DE4019904A1

DE4019904A1 - Mittel zur verringerung der stoerungen durch ascorbat bei reagens-systemen und darauf bezogenes verfahrens

Info

Publication number: DE4019904A1
Application number: DE4019904A
Authority: DE
Inventors: James P Albarella; Meitak Teresa Yip
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1989-06-26
Filing date: 1990-06-22
Publication date: 1991-01-03
Also published as: JP2876069B2; JPH0330697A; US4954451A

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Mittel und ein Verfahren zur Ausschaltung von Störungen durch Ascorbat in Reagens-Systemen gerichtet, insbesondere in Analysen- Systemen, die mit Oxidase/Peroxidase gekoppelte Reaktionen oder eine Redox-Chemie eines ähnlichen Typs benutzen. Die vorliegende Erfindung kann auch in Reagenssystemen unter Beteiligung von Enzym/Substrat-Reaktionen eingesetzt werden, bei denen das Substrat gegen Reduktionsmittel wie Ascorbat empfindlich ist. So kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, um Störungen durch Ascorbat in Analyt-Nachweissystemen zur Bestimmung von Glucose, okkultem Blut, Cholesterin, Triglyceriden und Harnsäure sowie anderen Analyten auszuschalten. Im einzelnen umfassen das Mittel und das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Verwendung wasserunlöslicher Cer(IV)-Verbindungen.

Ascorbinsäure ist ein bedeutsamer und wohlbekannter Nährstoff, der in vielen Nahrungsmitteln wie Obst und Gemüse natürlich vorkommt und der auch preisgünstig als Nahrungsmittel-Zusatz oder Vitamin-Ergänzungsstoff synthetisiert werden kann. Infolgedessen ist Ascorbinsäure weit verbreitet, und die Bevölkerung neigt allgemein dazu, mehr Ascorbinsäure als nötig aufzunehmen.

Ein Ascorbinsäure-Überschuß ist im allgemeinen nicht schädlich, weil der Körper Ascorbinsäure nur in einer Menge aufnimmt, die zur Befriedigung der Kurzzeit- Bedürfnisse des Körpers ausreicht, wobei der Überschuß rasch über das Harnsystem des Körpers ausgeschieden wird. Infolgedessen wird Ascorbinsäure häufig in Harn- Proben gefunden, die bei der medizinischen Analyse eingesetzt werden.

Leider kann Ascorbinsäure in Harn eine unerwünschte Stör-Komponente für viele gegenwärtig existierende Urin-Analysen sein. Allgemein sind Urin-Analysen wichtige medizinische Werkzeuge bei der Diagnose und Behandlung der gesamten Bevölkerung, und aus diesem Grund hat man diesem Problem in den letzten Jahren große Aufmerksamkeit zugewandt.

Urin-Analysen umfassen oft einen Redox-Indikator, und diese Redox-Indikatoren sind im allgemeinen in ihrer reduzierten Form in das Analysen-System eingearbeitet. Diese Indikatoren ändern ihre Farbe, wenn sie oxidiert werden, und werden aus diesem Grunde "Redox"-Indikatoren genannt, weil sie ihre Farbe ändern, wenn sie aufgrund der Anwesenheit eines Oxidationsmittels aus einem reduzierten Zustand in einen oxidierten Zustand übergehen.

Bei vielen Analysen-Systemen bewirkt ein interessierender Analyt direkt oder indirekt die Oxidation des Redox-Indikators des Analysensystems und ruft dadurch eine nachweisbare Antwortreaktion hervor, die mit der Anwesenheit des Analyten korreliert. Mit anderen Worten: Wenn der passende Analyt zu dem Analysensystem hinzugefügt wird, erleiden die Redox-Indikatoren die folgende Reaktion:

I_red → I_ox + wenigstens 1 Elektron

worin I_red der Indikator im reduzierten Zustand (negative Farb-Antwortreaktion) ist und worin I_ox der Indikator im oxidierten Zustand (positive Farb-Antwortreaktion) ist.

