DE102022132512A1 - Testsystem zur Messung der Enzymaktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms (ACE) - Google Patents
Testsystem zur Messung der Enzymaktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms (ACE) Download PDFInfo
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Abstract
Um ein möglichst sensitives Verfahren zur quantitativen Messung der Enzymaktivität von ACE bereitzustellen, dass gegenüber spektralen Störungen weitgehend unempfindlich ist und auf den gängigen Analyzern für den klinischen Routinebetrieb praktikabel automatisierbar ist, wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur quantitativen Messung der Enzymaktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms (ACE) in einer Probe vorgeschlagen, bei dem man ein Reaktionsgemisch erzeugt, indem man in der Probe enthaltenes ACE mit einem ersten Reagenziensatz in Kontakt bringt, der ein Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl und ein schwaches Oxidationsmittel und/oder ein Oxidationssubstrat einer Oxidoreduktase, enthält, und mit einem zweiten Reagenziensatz in Kontakt bringt, der eine Hippuricase und optional eine Oxidoreduktase, enthält, und mit einem Aminopyrin in Kontakt bringt.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein analytisches oder diagnostisches Testsystem zur quantitativen Messung der Enzymaktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms (ACE) in einer Probe. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Messung der Enzymaktivität sowie ein aus verschiedenen Reagenzien bestehendes Testsystem, mit dem das Verfahren ausgeführt werden kann.
- Bei dem Angiotensin-konvertierenden Enzym (Synonyme: ACE, Kininase II, Peptidyl-Dipeptidase A), das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, handelt es sich um eine Zink-Metalloprotease, die das Prohormon Angiotensin I in das vasokonstriktorisch wirksame Hormon Angiotensin II spaltet. Angiotensin II wiederum ist ein Effektor im Renin-Angiotensin-Aldosteron-System, der vasokonstriktorisch wirkt und auf diese Weise zur Erhöhung des Blutdrucks und das Extrazellulärvolumens führt.
- ACE kommt in membrangebundener Form an der luminalen Oberfläche von Endothelzellen vor - in erster Linie in der Lunge und in geringerem Umfang in Gehirn, Darm, Niere, Nebenniere und Hoden. Im Nervensystem findet man hohe ACE-Konzentrationen in den Plexus choroidei. Neben der membrangebundenen Form kommt ACE auch als freie, lösliche Form im Blutplasma und in anderen Körperflüssigkeiten (z.B. im Fruchtwasser, Spinalflüssigkeit, etc.) vor. Die lösliche Form von ACE entsteht durch Proteolyse des C-terminalen Membranankers.
- Die Bestimmung der Aktivität von ACE im Blut erfolgt unter anderem zur Diagnose und Verlaufskontrolle bei granulomatösen Lungenerkrankungen, wie z.B. Tuberkulose und Sarkoidose. Darüber hinaus erfolgt eine ACE-Diagnostik auch nebengeschaltet zur diagnostischen Abklärung von Lepra und Morbus Gaucher sowie bei verschiedenen Formen der Präeklampsie.
- Die Bestimmung des ACE-Gehaltes im Blutserum erfolgt üblicherweise mit einem der beiden folgenden Testsysteme.
- Bei der FAPGG-Methode wird das Peptid FAPGG als Substrat eingesetzt, das durch das patienteneigene ACE in der Probe hydrolytisch abgebaut wird, was zu einer Extinktionsabnahme im UV-Bereich führt. Die Messwellenlänge im UV-Bereich machen Assays auf der Grundlage der FAPGG-Methode allerdings recht anfällig gegenüber spektralen Störungen durch endogenes Bilirubin und Hämoglobin oder Lipide.
- Im Vergleich hierzu wird bei der sogenannten „Hippuricase-Methode“ das synthetische Substrat p-Hydroxybenzoyl-glycyl-L-histidyl-L-leucin durch das ACE aus der Probe i.V.m. dem Enzym Hippuricase, dass über das Reagenz bereitgestellt wird, bis zur p-Benzoesäure abgebaut. Über eine Trinder-Reaktion wird die entstandene p-Hydroxybenzoesäure in einen Farbstoff überführt, dessen Absorption bei 505 nm gemessen wird.
- Die Messung des photometrischen Signals im VIS-Bereich erlaubt eine im Vergleich zur FAPGG-Methode etwas sensitivere und gegenüber spektralen Störungen unempfindlichere ACE-Bestimmung. Das Testsystem besteht typischerweise jedoch aus fünf separaten, zum Teil lyophilisierten Reagenzienbestandteilen, und ist an vielen gängigen Analyzern für den klinischen Routinebetrieb kaum praktikabel automatisierbar.
- Vor diesem Hintergrund haben sich die Erfinder der vorliegenden Anmeldung die Aufgabe gestellt, ein möglichst sensitives Verfahren zur quantitativen Messung der Enzymaktivität von ACE bereitzustellen, dass gegenüber spektralen Störungen weitgehend unempfindlich ist und auf den gängigen Analyzern für den klinischen Routinebetrieb praktikabel automatisierbar ist.
- Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur quantitativen Messung der Enzymaktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms (ACE) in einer Probe vorgeschlagen, bei dem man ein Reaktionsgemisch erzeugt, indem man in der Probe enthaltenes ACE
- a) mit einem ersten Reagenziensatz in Kontakt bringt, wobei der erste Reagenziensatz folgende Reagenzienbestandteile umfasst:
- a1) ein Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl der allgemeinen Formel (I) als ACE-Substrat
- - R1 eine C1-4-Alkoxygruppe, ein Halogenatom oder eine unsubstitutierte Aminogruppe ist,
- - R2 and R3 jeweils unabhängig voneinander eine C1-4-Alkoxygruppe, ein Halogenatom oder H sind,
- - A aus den Aminosäuregruppen His, Gly or Ala ausgewählt ist und
- - B aus den Aminosäuregruppen Leu, Gly or Phe ausgewählt ist,
- a2) ein Oxidationsmittel mit einem Standardpotential E° gemessen bei 25°C und einer effektiven Konzentration von 1 mol/l gegen eine Normal-Wasserstoff-Elektrode im Bereich von 0,1 bis 0,5 V und/oder ein Oxidationssubstrat einer Oxidoreduktase, die das Oxidationssubstrat oxidiert und Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert, und
- a1) ein Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl der allgemeinen Formel (I) als ACE-Substrat
- b) mit einem zweiten Reagenziensatz in Kontakt bringt, wobei der zweite Reagenziensatz folgende Reagenzienbestandteile umfasst:
- b1) ein Enzym des Typs Hippuricase und optional
- b2) eine Oxidoreduktase, die das in dem ersten Reagenziensatz als Reagenzienbestandteil a2) optional enthaltene Oxidationssubstrat oxidiert und Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert, und
- c) mit einem Aminopyrin der allgemeinen Formel (II)
- Die Erfinder haben herausgefunden, dass dadurch das im ersten Reagenziensatz ein relativ schwaches Oxidationsmittel eingesetzt wird, dessen Standardpotential E° gemessen bei 25°C und einer effektiven Konzentration von 1 mol/l gegen eine Normal-Wasserstoff-Elektrode im Bereich von 0,1 bis 0,5 V liegt, oder durch die Aufteilung der bei derACE-Diagnostik eingesetzten Reagenzien auf die beiden oben definierten separaten Reagenziensätze ein stabiles für den klinischen Routinebetrieb praktikables Testsystem erhalten wird, dass eine sehr hohe Sensitivität bereitstellt und weitgehend unbeeinflusst von Interferenzen mit anderen in der zu untersuchenden Probe enthaltenen Stoffen durchgeführt werden kann.
- Der erfindungsgemäß eingesetzte erste Reagenziensatz enthält neben dem ACE-Substrat Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl entweder ein relativ schwaches Oxidationsmittel oder ein Oxidationssubstrat einer Oxidoreduktase, und der erfindungsgemäß vorgeschlagene zweite Reagenziensatz enthält das Enzym Hippuricase, und bei den Ausführungsformen, in denen das erste Reagenz ein Oxidationssubstrat enthält, zusätzlich noch die Oxidoreduktase, die das in dem ersten Reagenziensatz enthaltene Oxidationssubstrat oxidiert und dabei in dem Reaktionsgemisch enthaltenen Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert.
- Bei speziellen Ausführungsformen der Erfindung enthält das erste Reagenz sowohl das relativ schwache Oxidationsmittel als auch ein Oxidationssubstrat für eine im zweiten Reagenz enthaltene Oxidoreduktase.
- In dem aus dem ersten Reagenziensatz und dem zweiten Reagenziensatz gebildeten Reaktionsgemisch wird das aus dem ersten Reagenziensatz stammende Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl zunächst durch das in der Probe enthaltene ACE durch Abspaltung der beiden terminalen Aminosäuren zu 4-Hydroxyhippursäure umgewandelt, die dann durch die in dem zweiten Reagenziensatz enthaltene Hippuricase durch Abspaltung der Aminosäure Glycin in 4-Hydroxybenzoesäure umgewandelt wird.
- Die durch die oben beschriebene Reaktion in situ erzeugte 4-Hydroxybenzoesäure kondensiert mit dem im Reaktionsgemisch enthaltenen Aminopyrin in Gegenwart des im Reaktionsgemisch in situ gebildeten Wasserstoffperoxids zu einem Chinonimin mit einem Absorptionsmaximum im VIS-Bereich.
- Bei bestimmten Ausführungsformen findet die oben beschriebene Umsetzung der 4-Hydroxybenzoesäure mit dem Aminopyrin zu einem Chinonimin optional in Gegenwart einer Peroxidase statt, wodurch die Reaktionsgeschwindigkeit der Kondensationsreaktion und damit die Signalintensität erhöht wird. Die Peroxidase kann entweder als Bestandteil des ersten Reagenziensatzes oder als Bestandteil des zweiten Reagenziensatzes oder je nach Bedarf als individuelle, separate Komponente dem Reaktionsgemisch zugeführt werden.
