DE3150416A1 - Verfahren und reagenz zur bestimmung der aktivitaet von angiotensin-konvertierendem enzym - Google Patents

Verfahren und reagenz zur bestimmung der aktivitaet von angiotensin-konvertierendem enzym

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DE3150416A1 DE19813150416 DE3150416A DE3150416A1 DE 3150416 A1 DE3150416 A1 DE 3150416A1 DE 19813150416 DE19813150416 DE 19813150416 DE 3150416 A DE3150416 A DE 3150416A DE 3150416 A1 DE3150416 A1 DE 3150416A1
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Description

Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Aktivität von Angiotensinkonvertierendem Enzym.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Angiotensin-konvertierendem Enzym, insbesondere ein solches, das.die folgenden Stufen umfaßt: Vermischen einer Flüssigkeit, die (i) ein synthetisches Substrat von X-Hippuryl-L-dipeptid der allgemeinen Formel
Il
-C-NH-CHp-C-NH-CH-C-NH-CH-COOH v 11 ίο
R1 R^
X OH, NH2 oder N(CH3J2 und
1 2
das Substituenteripaar (R , R )
(a) (H, H) oder
(b)
-CH2CH(CH3)2
bedeuten,
(ii) Hippuricase und
(iii) 4-Amino-aivtipyrin enthält,
mit einer Angiotensin-konvertierendes Enzym enthaltenden Flüssigkeit und colorimetrische Bestimmung der Konzentration des nach Zusatz eines Oxidationsmittels zur erhaltenen Reaktionsmischung gebildeten Chinoniminfarbstoffs.
Das Angiotensin-konvertierende Enzym wirkt auf Angiotensin I im menschlichen Körper ein und setzt aus Angiotensin I ein C-End-dipeptid (d.h. L-Histidyl-L-leucin) frei, wobei ein aktives Angiotensin II, das den Blutdruck erhöht, gebildet wird. Das Angiotensin-konvertierende Enzym spielt im menschlichen Körper gemeinsam mit einer Renin-Angiotensin-Enzymgruppe oder mit einer Chinin-Kailikrein-Enzymgruppe eine wichtige
RqIle. Außerdem kann man durch Bestimmung des Blutspiegels an Angiotensin-konvertierendem Enzym die Diagnose auf Sarcoidose durchführen. Daher kommt der Messung der Enzymaktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms physiologisch und klinisch eine große Bedeutung zu.
Bislang sind für die Messung der Enzymaktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms folgende Methoden vorgeschlagen worden:
1) eine Methode, bei der ein Radioisotop,
2) eine Methode, bei der ein fluorescierendes Material und
3) eine Methode, bei der die Flüssigkeitschromatographie
benutzt wurde. Alle diese Methoden erfordern eine Spezialausstattung.
Außer diesen Methoden ist noch eine von Cushman et al vorgeschlagene Methode bekannt, wonach das synthetische Substrat Hippuryl-L-histidyl-L-leucin zunächst mit einer Testprobe, die Angiotensin-konvertierendes Enzym enthält, z.B. Serum oder Körperflüssigkeit, für eine bestimmte Zeit reagieren gelassen wird, um Hippursäure zu bilden. Dann wird der Reaktionsmischung zur Beendigung der Reaktion Salzsäure zugesetzt, die gebildete Hippursäure mit Äthylacetat extrahiert, aus dem erhaltenen Extrakt das Äthylacetat abgedampft und der erhaltene trockene Rückstand in destilliertem Wasser gelöst. In der so erhaltenen Lösung wird im UV-Bereich das Absorptionsvermögen (absorbens) und damit die Konzentration an Hippursäure bestimmt. Aus der Hippursäurekonzentration wird dann die Aktivität des Angiotensin-korivertierenden Enzyms errechnet. Diese Methode erfordert komplizierte Stufen und ist daher nicht immer brauchbar.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms, das die Nachteile der bekannten Methoden nicht aufweist, das sich gegenüber den bekannten Methoden durch eine verbesserte Meßgenauigkeit und durch verringerte Kosten auszeichnet und das keine komplizierten Messungen erfordert.
Gemäß Erfindung wird ein Testreagenz, das
(i) ein synthetisches Substrat von X-Hippuryl-L-dipeptid der allgemeinen Formel
-C-NH-CIL-C-NH-CH-C-NH-CH-COOH M '9
R1 FT
X OH, NH2 oder N(CH3J2 und
das Substituentenpaar (R
(a) (H, H) oder
R2)
, -CH2CH(CH3)2
bedeuten,
(ii) HippuriCdSe(
(iii) 4-Amino-autipyrin enthält,
