DE1260827B

DE1260827B - Zubereitung zum Glukosenachweis in Harn

Info

Publication number: DE1260827B
Application number: DE1964M0063425
Authority: DE
Inventors: James Thomas Rees
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1964-12-09
Filing date: 1964-12-09
Publication date: 1968-02-08

Description

Zubereitung zum Glukosenachweis in Harn Die Erfindung betrifft verbesserte Zubereitungen und Vorrichtungen zum Nachweis von Glukose.
Die Zubereitungen und Prüfvorrichtungen nach der Erfindung sind zur Bestimmung des Glukosegehaltes der verschiedenartigsten Substanzen geeignet. Eine der wichtigsten Anwendungen ist der Nachweis von Glukose in Körperflüssigkeiten, z. B. Harn. Die Bestimmung von Glukose im Harn ist natürlicherweise nicht nur für die Einstellung der Zuckermenge in der Diät diabetischer Patienten wichtig, sondern hat auch für umfangreiche Untersuchungen an der Bevölkerung, zur Feststellung von Diabetes, wesentliche Bedeutung.
Aus der britischen Patentschrift 808 742 ist bereits eine Zubereitung zum Nachweis von Glukose im Harn bekannt, die Glukoseoxydase, Peroxydase und einen Indikator, der durch Wasserstoffperoxyd oxydiert wird und bei dieser Oxydation eine Farbreaktion eingeht, z. B. o-Tolidin oder Benzidin, enthält. Diese Zubereitung kann auch einen Puffer, um den pH-Wert des Gemisches in Gegenwart von Harn auf etwa 2 his etwa 8 zu halten, und ein Protein oder ein Abbauprodukt eines Proteins enthalten.
Der Umgang mit größeren Mengen o-Tolidin und Benzidin ist jedoch gesundheitlich nicht unbedenklich. Es wurde jetzt gefunden, daß diese Indikatoren durch andere, ungefährlichere Substanzen ersetzt werden können, die ebenfalls zufriedenstellende Ergebnisse bei dem Nachweis von Glukose im Harn liefern.
Die Erfindung geht daher aus von einer Zubereitung zum Nachweis von Glukose im Harn, welche Glukoseoxydase, eine Substanz mit Peroxydaseaktivität und einen Indikator, der durch Wasserstoffperoxyd und Peroxydase oxydiert wird und eine Farbreaktion bei dieser Oxydation ergibt, enthält; der Indikator ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß er eine Verbindung der Formel oder ein Salz derselben ist und in dieser Formel R' und R", die verschieden sein können, Hydroxyl-, Amino-, NHR- oder NR2-Reste sind, worin R ein Alkyl- oder Arylrest ist und die Benzolringe weitere Substituenten enthalten können.
Ein Beispiel für einen erfindungsgemäß verwendbaren Indikator ist das durch die Kondensation von Vanillin mit p-Aminodimethylanilinhydrochlorid erhältliche Anil, das ein fast weißes Produkt der Formel ist, das seine Farbe in Gegenv, art von Glukose in schwach sauren Lösungen nach Malvenfarben (mauve) ändert.
Ein zweites Beispiel für einen verwendbaren Indikator ist das durch die Kondensation von p-Dimethylaminobenzaldehyd mit p-Aminophenol erhältliche Anil, welches ein gelbes Produkt der Formel ist, das seine Farbe in Gegenwart von Glukose in schwach saurer Lösung nach Braun ändert.
Ein drittes Beispiel für einen verwendbaren Indikator ist das durch die Kondensation von p-Hydroxybenzaldehyd mit p-Aminophenol erhaltene Anil, das ein gelbes Produkt der Formel ist und seine Farbe in Gegenwart von Glukose in schwach saurer Lösung nach Braun ändert.
Die Zubereitungen enthalten vorzugsweise einen Puffer, um den pH-Wert des Gemisches auf etwa 2 bis etwa 8, z. B. etwa 4 bis etwa 5 in Gegenwart von Harn zu halten, und ein Protein oder das Abbauprodukt eines Proteins, z. B. Gelatine. Die in den Zubereitungen nach der Erfindung verwendeten Enzyme sind Glukoseaerodehydrogenase, welche manchmal als Glukoseoxydase bezeichnet werden und fähig sind, Glukose in Gegenwart von atmosphärischem Sauerstoff in Glukonsäure überzuführen und gleichzeitig Wasserstoffperoxyd zu bilden, und eine Substanz mit Peroxydaseaktivität, die gewisse Substanzen, z. B. oxydierbare Farbstoffe, in Gegenwart von Wasserstoffperoxyd oxydieren kann. Beispiele für Substanzen mit Peroxydaseaktivität sind Peroxydase und Katalase. Andere Substanzen, die oxydierbare Farbstoffe in Gegenwart von Wasserstoffperoxyd katalytisch oxydieren können, sind z. B. Metallporphyrine, wie Haemin und Uroferriporphyrinchlorid, und gemischte Jodid-Molybdatsalze, z. B. Mischsalze aus Natriummolybdat und Kaliumjodid. An Stelle von .Kaliumjodid und Natriummolybdat können auch andere Jodide, z. B. Natrium- und Ammoniumjodid, und andere Molybdate, z. B. Kalium- und Ammoniummolybdat, verwendet werden.