- Die oben beschriebenen Reaktionen lassen sich wie folgt schematisch darstellen:
- Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit dem Vorteil verbunden, dass durch die von den Erfindern etablierte Reaktionschemie die Reagenzienbestandteile des ersten Reagenziensatzes in einem gemeinsamen Reagenzienbehälter vorgemischt vorliegen können und auch die Reagenzienbestandteile des zweiten Reagenziensatzes in einem gemeinsamen Reagenzienbehälter vorgemischt vorliegen können, ohne das es auch bei längeren Lagerzeiten zu Reaktionen der Reagenzienbestandteile miteinander kommt, die das Ergebnis der Messung der Enzymaktivität von ACE in einer Probe beeinflussen können. Hierdurch kann die Anzahl der bei der Diagnostik zu handhabenden Reagenzienbehälter signifikant reduziert werden.
- Eines der Hindernisse, die es hierfür zu überwinden galt, war die Tatsache, dass das ACE-Substrat Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl bei längeren Lagerzeiten von dem Enzym Hippuricase allmählich umgesetzt wird, was das Messergebnis entsprechend verfälschen würde. Ein weiteres zu lösendes Problem war, dass das für die Farbreaktion erforderliche Oxidationsmittel bei längeren Lagerzeiten im Gemisch mit Hippuricase die Aktivität des Enzymes zerstören würde, wenn es sich um ein starkes Oxidationsmittel handelt, das insbesondere dann erforderlich ist, wenn eine schnelle Oxidationsreaktion gewünscht ist.
- Die erfindungsgemäß vorgeschlagene Aufteilung des ACE-Substrats Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl und des Enzyms Hippuricase auf zwei Reagenziensätze verhindert, dass das Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl bei längeren Lagerzeiten von dem Enzym Hippuricase allmählich umgesetzt wird.
- Darüber hinaus wird durch die erfindungsgemäß vorgeschlagene Zusammenstellung der Reagenzien bzw. durch die Aufteilung der Reagenzien auf zwei Reagenziensätze verhindert, dass das für die Farbreaktion erforderliche Oxidationsmittel die verwendeten Enzyme zerstören kann. Erreicht wird dies dadurch, dass entweder im ersten Reagenziensatz ein relativ schwaches Oxidationsmittel eingesetzt wird oder dadurch das Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel erst unmittelbar vor der photometrischen Messung in situ durch ein geeignetes Oxidase/Substrat-Paar erzeugt wird. Für das in situ erzeugte Oxidationsmittel enthält der erste Reagenziensatz ein Substrat für eine Oxidase, die sich im zweiten Reagenziensatz befindet.
- Die hohe Lagerstabilität der erfindungsgemäß eingesetzten vorgemischten Reagenziensätze liegt im Bereich von 12 bis 24 Monaten, wobei hier unter hoher Lagerstabilität zu verstehen ist, dass bei einer Lagerung bei einer Temperatur im Bereich von 2 bis 8°C über einen Zeitraum von 12 bis 24 Monaten ab Herstellung die Sensitivität des erfindungsgemäßen Testsystems um maximal 5 % von der Sensitivität des Testsystems unmittelbar nach der Herstellung abweicht.
- Um die Anzahl der Reagenzienbehälter, die bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu handhaben sind, möglichst gering zu halten, sind bei einer bestimmten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testsystems entweder die beiden Reagenzienbestandteile a1) und a2) des ersten Reagenziensatzes jeweils in einem gemeinsamen Reagenzienbehälter vorgesehen oder die beiden Reagenzienbestandteile b1) und b2) des zweiten Reagenziensatzes sind in jeweils einem gemeinsamen Reagenzienbehälter vorgesehen. Bei speziellen Ausführungsformen liegen die Reagenzienbestandteile des ersten Reagenziensatzes in einem gemeinsamen ersten Reagenzienbehälter vor und die Reagenzienbestandteile des zweiten Reagenziensatzes liegen in einem gemeinsamen zweiten Reagenzienbehälter vor.
- Das zusätzliche Reagenz Aminopyrin kann entweder in einem separaten dritten Reagenzienbehälter vorgesehen sein („ready-to-use“ 3-Komponenten-System) oder Bestandteil eines Reagenziengemisches in einem Reagenzienbehälter des ersten oder zweiten Reagenziensatzes sein („ready-to-use“ 2-Komponenten-System).
- Die Reagenzienbestandteile des ersten Reagenziensatzes und des zweiten Reagenziensatzes können grundsätzlich in beliebiger Reihenfolge mit dem in der Probe enthaltenen ACE in Kontakt gebracht werden, um das Reaktionsgemisch zu erzeugen. Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden zuerst die (vorzugsweise vorgemischten) Reagenzienbestandteile des ersten Reagenziensatzes und dann die (vorzugsweise vorgemischten) Reagenzienbestandteile des zweiten Reagenziensatzes zum Reaktionsgemisch zugegeben. Für diese Reihenfolge wurde eine besonders hohe Sensitivität festgestellt. Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden zuerst die (vorzugsweise vorgemischten) Reagenzienbestandteile des zweiten Reagenziensatzes und dann die (vorzugsweise vorgemischten) Reagenzienbestandteile des ersten Reagenziensatzes zum Reaktionsgemisch zugegeben. Auch für diese Reihenfolge wurde eine sehr gute Sensitivität festgestellt, wenn auch etwas geringer als im Falle der zuerst genannten Reihenfolge.
