DE2602542A1

DE2602542A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von glucoamylase im menschlichen urin und in koerperfluessigkeiten

Info

Publication number: DE2602542A1
Application number: DE19762602542
Authority: DE
Inventors: Masanobu Hosotani; Junnosuke Kida; Noshi Minamiura; Kazuaki Tsujino; Takehiko Yamamoto
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1975-01-24
Filing date: 1976-01-23
Publication date: 1976-07-29
Also published as: US4009079A; JPS5185790A

Description

HOFFMANN c& J0ITLB · PATENTANWÄLTE £ O U / D 4 £

D-8000 München ei · Arabellastrasse 4 (sternhaus) · telefon (089)9ii087 · telex 05-29*19 (pathe)

27 659

Ono Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka / Japan

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glucoamylase im menschlichen Urin und in Körperflüssigkeiten

Die Erfindung betrifft ein Verfahren der klinischen Diagnose und insbesondere ein Verfahren der quantitativen Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Glucoamylase, die im Urin oder in Körperflüssigkeiten vorliegt, unter Verwendung von Maltotriitol, Phenyl-^glucosid oder 2^-Dinitrophenyl-tfC-glucosid, auf Grundlage der Substratspezifität von Glucoamylase ohne Beeinflussung durch die Gegenwart anderer Amylasen.

Durch einen der Erfinder ist gefunden worden, dass Glucoamylase üblicherweise im Urin vorliegt (Minamiura, N. et al, J. Biochem. 72, 1295 (1972)).

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Es· ist ebenfalls bekannt, dass Glucoamylase in der Leber
entsteht, und es wurde auch eine Beziehung zwischen Glucoamylase und Störungen der Leber und anderer Organe festgestellt.

Es ist daher wünschenswert, eine Methodik zur quantitativen Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Glucoamylasespuren, die im menschlichen Urin und in Körperflüssigkeiten enthalten sind, zu entwickeln.

Im allgemeinen wird bei der Bestimmung der Amylaseaktivität eine Pufferlösung zu einer Enzymlösung zur Aufrechterhaltung des optimalen pH-Wertes gegeben und ein Substrat zugefügt,
um eine Reaktion des Gemisches bei einer geeigneten Temperatur zu gestatten. Nach einem vorgeschriebenen Zeitraum wird die Menge des verringerten Zuckerzersetzungsproduktes auf
chemische oder enzymatiscne Weise zur Berechnung der Enzymati vitat bestimmt.

Es ist selten, dass nur ein Amylasetypus in einem Organismus erzeugt wird. Die Amylase existiert immer als ein Gemisch mehrerer Arten. Darüber hinaus werden beliebige der Substrate, für die jede der Amylasen spezifisch ist, durch die Amylasen zu Glucose oder Polymeren oder Oligomeren der Glucose, z.B. zu Maltose, Isomaltose, cyclischen! Dextrin oder dergleichen zersetzt, weshalb es unmöglich ist, die Zersetzungsprodukte mit einer Art der Amylase zu korrelieren. Aus diesem Grunde ist es auch schwierig, die Menge einer spezifischen Amylase zu bestimmen. In der Praxis ist die quantitative Analyse
derart ausgeführt worden, dass die anderen Eigenschaften
der Amylasen ebenfalls herangezogen werden.

Es werden üblicherweise mehrere Bestimmungsverfahren angewandt,

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die in Abhängigkeit von der Enzymquelle und der Art des Enzyms, dessen Bestimmung gewünscht ist, gewählt werden. Diese können wie folgt eingeteilt werden:

(1) Es werden thermisch resistente Amylasen und säureresistente Amylasen getrennt.

(2) Saccharogene Amylasen urid schmelzbare Amylasen werden getrennt.

(3) Das Polymerisierungsausmass des Zersetzungsproduktes wird durch ein Iod-Verfahren bestimmt.

(4) Es wird ein spezifisches Dextrin als Substrat eingesetzt.

Mit jedem dieser üblichen Verfahren ist es schwierig, eine exakte Teilbestimmung durchzuführen.

