid (500 g) in ungefähr 1 1 destilliertes Wasser 5 Minuten lang eingerührt wurde und die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen wurde. Pulverisiertes Erbsenpulver (10 g) wurde in einen 50 ml-Teil der gesättigten Kaliumchlöridlösung eingerührt. Sodann wurde die

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Malatdehydrogenase daraus' extrahiert. Die Extraktion wurde bei Raumtemperatur ungefähr 3 Stunden unter gelegentlichem Rühren durchgeführt. Am Ende der 3stündigen Extraktionsperiode wurde die resultierende Suspension mit 10 000 U/min unter Verwendung ' eines Winkelrotors Nr. 872 in einer gekühlten Zentrifuge vom Typ IEC B-20 bei 10⁰C 10 Minuten zentrifugiert. Die geringfügig kolloidale überstehende Extraktflüssigkeit wurde gesammelt und in eine Vielzahl von Gefriertrocknuhgsgefäße über-= führt. Der Extrakt wurde in dünnen Schichten gefroren, indem' die Gefäße in einem Trockeneis/Alkoholbad bei ~60°C oder darunter rotiert wurden. Die gefrorenen dünnen Schichten wurden bei -60 bis -70⁰C und einem absoluten Druck von 5 m /u Hg über 18 bis 20 Stunden lyophilisiert. Das resultierende, lyophilisierte Pulver wurde unter einer Atmosphäre bei einer relativen Feuchtigkeit von weniger als 5% gesammelt und in einem Exr sikkator bei 4⁰C gelagert. Es wurden ungefähr 14 g trockenes Pulver für die enzyrnatische Aktivität sowohl der Malatdehydrogenase (MDH) als auch der Glutaminsäure-oxalessigsäure-Transaminase (GOT) erhalten. Die spezifische GOT-Aktivität betrug weniger als etwa 0,05% im Verhältnis zur spezifischen MDH-Aktivität. Das extrahierte Enzym war daher für den Gebrauch geeignet. Die erhaltene MDH-Aktivität betrug etwa 1„4 I.U./6 mg.

Zur Herstellung eines reduzierten Nicotinamidadenindinucleotids (NADH), wurden Gummiarabikum (15 g) _s Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (12 g),"Amisol"(10 g) und Rinderserumalbumin (0,5 g) in destilliertem Wasser (450 ml) aufgelöst und die resultierende Lösung wurde mit 12n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt. Nach der Einstellung wurde die Lösung auf 500 ml mit destilliertem Wasser verdünnt und durch Zentrifugierung bei 10 000 U/min in der beschriebenen Einrichtung bei 10⁰C über 16 Minuten geklärt. Zu der von der Zentrifugierung erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurden 10 g NADH-PuIver (reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid-dinatriumsalz) zugegeben und das resultierende Gemisch wurde mindestens 5 Minu-

- 34 -309818/0734 · " .

ten gerührt, um ein gutes Vermischen zu gewährleisten. Das Gemisch wurde in Gefriertrocknungsgefäße überführt und in dünnen Schichten gefroren, indem die Gefäße in einem Trockeneis/Alkoholbad bei -60°C oder darunter rotiert wurden. Die gefrorenen dünnen Schichten wurden 20 bis 24 Stunden bei -60 bis -70⁰C lyophilisiert, was bei einem absoluten Druck von 5 m/U Hg geschah. Das resultierende lyophilisierte Pulver wurde in einer Atmosphäre bei einer relativen Feuchtigkeit von weniger als 5% gesammelt und in einem Exsikkator bei 4⁰C gelagert. Es wurden ungefähr 50 g trockenes lyophilisiertes Pulver erhalten.

Zur Herstellung der Coenzymformulierung F wurde L-Aspararinsäure (1250 g), das obige modifizierte MDH (äquivalent 1,4 I.U. oder 6,0 mg MDH), das vorgenannte modifizierte NADH (äquivalent 0,5 mg NADH), Tris-(hydroxymethyl)-aminoa*than (1875 g) und gemahlenerBernsteinsäure (187»5 g) in einem Hobart-Kugelmischer vermengt und zur Förderung eines innigen Vermischens durchbewegt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (25 g) in Methylenchlorid (800 ml) zu dem Gemisch gegeben. Weiteres Methylenchlorid (ungefähr 525 ml) wurde sodann zugeführt, um den gewünschten Grad der Granulierung und Feuchtigkeit zu erzielen. Das nasse Granulat wurde sodann gesiebt und bei Raumtemperatur getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 wieder gesiebt und abgepackt.

Zur Herstellung einer Substratformulierung G wurde Natrium-ocketogluterat (200 g) und klumpenfreies Mannit (765 g) in einer Hobart-Kugel vermischt und gründlich durchbewegt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (25 g) in Methylenchlorid (500 ml) zu dem Gemisch gegeben. Weiteres Methylenchlorid (ungefähr 200 ml) wurde danach zugegeben, um den gewünschten Grad der Granulierung und Feuchtigkeit zu erhalten. Das nasse Granulat wurde sodann gesiebt und bei Raumtemperatur und einem Druck von 635 mm (25") Hg oder weniger getrocknet,

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Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wieder gesiebt und abgepackt.

Bei einer Lagerung bei einer Temperatur von 45⁰C zeigte sich, daß die obigen Formulierungen mindestens drei· Wochen stabil waren, was einer Stabilität bei Raumtemperatur von 12 Wochen entspricht. ■

Gelöst in getrennten Portionen Wasser,ergeben die Formulierungen F und G flüssige Reagentien, die dazu geeignet sind, um die Serumglutaminsäure-oxalessigsäure-Transaminase zu bestimmen. Die in der Probe vorhandene SGOT katalysiert die Transaminierung von L-Asparaginsäure und cc-Ketoglutarsäure, wodurch Oxalacetat und Glutamat gebildet werden. Das Oxaloacetat und das NADH werden in Gegenwart von MDH zu Malat und NAD umgewandelt. Das Ausmaß der Reaktion ist für die anwesende SGOT indikativ und wird gemessen, indem die Abnahme der optischen Dichte bei 340 nm bei 37°C beobachtet wird.

Die flüssige Reagenslösung der Formulierung F wird hergestellt, indem 7,2 g der Formulierung in destilliertem Wasser gelöst werden, auf 125 ml verdünnt wird und gut gemischt wird. Die Lösung der Formulierung G wird in ähnlicher V/eise hergestellt, wozu 1,0g der Formulierung verwendet werden und auf 25 ml verdünnt wird. Die Lösung der Formulierung F sollte täglich frisch hergestellt werden, während die Lösung der Formulierung G eine Woche bei Kühlung stabil ist.

Bei der Vornahme des Tests werden 2,5 ml der Lösung der Formulierung F in ein Reagensglas gegeben. Hierzu werden 0,1 ml Serum gefügt und die resultierende Lösung wird bei 37°C in einer Heizeinheit 7 bis 10 Minuten gerührt und inkubiert. Hierauf werden 0,5 ml der Lösung der Formulierung G zugesetzt und in weniger als 10 Sekunden bei Raumtemperatur rasch damit vermischt. Genau 2 Minuten, nachdem die flüssige Reagenslösung der

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Formulierung G zugesetzt worden ist, wird das' Reagensglas aus der Heizeinheit entnommen und die Absorption des Reagens/Probesystems wird gemessen. Das Reagensglas wird sodann in die Heizeinheit zurückgebracht und dort genau 5 Minuten nach der ersten Zugabe der Formulierung G gehalten. An diesem Punkt wird das Reagensglas erneut aus der Heizeinheit herausgenommen und die Endabsorption des Reagens/Probesystems wird gemessen. Der SGOT-Gehalt wird bestimmt aus den zwei Absorptionsablesungen, indem folgende Gleichung verwendet wirdi

— χ 1667 = SGOT-Einheiten/ml Serum.

Darin bedeuten A₁ die Absorption, abgelesen bei 2 Minuten, Ao die Absorption, abgelesen,bei 5 Minuten, L den Lichtweg der Absorptionszelle oder den Innendurchmesser des Reagensglases in Zentimeter. Eine so definierte SGOT-Einheit ist diejenige Enzymmenge, die die Oxydation von 0,001/uMol NADH zu NAD ^e Minute bei 37⁰C katalysiert. Es sind auch andere Bedingungen für die Bestimmung der SGOT bekannt. Das Karmen-Verfahren führt die obigen Reaktionen bei 25⁰C anstelle bei 37⁰C durch.