Ascorbinsäure erleidet jedoch in wäßriger Lösung die folgende Reaktion:

worin A als C₄H₆O₄ definiert ist. Ascorbat ist ein Reduktionsmittel, da es zur Abgabe eines Elektrons befähigt ist und dadurch die das Elektron aufnehmende Substanz zu reduzieren vermag:

Auf diese Weise vermag Ascorbat einen Redox-Indikator dadurch zu stören, daß es den Indikator reduziert, wenn dieser in seiner oxidierten Form vorliegt, wodurch die beabsichtigte Farbänderung gehemmt wird und ein "falscher negativer Befund" verursacht wird.

Zahlreiche Methoden wurden versucht, einige davon mit Erfolg, die die nachteilige Wirkung ausschalten, die Ascorbinsäure auf Redox-Indikatoren in einem Analysen- System ausüben kann. Eine erfolgreiche Methode wird in der US-PS 45 87 220 von Mayambala-Mwanika et al. offenbart, bei der Eisen(III)-Komplexe mit Hydroperoxid kombiniert werden, um als Ascorbat-Abfangmittel zu wirken. Dieses Abfangmittel-System verhindert die Ascorbat-Reduktion der Redox-Indikatoren.

Bei Mayambala wird Fe⁺³ mit einem chelatbildenden Mittel für Eisen wie HEDTA (N-2-Hydroxyethylethylendiamintriessigsäure) komplexiert und mit Ascorbinsäure umgesetzt. Das Fe(III)-chelat fängt die Ascorbinsäure wie folgt ab:

Das Mayambala-Abfangmittel bewirkt, daß die sekundären Alkohol-Gruppen der Ascorbinsäure zu Ketonen oxidiert werden, und auf diese Weise wird Ascorbinsäure in eine nicht-reduzierende Verbindung umgewandelt, die ein Redox-Indikator-System nicht stört. Das Fe(II)-HEDTA wird jedoch mit Hilfe eines Peroxids oder von Hydrogenperoxid wie folgt im Kreislauf zu Fe(III)-HEDTA zurückverwandelt:

Das resultierende Hydroxid-Radikal kann gemäß der folgenden Gleichung ein Elektron aufnehmen:

HO˙ + 1 Elektron → HO^-

und vermag aus diesem Grunde als Oxidationsmittel zu wirken. Als Folge davon vermag das Hydroxid-Radikal den Redox-Indikator zu oxidieren, wenn der Redox-Indikator in seiner reduzierten (ursprünglichen) Form vorliegt, und verursacht dadurch eine Farbänderung ohne Rücksicht darauf, ob ein interessierender Analyt vorhanden ist oder nicht. Folglich kann, bei der Verhinderung eines falschen negativen Befundes, das Ascorbinsäure-Abfangmittel- System von Mayambala einen unerwünschten falschen positiven Befund verursachen. Indem das Ascorbinsäure- Abfangmittel-System ein Problem löst, schafft es ein anderes.

Das Mayambala-Patent schlägt eine Einstellung des pH-Wertes des Analysensystems mit Hilfe herkömmlicher Puffer vor, um die Oxidationswirkung des Abfangmittel- Systems zu minimieren. Da Oxidations-Reaktionen typischerweise durch Säure katalysiert werden und an unterschiedlichen Oxidations-Reaktionen unterschiedliche kinetische Wechselwirkungen beteiligt sein können, kann es in der Tat möglich sein, einen pH-Wert zu finden, der eine Indikator-Oxidation durch den Analyten beschleunigen würde, ohne in nennenswertem Maße die Indikator- Oxidation durch das Ascorbinsäure-Abfangmittel-System zu beschleunigen.

Das Mayambala-Patent schlägt auch ein Trockenphasen- Format vor, das das Reagens-System in zwei Tauchlösungen trennt. Eine Tauchlösung wird inkorporiert und auf einem Träger getrocknet, und danach wird die zweite Tauchlösung ebenfalls auf dem Träger inkorporiert und getrocknet. Mayambala schlägt deshalb vor, daß bestimmte Bestandteile eines Reagens-Systems vielleicht in einem Trockenformat in einer Weise getrennt werden können, wo die gewünschte Oxidationsreaktion über die unerwünschte Oxidationsreaktion dominiert.

