DE69411928T2 - Verfahren, reagenz und testsatz zum nachweis von okkultem blut in stuhl - Google Patents

Verfahren, reagenz und testsatz zum nachweis von okkultem blut in stuhl

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Description

  • Die Erfindung betrifft das Feststellen (den Nachweis) von okkultem (verborgenen) Blut in Stuhl und insbesondere die Verwendung von verstärkten Entwicklern beim Feststellen von okkultem Blut in Stuhl.
  • Okkultes Blut in Stuhl stellt einen verläßlichen diagnostischen Indikator für eine Vielzahl medizinischer Zustände dar, die ein gastro-intestinales Bluten mit sich bringen, das auf andere Weise schwierig festzustellen sein kann, einschließlich des kolorektalen Krebses. Die Verwendung dieses Verfahrens ist in der medizinischen Literatur gut beschrieben. Siehe zum Beispiel Greegor, D. H., Cancer 19 : 330-337 (1969) and Hastings, J.B., Amer. J. Surg. 127:228-233 (1974). Tests auf okkultes Blut in Stuhl, die auf der Oxidation von Guajak zum Bilden eines blaugefärbten Produktes in Gegenwart von Hydrogenperoxid und Hämoglobin basieren, sind im US-Patent Nr. 3,996,006 beschrieben und sind im Wege der Verweisung Bestandteil des vorliegenden Textes. Derartige Produkte werden unter den Markenbezeichnungen Hemoccult® und Seracult® verkauft. Kurz gesagt umfaßt der Test das Plazieren einer fäkalischen (Stuhl-)Probe auf einem mit Guajak beschichteten absorbierenden Papier und das Hinzufügen einer Hydrogenperoxid enthaltenden Entwickler-Lösung. Wenn Hämoglobin anwesend ist, wird das Guajak oxidiert, wobei sich das Papier blau färbt.
  • Es wird als wünschenswert erachtet, die Empfindlichkeit des Tests zu erhöhen, um im frühstmöglichen Stadium einen übermäßigen Blutverlust in die Gedärme festzustellen. Das Vorkommen falscher Negative, das Problem, daß die Anwesenheit von Blut nicht festgestellt wird, ist somit nachteilig. Es sind daher Anläufe unternommen worden, die Empfindlichkeit des Tests zu erhöhen. Zum Beispiel wurde das Hinzufügen von einem oder zwei Tropfen Wasser zu der fäkalischen Schmiere auf dem mit Guajak imprägnierten Testpapier vor dem Hinzugeben der Peroxidlösung eingesetzt, um die Test-Empfindlichkeit zu erhöhen. Ein derartiges Vorgehen ergibt jedoch häufig sogar dann eine positive Reaktion, wann keine pathologisch signifikante Menge Blut im Stuhl vorhanden ist.
  • Das Vorkommen falscher Positive ist ebenso unerwünscht, da es zu unnötigen nachfolgenden medizinischen Prozeduren führen kann.
  • Eine verbesserte Version dieses Tests ist in der Veröffentlichung des europäischen Patents Nr. 0 308 227 beschrieben. Phenole werden zu der Entwicklerlösung hinzugegeben, um eine Erhöhung der Menge des produzierten farbigen Produkts zu erreichen, woraus eine empfindlichere Untersuchung resultiert.
  • Das US-Patent Nr. 3,975,161 und das japanische Patent Nr. 1,147,366 beschreiben die Verwendung von Chinolinderivaten zum Sensibilisieren oder Beschleunigen von Reaktionen zum Feststellen von okkultem Blut in Stuhl. Im Falle des japanischen Patents Nr. 1,147,366 ist das Chinolinderivat gemeinsam mit einer Peroxid-Quelle und einem Ethanol-Amin-Salz mikroeingekapselt. Das mikro-eingekapselte Material wird mit einem Indikator kombiniert und zur Verwendung als Eintauch-Stab auf einen festen Träger gedruckt.