Beispiel 5

Alkalische Phosphataseformulierun^en und Analyse

Drei getrennte Formulierungen werden zum alkalischen Phosphatase-Test hergestellt. Diese Formulierungen sind in der Tabelle I als Formulierungen H, I und J angegeben. Vorbestimmte Mengen dieser Formulierungen, gelöst in getrennten Wassermengen, ergeben flüssige Reagentien zur Verwendung bei der Durchführung des alkalischen Phosphatase-Tests.

Vor der Herstellung der chromogenen Reagensformulierung I wurde die Natriummolybdat-Komponente des Reagensgemisches getrocknet. Natriummolybdat wurde in tarierte Pyrex-Böden mit den Abmessun-

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gen 20,3 x 30,5 cm (8 χ 12 inch) mit einer Tiefe zwischen etwa 1,27 und 1,90 cm (1/2 bis 3/4 inch) überführt. Die Böden wurden sodann in einen Vakuumofen gebracht und das Natriummolybdat wurde bei 55⁰C und einem Gesamtdruck von 635 mm (25") Hg getrocknet, bis ein Gewichtsverlust von nicht weniger als 13$ festgestellt wurde.

Zur Herstellung der chromogenen Reagensformulierung I wurde das getrocknete Natriummolybdat (475 g) und ein trockenes Natriumlaurylsulfat-Produkt, vertrieben unter dem Warenzeichen "Duponol ME" von E.I.DuPont de Nemours and Company, (737?5 g) in einer Hobart-Kugel vermengt und gut durchgemischt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 7Q7 (37?5 g) in Methylenchlorid (300 ml) zugegeben. Weiteres Methylenchlorid (150 ml) wurde nachfolgend zugegeben, um den gewünschten·Granulierungsgrad und Peuchtigkeitsgrad zu erzielen» Das nasse Granulat wurde gesiebt und getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt und abgepackt.

Bei der Herstellung der Reduktionsabschreckungsformulierung H wurde !.-Ascorbinsäure (3,25 kg) und Sulfaminsäure (1,60 kg) in einer Hobart-Kugel vermengt und gut durchbewegt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (150 g) in Methylenchlorid (500 ml) zugefügt. Danach wurde weiteres Methylenchlorid (200 ml) zugegeben, um den gewünschten Grad der Granulierung und Feuchtigkeit zu ergeben» Das nasse Granulat wurde gesiebt und getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt und abgepackt.

Die Herstellung einer Puffersubstrat-Reagensformulierung J wurde in Angriff genommen, indem ß-Glycerophosphorsäure-dinatriumsalz (500 g), Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (1,5 &g), gemahlene Bernsteinsäure (12,5 g) und Duponol MS (500 g) in einer

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Hobart-Kugel gut durchgemischt wurden. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (87_t5 g) in Methylenchlorid (400 ml) eingeführt. Weiteres Methylenchlorid (100 ml) wurde nachfolgend zugegeben, um den gewünschten Grad der Granulierung und Feuchtigkeit zu ergeben. Das nasse Granulat wurde gesiebt und getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt und abgepackt.

Gelöst in getrennten Portionen Wasser, ergeben die Formulierungen H, I und J flüssige Reagentien, die für die Bestimmung des alkalischen Phosphatasegehalts von biologischen Proben wie Blutserum geeignet sind. Die alkalische Phosphatase in der Probe beschleunigt die Freisetzung von Phosphat aus dem ß-Glycerophosphat-Bestandteil der Substratreagensformulierung J. Das auf diese Weise freigesetzte Phosphat setzt sich mit dem Natriummolybdat der chromogehen Reagensformulierung I in Gegenwart von Sulfamsäure und Ascorbinsäure der Redukfcionsabschreckungsformulierung H um. Die Ascorbinsäure reduziert die auf diese Weise gebildete Phosphormolybdänsäure zu Phosphorraolybäähblau. Die Farbe der letzteren Verbindung ist für die Konzentration der in dem Reagens/Probesystem vorhandenen alkalischen Phosphatase indikativ.

Bei der Zubereitung für einen Test werden die trockenen Reagensformulierungen jeweils in Wasser aufgelöst, um flüssige Reagentien zu ergeben. Die Formulierung I (1,25 g) wird in 25 ml destilliertem Wasser aufgelöst, um ein chromogenes flüssiges Reagens zu ergeben. Die Formulierung H (5_f00 g) wird in 25 ml Wasser aufgelöst, um ein Reduktionsabschreckungsflüssigkeitsreagens zu liefern, und die Formulierung J (2,60 g) wird in 150 ml Wasser aufgelöst, um ein Substratpuffer-Flüssigkeitsreagens zu ergeben. Die Lösung der Formulierung I ist bei Raumtemperatur 1 Woche stabil. Die Lösung der Formulierung J ist unter Kühlung 2 Wochen stabil. Das flüssige Reagens, bestehend aus der Lösung der Formulierung H, sollte täglich frisch herge-

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stellt -und vor Liclrfc geschützt werden. Die resultierenden Lösungen sind für. die Vornahme von 50 Tests ausreichend.

Die Durchführung einer alkalischen Phosphatase-Bestimmung wird in Angriff genommen, indem 3 ml-Portionen der Lösung, der Substratformulierung J jeweils in zwei Reagensgläser gegeben werden und indem jedes Reagensglas 2 Minuten bei 37°C inkubiert

Eines dieser Reagensgläser wird sodann für die Testreaktion verwendet, während das andere für die Leerprobe verwendet wird.

0,1 ml (100 lambda) Serum werden zu dem Reagensglas, das für die Testreaktion benutzt wird, gegeben, und gründlich mit dem darin vorhandenen flüssigen Reagens vermischt, um ein Probe/ Reagenstestsystem zu ergeben· Das Testsystem wird sodann genau 15 Minuten bei 37⁰C inkubiert, worauf sowohl zu dem Testsystem als auch zu dem Glas mit dem Leerversuch 0,5 ml-Portionen der flüssigen Reagenslösung der Formulierung I und 0,5 ml-Portionen der flüssigen Reagenslösung der Formulierung H gegeben werden. Sowohl das Testsystem als auch der Leerversuch werden v/eitere 20 Minuten bei 37°C inkubiert· Die optische Dichte wird jeweils bei 700 nm gegen einen Wasser-Leersatz mit 100$ Durchlässigkeit bestimmt. Unter Verwendung einer Standardkurve wird aus der optischen Dichte im Vergleich zu der Wasser-Leerprobe der anorganische Phosphorgehalt jeder Testlösung bestimmt. Da sowohl, das Testsystem als auch die Testleerprobe ursprünglich dieselbe Menge oder denselben Anteil von ß-Glycerophosphat enthalten, wird der anorganische Phosphor, der durch Einwirkung der alkalischen Phosphatase freigesetzt wird, bestimmt, indem der gesamte anorganische Phosphor in dem Testsystem von der Gesamtmenge des anorganischen Phosphors in der Leerprobe abgezogen wird.

Zur Berechnung der alkalischen Phosphatase-Einheiten, die in dem Testsystem vorhanden sind, wird der Wert für die mg^ anorganischen Phosphors, der freigesetzt worden ist, mit 4 multipliziert,

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Bei dem Verfahren von Bodansky besteht eine 1:1-Beziehung zwischen dem mg%-Wert des freigesetzten Phosphors und der alkalischen Phosphatase-Einheiten. Da der erfindungsgemäß verwendete Test nur eine 15minütige Inkubationszeit anstelle einer 60minütigen Inkubationszeit nach Bodansky verwendet, wird der Faktor 4 zur Erzielung entsprechender Ergebnisse verwendet.

Die Standardkurve, die zur Bestimmung des absoluten anorganischen Phosphors verwendet wird, wird erhalten, indem spektrometrische Messungen der optischen Dichten von Kaliumdihydrogenphosphat-Lösungen durchgeführt werden. Diese enthalten 0, 2,5, 5,0, 7,5 und 10 mg% Phosphor. Die Bestimmung erfolgt bei 700 nm gegen einen Reagensleersatz mit 100% Durchlässigkeit. Eine Standard-Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung zur Herstellung der Standardkurve wird hergestellt, indem KHpPO. (438,1 mg) in einem 100 ml-Meßkolben abgewogen werden und das mit destilliertem Wasser hoher Qualität verdünnt wird. Die verdünnte Lösung wird bei 4⁰C gelagert. Die Vorratslösung enthält 100 mg Phosphor je 100 ml (100 mg%). Geeignet verdünnte aliquote Teile dieser Vorratslösungen werden dazu verwendet, um die Standardkurve festzulegen.