Eine Einstellung des pH-Wertes mag sich jedoch nicht für jedes Reagens-System als vorteilhaft erweisen, und ein Mehrfach-Tauchverfahren zur Schaffung eines Trockenphasen- Systems mag nicht immer für jedes Reagens-System praktisch oder durchführbar sein. Weiterhin kann in manchen Fällen ein Flüssig-Format eher erwünscht sein als ein Trockenphasen-Format.

Demzufolge ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein System bereitzustellen, durch das die Störung durch Ascorbat oder ein Reduktionsmittel eines ähnlichen Typs ausgeschaltet werden kann, ohne die Zuverlässigkeit eines Redox-Indikator-Systems zu beeinträchtigen.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein gegen Ascorbat beständiges Analysensystem bereitzustellen, das in Form einer Lösung verwendet oder in einen Reagens-Streifen unter Anwendung eines Einmal- Tauchverfahrens eingearbeitet werden kann.

Andere Ziele und Merkmale werden für den Durchschnittsfachmann beim Lesen der nachfolgenden Beschreibung erkennbar, insbesondere der ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und der Ansprüche.

Kaminagayoshi et al., "A Container for Sample Analysis Based on Enzymic and Diazo Coupling Reactions", JP- Patentanmeldung Nr. 84/53 478 vom 22. März 1984, beschreibt die Verwendung eines wasserbeständigen Papierbechers, der mit einer Lösung aus Methylcellulose (2,5%) und NaIO₄ (10 mg/ml) behandelt ist, als Vorrichtung zur Bestimmung von Glucose im Harn im wesentlichen ohne Störung durch Ascorbinsäure.

Tom, "Immunoassay", europäische Patentanmeldung Nr. EP 1 03 958 vom 28. März 1984, offenbart einen Reagensstreifen- Immunoassay, bei dem Peroxidase verwendet wird, um die Bildung eines nachweisbaren Farbstoffs zu katalysieren. Ein saugfähiger Träger wird nach der Immobilisierung der Reagentien mit Periodat getränkt, um die Störung durch Ascorbat in Proben zu reduzieren oder eliminieren.

"Methods and Diagnostic Agents for the Detection of Redox Reactions", europäische Patentanmeldung Nr. 00 37 056 vom 24. März 1981, beschreibt die Verwendung von Iodat, um Ascorbinsäure zu oxidieren. Die Lehre stellt speziell fest, daß Periodat nicht eingesetzt werden kann, da es neben Ascorbinsäure auch die meisten Indikatoren oxidiert.

Tomioka et al., "Cerium Catalyzed Selective Oxidation of Secondary Alcohols in the Presence of Primary Ones", Tetrahedron Letters 23 (5), 539-542 (1982), beschreiben die Kombinationen aus (NH₄)₂Ce(NO₃)₆-NaBrO₃ oder Ce(SO₄)₂·2 H₂SO₄-NaBrO₃ als wirksame Reagentien zur selektiven Oxidation.

Firouzabadi et al., "Dinitratocerium(IV) Chromate Dihydrate, [Ce(NO₃)₂]CrO₄·2 H₂O, a Mild Reagent for the Oxidation of Organic Compounds in Organic Media", Synthetic Communications 14 (10), 973-981 (1984), diskutieren die Herstellung der Titel-Verbindung und ihre Verwendung zur Oxidation verschiedener organischer Substrate in Benzol, wie Benzylalkohol und Diole.

Firouzabadi et al., "Bis[trinitratocerium(IV] Chromate, [Ce(NO₃)₃]₂CrO₄: a Mild Oxidant in Organic Synthesis", Synthetic Communications 14 (7), 631-637 (1984), diskutieren die Herstellung der Titel-Verbindung und ihre Verwendung bei der Oxidation von Benzylalkoholen zu Aldehyden und Ketonen, von α-Hydroxyketonen zu Diketonen, von Hydrochinon zu p-Benzochinon und von Brenzcatechin zu o-Benzochinon.

