DE1185841B - Diagnostisches Reagens zum Nachweis von Glukose und Diagnosehilfsmittel - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Internat. Kl.: G Ol η

Deutsche Kl.: 421-3/54

Nummer: 1185 841

Aktenzeichen: M 44720IX b/421

Anmeldetag; 19. März 1960

Auslegetag: 21. Januar 1965

Die Erfindung betrifft ein neues diagnostisches Reagens, insbesondere für einen diagnostischen Test, der zum qualitativen Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Glukose in biologischen Flüssig' keilten, wie Urin, brauchbar ist, wobei wirkenden Reagenzien auf einen saugfähigen Träger aufgebracht sind.

Der Glukosenachweis in Urin nebst Bestimmung der· Glukosekonzentration ist von großer Bedeutung für Diabetiker, die ihre Diät so überwachen müssen, daß ;ihre Zuckeraufnahme ein Höchstmaß nicht überschreitet, und die häufig in dieser Beziehung durch eine regelmäßige Überprüfung des Glukosegehaltes im Urin untersucht werden müssen. Abgesehen von der »Brauchbarkeit für die regelmäßige Urinuntersuchung an Diabetikern durch die Patienten und Ärzte kann der Glukoseindikator wirksam für die routinemäßige Urinaoalyse in Krankenhäusern und in der ärztlichen Praxis zum Nachweis von Diabetes, in der Unterscheidung von Glucosuria von anderen Meliturias-Erkrankungen u. dgl. benutzt werden.

Weil eine frühzeitige Diagnose und ständige Überwachung zur Behandlung der Diabetes wesentlich sind, muß sich ein Urinzuckertest, um hochwertig zu sein, rasch durchführen lassen, so einfach, daß er von jedem Patienten leicht erlernt werden kann, hinreichend genau, um als Hilfsmittel für den Kliniker zu dienen, und ausreichend empfindlich sein, um Änderungen in dem Zustand des Patienten wiederzugeben. Das Mittel muß auch genügend beständig sein-.

Verfahren zum Nachweis des Urinzuckers sind in der klinischen Chemie hinlänglich bekannt. Das eine Verfahren bedient sich des Kupferreduktionetestes nach Benedict, ein anderes verwendet einen unter Wärmeentwicklung stattfindenden alkalischen Kupferreduktionstest mittels Tabletten (USA.-Patentschrift 2 387 244). Ein weiteres Verfahren bedient sich eines Testes, der lediglich von der Enzymwirkung abhängt (USA.-Patentanmeldüng Serial Nr. 514395 vom 9. Juni 1955). Kein Verfahren erfüllt vollständig die oben aufgeführten Bedingungen.

Man hat einen neuen und hochwertigen Glukosenachweis entwickelt, der eine wesentliche Verbesserung der bisherigen Verfahren und eine neue Behandlung des Problems zur Bestimmung von Glukose in verschiedenen Flüssigkeiten, wie Urin, mittels einer Maßnahme darstellt, die sich eines diagnostischen Reagenses bedient, das sogar die neuesten und gebräuchlichsten Glukoseteste an Beständigkeit und Bestimmungsschärfe der Gehaltsmenge übertrifft.

Es wurde gefunden, daß Metaliporphyrine, die Diagnostisches Reagens zum Nachweis von
Glukose und Diagnosehilfsmittel

Anmelder:

Miles Laboratories, Incorporated, Elkhart, Ind.

(V. St. A.)

Vertreter:

Dr. W. Kühl, Patentanwalt,
Hamburg 36, Esplanade 36 a

¹S Als Erfinder benannt:
Otis Earl Fancher,
Dale Adrian Stauffer, Elkhart, Ind. (V. St. A,)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 27. März 1959 (802 281)

an sich unwirksam sind, bei Aktivierung durch gewisse stickstoffhaltige Substanzen überraschender- und unerwarteterweise als Katalysatoren die Oxydation von Indikatoren durch Wasserstoffperoxyd einzu-* leiten vermögen, das sich bildet, wenn Glukose aerob in Gegenwart von Glykoseoxydase oxydiert wird. Die Grundlage dieser Reaktionen ist bekannt und bedarf keiner Erörterung.