Phosphor-Standardkurven, die von spektrophotometrischen Messungen variierender Konzentrationen von Kaliumdihydrogenphosphat erhalten werden, sind bekanntlich nur bis zu etwa 15 mg% linear. Wenn Seren mit hohem Phosphorgehalt (oberhalb 7,5 mg%) auf den alkalischen Phosphatase-Gehalt untersucht werden, dann wird daher ein 50 lambda-Serum verwendet und das Endergebnis wird mit 2 multipliziert.

Eine alkalische Phosphatase-Einheit ist als diejenige Enzymmenge in 100 ml Serum definiert, die 1 mg Phosphor je Stunde

bei 37°C freisetzt.

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Beispiel 6 Glucosereagensformulierungen und Analyse

Zur Durchführung des Glucosetests werden drei getrennte Formulierungen hergestellt. Diese sind in der Tabelle I als Formulierungen K, L und M angegeben. Vorgewählte Mengen dieser Formulierungen werden in separaten Portionen Wasser aufgelöst, um flüssige Reagentien für die Durchführung des Glucosetests zu ergeben.

Zur Herstellung der chromogenen Reagensformulierung K werden Mannit (423,6 g) und o-Dianisidin-dihydrochlorid (3,3-Dimethoxybenzidin-dihydrochlorid) (7,5 g) in einer Hobart-Kugel miteinander vermengt und innig miteinander vermischt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (14,4g) und dem Polyäthylenglykoi-6000 (4,5 g) in Methylenchlorid (150 ml) zugegeben. Darüberhinaus wurde nachfolgend Methylenchlorid . (125 ml) zugegeben, um den gewünschten Grad der Granulierung und der Feuchtigkeit zu ergeben. Die nasse Granulierung wurde gesiebt und bei Raumtemperatur getrocknet. Das erhaltene trockene Granulat wurde in der Weise des Beispiels 1 wiedergesiebt und abgepackt.

Eine Pufferreagensformulierung L wurde hergestellt, indem monobasisches Natriumphosphat (311,4 g), dibasisches Natriumphosphat (190,8 g), Mannit (52,8 g) und sprühgetrocknetes Gummiarabikum (30,0 g) in einer Hobart-Kugel miteinander vermischt wurden und innig verrührt wurden. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (15,0 g) in destilliertem'Wasser (40 ml) zugefügt. Weiteres destilliertes Wasser (10 ml) wurde sodann zugegeben, um den gewünschten Grad der Granulierung und der Feuchtigkeit zu ergebene Das feuchte Granulierungsprodukt wurde gesiebt und getrocknete Das erhaltene trockene Granulierungsprodukt wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt und abgepackt«

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Zur Herstellung einer modifizierten Glucoseoxidase wurden Gummiarabikum (60 g) und Mannit (40 g in Wasser (etwa 1600 ml) aufgelöst und die resultierende kolloidale Lösung wurde mit 2%igem Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Nach der Einstellung wurde die Lösung auf 2 1 mit destilliertem Wasser verdünnt und durch Zentrifugierung mit 10 000 U/min unter Verwendung der angegebenen Vorrichtung geklärt. Die klare überstehende, inerte Lösung wurde gesammelt und bei 4°C gelagert. Rinderserumalbumin (2 g) vmrde in 200 ml der oben hergestellten inerten Lösung unter Zuhilfenahme eines Magnetrührers aufgelöst. Die flüssige Glucoseoxidase (200 ml) mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 1000 titrimetrischen Einheiten je ml wurde sodann langsam zugegeben und das resultierende Gemisch wurde weitere 5 Minuten zur Gewährleistung einer guten Vermischung gerührt. Die Lösung wurde in Gefriertrockhungsgefäße jeweils zu einer Menge von 150 bis 200 ml der Lösung gegeben· Die Lösung wurde in dünnen Schichten gefroren, indem die Gefäße in einem Trockeneis/Alkoholbad bei -6O⁰C oder darunter rotiert wurden. Die gefrorenen Schichten wurden 16 bis 20 Stunden bei -60 bis -70⁰C lyophilisiert, wobei bei einem absoluten Druck von 5 m/U Hg gearbeitet wurde. Das resultierende lyophilisierte Pulver wurde unter einer Atmosphäre mit einer relativen Feuchtigkeit von weniger als 3% gesammelt und in einem Exsikkator bei 4⁰C gelagert. Ungefähr 14 g des trockenen lyophilisierten Glucoseoxidase-Pulvers mit einer spezifischen Aktivität im Bereich von 14 bis 16 IU/mg bei 37°C wurden erhalten.

Bei der Herstellung einer Enzymreagensformulierung M wurde zuerst eine Glucoseoxidase (GOD)-Unterformulierung hergestellt. Die vorgenannte modifizierte Glucoseoxidase (genügend, um 45 Einheiten unmodifiziertes Material/Test zu ergeben) und Mannit (genügend, um 14 mg - Gesamtmenge von modifiziertem GOD plus Mannit - je Test zu ergeben), wurden in einer Hobart-Kugel miteinander vermengt und gründlich vermischt. Bei laufendem Mischet wurde eine Lösung von Tetronic 707 (15,0 g) und Polyäthylen-

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glykol-6000 (3,0 g) in destilliertem Wasser (40 ml) zugegeben. Weiteres destilliertes Wasser (1.0 ml) wurde sodann zugefügt, um den gewünschten Grad der Granulierung und Feuchtigkeit zu erzielen· Die feuchte Granulierung wurde gesiebt und bei Raumtemperatur getrocknet. Die resultierende trockene Granulierung wurde in der Weise des Beispiels 1 wiedergesiebt. Die trockene, wiedergesiebte granulierte Glucoseoxidase-Unterformulierung wurde in eine tarierte 1500 ccm-Bernsteinflasche überführt und in einem trockenen Raum gelagert, während das nachfolgende Gemisch mit anderen Bestandteilen der Formulierung M wie unten beschrieben bereitet wurde. Jedes Gramm dieser granulierten Glucoseoxidase-Unterformulierung enthält genügend GOD zur Durchfülirung von 7-1 Glucosetests« Die Ausbeute dieser Formulierung, ausgedrückt als potentielle Testeinheiten,, kann daher . wie folgt errechnet werden:

Anzahl der Tests = Gewichtsmenge der GOD-Subformulierung (g) χ

71 Tests/g.

Eine Peroxidase-Subformulierung für die Formulierung M wurde hergestellt, indem in einem Mörser mit einem Pistill eine Menge von Meerrettichperoxidase (POD) und eine genügende Menge von Mannit für die oben errechnete Testzahl vermischt wurden und durch folgende Berechnungen bestimmt wurden:

- Nr d Tests χ ⁴⁴° Einheiten. 1

- nr.a.ies-cs χ Test ^x £

Test ^x £(Einheiten7£g7

r d Tests χ Ιώ-SS" - E£J2PÜ1 _χ !_£_ r.a.ies-cs χ _T*-_t--» fisF^^J TOOO mg

K '''"'¹' wurde durch vorhergehende Untersuchungen bestimmt. .

Zu dem auf diese Weise erhaltenen Gemenge wurden 25 g der Glucoseoxidase-Unterformulierung gegeben und das resultierende

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Gemisch wurde zur Dispergierung mit einem Spatel aus rostfreiem Stahl durchgemischt.

Nach der Herstellung der GOD/POD-Dispersion wurden 50 g der GOD-Unterformulierung, der Dispersion und weitere 50 g der GOP-Subformulierung nacheinander durch ein Sieb aus rostfreiem Stähl mit einer lichten Maschenweite von 0,42 mm (40 mesh) auf eine saubere Aufnahmeoberfläche gesiebt. Sämtliche gesiebten Materialien wurden sodann in einen PK-Mischer zusammen mit dem Rest der GOD-Unterformulierung überführt und über mehr als 5 Minuten vermischt. Das resultierende vermischte Granulat wurde in Pyrex-Böden mit den Abmessungen 20,3 cm χ 30,5 cm (8 χ 12 inch) zu einer Tiefe von 1,27 bis 1,90 cm (1/2 bis 3/4 inch) gegeben und etwa 15 Stunden bei Raumtemperatur und einem Gesamtdruck von 635 mm (25") Hg getrocknet.