(iv) ein Oxidationsmittel, z.B. Perjodsäure, Perchlorsäure, Kaliumferricyanid, Ammonium-ceric-nitrat, Chloramin-T, Chloramin-B und/oder Chromtrioxid enthält, mit einer Angiotensin-konvertierendes Enzym enthaltenden Flüssigkeit vermischt. Bei dem Vermischen des Testreagenzes mit der Angiotensin-konvertierendes Enzym enthaltenden Flüssigkeit bildet sich ein Chinoniminfarbstoff, dessen Konzentration colorimetrisch gemessen und wodurch die Aktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms bestimmt wird.
Das wesentliche Merkmal der Erfindung besteht darin, daß die Aktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms in sehr viel einfacherer Weise und sehr viel genauer als nach den konventionellen Methoden bestimmt werden kann, da die gemäß Erfindung verwendeten Oxidationsmittel in ihren Eigenschaften sehr beständig und außerdem billig sind.
Das Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms wird zweckmäßig in folgender Weise durchgeführt.
X-Hippuryl-L-dipeptid gibt man zu einer Angiotensin-konvertierendes Enzym enthaltenden Flüssigkeit, z.B. Serum oder Körperflüssigkeit, wobei X-Hippursäure und L-Dipeptid gebildet werden. Diese Mischung versetzt man mit Hippuricase, so daß sich X-Benzoesäure und Glycin bilden. Die
X-Benzoesäure wird durch das Oxidationsmittel in Gegenwart von 4-Aminoantipyrin oxidiert und kondensiert mit dem 4-Amino-antipyrin unter Bildung eines Chinoniminfarbstoffs, dessen Konzentration colorimetrisch gemessen wird. Aus der Konzentration des Chinoniminfarbstoffs wird die Aktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms berechnet.
Das Grundprinzip der Erfindung läßt sich zu den nachfolgenden Gleichungen zusammenfassen:
ACE *}
X-Hippuryl-L-dipeptid ■> X-Hippursäure + L-dipeptid
Hippuricase
X-Hippursäure > X-Benzoesäure + Glycin
Oxidationsmittel X-Benzoesäure+4-Amino-antipyrin ^ Chinoniminfarbstoff.
Bei der Durchführung des Verfahrens der Erfindung haben sich als synthetisches Substrat X-Hippuryl-L-dipeptid p-Hydroxihippuryl-glycyl-glycine
0 0 0
HO-/pt \ -C-NH-CH2-C-NH-CH-C-Nh-CH-COOH \ / H H
und p-Hydroxyhippuryl-L-histidyl-L-leucin der allgemeinen Formel
0-0.0
-C-NH-CH9-C-NH-CH-C-NH-CH-COOh
ch9 ch9ch(ch-). nh
und als Oxidationsmittel Perjodsäure als besonders nützlich erwiesen.
*) ACE = Angiotensin-konvertierendes Enzym .
Beispiel
Zu 0,5 ml eines Testreagenzes, das 5,6 mM p-Hydroxihippuryl-L-histidyl-L-leucin, 1 E Hippuricase, 2 mM 4-Amino-antipyrin, 0,5 M Natriumchlorid und 0,1 M Borsäure enthielt, gab man 50 μΐ Serum und ließ die Mischung 20 Minuten bei 37°C reagieren. Danach versetzte man die Reaktionsmischung zur Beendigung der Reaktion mit 0,5 ml einer 3 mM Äthylendiamintetraessiosäure enthaltenden Lösung und 17,5 mM Natriumperjodat und ließ die Mischung 5 Minuten bei 37°C stehen, so daß sich Chinoniminfarbstoff bildete. Sodann wurde das Absorptionsvermögen (absorbance) der Reaktionsmischung mit Licht einer Wellenlänge von 505 nm gemessen, was nachfolgend als Absorptionsvermögen A bezeichnet wird.
Getrennt davon wurde ein Reagenz für einen Blind(KontrolI)test bereitet, indem man zunächst 0,5 ml einer 0,1 M Borsäure enthaltenden Lösung zu 0,5 ml der die Reaktion beendenden Lösung und dann 0,05 ml Serum der Reaktionsmischung zusetzte.
Danach wurde in der oben angegebenen Weise das Absorptionsvermögen des Reagenzes für den Blindtest mit Licht einer Wellenlänge von 505 nm gemessen, was nachfolgend als Absorptionsvermögen B bezeichnet wird.
Die Aktivitätsemheit (mE) von Angiotensin-konvertierendem Enzym kann gemäß folgender Gleichung berechnet werden:
mE =^χ λ XJxl^xiO6 molekularer Extinktions- Reaktionsdauer Lichtweg- 0,05 koeffizient (E) (20 Minuten) länge (cm)
worin E = 12.000 (molekularer Extinktions-koeffizient des Chinoniminfarbstoffs) ist
Nach 20-facher Wiederholung des oben beschriebenen Testes wurde folgendes Ergebnis erhalten:
Aktivitätseinheit (mE) = 20 + 0,3 (nMol/ml/Min) Vdriationskoeff"izient (CV) = 1·,5 %