Ein diagnostisches Reagens im Sinne der Erfindung enthält als wesentliche Bestandteile Glukose- oxydase und einen Farbindikator für WasserstpnV peroxyd und ist erfindungsgemäß dadurch gekenn» zeichnet, daß es weiterhin ein Metallporphyrin und eine Verbindung mit Aminodonatorgrwppen zur Aktivierung des Metallporphyrins als Katalysator für die Oxydation des Indikators durch das sieh bildende Wasserstoffperoxyd enthält. Als Metallporphyrin kommt unter anderem Hämin in Betracht, als Amiinodonator eine komplexbildende Aminodonator-=· gruppen enthaltende Verbindung, wie 2-Aminobenzothiazol, Pyridia, Bipyridyl, Bipyridylpyridin, Nicotinsäure od. dgl., sund als farbbildende Substanz oder Indikator z. B. 2,f-Diammofluoren, o-Tolüidin, Leucoindophenole.

Als Metallporphyrin wird Hämin bevorzugt, das im Handel erhältlich ist und dessen vo!lständge chemische Bezeichnung l,3,5,8-TetraHiethyl-2,4 - divinylpörphin - 6,7 - dipropionsäureferricMorid.

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(C₃₄H₃₂N₄O₄FeCl) ist. Die folgende chemische Formel zeigt den komplexen Chemismus dieser Verbindung:

H₃C r—

HOOCCH₂CH₂

HC
HOOCCH₂CH₂

Hämin und die anderen Metallporphyrine, die erfindungsgemäß benutzt werden können, reagieren mit stickstoffhaltigen Basen oder Aminodonatorgruppen unter Bildung von Komplex- oder Adduktionsverbindungen der Struktur

in der der viergliedrige Ring ein octaedrisches Porphyrinringsystem darstellt; M bedeutet Fe, Co, Ni, Mn, Mg, Cu, Zn usw. oder einen Komplex wie VO usw.: .

steht für ein Stickstoffatom einer komplexbildenden Aminodonatorgruppe.

An Stelle eines Metallporphyrins kann man auch äquivalente metallische Komplexe oder Chelate wie Phthalocyanine verwenden, deren Struktur der des Porphinkernes im Hämin sehr ähnlich ist. Weitere katalytisch wirksame Stoffe, die im Sinne der Erfindung einsatzfähig sind, sind Ferrocenverbindungen, das Ferrosalz von Dimethylglyoxim usw.
- Das erfindungsgemäße diagnostische Reagens wird wegen der Unverträglichkeit der Bestandteile aus zwei getrennten Lösungen hergestellt; die eine Lösung enthält die Glykoseoxydase und den Indikator, zweckmäßig in einer Lösung Alkohol—Wasser im Verhältnis 1:1; die andere Lösung enthält ein Metallporphyrin, wie Hämin, und die stickstoffhaltige Substanz in einem alkoholischen Medium.

Weitere Substanzen, z.B. Schutz- und Netzmittel, können zugesetzt werden.

Ferner kann man für den Glukosetest einen geeigneten inerten Farbstoff verwenden, der dem Mittel eine gleichmäßige Grundfärbung erteilt, ferner ein Puffersystem, um den pH-Wert nach Wunsch einzuregeln (pH = 3 bis 7, vorzugsweise 5,4),

Die folgenden Beispiele erläutern im einzelnen mehrere Ausführungsformen der Erfindung nebst Herstellungsverfahren; sie zeigen die Anpassungsfähigkeit der Erfindung und die in ihrem Wirkungskreis möglichen mannigfaltigen Abwandlungen des Erfindungsgedankens; sie enthalten keine Werte, an die die Erfindung gebunden wäre.

Beispiel. 1

- Erläuterung der Herstellung nach der bevorzugten Ausführungsform.

Herstellung der Imprägnierungslösungen

Lösung A: 200 mg Algin werden mit 20 ml Wasser bis zur Bildung einer klaren Lösung verrührt und dann mit 20 ml einer Pufferlösung vom pH 5,4 (hergestellt durch Auflösung von 352,8 g Natriumcitratmonohydrat und 25,6 g wasserfreier Citronensäure in Wasser und Verdünnung auf 1000 ml) unter Rühren versetzt. Eine Lösung von 2 g Gelatine und 150mg F.D. &C.Red No. 3 (Dinatriumsalz von 9Λ65ία3Ϊ

xanthon) in 100 ml heißem Wasser wird hergestellt.

ao 20 ml dieser Lösung werden in die Algin-Pufferlösung unter Rühren eingetragen. Dann wird eine Lösung von 200 mg 2,7-Diaminofluorendihydrochlorid in 20 ml heißem 50%igem Äthanol zugesetzt. Eine Lösung von 400 mg Glykose-Oxydase (16 000 Einheiten je Gramm, nach 5stündigem Erhitzen auf 100° C zur Zerstörung der Katalase) in 5 ml Wasser wird eingetragen. Die entstandene Lösung wird nötigenfalls durch Wärmezuführung auf 40 bis 45° C gehalten,

Lösung B: 50 mg Hämin und 500 mg 2-Aminobenzothiazol werden in 50 ml 95%igen Äthanol und 50 ml 10%igen Polyvinylalkohol eingetragen. Das Gemisch wird zum Sieden erhitzt und 2 Minuten geschüttelt. Überschüssiges Hämin wird abfiltriert und das Filtrat zum Abkühlen auf Zimmertemperatur stehengelassen.