Glucoamylase wird als eine saccharogene Amylase angesehen, die nur Glucose aus Stärkeglucogen erzeugt. Ein Teilbestimmungsverfahren, welches dieses von anderen, vorliegenden Amylasen unterscheidet, die ebenfalls in der Lage sind, Glucose zu erzeugen, ist bisher nicht beschrieben worden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glucoamylase zu schaffen, die im Urin oder in Körperflüssigkeiten vorliegt.

Fig. 1 stellt eine Standardkurve zur Bestimmung der Glucosekonzentrationen nach einer Fluoreszenzmethodik dar.

Fig. 2 stellt eine Standardkurve zur Bestimmung von Glucosekonzentrationen nach der Park-Johnson-Methodik dar.

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-A-

Fig. 3 stellt eine schematische Darstellung einer Säure dar, die gemäss der Erfindung zur Gelfiltration eingesetzt wird.

Fig. 4 zeigt Beispiele von Urinfraktionen, die durch Säulenchromatografie unter Verwendung von Biogel P-1 ο (Warenzeichen für ein Molekularsieb, hergestellt durch das Bio-Rad Laboratory) erhalten wurden, wobei Fig. 4(a) das Verhalten von Bovin-Serumalbumin bei Zugabe zu Urin wiedergibt, und Fig. 4(b) das Verhalten von ultraviolett-absorbierenden Substanzen, Glucose und fluoreszierenden Substanzen wiedergibt.

Die Bezeichnung "Körper'flüssigkeiten", die nachstehend verwendet ist, bezeichnet Blut, Lymphe, Absonderungen mit Ausnahme von Urin und dergleichen.

Es sind verschiedene Untersuchungen durch die Erfinder hinsichtlich der komplizierten Substratspezifitat der Amylasen, die Oligosaccharide verwenden, durchgeführt worden. Bei Anwendung der nachstehend angeführten Methodik haben die Erfinder verschiedene Tatsachen festgestellt.

Es wurde eine Essigsäure-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 5,ο zu kristallinero6-Amylase (Bacillus subtilis), kristalliner β-Amylase (Malz) oder kristalliner Glucoamylase (RHizopus sp.) hinzugefügt, die alle im Handel erhältlich sind. Jedes der in Tabelle 1 angeführten Oligosaccharide wurde hierzu als ein Substrat hinzugegeben und das resultierende Gemisch bei einer Temperatur von 37°C während 2 Stunden umgesetzt. Die Menge der in jedem Reaktionsgemisch erzeugten Glucose wurde nach der Park-Johnsen-Methodik bestimmt (Sakuzo Fukui:

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A Method for Determining Reduced Sugar, S. 15, veröffentlicht durch das Tokyo University Publication Department), um die Amylaseaktivität jedes Substrates zu bestimmen. Als Ergebnis ergab sich die Substratspezifxtat von-■<>-Amyläse, ß'-Amylase oder Glucoamylase, wie in Tabelle 1 dargestellt, wodurch sich wiederum ergibt, dass oo-Amylase, ß-Amylase und Glucoamylase hinsichtlich ihrer individuellen Aktivität bei Substraten, die allein aus Glucosebestehen, nicht unterschieden werden können.

Es wurde jedoch auch festgestellt, dass Maltotriitol, Phenylok-glucosid und 2,4-Dinitrophenyl-oi?-glucosid, die'jeweils eine von Glucose verschiedene Verbindung aufweisen, die an einen Teil der Struktur des Substrates geknüpft ist, ausschliesslich durch Glucoamylase, nicht jedoch durch cL-Amyläse oder ß-Amylase zersetzt werden.

Tabelle 1	Zersetzungs
Oligo- Glycoamylase	produkt
saccharide <*>-Amylase ß-Amylase Rhizopus sp. "tlrin	Glucose
Maltose - - + +	Glucose
Maltotriose + + + +	Glucose Maltitol
Maltotriitol + +	Glucose
Maltotetraose + + + +	Glucose Phenol
Phenyl-rf/- glucosid - - + +	Glucose 2,4-Dinitro- phenol
2,4-Dinitro- glucosid - - + +

Bemerkung: Die Bezeichnung "+" gibt an, dass das Versuchs-Oligosaccharid zersetzt wurde. Die Bezeichnung "-" gibt an, dass das Versuchs-Oligosaccharid nicht zersetzt wurde.