Gelöst in zwei getrennten Portionen Wasser, ergeben die Formulierung K und die Formulierung L- zusammen mit M flüssige Reagenslösungen, die für die Bestimmung der wahren Glucose in biologischen Proben wie Blutserum geeignet sind. In Gegenwart von Wasser und der Glucoseoxidase-Komponente der Enzymformulierung M wird die Glucose in der Probe zu Gluconsäure oxydiert, wobei Hydroperoxyd als Nebenprodukt gebildet wird. Das als Nebenprodukt gebildete Hydroperoxyd oxydiert den o-Dianisidin-Bestandteil der chromogenen Reagensformulierung K in Gegenwart der Meerrettichperoxxdase, wodurch ein gefärbtes Produkt erhalten wird, welches eine Zunahme der optischen Dichte bei 445 nm bewirkt. Das Ausmaß der Zunahme gibt die Konzentration der Glucose in dem Testsystem an.

Ein chromogenes flüssiges Reagens wird hergestellt, indem die Formulierung K (0,75 g) in 50 ml Wasser aufgelöst wird. Ein flüssiges Reagens, das sowohl eine Enzyraaktivität als auch eine Pufferungskapazität hat, wird hergestellt, indem die Formulierung M (0,75 g) und die Formulierung L (1,0 g) in einem

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weiteren 50 ml-Teil destilliertem Wasser aufgelöst werden. Das chromogene flüssige Reagens sollte täglich frisch bereitet werden» Das flüssige Reagens, das die Formulierungen L und M enthält, ist mindestens eine Woche lang stabil, wenn es gekühlt · wird. Die resultierenden Lösungen reichen aus, um 50 Tests durchzuführen.

Bei der Durchführung des Tests werden 1 ml jeweils der Lösung der Formulierung K und der Lösung, die die Formulierungen L und M enthält, in ein sauberes, trockenes Reagensglas gegeben. 10/Ul Serum werden in das, Reagensglas gegeben und das erhaltene Gemisch wird gründlich durchgemischt und genau 15 Minuten bei ■ 37⁰C inkubiert. Die optische Dichte des Testsystems wird sodann bei 445 nm gegen einen Reagensleersatz mit 100% Durchlässigkeit abgelesen. Der Anteil der wahren Glucose in der Probe wird anhand einer Standardkurve bestimmt.

Glueοse-Standardkurven sind bis zu 300 mg% bei Verwendung der Formulierungen und der Analysenmethode dieses Beispiels linear. Seren mit hohem Glucose-Werten (oberhalb 300 mg%) sollten mit Kochsalzlösung (Q,9?6 NaCl) vor der Analyse verdünnt werden, wobei die Berechnung um den Verdünnungsfaktor korrigiert werden muß. · .

Beispiel 7 . ·

Anorganische Phosphorformulierungen und Analyse

Zwei getrennte Formulierungen werden für den anorganischen Phosphortest zur Verfügung gestellt. Die beiden Formulierungen, die verwendet werden, sind in Tabelle I als Formulierungen N und 0 angegeben. Vorgewählte Mengen dieser Formulierungen werden in getrennten Wasserportionen zu flüssigen Reagentien aufgelöst, welche für die Durchführung des anorganischen Phosphortests geeignet sind.

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Bei der Herstellung der Reduktionsabschreckungsformulierung M wurden L-Ascorbinsäure (3»25 kg), gemahlene Sulfaminsäure (800 g) und trockenes Duponol ME (775 g) in einer Hobart-Kugel miteinander vermischt und gründlich durchgemischt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (125 g) in Methylenchlorid (1000 ml) zugegeben. Weiteres Methylenchlorid (5ÖO mlj wurde sodann zugegeben, um den gewünschten Grad der Granulierung und der Feuchtigkeit zu ergeben. Das nasse Granulat wurde gesiebt und getrocknet. Die resultierende trockene Granulierung wurde wie In Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt und abgepackt.

Zur Herstellung der chromogenen Reagensformulierung 0 wurde der Natriummolybdat-Bestandteil der Formulierung in der Weise des Beispiels 5 getrocknet. Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (1,50 kg), Duponol ME (470 g) und getrocknetes Natriummolybdat (950 g) wurden sodann in einer Hobart-Kugel vermischt und gründlich durchgemischt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (80,0 g) in Methylenchlorid (475 ml) zugegeben. Weiteres Methylenchlorid (175 ml) wurde sodann zugegeben, um den gewünschten Grad der Granulierung und der Feuchtigkeit zu ergeben. Die feuchte Granulierung wurde gesiebt und getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde in der Weise des Beispiels 1 wiedergesiebt und abgepackt.

Gelöst in getrennten Portionen Wasser, ergeben die Reagensformulierungen N und 0 flüssige Reagentien, die für die Untersuchung von Körperflüssigkeiten auf anorganischen Phosphor geeignet sind. Natriummolybdat von der Lösung der chromogenen Formulierung N reagiert mit dem anorganischen Phosphor aus der Probe unter Bildung von Phosphomolybdänsäure. Die Phosphomolybdänsäure wird sodann durch die Ascorbinsäure-Komponente der Lösung der Reduktionsabschreckungsformulierung 0 reduziert» wodurch ein Phosphomolybdänblau gebildet wird; dessen Färbung zeigt den anorganischen Phosphorgehalt der Probe an.

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Die flüssige Reagenslösung der Formulierung N wird hergestellt, indem 1,5 g der Formulierung in 150 ml Wasser aufgelöst v/erden. Die Lösung der Formulierung O wird hergestellt, indem 4,9 g. dieser Formulierung in 50 ml Wasser aufgelöst werden. Die chromogene Flüssigkeitsreagenslösung der Formulierung N ist bei Raumtemperatur eine Woche stabil. Die flüssige Reagenslösung der Formulierung O sollte täglich frisch, hergestellt werden und vor Licht geschützt werden. Die resultierenden Lösungen sind für die Durchführung von 50 Tests ausreichend.

Bei der Vornahme des Tests werden 3 ml der Lösung der Formulierung 0 und 1ml der Lösung der Formulierung N in ein sauberes, trockenes Reagensglas gegeben und miteinander vermischt. 0,05 ml (50 lambda) Serum werden zu dem Reagensgemisch gegeben und gründlich damit vermischt. Das resultierende Reagens/Probetestsystem wird 20 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach die optische Dichte des Systems bei 700 nm gemessen und mit einem Reagensleersatz von 100^ Durchlässigkeit verglichen wird. Der anorganische Phosphorgehalt der Probe wird sodann anhand einer Standardkurve bestimmt.

Die Phosphor-Standardkurven sind bis zu 15 mg% linear.

Beispiel 8

Lactatdehydrofrenase-Reagensformulierunften und Analyse'

Für die Lactatdehydrogenase (Lactat als Substrat) (LDH-L)-Analyse werden zwei separate Formulierungen verwendet. Die zwei Formulierungen, die verwendet werden, sind in Tabelle I als Formulierungen P und Q angegeben. Vorgewählte Mengen dieser Formulierungen werden in einer einzigen Portion Wasser miteinander aufgelöst, um das flüssige Reagens für die Durchführung der LDH-L-Analyse zu bilden.

Zur Herstellung der Coenzym-Formulierungen P werden Nicotinamid-adenindinucleotid, modifiziert wie unten beschrieben,

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(äquivalent 225 mg Nicotinamid-adenindinucleotid) und Mannit (genügend, um 25,0 mg/Test zu ergeben) in einer Hobart-Kugel miteinander vermengt und gründlich vermischt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (60,0 g) in Methylenchlorid (500 ml) zu dem Gemisch gegeben. Weiteres Methylenchlorid (ungefähr 250 ml) wurde nachfolgend zugegeben, um den gewünschten Grad der Granulierung und der Feuchtigkeit zu erzielen. Das nasse Granulat wurde sodann gesiebt und bei Raumtemperatur getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt und abgepackt.