  • Die US-Nr. 4,971,914, die WO 89/05972 und die WO 86/03585 beschreiben einen Test auf okkultes Blut in Stuhl, in dem zumindest 50% eines Lösungsmittels für Eisen-Protoporphyrine in dem Träger enthalten sind. Der Träger kann nicht beschriebene Mengen von Pyridin, Histidin, Koffein, Imidazol oder Imidazol-Derivaten einschließen, zur Unterstützung der Solubilisation durch Stabilisierung der Eisen-Protoporphyrine.
  • Die EP 0 253 548 A2 beschreibt lagerstabile flüssige Zusammensetzungen zur Verwendung beim Testen auf Pseudoperoxidasen, insbesondere Hämoglobin. Diese Zusammensetzungen werden in einem Medium hergestellt, das aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren aprotischen Lösungsmittel wie DMSO besteht, und sie können irgendeinen aus einer Anzahl von Stabilisatoren oder farbverstärkenden Komponenten enthalten.
  • Wir haben jetzt herausgefunden, daß andere Verbindungen als Phenole, speziell tertiäre und quartäre Stickstoff-Verbindungen, zum Erhöhen der Empfindlichkeit eines Tests auf okkultes Blut in Stuhl verwendet werden können. Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zum Testen auf okkultes Blut in Stuhl anzugeben, das Verwendung macht von (1) monozyklischen, Stickstoff enthaltenden, aromatischen heterozyklischen Verbindungen wie Triazol, Pyridin, Pyrazin oder deren substituierten Derivaten oder (2) tertiären oder quartären Ammonium- Verbindungen, die zumindest eine Hydroxy-Alkyl- oder veresterte Hydroxy- Alkyl-Gruppe oder eine Phenyl-Gruppe enthalten, die an den Stickstoff gebunden ist, um die Empfindlichkeit des Tests zu erhöhen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, eine Entwickler-Lösung zur Verfügung zu stellen, die in einem Ethanol-Wasser-Träger einen erfindungsgemäßen Verstärker zusammen mit Peroxid erhält, zur Verwendung beim Testen auf okkultes Blut in Stuhl.
  • Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, einen Testsatz zum Testen auf okkultes Blut in Stuhl zur Verfügung zu stellen. Ein solcher Testsatz enthält eine verbesserte (verstärkte) Entwickler-Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen Verstärker und ein oxidierbares Substrat wie z. B. Guajak enthält.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Feststellen okkulten (verborgenen) Blutes in einer Probe, bei dem die Probe kombiniert wird mit:
  • (a) Hydrogenperoxid oder einer Peroxid-Quelle,
  • (b) einem oxidierbaren Substrat, das in Gegenwart von einem Peroxid und Hämoglobin ein farbiges Produkt erzeugt, und
  • (c) einem Verstärker in einem im wesentlichen aus Ethanol und Wasser bestehenden Träger.
  • Erfindungsgemäß ist der Verstärker eine monozyklische, Stickstoff enthaltende, aromatische heterozyklische Verbindung, ein tertiäres oder quartäres Amin, das eine an den Stickstoff gebundene Hydroxyalkyl- oder veresterte Hydroxyalkyl-Gruppe besitzt, oder ein tertiäres oder quartäres Amin, das ein wahlweise substituiertes, an den Stickstoff gebundenes Phenyl besitzt, wobei das Peroxid, das oxidierbare Substrat und der Verstärker mit der Probe in Mengen kombiniert werden, die wirksam sind, um eine visuell feststellbare Farbänderung zu produzieren, wenn medizinisch signifikante Mengen Blutes in der Probe vorhanden sind.
  • Ein bevorzugtes oxidierbares Substrat zur erfindungsgemäßen Verwendung ist Guajak, welches das in kommerziell verfügbaren Testsätzen verwendete Substrat ist. Andere Substrate, die durch Peroxid in Gegenwart von Hämoglobin oxdiert werden, um ein farbiges Produkt zu produzieren, das im Gegenwart fäkalischen Materials visuell feststellbar ist, können ebenso verwendet werden. Geeignete alternative Materialien umfassen 3,3',5,5-Tetramethylbenzidin (siehe US-A-4562043), Guajakonsäure A und andere Leuko- Farbstoffe, die in Gegenwart von Peroxid und Hämoglobin oxidiert werden (siehe US-A-4212936 und 4971914).