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Die Mengen der Zersetzungsprodukte, d.h. Glucose, Phenol und 2,'4-Dinitrophenol,können durch bekannte Verfahren bestimmt werden. Daher kann die Menge der Glucoamylase, die in einem Amylasegemisch vorliegt, in quantitativer Weise bestimmt werden, wobei der Vorteil ihrer Spezifität für Maltotriitol, Phenyl-cO-glucosid und 2,4-Dinitrophenyl-^-glucosid ausgenützt wird.

Die Reaktionsbedingungen für Glucoamylase, wenn das Substrat Maltotriitol darstellt, sind wie folgt:

(1) Es werden o,3 ml einer 1m Essigsäure-Pufferlösung bei einem pH-Wert von etwa 4,ο bis etwa 6,ο zu 3,ο ml einer Urinoder Körperflüssxgkextsprobe (wobei die Endkonzentration der Essigsäure in der Probe etwa o,o91 m beträgt) hinzugefügt, aus der Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht durch Dialyse oder Gelfiltration (Substanzen mit einem Molekulargewicht von etwa 5oo bis etwa 2o.ooo) entfernt worden sind;

(2) es werden o,3 ml Maltotriitol-Lösung bei einer Konzentration von etwa o,1 bis 1o ,ug/ml zu dem. resultierenden Gemisch hinzugegeben;

(3) das Gemisch wird bei einer Temperatur von etwa 28 bis etwa 55°C während eines Zeitraumes von etwa 1o bis etwa 6o Minuten gehalten; und

(4) o,25 ml einer 1m tris(Hydroximethyl)-aminomethan-Lösung (nachstehend als "tris-Lösung" bezeichnet), werden :

zu dem Reaktionsgemisch zur Beendigung der Reaktion hinzugegeben. Zur Beendigung der Reaktion reicht es aus, das Reaktionssystem auf einen pH-Wert zu bringen, der höher als 8 bis 8,5 liegt, wobei die vorstehend angeführte Menge einer 1m tris-Lösung zu diesem Zweck ausreichend ist.

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Die Glucoseamylaseaktivitat kann nach der folgenden Gleichung berechnet werden:

Glucoseamylase- Menge der in 1o-minütiger Reaktion erzeugten Glucose (/UMol) aktivität (Ein- = lö ^f

heiten)

Die Bezeichnung "Einheit" bezeichnet die Aktivität eines Enzymes, die hinsichtlich der Menge ( ,uMole) des Substrates, das innerhalb des Zeitraumes (Minuten) zersetzt worden ist, der zur enzymatischen Zersetzung einer derartigen Substratmenge erforderlich ist, d.h. die Aktivität, die zur Zersetzung von 1 /UMol des Substrates in 1 Minute fähig ist, bestimmt ist.

Die Reaktionsbedingungen, die im Fall der Verwendung von Phenyl-Λ-glucosid oder 2,4-Dinitrophenyl-oO-glucosid als ein Substrat angewandt werden, sind nachstehend angegeben.

Die Bestimmung der Zersetzungsprodukte kann wie folgt durchgeführt werden:

(1) Die Bestimmung der Glucose durch ein Enzymverfahren kann nach dem Verfahren von Guilbault et al, beschrieben in Anal. Chem. 4o, 19o (1968) durchgeführt werden. D.h. es wird eine tris-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8,5 zu einer wässrigen Glucoselösung hinzugefügt und zu einem 2,7 ml Anteil hiervon werden o,1 ml einer Glucoseoxidase-(erhalten aus Aspergillus niger Typ II (Sigma Chemical Co.)) Lösung einer Konzentration von 2 mg/ml, o,1 ml einer Peroxidase-(erhalten aus Meerrettich Typ I (Sigma Chemical Co.)) Lösung einer Konzentration von 1 mg/ml und o,1 ml einer Homovanillinsäure-Lösung einer Konzentration von 2,5 mg/ml hinzugefügt. Die Fluoreszenzzunahme im Verlauf der Zeit (4F/min) wird sodann unter Anwendung eines Spektrofotofluorometers bei einer

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Anregungswellenlänge von 33o nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 43o nm bestimmt. Die Standardkurve, die das Verhältnis zwischen der hierdurch erhaltenen Glucosekonzentrationen in der Probe und denA F/min-Werten darstellt, ist in Fig. 1 wiedergegeben.