Zur Herstellung des modifizierten Nicotinamid-adenindinucleotids (NAD) wurde NAD-freie Säure (10 g) in destilliertem Wasser (ungefähr 150 ml) aufgelöst und die resultierende Lösung wurde langsam mit 1Obiger Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6,4 bis 6,5 eingestellt (es waren ungefähr 6,5 ml Natriumhydroxydlösung erforderlich). Lactose (20,5 g) wurde sodann zusammen mit einer genügenden Wassermenge zugegeben, um ein Gesamtvolumen von ungefähr 400 ml zu ergeben. Die Lösung wurde gerührt, bis alle Feststoffe vollständig aufgelöst waren. Die resultierende Lösung wurde in Gefriertrocknungsgefäße überführt und Hüllen gefroren, indem die Gefäße in einem Trockeneis/Alkoholbad bei -60⁰C oder darunter rotiert wurden. Das gefrorene Produkt wurde 20 bis 24 Stunden bei -60 bis -70°C und einem absoluten ^ruck von 5 m/U Hg lyophilisiert. Das resultierende lyophilisierte Pulver wurde in einer Atmosphäre mit einer relativen Feuchtigkeit von weniger als 5% gesammelt und in einem Exsikkator bei 4°C gelagert. Es wurden ungefähr 30,8 g des trockenen modifizierten NAD-Pulvers erhalten.

Zur Herstellung der Substratformulierung Q wurden Lithiuralactat (2,25 kg)„ Tris-(hydroxyraethyl)-aminomethan (225 g), Natriumbicarbonat (450 g) und Renex 35 (175 g) in einer Hobart-Kugel miteinander vermischt und gründlich vermengt. Bei laufendem

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Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (75 g) und PoIyäthylenglykol-6000 (25 g) in Methylenchlorid (500 ml) zu dem Gemisch zugesetzt. Weiteres Methylenchlorid (ungefähr 1175 ml) wurde nachfolgend eingeführt, um den gewünschten Grad der Granulierung und der Feuchtigkeit zu erzielen» Das nasse granulierte Produkt wurde sodann gesiebt und bei Raumtemperatur getrocknet. Das resultierende trockene Granulierungsprodukt wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt und abgepackt.

In einer einzigen Wasserportion zusammen aufgelöst, ergeben die Formulierungen P und Q ein flüssiges Reagens, das für die Untersuchung von biologischen Proben auf Lactatdehydrogenase-L geeignet ist. Katalysiert durch die LDH-L von der Probe, werden Lactat von der Substratformulierung Q und NAD von der Coenzymformulierung P zu Pyruvat und NADH umgewandelt. Das· Ausmaß dieser Reaktion, das der enzymatisehen LDH-Aktivität der Probe entspricht, wird gemessen, indem die Zunahme der optischen Dichte bei 340 nm festgestellt wird.

Zur Herstellung einer für 50 Tests ausreichenden Menge des flüssigen Reagens v/erden die Formulierung P (1,25 g) und die Formulierung Q (3,20 g) zu destilliertes Wasser (150 ml) in einem geeigneten Behälter gegeben und der Behälter wird mäßig geschüttelt, bis das Granulat sich, vollständig aufgelöst hat. Die auf diese Weise hergestellte flüssige Reagenslösung sollte innerhalb 8 Stunden eingesetzt werden»

Bei der Durchführung des Tests werden 3 oil der flüssigen Reagenslösung in eine klare Absorptionsζeile gegeben. Sowohl das Reagens in der Zelle als auch die Serumprobe werden getrennt vorinkubiert, indem sie in einer Heizeisheit 7 bis 10 Minuten auf 37⁰C erhitzt werden. Mach, der YorintaMerwäg werden 0,050 ml (50 lamda) der Serumprobe in die Zelle gegeben und gründlich mit dem flüssigen Reagens bei 37⁰G vermischt ₉ 'um ein Probe/Reagenstestsystem zu ©r-geben«, uenau i 'Minute nach

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Beginn der Vermischung der Serumprobe mit dem Reagens wird die Zelle aus der Heizeinheit entnommen und die Absorption des Probe/Reagenstestsystems wird mit einem Spektrophotometer abgelesen, das zuvor mit destilliertem Wasser auf Null eingestellt worden ist. Unmittelbar nach Vornahme dieser Messung wird die Zelle in die Heizeinheit zurückgegeben und dort exakt 3 Minuten nach der ersten Vermischung des Serums mit dem Reagens, d.h. 2 Minuten nach der ersten Ablesung, gehalten. Sodann wird die Zelle erneut aus der Heizeinheit entommen und die Endabsorption wird abgelesen. Die in der Probe vorhandenen LDH-Einheiten werden nach folgender Gleichung errechnet:

(A₂ - A₁) χ 4900

- = LDH-Einheiten je ml Serum.

Darin bedeutet A- die Absorption, abgelesen nach 1 Minute, Ap die Absorption, abgelesen nach 3 Minuten,und L der Lichtweg, ausgedrückt in cm.

Wenn die Absorptionsdifferenz (Ap - A₁) über 0,14 hinausgeht, dann bedeutet dies eine sehr hohe LDH-Aktiv!tat in dem Serum. Bei diesem Aktivitätswert ist die Beziehung zwischen der Absorptionsdifferenz und den LDH-Einheiten je ml Serum nicht linear und der Koeffizient in der oben angegebenen Gleichung kann ungenau sein, was zu ungenauen Ergebnissen führen kann. Zur Erzielung einer größeren Genauigkeit bei der Messung von hohen LDH-Aktivitäten wird der oben genannte Test mit einer 20yul Serumprobe wiederholt. Die Aktivität wird nach der folgenden Gleichung errechnet: ^

(A₂ - A₁) χ 12 180

— · = LDH-Einheiten je ml Serum.

Bekanntlich ist die Genauigkeit dieser LDH-Tests auch hoch von der Temperaturkontrolle abhängig. Das verwendete Spektrophotometer enthält daher vorzugsweise Temperaturkontrolleln-

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richtungen für das Küvettenabteil, in welchem die Probezelle -während der Messung gehalten wird, wobei die Temperatur der Probe auf 37⁰C kontrolliert wird. Wenn das Instrument nicht mit einer solchen Temperaturkontrolleinrichtung ausgestattet ist.j dann sollte die Absorptionzelle bei der Ablesung der' Probe nicht langer als 10 Sekunden aus der Heizeinheit entfernt werden.

Die LDH-Einheit ist als diejenige -Enzymmenge definiert, die die.Umwandlung von 0,001 /uMol je Minute NAD zu NADH bei den oben beschriebenen Testbedingungen katalysiert. Das Verfahren nach Wacker (oder Amador), das ebenfalls bekannt ist, verwendet die gleiche primäre Reaktion, wird aber bei 25°C anstelle von 37°C durchgeführt. Definitionsgemäß ist eine Wacker (oder Amador)-Einheit 1_S15 LDH-Einheiten äquivalent. Somit müssen zur Umrechnung der LDH-Einheiten in Wacker-Einhelten die LDH-Einheiten mit 0,87 multipliziert werden»'

Beispiel 9

ServMglutaminsäure-brenztraubensäure-Traasaminaseformulierunpen und Analyse

Für den Serumglutaminsäure-brenztraubensäure-Transaminasetest werden zwei getrennte Formulierungen verwendet. Die beiden verwendeten Formulierungen sind in Tabelle I als Formulierungen R und S angegeben.

Vor der Vermischung der Konstituenten der Enzymreagensformulierung R v/erden die modifizierte Lactatdehydrogenase und die reduzierten Nicotinamid-adenindinucleotid-Komponenten hergestellt. Die modifizierte NADH-Komponente vairde gemäß der Arbeitsweise des Beispiels k hergestellt. Die modifizierte Lactatdehydrogenase wurde wie unten beschrieben hergestellt. ' -

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Gummiarabikum (15 g), Ammoniumsulfat (10 g), Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (12 g) und Rinderserum-albumin (0,1 g) wurden in destilliertem Wasser (450 ml) aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde mit 12n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und dann zu einem Gesaratvolumen von 500 ml verdünnt. Diese Lösung wurde durch Zentrifugierung mit 10 000 U/min bei einer Temperatur von 10⁰C über 16 Minuten unter Verwendung der angegebenen Vorrichtung geklärt. Zu 300 ml der geklärten Lösung wurde eine kristalline LDH-Suspension in Ammoniumsulfatlösung (10 ml mit 100 mg LDH) gegeben. Das resultierende Enzyrngemisch wurde 5 Minuten zur Gewährleistung!, einer guten Vermischung gerührt und sodann aufgeteilt. Jeder Teil wurde in einen von mehreren Gefriertrocknungsgefäßen gebracht. Jeder Teil wurde sodann in dünnen Schichten gefroren, indem die Gefäße in einem Trockeneis/Alkoholbad bei -60 C oder darunter rotiert wurden. Die gefrorenen, dünnen Schichten wurden bei -60 bis -7O⁰C bei einem Gesamtdruck von 5 m/u Hg über einen Zeitraum von 18 bis 20 Stunden lyophilisiert. Das erhaltene lyophilisierte Pulver wurde in einer Atmosphäre mit einer relativen Feuchtigkeit von weniger als 3% gesammelt und in einem Exsikkator bei 4°C gelagert. Es wurden ungefähr 26 g trockenes Pulver erhalten. Dieses Pulver wurde auf die enzymatischen Aktivitäten sowohl von Glutaminsäure-brenztraubensäure-Transaminase und LDH untersucht. Die GPT-spezifische Aktivität wurde als weniger als 0,04% in Beziehung zu der spezifischen LDH-Aktivität gefunden. Das modifizierte lyophilisierte LDH-Pulver war daher für die Herstellung der Formulierung R geeignet.