Herstellung eines diagnostischen Streifens

Saugfähige Streifen, z.B. in schmale Streifen geschnittenes Filtrierpapier, kleine Stückchen aus Holz oder anderem porösem bzw. absorptionsfähigem Material mit einer wasserundurchlässigen Schranke von Äthylcellulose, 12,7 mm bis zum Ende, werden in Lösung A so eingetaucht, daß während des submersen und kapillarenfüllenden Vorgehens der ganze Streifenabschnitt von 12,7 mm bis zur Schranke vollständig imprägniert ist. Die Streifen werden dann in einem Heißluftofen bei 100° C innerhalb weniger Minuten bis etwa 5 Stunden getrocknet. Die imprägnierten Streifen werden dann in gleicher Weise in die Lösung B, eine klare braune Lösung, eingetaucht und danach wiederum in einem Heißluftofen bei etwa 100° C getrocknet.

55 Testverfahren

Bei der praktischen Anwendung wird ein nach obigen Angaben imprägnierter Streifen in eine Probe der zu testenden Flüssigkeit getaucht. Wenn es sich um glukosehaltigen Urin handelt, geben die Streifen in etwa einer Minute positive Reaktionen, die durch verschiedene Abstufungen in blauer Farbe ausgewiesen werden.

Wenn Urin mit einem Gehalt an 1 oder 2% Glukose untersucht wird, entwickelt sich in einer Minute eine intensive blaue Farbe; Urin mit 0,1% Glukose ergibt eine matte blaue Farbe in einer Minute, mit einem Glukosegehalt von 0,25% und 0,5% in einer Minute einen blauen Farbton mitt-

lerer Intensität. Urin mit dem höchsten Glukosegehalt zeigt das tiefste Blau. Beim Eintauchen in glukosefreien Urin unterliegen die Streifen keiner Farbänderung. Nach diesen Farberscheinungen kann man leicht eine Farbkarte zur Verwendung bei Urinuntersuchungen auf den Glukosegehalt herstellen.

Beispiel 2

A. 12 ml Pufferlösung (hergestellt durch Auflösen von 7,4 g wasserfreier Citronensäure und 32,6 g Trinatriumcitratdihydrat in 100 ml Wasser) werden rasch unter lebhaftem Rühren in 10 ml wanne Gelatinelösung eingetragen, die durch Auflösen von 4,8 g Gelatine in 100 ml siedendem Wasser bereitet ist. 100 mg o-Toluidindihydrochlorid werden mit 10 ml 95%igem Äthanol (2, B) vermischt; das Gemisch wird schnell in die Gelatine-Pufferlösung unter lebhaftem Rühren eingetragen. Dann wird eine GIukoseoxydaselösung in einer Menge von 10 ml zugesetzt, die durch Auflösen von 0,5 g Glukoseoxydase (Aktivität 16000 Einheiten je Gramm) in 50 ml Wasser bereitet war; die Masse wird unter Rühren gut vermischt. Papierstreifen werden in die Lösung eingetaucht und bei. 100° C 10Minuten getrocknet.

B. 5 mg Hämin werden in 2 bis 10 Tropfen Pyridin gelöst; das Gemisch wird mit 9O°/oigem Äthanol verdünnt. Die Streifen werden in diese Lösung eingetaucht und noch feucht in Urin mit einem Gehalt von 1% Glukose eingetaucht. In einer Minute entwickelt sich eine mäßige blaue Färbung. Wenn die Streifen getrocknet werden, verdampft das Pyridin, so daß im Urin (1% Glukose) keine Farbänderung beobachtet wird.

Dieses Beispiel, wonach Pyridin beim Trocknen verlorengeht, beweist eindeutig, daß Hämin für sich die Oxydation der Indikatoren durch Wasserstoffperoxyd nicht in einem für die Zwecke der Erfindung ausreichendem Maße katalysiert.