Firouzabadi et al., "Tris-trinitratocerium(IV) Paraperiodate, [(NO₃)₃Ce]₃H₂IO₆, An Efficient and a Versatile Oxidant in Organic Synthesis", Synthetic Communications 14 (11), 1033-1042 (1984), diskutieren die Herstellung der Titel-Verbindung und ihre Verwendung zur Oxidation unterschiedlicher Klassen organischer Verbindungen, etwa von Benzylalkoholen und Diolen in trockenem Benzol mit hohen Ausbeuten.

Firouzabadi et al., "Ceric Triethylammonium Nitrate [Ce(Et₃NH)₂](NO₃)₆, an Efficient Oxidant for the Oxidation of Benzylic Alcohols and α-Hydroxy Ketones To Their Corresponding Carbonyl Compounds Under Mild Conditions", Synthetic Communications 13 (13), 1143-1147 (1983), diskutieren die Herstellung der Titel-Verbindung und ihre Verwendung zur Oxidation von Benzylalkoholen und α-Hydroxyketonen in ihre entsprechenden Carbonyl- Verbindungen in Methylenchlorid mit hohen Ausbeuten.

Ho, "Cerium(IV) Oxidation With a Dual Oxidant System: Reaction of Some Arylmethanols", Synthesis 12, Seite 936 (1978), beschreibt ein duales Oxidationsmittel-System aus Ce(IV)/Bromat.

Die im vorstehenden zitierten Literaturangaben betreffen allgemein die Chemie der vorliegenden Erfindung. Keine dieser Literaturstellen lehrt jedoch oder legt nahe, daß die Cer(IV)-Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um selektiv Ascorbat zu oxidieren und dadurch eine Störung durch Ascorbat auszuschalten, ohne die gewünschten Redox-gekoppelten Reaktionen zu stören, die typischerweise in Analysensystemen angewandt werden.

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Mittel und ein Verfahren zur Ausschaltung von Störungen durch Ascorbat in Reagens-Systemen gerichtet, insbesondere in Analysen- Systemen, die mit Oxidase/Peroxidase gekoppelte Reaktionen oder eine Redox-Chemie eines ähnlichen Typs benutzen. Die vorliegende Erfindung kann auch in Reagenssystemen unter Beteiligung von Enzym/Substrat-Reaktionen eingesetzt werden, bei denen das Substrat gegen Reduktionsmittel wie Ascorbat empfindlich ist. Das Mittel der vorliegenden Erfindung umfaßt wasserunlösliche Cer(IV)- Verbindungen.

Viele Nachweissysteme unter Einsatz von Redox-Reaktionen werden durch die Anwesenheit von Ascorbinsäure nachteilig beeinflußt. Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung wasserunlöslicher Cer(IV)-Verbindungen gerichtet. Im Gegensatz zu löslichen Cer-Verbindungen wie Cernitrat, Cersulfat, Cerammoniumnitrat (CAN), Certriethylammoniumnitrat (CTEN) und dergleichen sind unlösliche Cer-Verbindungen wie Cerhydroxid, Ceroxid, Cerfluorid, Ceriodat, Tris(trinitratocer)paraperiodat (TNCP), Bis(trinitratocer)chromat (BTCC), Ceracetylacetonat, Certrifluoroacetylacetonat und Pyridiniumhexachlorocerat brauchbar zur Überwindung der Störungen durch Ascorbat. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können eine beliebige wasserunlösliche Cer(IV)- Verbindung sein. Die Konzentration solcher wasserunlöslicher Cer(IV)-Verbindungen in Form einer Aufschlämmung liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 5 bis etwa 50 mM (millimolar), und insbesondere von etwa 7 bis etwa 37 mM. Konzentrationen unterhalb von 5 mM sind im allgemeinen nicht wirksam, während Konzentrationen oberhalb von etwa 50 mM wirksam sein können, jedoch dazu neigen, keinen gesteigerten Vorteil zu bieten.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung oxidieren Ascorbat selektiv, wodurch eine Störung durch Ascorbat ausgeschaltet wird. Die Cer(IV)-Oxidationsmittel der vorliegenden Erfindung sind spezifisch und erzeugen typischerweise keinerlei Farbentwicklung in Gegenwart eines konventionellen Redox-Indikator-Systems.