Bei der Herstellung der EnzymreagensforiBulierung R wurden modifiziertes NADH (mit einem äquivalenten NADH-Gehalt von 0,4 mg), modifiziertes LDH (mit einem LDH-Äquivalent von 2 Einheiten), DL-Alanin (1,20 kg), dibasisches Natriumphosphat (585 g) und gemahlenes einbasisches Natriumphosphat (750 g) in einer Hobart-Kugel miteinander vermischt und gründlich

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durchbewegt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (5Q,4 g) in Methylendichlorid (200 ml) zu dem Gemisch gegeben. Weiteres Methylenchlorid (ungefähr 70 ml) wurde nachfolgend eingeführt, um den gewünschten Grad der Granulierung zu ergeben. Die feuchte Granulierung wurde sodann gesiebt und bei Raumtemperatur getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt und abgepackt.

Die Substratreagensformulierung S hat im wesentlichen die gleiche Zusammensetzung und wurde im wesentlichen in der Weise wie die Formulierung G des Beispiels 4 bereitet.

Gelöst in separaten Wasserportionen, ergeben die Formulierungen R und S flüssige Reagentien, die für die Untersuchung der Serumglutaminsäure-brenztraubensäure-Transaminase (SGPT) geeignet sind. Die in der Probe vorhandene SGPT katalysiert die Transaminierung von L-Alanin und a-Ketoglutarsäure, wodurch ein Pyruvat und Glutamat gebildet .werden. Das Pyruvat und NADH werden in Gegenwart von LDH zu Lactat und NAD umgewandelt. Das Ausmaß der Reaktion ist für die vorhandene SGPT indikativ. Die Messung erfolgt durch Beobachtung der Veränderung der optischen Dichte bei 340 nm bei 37⁰C.

Zur Herstellung einer Coenzym-Flüssigkeitsreagenslösung wird die Formulierung R (6,55 g) in destilliertem Wasser (125 ml) aufgelöst. Ein flüssiges Substratreagens wird hergestellt, indem die Formulierung S (1,00 g) in destilliertem Wasser (25 ml) aufgelöst wird. Die resultierenden Lösungen reichen für 50 Tests aus. Das flüssige Substrat-Reagens ist unter Kühlung eine Woche stabil« Andererseits sollte die Coenzym-Reagensformulierung täglich frisch, bereitet werden» _x

Bei der Durchführung des Tests wird ein aliquoter. Teil der Lösung der Formulierung R (2,5 ml) mit einer Serumprobe(100yul)

unter Bildung eines Reagens/Probetestsystems vermischt. Dieses wird 7 bis 10 Minuten in einer Heizeinheit bei 37⁰C vorinkubiert. Nach der Vorinkubierung wird eine aliquote Menge der Lösung der Reagensformulierung S (0,5 ml) zu dem festsystem zugegeben und bei Raumtemperatur innerhalb weniger ails 10 Sekunden zugemischt. Der das System haltende Behälter wird in die Heizeinheit zurückgeführt, wo es bei 37°C gehalten wird. Genau 2 Minuten nach Zugabe der Lösung der Formulierung S wird der Behälter aus der Heizeinheit entnommen und die Absorption des Testsystems wird unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen, welches zuvor unter Verwendung voh destilliertem Wasser als Leerprobe auf eine Absorption von Null eingestellt worden war. Unmittelbar nach Vornahme der Messung wird der Behälter in die Heizeinheit zurückgeführt und bei 37⁰C gehalten. Exakt 5 Minuten nach Zugabe der Lösung der Formulierung S (d.h. 3 Minuten nach der ersten Ablesung) wird der Behälter, der das Testsystem enthält, erneut aus der Heizeinheit herausgenommen und die Absorption wird erneut mit dem Spektrophotometer gemessen. Der SGPT-Gehalt des Systems wird sodann nach der folgenden Gleichung berechnet!

A₁ - Ap χ 1665 . >

—- - = SGPT-Einheiten je ml Serum

Darin bedeutet A₁ die Absorption, abgelesen bei 2 Minuten, Ag die Absorption, abgelesen bei 5 Minuten, und L bedeutet den Lichtweg der Absorptionszelle oder den Innendurchmesser des ' Behälters, ausgedrückt in Zentimeter.

Eine SGPT-Einheit ist als diejenige Enzymmenge definiert, die die Oxydation von 0,001 /uMol je Minute NADH zu NAD bei 37°C unter den obigen Testbedingungen katalysiert. Das bekannte Karmen-Verfahren führt die obigen Reaktionen bei 25°C anstel" von 37°C aus. Definitionsgemäß ist eine Kannen-Einheit 1,09 SGPT-Einheiten gleich. Die SGPT-Einheiten können in Karmen-Einheiten umgewandelt werden, indem man die SGPI-JSinheiten mit 0,917 multipliziert.

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Wenn die bei der obigen Bestimmung gemessene Absorptionsdifferenz (A^ - kg) über 0,225 hinausgeht, dann wird eine sehr hohe SGPT-Aktivität in dem Serum angezeigt. Bei diesem Aktivitätswert ist die Beziehung zwischen der Absorptionsdiffe- renz und den LDH-Einheiten je ml Serum nicht linear und der Koeffizient bei der oben angegebenen Gleichung kann ungenau sein, wodurch ungenaue Ergebnisse bewirkt werden. Zur Erzielung einer größeren Genauigkeit bei der Messung von hohen SGPT-Aktivitäten wird der obige Test mit einer 20/ul-Serumprobe wiederholt." Die Aktivität wird gemäß der folgenden Gleichung bestimmt:

A₁-Ao

—■ - χ 8100 = SGPT-Einheiten je ml Serum

Naturgemäß ist die Genauigkeit des SGPT-Tests auch hoch von einer engen Temperaturkontrolle abhängig. Daher enthält das Küvettenabteil des Spektrophotometers vorzugsweise Einrichtungen für die Temperaturkontrolle, wobei die Temperatur der Probe auf 37°C kontrolliert wird« Wenn das Instrument nicht mit solc/hen- Temperaturkontrolleisirichtungen ausgestattet ist, dann sollte die Absorptionszelle aus der Heizeinheit .nicht langer als 10 Sekunden bei der Bestimmung der optischen Dichte des Testsystems entfernt werden..

Beispiel 10 ' ·

CoIoriraetrisehe Formulierungen und Analyse für_THa,rji^äure

Für den colorimetrischen Harnsäure-Test werden drei separate Formulierungen zur Verfügung gestellt. Diese drei Formulierungen sind in der Tabelle I als Formulierungen T, U und V angegeben. Vorgewählte Mengen dieser Formulierungen γ/erden in separaten Wasserportionen aufgelöst, um flüssige Reagentien zur Verwendung für die Harnsäure,-Analyse zu bilden.