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verwendung als Entwickler in einem auf der Oxidation eines Substrats zu einem farbigen Produkt basierenden Test auf okkultes Blut zur Verfügung gestellt, wobei die Zusammensetzung umfaßt:
  • (a) Hydrogenperoxid oder eine Peroxidquelle,
  • (b) eine Menge eines Verstärkers, die wirksam ist, um die Menge des produzierten farbigen Produkts zu erhöhen, und
  • (c) einen Träger, der im wesentlichen aus Wasser und Ethanol besteht, wobei der Verstärker eine monozyklische, Stickstoff enthaltende, aromatische heterozyklische Verbindung, ein tertiäres oder quartäres Amin, das eine an den Stickstoff gebundene Hydroxyalkyl- oder veresterte Hydroxyalkyl-Gruppe besitzt, oder ein tertiäres oder quartäres Amin, das ein wahlweise substituiertes, an den Stickstoff gebundenes Phenyl besitzt, ist.
  • Vorzugsweise ist der Verstärker Pyridin, 4-Benzyl-Pyridin, Pyrazin oder Pyrazin-Carbonsäure. Vorzugsweise liegt der Verstärker in dem Lösungsmittel in einer Menge von 0,2 bis 4 Gewichtsprozent vor, z. B. in einer Menge von 0,3 bis 1,5 Gewichtsprozent.
  • Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Testsatz zum Feststellen okkulten Blutes zur Verfügung gestellt, der in abgepackter Kombination umfaßt:
  • (a) ein oxidierbares Substrat, das in Anwesenheit von einem Peroxid und Hämoglobin in ein farbiges Produkt umgewandelt werden kann, und
  • (b) einen Entwickler, umfassend einen im wesentlichen aus Ethanol und Wasser bestehenden Träger, Hydrogenperoxid oder eine Peroxidquelle und einen Verstärker in einer Menge, die wirksam ist, die Umwandlung des oxidierbaren Substrats in das farbige Produkt zu verstärken.
  • Erfindungsgemäß ist der Verstärker eine monozyklische, Stickstoff enthaltende, aromatische heterozyklische Verbindung (wie z. B. Pyridin, Pyrazin oder ein substituiertes Derivat dieser Stoffe oder 4-Benzyl-Pyridin), ein tertiäres oder quartäres Amin, das ein an den Stickstoff gebundene Hydroxyalkyl- oder veresterte Hydroxyalkyl-Gruppe besitzt, oder ein tertiäres oder quartäres Amin, das ein an den Stickstoff gebundenes Phenyl oder substituiertes Phenyl besitzt.
  • Typischerweise ist der Verstärker Pyrazin-Carbonsäure.
  • Ein einfacher und bequemer Weg zur Ausführung des Tests ist es, das oxidierbare Substrat auf einer festen Unterlage zu plazieren. Eine bevorzugte feste Unterlage ist ein aufnahmefähiges (absorptives) Papier, das mit dem oxidierbaren Substrat imprägniert worden ist. Das oxidierbare Substrat muß in Mengen anwesend sein, die ausreichen, eine feststellbare Menge des farbigen Produkts zu erzeugen. In dem beschichteten Papier, das heute in kommerziellen Testsätzen eingesetzt wird, beläuft sich diese Menge auf 0,75 g/1000 in². Unter Verwendung einer Mikropipette wird ein kleines (z.B. 0,03 ml) Aliquot der fäkalischen (Stuhl-)Probe auf der Unterlage plaziert. Es werden dann ein oder zwei Tropfen der Entwicklerlösung hinzugefügt, und es wird das Ausmaß der Farbentwicklung beobachtet, falls es eine gibt.