Beispielsweise vermag die Verbindung TNCP, in den Beispielen identifiziert, eine Störung durch Ascorbat bis zu 250 mg Ascorbinsäure, die in 1 dl einer Test-Probe vorliegen, (mg/dl) innerhalb einer Mischzeit von 10 s zu beseitigen. Die rasche und wirksame Entfernung der Ascorbat-Störung hat eine stark verbesserte Genauigkeit in den meisten Analysensystemen zur Folge, die sich einer Oxidase/Peroxidase-gekoppelten Reaktion und eines Redox-Indikator-Systems bedienen.

Die Cer(IV)-Oxidationsmittel der vorliegenden Erfindung sind nicht abhängig vom pH-Wert. Sie sind leicht herzustellen und können in einfacher Weise eine Filter-Vorrichtung tränken oder an ihr immobilisiert werden, um ein heterogenes Test-System zu bilden.

Beispiele I. Synthese wasserunlöslicher Cer(IV)-Verbindungen (1) und (2) und einer wasserlöslichen Cer-Verbindung (3)

Cer(IV)-Oxidationsmittel wurden gemäß den folgenden Arbeitsvorschriften hergestellt:

(1) Tris(trinitratocer)paraperiodat (TNCP)
[(NO₃)₃Ce]₃H₂IO₆

Kaliumperiodat (4,6 g, 20 mmol) wurde in 200 ml warmem entionisierten Wasser gelöst. Nachdem man die Lösung sich geringfügig abkühlen gelassen hatte, wurde eine Lösung von Cerammoniumnitrat (32,9 g, 60 mmol) in 30 ml entionisiertem Wasser tropfenweise im Laufe von 5 min hinzugefügt. Die resultierende Reaktionsmischung wurde dann 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Ein zitronenfarbener Feststoff trennte sich ab; dieser wurde abfiltriert, zweimal mit entionisiertem Wasser gewaschen, in 100 ml entionisiertem Wasser suspendiert und gefriergetrocknet, wonach 10,8 g eines gelben festen Stoffs erhalten wurden (Ausbeute 48%). Das auf diese Weise hergestellte Produkt kann einfacher in einer wäßrigen Lösung resuspendiert werden.

(2) Bis(trinitratocer)chromat (BTCC)
[(NO₃)₃Ce]₂CrO₄

Kaliumdichromat (11,8 g, 40 mmol) wurde in 200 ml entionisiertem Wasser gelöst, und dann wurde eine Lösung von Cerammoniumnitrat (21,9 g, 40 mmol) in 60 ml entionisiertem Wasser tropfenweise im Laufe von 10 min hinzugefügt. Ein orangefarbener Feststoff schied sich sofort ab. Nach 2 h Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung filtriert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der feste Stoff wurde in 50 ml entionisiertem Wasser suspendiert und gefriergetrocknet, wonach 14,3 g eines organgefarbenen festen Stoffs erhalten wurden (Ausbeute 92%).

(3) Certriethylammoniumnitrat (CTEN)
Ce(Et₃NH)₂(NO₃)₆

Cerhydroxid (10,4 g, 50 mmol) wurde in 35 ml Salpetersäure unter Erhitzen gelöst. Man ließ die Lösung sich geringfügig abkühlen und fügte dann Triethylamin (20,9 ml, 150 mmol) tropfenweise im Laufe von 5 min hinzu. Die resultierende Reaktionsmischung wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt und dann in einem Eisbad gekühlt. Der entstandene orangefarbene Niederschlag wurde filtriert, schnell mit entionisiertem Wasser gewaschen und aus heißem Wasser umkristallisiert, wonach 4 g eines orangefarbenen festen Stoffs erhalten wurden; Schmp. 135°C (Ausbeute 11%).