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Vor der Vermischung der Konstituenten der Enzym-Reagensformulierung T wurde die modifizierte Uricase-Komponente hergestellt. Zur Herstellung der modifizierten Uricase wurde anfangs ein Boratpuffer hergestellt, indem Borsäure (50 g) in destilliertem Wasser (3,5 1) aufgelöst wurde und die resultierende Lösung mit einer 10bigen Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 9 eingestellt wurde. Die eingestellte Lösung wurde sodann auf ein Gesamtvolumen von 4 1 (0,2 m an Borat) verdünnt und vor dem Gebrauch in einem Kühlschrank abgekühlt. Uricase (etwa 40 mg) wurde in ein 250 ml Becherglas durch Ströme des von einer Waschflasche gelieferten Boratpuffers überführt. Die verwendete Uricase war eine Uricase-Lösung in 30% Glycerin, erhalten von Boehringer Mannheim Corporation (Kat.Nr. 15074 EVAC) mit einer spezifischen Aktivität von etwa 4,5 U/mg bei 25⁰C und etwa 10,5 U/mg bei 37⁰C. Nach Überführung der Uricase wurde weiterer Boratpuffer zugesetzt, um das Gesamtvolumen der Uricase-Lösung in dem Becherglas auf ungefähr 100 ml zu bringen. Die verdünnte Uricase-Lösung wurde sodann gegen ungefähr 2 1 0,2 m Boratpuffer 4 Stunden lang dialysiert, wobei der verunreinigte Puffer mit frischem Puffer am Ende der ersten zwei Dialyse-Stunden ersetzt wurde. Wäh rend der fortschreitenden Dialyse wurden Kaliumchlorid (6 g), Mannit (4 g) und Akaziengummi (4g) in 0,2 m Boratpuffer (100 ml) aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde durch Zentrifugierung mit 10 000 U/min bei 1O⁰C und über einen Zeitraum von 16 Minuten unter Verwendung der angegebenen Vorrichtung geklärt. Rinderserumalbumin (0,4 g) und ungefähr 67 200 Einheiten Catalase wurden zu der geklärten Lösung gegeben, um eine Lösung herzustellen, die nachstehend als inerte Lösung bezeichnet wird.

Nach beendigter Dialyse der Uricase-Lösung wurde die dialysierte Uricase-Lösung in ein 500 ml-Becherglas und mit einem 200 ml-Teil der inerten Lösung kombiniert. Destilliertes Wasser (200 ml) wurde sodann zugegeben und die resultierende

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Lösung wurde gründlich gemischt. Diese Lösung wurde sodann in zwei separate Gefriertrocknungsgefäße überführt und in einem Trockeneis/Alkoholbäd bei einer Temperatur von -6Q⁰C oder darunter gefroren. Die gefroreneiiLösung wurde "bei -60 bis -70⁰C und einem absoluten Druck von 5 m/U Hg. 20 bis 24 Stunden lang lyophilisiert. Das resultierende lyophilisierte Pulver wurde in einer Atmosphäre mit einer relativen Feuchtigkeit von weniger als 5% gesammelt und in einem Exsikkator bei 4°C gelagert. Es wurden ungefähr 19»5 g modifizierte Uricase erhalten.

Zur Herstellung des Üricase-Reagens T wurden modifizierte Uricase (äquivalent 0,05 Einheiten/Test), Glycin (113,25 g) und wasserfreies Natriumcarbonat (39»75 g) in einer Hobart-Kugel vermischt und gründlich miteinander vermengt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (4,50 g) in Methylenchlorid (25 ml) eingeführt. Weiteres Methylen-» chlorid (ungefähr 10 ml) wurde nachfolgend zugegeben _f vm den gewünschten Grad der Granulierung und der Feuchtigkeit zu erzielen. Das nasse Granulat wurde sodann gesiebt und getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt und abgepackt. - ·■ .

Zur Herstellung der Kupferreagensformulierung TJ wurden Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (112,50 g), Natriumbicarbonat (112,5 g) und wasserfreies Kupfer(IX)-sulfat (1,95 g) in einer Hobart-Kugel vermischt und gründlich miteinander vermengt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (7,05 g) in Methylenchlorid (15 ml) eingeführt. Weiteres Methylenchlorid (ungefähr 5 ml) wrde nachfolgend zugegeben,· um den gewünschten Grad der Granulierung und der Feuchtigkeit zu erzielen. Das nasse Granulat wurde sodann gesiebt und getrocknet«, Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt xmd abgepackt.'

• . '--58 -

Zur Herstellung der Neocuproin-Reagensformulierung V wurden Neocuproinhydrochlorid (5_t25 g), Renex~55 (150 g) und Tetronic 707 (^»75 g) in einer Hobart-Kugel vermischt und gründlich durchgemischt. Methylenchlorid (ungefähr 40 ml) wurde sodann zugegeben, um den gewünschten Grad der Granulierung und Feuchtigkeit zu ergeben. Das feuchte Granulat wurde sodann gesiebt und getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt und abgepackt.

Gelöst in separaten Portionen Wasser, ergeben die Formulierungen T, U und V flüssige Reagentien, die für die Analyse von biologischen Proben auf Harnsäure geeignet sind. Die Harnsäure in den Proben reduziert die Kupfer(II)-ionen der Formulierung U zu Kupfer(I)-ionen, die sich ihrerseits mit dem Neocuproin der Formulierung V in gepufferter Lösung unter Bildung eines Farbkomplexes umsetzen. Die resultierende optische Dichte des Testsystems wird mit der optischen Dichte einer Leerprobe verglichen, die in der gleichen Weise, aber unter Zusatz von Uricase von der Formulierung T, die die Harnsäure zerstört, bereitet wird. Die Differenzen der Absorptionen zwischen dem Testsystem und der Leerprobe sind dem Serumharnsäuregehalt proportional.

Zur Herstellung des flüssigen enzymatischen Reagens wird die Formulierung T (1,18 g) in destillierte» Wasser (150 ml) aufgelöst. Eine Uricaseleerlösung (Formulierung W) wird hergestellt, indem (1,18 g) in destilliertem Wasser (1§O ml) aufgelöst werden. Das kupferhaltige flüssige Reagens wird hergestellt, indem die Formulierung U (1,55 g) in destilliertem Wasser (25 ml) aufgelöst wird. Ein Neocuproin enthaltendes flüssiges Reagens wird hergestellt, indem die Formulierung V (1,06 g) in destilliertem Wasser (25 ml) aufgelöst wird. Die flüssigen Reagenslösungen der Formulierungen U und V sind bei Raumtemperatur unbegrenzt stabil, während die Lösung der

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Formulierung T täglich frisch bereitet werden sollte. Die resultierenden Lösungen reichen für die Vornahme von 50 Tests aus.

Bei Durchführung des Tests wird ein 3 ml-Teil der Lösung der Formulierung T in ein Reagensglas gegeben. Ein 3 ml-Teil der Formulierung ¥ -wird in ein zweites Reagensglas gegeben. Zu beiden Reagensgläsern werden 0,1 ml Serum gegeben,, um ein Probe/Reagenstestsystem in dem Reagensglas, das destilliertes Wasser und ein Leertestsystem in dem Reagensglas, das die Lösung der Formulierung T enthält, enthält, zu ergeben. Der Inhalt beider Reagensgläser.wird sodann 15 Minuten bei 37°C irikubiert, worauf 1 ml des kombinierten Farbreagensgemisches, hergestellt durch Vermischung gleicher Volumina der Lösungen der Formulierungen U und V, zu dem Probe/Reagenstestsystem und dem Leertestsystem gegeben werden» Beide Testsysteme werden bei Raumtemperatur 15 Hinuten nach Zugabe des kombinierten Farbreagensgemisches stehengelassen^ Die Lichtabsorption jedes Systems wird sodann bei 455 ran mit einem Spektrophotometer, das mit einer Wasserleerprobe auf 100% Durchlässigkeit eingestellt worden ist, gemessen. Zum Erhalt der für die Berechnung der Harnsäure im Serum erforderlichen Werte wird mit einer Standard-Reagensleerprobe eine weitere Messung der optischen Dichte durchgeführt. Diese Standardleerprobe des Reagens wird hergestellt,'indem Harnsäure (100 mg) "und Lithiumcarbonat (60 mg) zu destilliertem Wasser (etwa 500 ml) gegeben werden und das Gemisch auf 60⁰C erhitzt wird, um die Additive aufzulösen. Die resultierende Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und auf ein Gesamtvolumen von 1000 ml mit weiteren , Mengen von destilliertem Wasser verdünnt. 3 ml dieser Reagensleerprobe werden sodann in ein Reagensglas gegeben und in der gleichen Weise wie die Leerprobe und das Probe/Reagenstestsystem behandelt mit Einschluß der Zugabe, Inkubierung, Zugabe des obengenannten kombinierten Farbreageiisgemisches und 15minütiger Haltung vor der Messung der optischen Dichte.