  • Diese Entwicklerlösung enthält Hydrogenperoxid oder eine Peroxid-Quelle wie z.B. Cumol-Hydroperoxid und den Verstärker in einem Ethanol/Wasser-Träger. Die erfindungsgemäßen Entwicklerlösungen enthalten 4 bis 6 Gewichtsprozent Hydrogenperoxid, 0,2-4 Gewichtsprozent des Verstärkers und 80-90 Prozent Ethanol, wobei der Rest Wasser ist. Vorzugsweise ist der Verstärker in Mengen von 0,3 bis 1,5 Gewichtsprozent vorhanden, wobei die exakte Menge vom verwendeten spezifischen Verstärker abhängt. Wenn keine Begrenzung aufgrund von Löslichkeits-Überlegungen besteht, können auch höhere Verstärker-Konzentrationen eingesetzt werden, aber man wird verstehen, daß die resultierende Empfindlichkeitserhöhung zur Detektion von niedrigen Niveaus okkulten Blutes, die medizinisch nicht signifikant sind, d. h. zu falschen Positiven führen kann.
  • Die Verstärker, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen monozyklische, Stickstoff enthaltende, aromatische heterozyklische Verbindungen wie z. B. Triazol, Pyridin, Pyrazin und deren substituierte Derivate, einschließlich 4-Benzyl-Pyridin, 2-Methoxy-Pyridin, 4-(p-Nitrobenzyl)-Pyridin und Pyrazin-Carbonsäure. Andere erfindungsgemäße Verstärker sind tertiäre oder quartäre Amine, die zumindest eine an den Stickstoff gebundene Hydroxyalkyl- oder veresterte Hydroxyalkyl-Gruppe besitzen. Beispiele solcher Verstärker umfassen Diethyl-Ethanolamin, Ethyl-Diethanolamin und Triethanolamin, Acetylcholin-Chlorid und β-Methyl-Acetylcholin- Chlorid. Eine weitere Klasse erfindungsgemäßer Verstärker sind tertiäre und quartäre Amine, die eine an den Stickstoff gebundene Phenyl-Gruppe besitzen, z. B. Dimethyl-Anilin.
    • Beispiel 1
  • Verschiedene Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, als Verstärker für die Oxidation von Guajak durch Peroxid in Gegenwart von Hämoglobin zu wirken. Eine Blutprobe wurde im Verhältnis 1:20.000 verdünnt, um dem Blutniveau in einer fäkalischen (Stuhl-)Probe zu entsprechen, und ein 0,03 ml-Tropfen wurde auf einer mit Guajak beschichteten Papierunterlage des Typs plaziert, wie er in Seracult®- und Seracult Plus®-Testsätzen Verwendung findet. Ein bis zwei Tropfen einer Entwicklerlösung (0,04 bis 0,1 ml), die 84% Ethanol, 4% H&sub2;O2, 4% eines ausgewählten Verstärkers, 8% Wasser und 84% Ethanol enthielt, wurden dann auf der Papierunterlage plaziert, und es wurden Beobachtungen zur Farbbildung gemacht. Jeder Verstärker wurde auf einer Skala von 1 bis 4 hinsichtlich der Farbbildung bewertet, wobei 1 die Farbmenge ist, die erzeugt wird, wenn kein Verstärker verwendet wird, und 2 die Farbmenge ist, die erzeugt wird, wenn 1,5% Ethyl-Hydroxybenzoesäure (Ethyl-Paraben) verwendet werden, ein phenolischer Verstärker des Typs, der in der EP 0 308 227 beschrieben ist und in kommerziellen Produkten eingesetzt wird. Die Resultate dieser Tests sind in Tabelle 1 dargestellt. In Tabelle 1 ist eine beobachtbare Farbintensität, die geringer ist als die der unverstärkten Kontrolle, als TR aufgeführt.