- Als Substrat für das in der Probe enthaltene ACE dient in dem System, dass mit den oben dargestellten chemischen Gleichungen beschrieben ist, 4-Hydroxybenzoyl-Glycin-Histidin-Leucin. Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist das Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl des Reagenzienbestandteils a1) des ersten Reagenziensatzes ausgewählt unter:
- ▪ N-(4-hydroxy-benzoyl)-glycyl-histidy-leucin,
- ▪ N-(4-hydroxy-3-methoxybenzoyl)-glycyl-glycyl-glycin,
- ▪ N-(4-hydroxy-3-methoxybenzoyl)-glycyl-histidyl-leucin,
- ▪ N-(3-chlor-4-hydroxybenzoyl)-glycyl-glycyl-glycin,
- ▪ N-(3,5-dimethoxy-4-hydroxy-benzoyl)-glycyl-histidyl-leucin,
- ▪ N-(3,5-dibrom-4-hydroxy-benzoyl)-glycyl-glycyl-glycin,
- ▪ N-(3,5-dichlor-4-hydroxy-benzoyl)-glycyl-histidyl-leucin,
- ▪ N-(3-hydroxy-2,4,6-triiodo-benzoyl)-glycyl-histidyl-leucin,
- ▪ N-(4-hydroxy-3-methoxybenzoyl)-glycyl-alanyl-phenylalanin,
- ▪ N-(3-chlor-4-hydroxybenzoyl)-glycyl-alanyl-phenylalanin,
- ▪ N-(3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoyl)-glycyl-alanyl-phenylalanin.
- Bei manchen Ausführungsformen der Erfindung wird für die Erzeugung von Wasserstoffperoxid in situ in der Probe bereits enthaltene Glukose oder zu dem Reaktionsgemisch zugegebene Glukose von der Glukoseoxidase in Gegenwart von im Reaktionsgemisch enthaltenen Sauerstoff zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid umgesetzt. Bei alternativen besonderen Ausführungsformen der Erfindung ist die Oxidoreduktase des Reagenzienbestandteils b2) und deren Oxidationssubstrat des Reagenzienbestandteils a2) unter den folgenden Kombinationen ausgewählt:
- ▪ Cholesteroloxidase/Cholesterol
- ▪ Cholinoxidase/Cholin
- ▪ Lactatoxidase/Lactat
- Auch in diesen Fällen kann das jeweilige Oxidationssubstrat entweder schon naturgemäß in der Probe enthalten sein oder es wird gezielt zu dem Reaktionsgemisch zugegeben oder beides.
- Bei dem oben schematisch dargestellten Testsystem ist das für die Kondensationsreaktion mit der 4-Hydroxybenzoesäure vorgesehene Aminopyrin 4-Aminoantipyrin.
- Bei manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält dieses im ersten Reagenziensatz als Reagenzienbestandteil a2) ein relativ schwaches Oxidationsmittel. Unter dem Begriff „schwaches Oxidationsmittel“ sind hier solche Oxidationsmittel zu verstehen, die gemessen bei 25°C und einer effektiven Konzentration von 1 mol/l gegen eine Normal-Wasserstoff-Elektrode ein Standardpotential E° im Bereich von 0,1 bis 0,5 V aufweisen.
- Bei bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das in dem ersten Reagenziensatz als Reagenzienbestandteil a2) optional enthaltene relativ schwache Oxidationsmittel ausgewählt ist unter:
- - Tetraaminkupfer(II)sulfat
- - Molybdate mit zweiwertigen Metallionen
- - Kaliumhexacyanoferrat(III)
- - Hexachlorrhodat(III)
- - Mangan,
- - Oxalsäure,
- - Sulfaten, Thiosulfaten und Nitriten.
- Typischerweise handelt es sich bei der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren analysierten Probe um eine flüssige Probe in der eine zu bestimmenden Menge an ACE enthalten ist. In den meisten Fällen wird es sich hierbei um eine Körperflüssigkeit handeln, die lösliches ACE enthält und die je nach konkretem Anwendungsfall ausgewählt sein kann unter Blut, Blutserum, Blutplasma oder Liquor. Bei besonderen Ausführungsformen kann es sich jedoch auch um eine flüssige Probe handeln, die aus einem anderen biologischen Material gewonnen wurde, wobei ursprünglich membrangebundenes ACE mobilisiert wurde.
- Am Ende des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt typischerweise die Messung der Absorption im sichtbaren Wellenlängenbereich. Je nachdem, welches Aminopyrin bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommt, unterscheidet sich der für die Absorptionsmessung infrage kommende Bereich. Idealerweise wird im Sinne der möglichst hohen Sensitivität und Genauigkeit in einem Bereich von 5-50 nm um das Absorptionsmaximum des bei der Reaktion entstehenden Chinonimins gemessen. Bei bestimmten Ausführungsformen liegt die Wellenlänge, bei der die Absorption gemessen wird im Bereich von 480-530 nm.