Die Menge der in dem Zersetzungsgemisch enthaltenen Glucose, welche durch die Aktivität der im Urin oder in Körperflüssigkeiten vorhandenen Glucoamylase erhalten wird, kann unter Anwendung der in Fig. 1 dargestellten Standardkurve bestimmt werden. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass im Fall einer Urinprobe, die im allgemeinen saure Substanzen,wie Harnsäure, enthält, o,25 ml einer 1m tris-Lösung anstelle der tris-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8,5 zu 3,6 ml des Reaktionsgemisches zur Einstellung eines Reaktionssystem-pH-Wertes von 8,5 hinzugefügt werden.

(2) Die quantitative Bestimmung des reduzierten Zuckers wurde nach der vorstehend erwähnten Park-Johnson-Methodik durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, dass der Zusatz an Kaliumcyanid als Stabilisierungsmittel weggelassen ist. D.h. ein Gemisch von 3 ml einer Glucoselösung, 1 ml einer wässrigen Lösung von Kaliumferricyanid bei einer Konzentration von o,5 g/l und 1 ml einer Natriumcarbonatlösung bei einer Konzentration von 5,3 g/l wurde in siedendem Wasser während 15 Minuten gehalten und nachfolgend mit fliessendem Wasser auf Raumtemperatur abgekühlt. Es wurden 5 ml einer o,o5 η Schwefelsäurelösung, die 1,5 g/l Eisenalaun und 1 g/l Natriumdodecylsulfat enthielt, zu dem Gemisch hinzugegeben und das System wurde sodann bei Raumtemperatur während 15 Minuten stehen gelassen und sodann unter Einsatz eines Spektrofotometers bei einer Wellenlänge von 69o nm eine colorimetrische Analyse

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durchgeführt. Die Standardkurve, die das Verhältnis zwischen der hierdurch erhaltenen Glucosekonzentrationen der Proben und deren Absorption ergibt, ist in Fig. 2 gezeigt.
(3) Die quantitative Bestimmung von Phenol, welches aus Phenol-^glucosid erhalten wurde, kann wie folgt durchgeführt werden. 2 ml einer o,oo5m Essigsäure-Pufferlösung bei einem pH von 5,o, die Phenyl-oC-glucosid bei einer Konzentration von 1,5 ,uMol/ml enthielt, d.h. 41o,ug/ml, wurdenmit 1 ml Urin oder einer Körperflüssigkeit, aus der die Materialien niedrigen Molekulargewichtes durch Dialyse oder Gelfiltration entfernt worden waren (die Endkonzentration der Essigsäure in der Probe beträgt ca. o,oo33 m) vermischt und bei einer Temperatur von etwa 28 bis 55°C während eines Zeitraumes stehen gelassen, in dem die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 27o nm zu dem Zeitverlauf proportional war, und es wurde das Anwachsen der Absorption bei einer Wellenlänge von 27o nm unter Anwendung eines Spektrofotometers zu einem definierten Zeitpunkt oder im Verlauf der Zeit bestimmt. Die Glucoamylaseaktivitätseinheit kann aus dem Anwachsen der Absorption pro Minute (Δ OD/min) nach der folgenden Gleichung erhalten werden:

Glycoamylase- A OD/min χ 3

⁼ Phenol/_/U MOD (1,45ο)

(4) Bestimmung des 2,4-Dinitrophenols, das aus 2,4-Dinitrophenyl-oC-glucosid erzeugt wird:

In gleicher Weise wie es vorstehend unter (3) beschrieben ist, wurde das Anwachsen der Absorption bei einer Wellenlänge von 362 nm unter Anwendung eines Spektrofotometers,

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- 1o -

jedoch unter Verwendung von2_/4-Dinitrophenyl-^t3t^-glucosid anstelle von Phenyl-oC-glucosid als Substrat bestimmt. Die Glucoamylaseaktivitätseinheit kann nach der folgenden Gleichung erhalten werden:

Glucoamylase- Δ OD/min χ 3

aktivität = 2,4-Dinitrophenol/Ai MOD (12,2) (Einheit) '

Im folgenden ist ein Verfahren zur Entfernung der Substanzen niedrigen Molekulargewichtes aus den Proben beschrieben.