  • Während dieser Tests wurde beobachtet, daß die Stabilität des hergestellten farbigen Produktes in Abhängigkeit vom Verstärker variierte. Die Verblassungs-Geschwindigkeit ("rate of fading") ist ebenfalls in Tabelle 1 aufgelistet (VS = sehr langsam, S = langsam, M = moderat, F = schnell). Im allgemeinen stimmt eine moderate oder langsamere Verblassungsgeschwindigkeit mit dem gewöhnlichen Zeitraum für die Beobachtung der Resultate von Tests auf okkultes Blut in Stuhl von 30 bis 120 Sekunden nach dem Testen überein. Tabelle 1
    • Beispiel 2
  • Ein 0,03 ml-Tropfen einer im Verhältnis 1:30.000 verdünnten Blutprobe wurde auf einem mit Guajak beschichteten Papier plaziert. Ein bis zwei Tropfen einer Entwicklerlösung, die 84% Ethanol, 4% Hydrogenperoxid und 0,7% Pyrazin-Carbonsäure enthielt, wobei der Rest Wasser war, wurden auf dem Testpapier plaziert. Eine blaue Färbung wurde dort beobachtet, wo die Blutprobe auf dem Testpapier plaziert worden war.
    • Beispiel 3
  • Ein 0,03 ml-Tropfen einer im Verhältnis 1:30.000 verdünnten Blutprobe wurde auf einem mit Guajak beschichteten Testpapier plaziert. Ein bis zwei Tropfen einer Entwicklerlösung, die 84% Ethanol, 4% Hydrogenperoxid und 0,5% 4-Benzyl-Pyridin enthielt, wobei der Rest Wasser war, wurden auf dem Testpapier plaziert. Eine blaue Färbung wurde dort beobachtet, wo die Blutprobe auf dem Testpapier plaziert worden war.
    • Beispiel 4
  • Zusätzliche Verstärker wurden unter Verwendung einer im Verhältnis 1: 25.000 verdünnten Blutprobe getestet. Die Resultate sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2
    • Beispiel 5
  • Weil Peroxid aufgrund von Alterungseinflüssen aus Entwickler-Lösungen verloren gehen kann, wurden Entwickler-Lösungen mit niedrigeren Peroxid- Niveaus getestet. Drei Sätze von Entwickler-Lösungen wurden für jeden getesteten Verstärker präpariert, wobei die Entwickler-Lösungen 2%, 3% und 4% Hydrogenperoxid enthielten, indem 44 g Ethanol, 0,04 g Phosporsäure, 0,3 bis 2 g eines Verstärkers und 0,32, 0,47 oder 0,67 g Peroxid vermischt wurden und Wasser bis zu einer Gesamtmasse von 50 g hinzugefügt wurde. Die in Tabelle 3 zusammengefaßten Resultate zeigen, daß geringere Peroxid-Konzentrationen effektiv eingesetzt werden können. Tabelle 3
    • Beispiel 6
  • Zur Bewertung der Lagerstabilität von erfindungsgemäßen Entwickler-Lösungen wurden Entwickler, die verschiedene Verstärker enthielten, für 48 oder 65 Stunden refluxiert und auf das Peroxid-Niveau getestet. Das durchschnittliche Peroxid-Startniveau lag bei 4,27 %. Die Proben, die für 65 Stunden refluxiert worden waren, wurden auch auf ihre Verwendbarkeit beim Entwikkeln eines Tests auf okkultes Blut in Stuhl getestet. Die in Tabelle 4 zusammengefaßten Resultate zeigen die Stabilität verschiedener erfindungsgemäßer Verstärker, obwohl Triazol in diesem ziemlich extremen Test schlechte Ergebnisse hatte. Tabelle 4
    • Beispiel 7
  • Der Test aus Beispiel 6 wurde wiederholt, jedoch mit einem Refluxier- Zeitraum von 72 Stunden und mit unterschiedlichen Verstärkern. Die Resultate sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Tabelle 5

Claims (10)

1. Verfahren zum Feststellen okkulten (verborgenen) Blutes in einer Probe, umfassend das Kombinieren der Probe mit:
(a) Hydrogenperoxid oder einer Peroxid-Quelle,
(b) einem oxidierbaren Substrat, das in Gegenwart von einem Peroxid und Hämoglobin ein farbiges Produkt erzeugt, und