II. Verwendung wasserunlöslicher Cer(IV)-Verbindungen zur Verhinderung von Störungen durch Ascorbat

Niederbereichs-Glucose-Kissen wurden dadurch hergestellt, daß Whatman 54-Papier in zwei Tauchlösungen getränkt wurde. Die erste Tauchlösung besteht aus 100 mM (millimolar) Tetramethylbenzidin (TMB) und 0,5% Aerosol OT in 1-Methoxy-2-propanol, und die zweite Tauchlösung besteht aus 250 Einheiten/ml Glucoseoxidase Sigma Typ VII, 500 Einheiten/ml Peroxidase, 2% Polyvinylpyrrolidon (PVP) K-60 und 0,01% FD 5 in 0,2 M Morpho linoethansulfonat-natrium-Salz (pH 6,0) als Puffer.

Tabelle I zeigt die Ergebnisse, wie die Cer-Oxidationsmittel als Ascorbinsäure-Abfangmittel wirksam waren. Eine ausgeprägte Verbesserung der Reaktionsfähigkeit der Tupfer wurde beobachtet, wenn ein Oxidationsmittel anwesend war, im Vergleich zu derjenigen, wenn kein Oxidationsmittel eingesetzt wurde.

Tabelle II zeigt zum Vergleich die Ergebnisse bestimmter wasserlöslicher Cer-Oxidationsmittel. Es ist zu sehen, daß in Abwesenheit jeglicher Glucose oder Ascorbinsäure diese löslichen Cer-Oxidationsmittel ein falsches positives Ergebnis liefern.

Tabelle I

Ascorbat-Oxidationsmittel-Systeme

Die Messungen des Reflexionsgrades wurden mit einer vereinfachten Form der wohlbekannten Kubelka-Munk-Gleichung (siehe Gustav Kortüm, "Reflectance Spectroscopy", S. 106-111, Springer-Verlag, NY [1969]) ausgewertet: K/S = (1-R)²/2R, worin R der Anteil des Reflexionsgrades von der Test-Vorrichtung ist, K eine Konstante ist und S der Lichtstreuungs-Koeffizient des speziellen reflektierenden Mediums ist.

Tabelle II

Eine Analysensystem-Vorrichtung wurde entwickelt, die einen Filter-Tauchkolben und ein Polypropylen-Teströhrchen umfaßte. Ein herkömmliches Analysen-Reagenssystem wird zusammen mit einem Cer(IV)-Oxidationsmittel in das Teströhrchen gegeben. Der Filter-Tauchkolben wird in das Teströhrchen geschoben, um das feste Cer-Oxidationsmittel von der Lösung zu trennen und dadurch eine Analyse des Reagenssystems ohne Störung durch das unlösliche Cer(IV)-Oxidationsmittel zu ermöglichen.

Die Experimente wurden wie folgt durchgeführt: Zu dem Inhalt eines Teströhrchens, das 100 µl 0,2 M Tris (trinitratocer)paraperiodat-Suspension in Wasser enthielt, wurde 1 ml 0,1 M Phosphat (pH 7) hinzugefügt, das 100 mg/dl Glucose und 100 mg/dl Ascorbinsäure enthielt. Die Suspension wurde 5 s vermischt, und dann wurde der Filter-Tauchkolben hineingeschoben. Ein aliquoter Anteil von 50 µl wurde abpipettiert und mit 0,1 M Phosphat- Lösung (pH 7) auf 500 µl verdünnt. Dann wurden 7 µl auf ein Niederbereichs-Glucose-Kissen pipettiert, und der Reflexionsgrad bei der Wellenlänge 600 nm wurde mit einem Reflexions-Photometer Seralyzer® gemessen. Der Wert K/S nach 60 s wurde aufgezeichnet. Die Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der Standard-Kurve unter Einsatz von Lösungen, die 0, 30, 50, 65, 80, 90, 100 und 120 mg/dl Glucose enthielten.