Die Entfernung der Substanzen niedrigen Molekulargewichtes aus dem Urin oder Serum kann durch Dialyse oder durch Gelfiltration erfolgen.

Die Dialyse kann unter Anwendung einer Essigsäure-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 4,5 mit einem Wechsel nach jeweils 3 bis

ο
4 Stunden bei etwa 4 C während eines Zeitraumes von etwa bis 3 Tagen durchgeführt werden.

Die Gelfiltration kann durch Beladung einer Säule, die schematisch in Fig. 3 dargestellt ist, mit 1 g (Trockengewicht) Biogel Ρ-Ι0 (Warenzeichen für ein Molekularsieb, das aus Polyacrylamid hergestellt ist und ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 1 Mio, oder mehr aufweist, hergestellt durch Bio-Rad Laboratory), welches zuvor in entionisiertem Wasser gequollen worden ist, und den Durchtritt von der Spitze der Säule her von zwei 3 ml Anteilen von Urin oder Serum unter Erhalt von zwei Fraktionen durchgeführt werden. Die zweite Fraktion wird als behandelter Urin oder behandeltes Serum verwendet, während die erste Fraktion verworfen wird.

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Natürlich kann ein beliebiges anderes Molekularsieb ebenfalls Verwendung finden, welches einen Molekularsiebeffekt aufweist, der zum Erhalt der gewünschten Substanzen durch Fraktionierung, die einem Molekulargewicht von etwa 4.ooo bis 4o.ooo aufweisen, befähigt. Beispielsweise kamSephadex-G-I00 (Warenzeichen für ein Molekularsieb, das aus Dextran hergestellt ist und ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 1 Mio oder mehr aufweist, hergestellt durch Pharmacia Fine Chemicals) verwendet werden.

Das Verhalten, das Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht und Substanzen mit hohem Molekulargewicht während der vorstehenden Säulenbehandlung zeigten, ist in Fig. 4 aufgezeichnet. Das 1 %-ige Bovin-Serum Albumin, das als eine Probe zugegeben wurde, erschien in der zweiten Fraktion (cf. Fig. 4 (a)). In den weiter folgenden Fraktionen wurden die reduzierten Zucker, die fluoreszierenden Substanzen, die im ultravioletten Bereich absorbierenden Stoffe und dergleichen, die inhärent im Urin oder Blut enthalten sind eluiert (cf. Fig. 4 (b)).

Es wurden vergleichende Untersuchungen zwischen dialysiertem Urin und säulenbehandeltem Urin hinsichtlich der Glucoamylaseaktivität durchgeführt. Die Urinproben wurden in zwei Teile aufgeteilt. Ein Teil wurde dialysiert und der andere säulenbehandelt (beides nach der vorstehend angegebenen Weise), wobei die Glucoamylaseaktivität jedes Teils unter Anwendung des vorstehend angeführten Fluoreszenzverfahrens nach Guilbault et al bestimmt wurde. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

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	Tabelle 2	Säulenbehandelter Urin ( raunit )
Probe Nr.	Dialysierter Urin ( irtunit )/	1,8
1	1,6	1,o
2	ο,9	1,2
3	1,2	o,6
4	ο,Ί	o,5
5	ο,Ί	1,6
6	1,4

/ irninit = 1/1.ooo einer Einheit

Es wurden keine erheblichen Unterschiede in den erhaltenen Messwerten in Abhängigkeit von der Art der Entfernung der Substanz niedrigen Molekulargewichtes festgestellt, wie durch die vorstehend angeführten Resultate gezeigt ist, bei denen zwei Teile aus einer Probe im wesentlichen die gleichen Aktivitäten zeigten.