Beispiel 3

Ein Gemisch von 50 mg Hamm, 500 mg Nicotinsäure, 50 ml 95%igem Äthanol und 50 ml lOVoigem wäßrigem Polyvinylalkohol wird erwärmt und 5 Minuten geschüttelt. Überschüssiges Hämin wird abfiltriert. Streifen nach Beispiel 2, A werden mit diesem Gemisch imprägniert und 10 Minuten bei 100° C getrocknet. Die Streifen entwickeln eine blaugrüne Farbe nach 5 Minuten langem Eintauchen in 1 % Glukose enthaltendem Urin und nur einen sehr schwachen grünen Farbton mit ¹Ao % Glukose enthaltendem Urin.

Beispiel 4

Bei Verwendung von 50 mg 2-Aminobenzothiazol an Stelle der Nicotinsäure im Beispiel 3 werden die Streifen etwas aktiver, und es entwickelt sich mit 1% Glukose enthaltendem- Urin in 3 Minuten eine blaugrüne Farbe.

lösung (hergestellt durch Auflösen von 2 g Gelatine und 150 mg F. D. & C. Red No. 3-Farbe in 100 ml Wasser) unter Rühren zugesetzt; danach werden 200 mg 2,7-Diaminofluorendihydrochlorid in 20 ml heißem 50%igem Äthanol gelöst, und schließlich wird eine Lösung von 400 mg .Glukoseoxydase (16 000 Einheiten je Gramm) in 5 ml Wasser unter gutem Rühren eingetragen; die Papierstreifen werden sogleich mit der warmen Mischung imprägniert und dann 10 Minuten bei 100° C getrocknet.

B. Diese Streifen werden in die Lösung des Hämin-Nicotinsäure-Komplexes gemäß Beispiel 3 eingetragen und 10 Minuten bei 100° C getrocknet. Beim Eintauchen in Urin mit 1% Glukose entsteht ein. mittelstarker blauer Farbton in 2 Minuten. Bei Verwendung von Urin mit Vio% Glukose wird nur eine schwache Farbänderung in 2 Minuten beobachtet.

Zusammenfassung: Die Erfindung betrifft ein Diagnosereagens und ein Diagnosehilfsmittel zum Nachweis von Glukose in Körperflüssigkeiten, namentlich in Urin. Das Hilfsmittel besteht aus einem saugfähigen Streifen od. dgl., der mit einem Reagens imprägniert ist, welches aus Glukoseoxydase, einem Metajlporphyrin, z. B. Hämin, einer Aminodonatorgruppen enthaltenden komplexbildenden Verbindung, wie 2-Aminobenzothiazol, Nicotinsäure oder Pyridin, als Aktivator für das Metallporphyrin und einer farbbildenden Substanz, wie 2,7-Diaminofluoren oder o-Toluidin, besteht, die durch WasserstofEperoxyd in Gegenwart von aktiviertem Metallporphyrin oxydiert wird. Ein Reagens aus Glukoseoxydase, Hämin, 2-Aminobenzothiazol und 2,7-Diaminofluoren bildet die bevorzugte Ausführungsform des Reagens nach der Erfindung.

Beispiel 5

60

A. 20 ml heißer Pufferlösung (hergestellt durch Auflösen von 352,8 g Natriumcitratmonohydrat und 25,6 g wasserfreier Citronensäure in Wasser und Verdünnen auf 1 000 ml) werden unter Rühren in eine Lösung von 200 mg Algin in 20 ml Wasser eingetragen. Dann werden 20 ml heiße Gelatine-Farb-

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Diagnostisches Reagens zum Nachweis von Glukose mit Hilfe von Glukoseoxydase und einem Farbindikator für Wasserstoffperoxyd, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Metallporphyrin und eine Verbindung mit Aminodonatorgruppen zur Aktivierung de.s⁼ Metallporphyrins als Katalysator für die Oxydation des Indikators durch das sich bildende Wasserstoffperoxyd enthält.

2. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminodonatorgruppen enthaltende Verbindung eine komplexbildende Verbindung ist.

3. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als Aminodonatorgruppen enthaltende Verbindung 2-Aminobenzothiazol, Nicotinsäure oder Pyridin und als Farbindikator 2,7-Diaminofluoren oder o-Toluidin enthält.

4. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Metallporyphyrin Hämin enthält.

5. Diagnosehilfsmittel zum Nachweis von Glukose, dadurch gekennzeichnet, daß es die Form eines mit den in den Ansprüchen 1 bis 4 angegebenen Bestandteilen getränkten saugfähigen Trägers besitzt.

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