III. Gebrauchsverhalten von TNCP {Tris(trinitratocer)paraperiodat} in einem Flüssig-Format

Das Oxidationsmittel TNCP wurde in einem flüssigen Analysensystem in Übersichtsuntersuchungen auf seine Reaktionsfähigkeiten als Ascorbinsäure-Abfangmittel geprüft. Die angewandten allgemeinen Arbeitsweisen waren die folgenden:

1. Das Oxidationsmittel wurde mit Puffer-Lösung in einem Teströhrchen von 12 mm×75 mm vermischt.
2. Lösungen von Glucose und von Ascorbinsäure wurden hinzugefügt, und das resultierende Material wurde etwa 10 s durchgemischt.
3. Glucose-Kissen, die Tetramethylbenzidin (TMB), Glucoseoxidase und Peroxidase enthielten, nachdem sie mit einer Lösung getränkt waren, die 100 mM, 300 Einheiten/ml bzw. 500 Einheiten/ml der genannten Stoffe in MES-Puffer (4-Morpholinethansulfonsäure), pH 6, enthielt, Papier: Whatman 54, wurden dann in die Mischung getaucht, und die Rate der Farbentwicklung wurde aufgezeichnet.
4. Kontroll-Versuche wurden durchgeführt, bei denen die Oxidationsmittel oder Glucose oder Ascorbinsäure abwesend waren.

Puffer:
Phosphat, 0,4 M, pH 7
Glucose:	100 mg/dl
Ascorbinsäure:	100 mg/dl
Oxidationsmittel:	TNCP

Somit ist aus vorstehendem ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung gut dafür gerüstet ist, sämtliche Ziele der vorliegenden Erfindung sowie viele andere Vorteile mit Nachweissystemen zu erreichen, die Redox-Reaktionen benutzen, die durch Ascorbinsäure gestört werden. Die Oxidationsmittel-Systeme sind sehr schnell und wirksam. Beispielsweise vermag TCNP die Störung durch bis zu 250 mg/dl Ascorbinsäure, die in einer Test-Probe vorhanden sind, innerhalb einer Mischzeit von 10 s zu beseitigen. Zweitens sind die Oxidationsmittel-Systeme spezifisch. Wasserunlösliche Oxidationsmittel-Systeme wie TNCP und BTCC reagieren nicht mit dem Indikator Tetramethylbenzidin unter Hervorrufen einer Färbung in Abwesenheit von Glucose. Die besser wasserlöslichen Cer- Oxidationsmittel wie CAN und CTEN ergeben eine Farbentwicklung von weniger als 10% in Abwesenheit von Glucose. Ein zusätzlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, daß eine wirksame Beseitigung der Störung durch Ascorbat eine verbesserte Genauigkeit der Bestimmung von Glucose in der Test-Lösung zur Folge hat. Außerdem sind die Oxidationsmittel-Systeme der vorliegenden Erfindung nicht pH-abhängig. Darüber hinaus sind die Oxidationsmittel einfach herzustellen und können zur Bildung eines heterogenen Test-Systems in einfacher Weise eine Filter-Vorrichtung tränken oder an ihr immobilisiert werden.

Es ist offensichtlich, daß viele andere Modifikationen und Änderungen der vorliegenden Erfindung, so wie sie im vorstehenden dargelegt wurde, vorgenommen werden können, ohne vom Erfindungsgedanken und dem Umfang der Erfindung abzuweichen, und demgemäß sind nur solche Beschränkungen aufzuerlegen, wie sie durch die Ansprüche angegeben werden.

Claims

1. Verfahren zur weitestgehenden Ausschaltung von Störungen durch Ascorbat in einem Reagens-System, umfassend das Kombinieren eines Reagens-Systems mit einer wasserunlöslichen Cer(IV)-Verbindung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Cer(IV)-Verbindung eine Verbindung aus der aus
(a) Tris(trinitratocer)paraperiodat,
(b) Bis(trinitratocer)chromat,
(c) Cer(IV)fluorid,
(d) Cer(IV)hydroxid,
(e) Cer(IV)oxid und
(f) Cer(IV)iodat
bestehenden Gruppe ist.

3. Mittel zur weitestgehenden Ausschaltung von Störungen durch Ascorbat in einem Reagens-System, umfassend eine wasserunlösliche Cer(IV)-Verbindung.

4. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Cer(IV)-Verbindung eine Verbindung aus der aus
(a) Tris(trinitratocer)paraperiodat,
(b) Bis(trinitratocer)chromat,
(c) Cer(IV)fluorid,
(d) Cer(IV)hydroxid,
(e) Cer(IV)oxid und
(f) Cer(IV)iodat
bestehenden Gruppe ist.