- Es hat sich gezeigt, dass die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgesprochen hoch ist, sodass für die Messung der Enzymaktivität von ACE bereits sehr geringe Mengen an Probe genügen. Bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung liegt die Menge an eingesetzter Probe im Bereich von 0,1-100 µl. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden weniger als 20 µl Probe eingesetzt, und bei besonders bevorzugten Ausführungsformen liegt die Menge an eingesetzter Probe bei < 10 µl, < 5 µl oder gar < 1 µl.
- Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Enzymaktivitäten in einem relativ breiten Bereich äußerst genau bestimmen. Bei bestimmten Ausführungsformen liegt der Bereich der mit dem Verfahren bestimmten Enzymaktivität von 0,1-250 U/L. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Bereich der Enzymaktivität < 20 U/L, und bei bevorzugten Ausführungsformen liegt die Enzymaktivität bei < 10 U/L, < 5U/L oder gar < 1 U/L.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität von ACE kann für Zwecke der pharmakologischen Analytik oder für Zwecke der Diagnose oder Verlaufskontrolle in einer Probe eines Patienten durchgeführt werden. Vorzugsweise erfolgt die Analytik mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bei einem Patienten, der wenigstens eines der folgenden Krankheitsbilder oder Symptome oder wenigstens einen der folgenden physiologischen Zustände aufweist:
- Bluthochdruck, chronische Herzinsuffizienz, Neurosarkosidose, Lepra, Morbus Gaucher, Tuberkulose, Praeklampsie, chronische Berylliose, proliferative Retinopathie, HIV-Infektion, Schwangerschaft, chronisches Müdigkeitssyndrom, Krebs, Alzheimer, Nephropathie, Fibrose, COVID-19.
- Für Zwecke der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird mit der vorliegenden Erfindung auch ein analytisches oder diagnostisches Testsystem vorgeschlagen, wobei dieses Testsystem dadurch gekennzeichnet ist, dass das Testsystem einen ersten Reagenziensatz und einen zweiten Reagenziensatz umfasst, wobei der erste Reagenziensatz wenigstens folgende Reagenzienbestandteile umfasst:
- a1) ein Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl der allgemeinen Formel (I) als ACE-Substrat
- - R1 eine C1-4-Alkoxygruppe, ein Halogenatom oder eine unsubstitutierte Aminogruppe ist,
- - R2 and R3 jeweils unabhängig voneinander eine C1-4-Alkoxygruppe, ein Halogenatom oder H sind,
- - A aus den Aminosäuregruppen His, Gly or Ala ausgewählt ist und
- - B aus den Aminosäuregruppen Leu, Gly or Phe ausgewählt ist, und
- a2) ein Oxidationsmittel mit einem Standardpotential E° gemessen bei 25°C und einer effektiven Konzentration von 1 mol/l gegen eine Normal-Wasserstoff-Elektrode im Bereich von 0,1 bis 0,5 V und/oder ein Oxidationssubstrat einer Oxidoreduktase, die das Oxidationssubstrat oxidiert und Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert,
- b1) ein Enzym des Typs Hippuricase und optional
- b2) eine Oxidoreduktase, die das in dem ersten Reagenziensatz als Reagenzienbestandteil a2) optional enthaltene Oxidationssubstrat oxidiert und Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert,
- Der Begriff „Reagenziensatz“ ist hier so zu verstehen, dass ein Reagenziensatz stets mindestens zwei flüssige oder feste an der chemischen Reaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens beteiligte chemische Stoffe als Reagenzienbestandteil enthält, wobei die einzelnen Reagenzienbestandteile eines Reagenziensatzes entweder separat in unterschiedlichen Reagenzienbehältern vorliegen können oder zumindest teilweise in Form eines Reagenziengemisches gemeinsam in ein und demselben Reagenzienbehälter vorliegen können mit der Maßgabe, dass die Reagenzienbestandteile des ersten Reagenziensatzes nie mit Reagenzienbestandteilen des zweiten Reagenziensatzes im Gemisch vorliegen.
- Zusätzlich zu den Reagenzienbestandteilen des ersten Reagenziensatzes und den Reagenzienbestandteilen des zweiten Reagenziensatzes umfasst das Testsystem der vorliegenden Erfindung das oben definierte Aminopyrin entweder in einem separaten Reagenzienbehälter oder als Bestandteil des Reagenziensatzes 1 oder als Bestandteil des Reagenziensatzes 2.
- Zusätzlich zu den Reagenzienbestandteilen des ersten Reagenziensatzes und den Reagenzienbestandteilen des zweiten Reagenziensatzes umfasst das Testsystem der vorliegenden Erfindung das oben erwähnte Peroxidase entweder in einem separaten Reagenzienbehälter oder als Bestandteil des Reagenziensatzes 1 oder als Bestandteil des Reagenziensatzes 2.