Die Erfindung wird an Hand nachstehender Beispiele näher erläutert.

Beispiel l

Es wurde ein Gemisch nachstehender Zusammen-

setzung hergestellt:

Glukoseoxydase................. 9,6 g

Peroxydase .................... 0,29

Zitronensäure................... 14,8 g

Natriumzitrat .................. 65,2 g

Gelatine ....................... 9,6 g

3-Methoxy-4-hydroxybenzol-

p-di-methylaminoanilin ........ 4,0 g

Alkohol (95% Äthanol) ......... 200 ml

Destilliertes Wasser.............. 600 ml

Man verfuhr, wie folgt a) 9,56 g Gelatine wurden 200 ml heißem destilliertem Wasser zugegeben. Das Gefäß wurde warm gehalten und gelegentlich gerührt bis zur Lösung der Gelatine. Vor der Verwendung wurde die Gelatine verflüssigt und die Temperatur auf 35'C (95' F) erhöht.

b) 200 ml destilliertem Wasser wurden 14,8 g Zitronensäure und 65,2 g Natriumzitrat zugegeben und das Gemisch bis zur Lösung der Feststoffe gerührt.
c) 4,0 g 3-Methoxy-4-hydroxybenzal-p-dimethylaminoanilin wurden in 200 ml Alkohol gelöst und bis zur Herstellung des Gesamtgemisches gerührt.
d) 5 bis 10 Minuten vor der Verwendung wurde die Peroxydase in 200 ml destilliertem Wasser unter Rühren gelöst, die Glukoseoxydase zugegeben und bis zur Lösung gerührt.
e) Herstellung der fertigen Mischung: Die Gelatinelösung a) wurde in ein Gefäß aus korrosionsbeständigem Stahl gegossen und die Puffer-Lösung b) rasch unter Rühren zugegeben. Anschließend wurde die Lösung des 3-Methoxy-4-hydroxybenzal-p-dimethylaminoanilins c) eingerührt und die Rückstände in den Bechergläsern mit der Gelatinepufferlösung nachgespült. Schließlich wurde die Enzymlösung d) unter Rühren bis zur vollständigen Lösung zugegeben. Beispiel 2 Man verfuhr nach Beispiel 1, verwendete jedoch 4,0 g p-Hydroxybenzal-p-hydroxyanilin an Stelle von 3-Methoxy-4-hydroxybenzal-p-dimethylaminoanilin. Diese imprägnierten Streifen ergaben beim Eintauchen in glukosehaltigem Harn oder eine glukosehaltige Lösung eine Braunfärbung, deren Intensität und Entwicklungsgeschwindigkeit annähernd zur Menge der vorhandenen Glukose in Beziehung stand, wenn keine Inhibitoren anwesend waren.
Beispiel 3 Man verfuhr nach Beispiel 1, verwendete jedoch 4,0 g p - Dimethylaminobenzal - p - hydroxyanilin an Stelle von 3-Methoxy-4-hydroxybenzal-p-dimethylaminoanilin. Beim Eintauchen der imprägnierten Streifen in glukosehaltigem Harn oder eine glukosehaltige Lösung entstand eine braune Färbung, deren Intensität und Entwicklungsgeschwindigkeit annähernd in Beziehung zur Menge der vorhandenen Glukose stand, wenn keine Inhibitoren anwesend waren.

Claims

Patentansprüche: 1. Zubereitung zum Glukosenachweis im Harn, enthaltend Glukoseoxydase, eine Substanz mit Peroxydaseaktivität und einen Indikator, der durch Wasserstoffperoxyd und Peroxydase oxydiert wird und bei dieser Oxydation eine Farbreaktion ergibt, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator eine Verbindung der Formel oder ein Salz derselben ist und in dieser Formel R' und R", die verschieden sein können, Hy droxyl-, Amino-, NHR- oder NR2-Reste sind, worin R ein Alkyl- oder Arylrest ist und die Benzolringe weitere Substituenten enthalten können.
2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator eine Verbindung der Formel ist.
3. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator eine Verbindung der Formel ist.
4. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator eine Verbindung der Formel ist. In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Auslegeschriften Nr. 1075 869, 1121847; USA.-Patentschrift Nr. 3 042 496.