Claims (1)

  1. LICHTENSTEINSTRASSE 3 FERNSPRECHER: (0611) SS506I TELEGRAMME: LOMOSAPATENT LANDESZENTRALBANK 50007149 POSTSCHECK-KONTO FFM. 1667-608
    Fujizoki Pharmaceutical Co. Ltd.
    6-7, Shimoochiai 4-chome, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan
    Patentansprüche
    "Π- Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Angiotensin-konvertierendem Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß man 1) eine Flüssigkeit, die
    (I) X-Hippuryl-L-dipeptid der allgemeinen Formel
    -C-NH-CH9-C-NH-CH-C-Nh-CH-COOH R1 R2
    worin
    X OH, NH2 oder N(CH3J2 und
    1 das Substituentenpaar (R , R )
    (a) (H, H) oder (b)
    -CH2CH(CH3),
    bedeuten,
    (ii) Hippuricase und (iii) 4-Amino-antipyrin enthält,
    mit einer Angiotensin-konvertierendes Enzym enthaltenden Flüssigkeit vermischt,
    2) der erhaltenen Reaktionsmischung ein Oxidationsmittel unter Bedingungen,
    daß !lieh (in Chinonirriinfcirbvl.off bildel., /nsel/l. und 3; du· Kon/enirdUuri dc, ycbildelen Chi non irrii nf arbsLof f s kolorimetrisch be s U mm I..
    -z-
    '/.}' ViτΙ.ihren ri.u.h Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als X-Hippuryl-L-dipeptid X-Hippuryl-glycyl-glycin der allgemeinen Formel
    0 0 0
    -C-NH-CH9-C-NH-CH-C-NH-CH-COOh t
    H H worin
    X die oben angegebene Bedeutung hat,
    oder X-Hippuryi-L-histidyl-L-leucin
    X , L 0 0 0
    -C-NH-CH2-C-NH-CH-C-NH-Ch-COOH . η CH2 CH2CH(CH3)2
    X die oben angegebene Bedeutung hat,
    verwendet.
    3)^ Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oxidationsmittel Perjodsäure, Perchlorsäure, Kaliumferricyanid, Ammonium-ceric-nitrat, Chloramin-T, Chloramin-B und/oder Chromtrioxid verwendet.
    4K Testreagenz zur Bestimmung der Aktivität von Angiotensin-konvertierendem Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es
    (i) ein synthetisches Substrat von X-HippuryL-L-dipeptid der allgemeinen Formel
    0 0 0
    -C-NH-CH9-C-NH-CH-C-NH-Ch-COOH , 11 '2
    X OH, NH2 oder N(CH3J2 und
    das Substituentenpaar (R1, R)
    (a) (H, H) oder bedeuten, liippuricase, H N (b) / (ii) ι
    N ,         I (iii) V I -CH2- (iv) 4-Amino-antipyrin und ein Oxidationsmittel enthält.
    -CH2CH(CH3),
    S), Testreagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Oxidationsmittel Perjodsäure, Perchlorsäure, Kaliumferricyanid, Ammoniumcerie-nitrat, Chloraniin-T, Chloramin-B und/oder Chromtrioxid enthält.
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