- Bei einer bestimmten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testsystems liegen die Reagenzienbestandteile des ersten Reagenziensatzes in einem gemeinsamen Reagenzienbehälter vor oder es liegen die Reagenzienbestandteile des zweiten Reagenziensatzes in einem gemeinsamen Reagenzienbehälter vor. Bei speziellen Ausführungsformen liegen die Reagenzienbestandteile des ersten Reagenziensatzes in einem gemeinsamen ersten Reagenzienbehälter vor und die Reagenzienbestandteile des zweiten Reagenziensatzes liegen in einem gemeinsamen zweiten Reagenzienbehälter vor.
- Das zusätzliche Reagenz Aminopyrin kann entweder in einem separaten dritten Reagenzienbehälter vorgesehen sein oder Bestandteil eines Reagenziengemisches in einem Reagenzienbehälter des ersten oder zweiten Reagenziensatzes sein.
- Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testsystems liegen die beiden Reagenzienbestandteile a1) und a2) des ersten Reagenziensatzes als Bestandteile eines ersten flüssigen Reagenziengemisches vorgemischt in einem ersten Reagenzienbehälter vor und/oder die beiden Reagenzienbestandteile b1) und b2) des zweiten Reagenziensatzes als Bestandteile eines zweiten flüssigen Reagenziengemisches vorgemischt in einem zweiten Reagenzienbehälter.
- Spezielle Ausführungsformen der Erfindung, bei denen die Reagenzienbestandteile als Bestandteile von flüssigen Reagenziengemischen vorgesehen sind, sind dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenziengemische einen Puffer enthalten, der jeweils unabhängig voneinander ausgewählt ist unter PIPES, MES, MOPS, HEPES, BIS-TRIS-Propan, TRIS, AMPSO, Borat, TABS und TAPS, wobei im Falle des Reagenziengemisches des ersten Reagenziensatzes TRIS, TAPS und AMPSO bevorzugt sind und im Falle des Reagenziengemisches des zweiten Reagenziensatzes PIPES und MOPS bevorzugt sind.
- Bei manchen Ausführungsformen der Erfindung kann die Signalintensität noch durch den Zusatz von einwertigen Metall-Ionen, wie z.B. K+, Na+, NH4+, und/oder von zweiwertigen Metall-Ionen, wie z.B. Mg2+, Ca2+, Ba2+, Cu2+, Fe2+, Zn2+ und/oder durch den Zusatz von milden Detergentien, wie z.B. Triton, Tergitol, CTAB, SDS, Thesit und Tween gesteigert werden, wobei nichtionische Tenside, wie z.B. Triton und Tergitol, bevorzugt sind.
- Besondere Ausführungsformen der Erfindung mit vorgemischten flüssigen Reagenziengemischen des ersten und/oder zweiten Reagenziensatzes sind dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Reagenziengemisches des ersten Reagenziensatzes vorzugsweise im Bereich von 6,0 bis 9,0 und besonders bevorzugt im Bereich von 7,5 bis 9,0 liegt und/oder der pH-Wert des zweiten Reagenziengemisches des zweiten Reagenziensatzes vorzugsweise im Bereich von 6,0 bis 9,0 und besonders bevorzugt im Bereich von 6,5 bis 8,5 liegt.
- Bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die Bestandteile des ersten Reagenziensatzes in einem Gemisch mit folgenden Anteilen der einzelnen Bestandteile eingesetzt:
Reagengemisch 1 Bestandteil Konzentration Puffer 10-1000 mM zweiwertige Metallionen (optional) 1-100 mM Substrat für Oxidoreduktase 0,1-10 mM schwaches Oxidationsmittel (optional) 0,01-5 mM Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl 0,2-25 mM - Bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die Bestandteile des zweiten Reagenziensatzes in einem Gemisch mit folgenden Anteilen der einzelnen Bestandteile eingesetzt:
Reagenzgemisch 2 Bestandteil Konzentration Puffer 10-1000 mM Aminopyrin 0,5-50 mM Peroxidase (optional) 2-200 kU/L Oxidoreduktase 3-350 kU/L Hippuricase 2-250 kU/L - Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst das analytische oder diagnostische Testsystem der Erfindung wenigstens eine Kontrollflüssigkeit und/oder wenigstens eine Kalibratorflüssigkeit, wobei die Kontrollflüssigkeit und/oder Kalibratorflüssigkeit als Matrixbestandteile vorzugsweise Humanplasma und/oder Natriumazid enthält und optional zusätzlich 6-Aminohexansäure und/oder Calciumchlorid.
- Bei bestimmten Ausführungsformen enthält das erste und/oder das zweite flüssige Reagenziengemisch eine Kombination von Konservierungsmitteln, die wenigstens Gentamycinsulfat und wahlweise eines unter Amphotericin und Onium 46.
- Für Zwecke der ursprünglichen Offenbarung wird darauf hingewiesen, dass sämtliche Merkmale, wie sie sich aus der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen für einen Fachmann erschlie-ßen, auch wenn sie konkret nur im Zusammenhang mit bestimmten weiteren Merkmalen beschrieben wurden, sowohl einzeln als auch in beliebigen Zusammenstellungen mit anderen der hier offenbarten Merkmalen oder Merkmalsgruppen kombinierbar sind, soweit dies nicht ausdrücklich ausgeschlossen wurde oder chemische, physikalisch chemische oder pharmakologische Gegebenheiten derartige Kombinationen unmöglich oder sinnlos machen. Auf die umfassende, explizite Darstellung sämtlicher denkbarer Merkmalskombinationen wird hier nur der Kürze und der Lesbarkeit der Beschreibung wegen verzichtet.