(c) einem Verstärker in einem im wesentlichen aus Ethanol und Wasser bestehenden Träger, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstärker eine monozyklische, Stickstoff enthaltende, aromatische heterozyklische Verbindung, ein tertiäres oder quartäres Amin, das eine an den Stickstoff gebundene Hydroxyalkyl- oder veresterte Hydroxyalkyl-Gruppe besitzt, oder ein tertiäres oder quartäres Amin, das ein wahlweise substituiertes, an den Stickstoff gebundenes Phenyl besitzt, ist, wobei das Peroxid, das oxidierbare Substrat und der Verstärker mit der Probe in Mengen kombiniert werden, die wirksam sind, um eine visuell feststellbare Farbänderung zu produzieren, wenn medizinisch signifikante Mengen Blutes in der Probe vorhanden sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das oxidierbare Substrat Guajak ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstärker Pyridin oder 4-Benzyl-Pyridin ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstärker Pyrazin oder Pyrazin-Carbonsäure ist.
5. Verfahren nach einen der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstärker in dem Lösungsmittel in einer Menge von 0,2 bis 4 Gewichtsprozent vorliegt, wie zum Beispiel in einer Menge von 0,3 bis 1,5 Gewichtsprozent.
6. Zusammensetzung zur Verwendung als Entwickler in einem auf der Oxidation eines Substrats zu einem farbigen Produkt basierenden Test auf okkultes Blut, wobei die Zusammensetzung umfaßt:
(a) Hydrogenperoxid oder eine Peroxidquelle,
(b) eine Menge eines Verstärkers, die wirksam ist, um die Menge des produzierten farbigen Produkts zu erhöhen, und
(c) einen Träger, der im wesentlichen aus Wasser und Ethanol besteht, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstärker eine monozyklische, Stickstoff enthaltende, aromatische heterozyklische Verbindung, ein tertiäres oder quartäres Amin, das eine an den Stickstoff gebundene Hydroxyalkyl- oder veresterte Hydroxyalkyl-Gruppe besitzt, oder ein tertiäres oder quartäres Amin, das ein wahlweise substituiertes, an den Stickstoff gebundenes Phenyl besitzt, ist,
7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstärker Pyridin oder 4-Benzyl-Pyridin ist.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstärker Pyrazin oder Pyrazin-Carbonsäure ist.
9. Testsatz zum Feststellen okkulten Blutes, in abgepackter Kombination umfassend:
(a) ein oxidierbares Substrat, das in Anwesenheit von einem Peroxid und Hämoglobin in ein farbiges Produkt umgewandelt werden kann, und
(b) einen Entwickler, umfassend einen im wesentlichen aus Ethanol und Wasser bestehenden Träger, Hydrogenperoxid oder eine Peroxidquelle und einen Verstärker in einer Menge, die wirksam ist, die Umwandlung des oxidierbaren Substrats in das farbige Produkt zu verstärken, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstärker Pyridin, Pyrazin oder ein substituiertes Derivat dieser Stoffe, 4-Benzyl-Pyridin, ein tertiäres oder quartäres Amin, das eine an den Stickstoff gebundene Hydroxyalkyl- oder veresterte Hydroxyalkyl-Gruppe besitzt, oder ein tertiäres oder quartäres Amin, das ein an den Stickstoff gebundenes Phenyl oder substituiertes Phenyl besitzt, ist.
10. Testsatz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstärker Pyrazin-Carbonsäure ist.
DE69411928T 1993-09-14 1994-09-13 Verfahren, reagenz und testsatz zum nachweis von okkultem blut in stuhl Expired - Lifetime DE69411928T2 (de)

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