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Die Harnsäure in mg% in der Serumprobe wird sodann nach folgender Gleichung errechnet:

Test 0.D.(gegen Wasser) - Leerprobe 0.D.(gegen Wasser)

χ 10 mg

Standard 0.D.(gegen Reagensleerprobe)

Beispiel 11 U.V.-Formulierungen und Analyse für Harnsäure

Zwei Formulierungen werden für den Harnsäure(U.V.)-Test verwendet. Eine dieser Formulierungen ist- die Formulierung T des Beispiels 10, während die andere in Tabelle I als Formulierung W angegeben ist. Vorgewählte Mengen dieser Formulierungen werden in separaten Wasserportionen aufgelöst, um flüssige Reagentien für die Harnsäure(U.V.)-Analyse ^ergeben.

Bei,der Herstellung der Formulierung W wird ein Uricaseplacebo verwendet. Dieses wird in der gleichen Weise wie die modifizierte Uricase-Komponente der Formulierung T, wie in Beispiel 10 beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Uricase weggelassen wird.

Zur Herstellung der Formulierung W wurden Uricaseplacebo (19,50 g), Glycin (113,25 g) und wasserfreies Natriumcarbonat (39,75 g) in einer Hobart-Kugel vermengt und gründlich miteinander vermischt. Bei laufendem Mischer wurde eine Lösung von Tetronic 707 (4,50 g) in Methylenchlorid (25 ml) eingeführt. Weiterhin wurde Methylenchlorid (ungefähr 10 ml) nachfolgend zugegeben, um den gewünschten Grad der Granulierung und Feuchtigkeit zu ergeben. Das nasse Granulat wurde gesiebt und getrocknet. Das resultierende trockene Granulat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben wiedergesiebt und abgepackt.

Eine flüssige Reagenslösung der Formulierung W wird in Verbindung mit der flüssigen Reagenslösung der Formulierung T bei

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der Durchführung des Harnsäure(U.Vi)-Tests verwendet. In Gegenwart von Uricase der Formulierung T setzt sich Harnsäure von der Probe mit Wasser und Sauerstoff unter Bildung von Allantoin, Kohlendioxyd und Hydroperoxyd um» Die Lichtabsorption bei 293 mn, die Absorptionsspitze von Harnsäure wird vor und nach der Behandlung der Probe mit Uricase von der Formulierung T gemessen. Die Differenz der Absorption ist der in dem System vorhandenen Harnsäuremenge proportional. Allantoin, das Produkt der Uricase-katalysierten Reaktion von.Wasser, Harnsäure und Sauerstoff, absorbiert bei 293 nm nicht.

Die flüssige Reagenslösung der Formulierung T wird wie in Beispiel 10 oben hergestellt. Zur Herstellung eines flüssigen Leerprobereagens wird die Formulierung ¥ (1,18 g) in destilliertem Wasser (150 ml) aufgelöst. Wie oben ausgeführt, sollte die Lösung der Formulierung T täglich frisch hergestellt werden. Die flüssige Reagenslösung der Formulierung W ist beim . Kühlen einen Monat stabil. Die resultierende Lösung ist für die Durchführung von 50 Tests genügende

Bei Durchführung des Tests wird ein Leerprobensystem hergestellt, indem die Lösung der Formulierung W (3,0 ml) mit einer Probe des Serums (100 /Ul) vermischt wird, während ein Probe/Reagenstestsystem hergestellt wird, indem die Lösung der Formulierung T (3,0 ml) mit einer Probe des gleichen Serums (100/ul) vermischt wird. Sowohl das Leersystem als auch das Probe/Reagenstestsystem werden 15 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Die inkubierten Gemische werden sodann in Küvetten eines Spektrophotometers mit einem Lichtweg von 1 cm überführt. Das Instrument wird bei 0,800 O.D. auf Null eingestellt, wobei die Leerprobe bei 293 nm durchgeführt wird. Die Absorption des Unbekannten wird sodann abgelesen und die in mg% ausgedrückte Harnsäure-Menge in der Probe wird nach folgender Gleichung errechnet;

(0,8 - O.D. von Unbekannt) χ 41,36.

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Claims (8)

1. Patentansprüche

   Reagensformulierung zur Durchführung von klinischen diagnostischen Tests mit biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet , daß sie ein festes, wasserlösliches, im wesentlichen wasserfreies, lagerbeständiges Gemisch darstellt, welches

   mindestens ein Reagens, das dazu imstande ist, bei einer Testreaktion unter Bewirkung einer meßbaren Veränderung in einem Testsystem teilzunehmen, und

   ein stickstoffhaltiges, nicht-ionogenes Polyoxyalkylen-Netzmittel, welches eine Struktur hat, die derjenigen entspricht, wenn Äthylendiarain in Gegenwart eines Katalysators aufeinanderfolgend mit Propylenoxyd und Ithylenoxyd umgesetzt wird, wobei die Polyoxypropylen-Ketten des Netzmittels ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 750 und etwa 6750 besitzen,

   enthält.
2. 2. Reagensformulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das stickstoffhaltige Netzmittel fest ist und daß die Polyoxypropylen-Ketten ein mittleres Molekulargewicht von weniger als etwa 4000 haben,
3. 3t Reagensformulierung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyoxypropylenketten des Netzmittels ein mittleres Molekulargewicht von etwa 2750 haben und daß der Mengenanteil an Polyoxyäthyleneinheiten in der Größenordnung von 7.0% liegt.
4. 4. Reagensformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 3»

   dadurch gekennzeichnet , daß mindestens ein Reagens ein Enzym oder ein Coenzym ist.

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5. 5. ' Verfahren zur Herstellung einer festen, wasserlöslichen, im wesentlichen wasserfreien, lagerbeständigen Reagensformulierung zur Durchführung von klinischen diagnostischen Tests mit biologischen Pro.ben, dadurch gekennzeichnet, daß man

   (1) mindestens ein Reagens, das dazu imstande ist, bei einer Testreaktion' unter Bewirkung einer meßbaren Veränderung in einem Testsystem teilzunehmen, mit einem festen, stickstoffhaltigen, nicht-ionogenen Polyoxyalkylen-Netzmittel, welches eine Struktur hat, die derjenigen entspricht, wenn Äthylendiamin in Gegenwart eines Katalysators aufeinanderfolgend mit Propylenoxyd und Äthylenoxyd umgesetzt wird; wobei die Polyoxypropylen-Ketten des Netzmittels ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 750 und etwa 6750 besitzen, und einem Lösungsmittel für das Netzmittel vermischt, und daß man

   (2) das Lösungsmittel unter Bildung eines imwesentlichen wasserfreien, freifließenden, wasserlöslichen, kornförmigen Feststoffs entfernt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß mindestens*ein Reagens der Stufe (1) ein Enzym oder ein Goenzym ist.
7. 7. Verfahren zur Durchführung von klinischen diagnostischen Tests mit biologischen Proben unter Verwendung einer Reagensformulierung, dadurch gekennzeichnet ,. daß man ein festes, wasserlösliches, im wesentlichen wasserfreies, lagerbeständiges Gemisch, welches

   mindestens ein Reagens, das dazu imstande ist, bei einer Testreaktion unter Bewirkung einer meßbaren Veränderung in einem Testsystem teilzunehmen, und

   ein stickstoffhaltiges, nicht-ionogenes Polyoxy- , alkylen-Netzmittel, welches eine Struktur hat, die derjenigen

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   entspricht, wenn Äthylendiamin in Gegenwart eines Katalysators aufeinanderfolgend mit Propylenoxyd,und Ätbylenoxyd umgesetzt wird, wobei die Polyoxypropylen-Ketten des Ifetzmittels ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 750 und etwa 6750 besitzen, enthält,

   (1) in Wasser zur Bildung eines flüssigen Reagens auflöst,

   (2) das flüssige Reagens mit einer Probe unter Bildung eines Probe/Reagens-Testsystema vermischt, und daß man

   (3) eine Veränderung in dem System mißt, welche von der Reaktion zwischen dem Reagens und der Probe herrührt.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 71 dadurch g e k e η η <zeichnet , daß mindestens ein Reagene, das in der Reagenaformulierung enthalten'ist, ein Enzym oder ein Coenzym ist.

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