- Des Weiteren wird darauf hingewiesen, dass es für den Fachmann selbstverständlich ist, dass die nachfolgenden Ausführungsbeispiele lediglich dazu dienen, die als Ausführungsbeispiele wiedergegebenen möglichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beispielhaft anzugeben. Der Fachmann wird daher ohne Weiteres verstehen, dass darüber hinaus auch alle anderen Ausführungsformen, die die in den Ansprüchen genannten erfindungsgemäßen Merkmale oder Merkmalskombinationen aufweisen, innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegen. Auf die umfassende, explizite Darstellung sämtlicher denkbarer Ausführungsformen wird auch hier nur der Kürze und der Lesbarkeit der Beschreibung wegen verzichtet.
- Ausführungsbeispiele
- Bei einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wurden die Bestandteile des ersten Reagenziensatzes in einem Gemisch mit folgenden Anteilen der einzelnen Bestandteile eingesetzt:
Reagenzgemisch 1 (pH 8,5) Bestandteil Konzentration TAPS 200 mM Glucose 1mM Kaliumhexacyanoferrat (III) 2mM Calciumchlorid 50 mM p-Hydroxyhippuryl-His-Leu-OH 5 mM - Bei einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wurden die Bestandteile des zweiten Reagenziensatzes in einem Gemisch mit folgenden Anteilen der einzelnen Bestandteile eingesetzt:
Reagenzgemisch 2 (pH 8,0) Bestandteil Konzentration PIPES 250 mM 4-Aminoantipyrin 15 mM Peroxidase 100 kU/L Glucoseoxidase 250 kU/L Hippuricase 75 kU/L - Bei einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wurden der erste Reagenziensatz und der zweite Reagenziensatz wie folgt angewendet:
Applikation Reagenzkomponente 1 80 µL Probe 6 µL Inkubieren 5 Minuten Reagenzkomponente 2 20 µL 1. Messpunkt 6 Minuten 2. Messpunkt 9 Minuten Hauptwellenlänge 505 nm Nebenwellenlänge 658 nm - Bei einem Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem hauseigenen Test nach dem alternativen FAPGG-Verfahren und mit einem herkömmlichen Hippuricase-Test eines Wettbewerbers wurden folgende Ergebnisse erzielt:
Hippuricase-Methode FAPGG-Methode Erfindung Wettbewerber DiaSys gemessen Packungsbeilage Packungsbeilage CV (%) Kontrolle Ivl 1 (50 U/L) [%] 1,2 10 2,17 Linearität [U/L] 220 70 5,4-160 Lipid Interferenz [mg/dL] 600 57,6 FTU 200 Hämolyse Interferenz [mg/dL] 200 19,56 - Billirubin Interferenz [mg/dL] 30 0,764 26 Ditaurobillirubin Interferenz [mg/dL] 30 0,8 13
Claims (15)
- Verfahren zur quantitativen Messung der Enzymaktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms (ACE) in einer Probe, bei dem man ein Reaktionsgemisch erzeugt, indem man in der Probe enthaltenes ACE a) mit einem ersten Reagenziensatz in Kontakt bringt, wobei der erste Reagenziensatz folgende Reagenzienbestandteile umfasst: a1) ein Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl der allgemeinen Formel (I) als ACE-Substrat
- Verfahren nach
Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl des Reagenzienbestandteils a1) ausgewählt ist unter: - N-(4-hydroxy-benzoyl)-glycyl-histidy-leucin, - N-(4-hydroxy-3-methoxybenzoyl)-glycyl-glycyl-glycin, - N-(4-hydroxy-3-methoxybenzoyl)-glycyl-histidyl-leucin, - N-(3-chlor-4-hydroxybenzoyl)-glycyl-glycyl-glycin, - N-(3,5-dimethoxy-4-hydroxy-benzoyl)-glycyl-histidyl-leucin, - N-(3,5-dibrom-4-hydroxy-benzoyl)-glycyl -glycyl-glycin, - N-(3,5-dichlor-4-hydroxy-benzoyl)-glycyl-histidyl-leucin, - N-(3-hydroxy-2,4,6-triiodo-benzoyl)-glycyl-histidyl-leucin, - N-(4-hydroxy-3-methoxybenzoyl)-glycyl-alanyl-phenylalanin, - N-(3-chlor-4-hydroxybenzoyl)-glycyl-alanyl-phenylalanin, - N-(3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoyl)-glycyl-alanyl-phenylalanin. - Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 und2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidoreduktase des Reagenzienbestandteils b2) und deren Oxidationssubstrat des Reagenzienbestandteils a2) unter den folgenden Kombinationen ausgewählt sind: - Glucoseoxidase/Glucose - Cholesteroloxidase/Cholesterolchlorid - Cholinoxidase/Cholinchlorid - Lactatoxidase/Lactat - Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis3 dadurch gekennzeichnet, dass das Aminopyrin 4-Aminoantipyrin ist. - Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis4 dadurch gekennzeichnet, dass das in dem ersten Reagenziensatz als Reagenzienbestandteil a2) optional enthaltene Oxidationsmittel ausgewählt ist unter: - Tetraaminkupfer(II)sulfat - Molybdate mit zweiwertigen Metallionen - Kaliumhexacyanoferrat(III) - Hexachlorrhodat(III) - Mangan, - Oxalsäure, - Sulfaten, Thiosulfaten und Nitriten. - Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis4 , dadurch gekennzeichnet, dass die Probe, in der die Enzymaktivität von ACE gemessen wird, eine flüssige Probe ist, die ausgewählt ist unter Blut, Blutserum, Blutplasma oder Liquor. - Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis5 , dadurch gekennzeichnet, dass die Absorption des Reaktionsgemischs bei einer Wellenlänge im Bereich von 480 bis 530 nm gemessen wird. - Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis6 , dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an ACE enthaltender Probe, die bei der Erzeugung des Reaktionsgemisches eingesetzt wird, im Bereich von 0,1 bis 100 µl liegt und vorzugsweise < 20 µl < 10 µl, < 5 µl oder gar < 1 µl ist, und/oder dass die Enzymaktivität von ACE in der Probe im Bereich von 0,1 bis 250 U/L liegt und vorzugsweise < 20 U/L, < 10 U/L, < 5 U/L oder gar < 1 U/L ist. - Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis8 , dadurch gekennzeichnet, dass hiermit die Enzymaktivität von ACE für Zwecke der pharmakologischen Analytik oder für Zwecke der Diagnose oder Verlaufskontrolle in einer Probe eines Patienten gemessen wird, der wenigstens eines der folgenden Krankheitsbilder oder Symptome oder wenigstens einen der folgenden physiologischen Zustände aufweist: Bluthochdruck, chronische Herzinsuffizienz, Neurosarkosidose, Lepra, Morbus Gaucher, Tuberkulose, Praeklampsie, chronische Berylliose, proliferative Retinopathie, HIV-Infektion, Schwangerschaft, chronisches Müdigkeitssyndrom, Krebs, Alzheimer, Nephropathie, Fibrose, COVID-19. - Analytisches oder diagnostisches Testsystem zur quantitativen Messung der Enzymaktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms (ACE) in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass das Testsystem einen ersten Reagenziensatz und einen zweiten Reagenziensatz umfasst, wobei der erste Reagenziensatz wenigstens folgende Reagenzienbestandteile umfasst: a1) ein Hydroxybenzoyl-Tripeptidyl der allgemeinen Formel (I) als ACE-Substrat
- Analytisches oder diagnostisches Testsystem nach
Anspruch 10 , dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Reagenzienbestandteile a1) und a2) des ersten Reagenziensatzes als Bestandteile eines ersten flüssigen Reagenziengemisches vorgemischt in einem ersten Reagenzienbehälter vorliegen und/oder die beiden Reagenzienbestandteile b1) und b2) des zweiten Reagenziensatzes als Bestandteile eines zweiten flüssigen Reagenziengemisches vorgemischt in einem zweiten Reagenzienbehälter vorliegen. - Analytisches oder diagnostisches Testsystem nach
Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das erste und das zweite flüssige Reagenziengemisch einen Puffer enthalten, der jeweils unabhängig voneinander ausgewählt ist unter PIPES, MES, MOPS, HEPES, BIS-TRIS-Propan und TAPS, wobei im Falle des ersten Reagenziengemisches HEPES bevorzugt ist und im Falle des zweiten Reagenziengemisches PIPES bevorzugt ist. - Analytisches oder diagnostisches Testsystem nach einem der
Ansprüche 11 und12 , dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des ersten Reagenziengemisches im Bereich von 8,0 bis 8,5 liegt und/oder der pH-Wert des zweiten Reagenziengemisches im Bereich von 7,0 bis 9,0 liegt. - Analytisches oder diagnostisches Testsystem nach einem der
Ansprüche 10 bis13 , dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens eine Kontrollflüssigkeit und/oder wenigstens eine Kalibratorflüssigkeit enthält, wobei die Kontrollflüssigkeit und/oder Kalibratorflüssigkeit als Matrixbestandteile vorzugsweise Humanplasma und/oder Natriumazid enthält und optional zusätzlich 6-Aminohexansäure und/oder Calciumclorid. - Analytisches oder diagnostisches Testsystem nach einem der
Ansprüche 10 bis14 , dadurch gekennzeichnet, dass das erste und/oder das zweite flüssige Reagenziengemisch eine Kombination von Konservierungsmitteln enthält, die wenigstens Gentamycinsulfat und wahlweise eines unter Amphotericin und Onium 46 umfasst.
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| WO1984004331A1 (en) | 1983-05-03 | 1984-11-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and reagent for the determination of angiotensin converti ng enzyme |
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2022
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-
2023
- 2023-12-04 WO PCT/EP2023/084080 patent/WO2024121040A1/de unknown
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JP H05 / 25 199 A (Zusammenfassung, WPI-Zusammenfassung, Computer-Übersetzung und Original) |
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