Die Erfindung wird nachstehend durch Beispiele, die nicht einschränkend sind, veranschaulicht. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Versuche bei Atmosphärendruck und Raumtemperatur durchgeführt.

Beispiel 1

1o ml menschlichen Urins wurden gegenüber einer o,o2 m Essigsäure-Pufferlösung bei einer Temperatur von 5 bis Io C bei einem pH-Wert von 4,5 während 48 Stunden dialysiert. 3,ο ml des hierdurch erhaltenen, dialysierten Urines, ο,3 ml einer Maltotriitol-Lösung bei einer Konzentration von 1 mg/ml und o,3 ml einer 1 m Essigsäure-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 5,5 wurden vermischt und das Gemisch wurde bei 4o C

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während 1o Minuten reagieren gelassen. Unmittelbar hierauf wurden o,25 ml einer 1 m tris-Lösung zu dem Reaktionsgemisch zur Einstellung des pH-Wertes auf 8,5 hinzugefügt, wodurch die Reaktion gestoppt wurde. Ein 2,7 ml Anteil des resultierenden Gemisches wurde in eine Fluoreszenzfotometerzelle eingebracht und es wurden o,1 ml einer Homovanillinsäurelösung einer Konzentration von 2,5 mg/ml, o,1 ml einer Peroxidase- (erhalten aus Aspergillus niger Typ II(Sigma Chemical Co.)) Lösung einer Konzentration von 1 mg/ml und o,1 ml einer Glucoseoxidase- (erhalten aus Meerrettich Typ I (Sigma Chemical Co.)) Lösung einer Konzentration von 2 mg/ml ■ hinzugefügt. Die Zunahme der Fluoreszenz (Δ F/min) betrug 1,5, wobei dieser Wert in bezug zu der Standardkurve der Fig. 1 gesetzt wurde und sich hierbei ergab, dass die Glucosekonzentration des Reaktionsgemisches 233 ,ug/ml betrug. Da das Volumen des Reaktionsgemisches 3,85 ml, bezogen auf die Summe des Urines, der Maltotriitollösung, der Essigsäure-Pufferlösung und der tris-Lösung betrug, ergab sich die Menge der erzeugten Glucose als 2,33 χ 3,85 = 8,97/Ug. Nach der Definition, dass die "Glucoamylaseaktivität die mikromolare Menge der Glucose darstellt, die in 1 Minute Reaktionszeit erzeugt ist", wurde die Glucoamylaseaktivität in der Urinversuchsprobe nach der folgenden Gleichung berechnet:

Glucoamylase Menge der erzeugten Glucose _χ 1

aktivität = Molekulargewicht der Glucose Urinmenge (ml) (Einheit)

^X ⁼ τ£γ* I ^xll· = °,oo17Einh./ml

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Nach der Definition 1/1.ooo einer 1 ,o Einheit als 1 munit stellt das vorstehende Ergebnis in dieser Ausdrucksweise 1,7 munit dar.

Beispiel 2

6 ml menschlichen Urins wurden durch eine Säule geführt, die mit 1 g Biogel P-1ο gefüllt war, welches zuvor in entionisiertem Wasser gequollen worden war, wobei die ersten 3 ml des Ausflusses verworfen wurden. Zu den letzten 3 ml des Ausflusses wurden o,3 ml einer Maltotriitol-Lösung bei einer Konzentration von 1 mg/ml und o,3 ml einer 1 m Essigsäure-Pufferlösung eines pH-Wertes von 5,5 hinzugegeben, wonach das Gemisch bei 4o C während 1 ο Minuten reagieren gelassen wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurden o,25 ml einer 1 m tris-Lösung zu dem Reaktionsgemisch zur Beendigung der Reaktion hinzugegeben. Ein 2,7 ml Anteil des resultierenden Reaktionsgemisches wurde herausgenommen und in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet, wobexAF/min als 2,ο ermittelt wurde. Dieser Wert wurde zu der Standardkurve der Fig. 1 in Beziehung gesetzt, wobei 2,96 ,ug/ml Glucosekonzentratxon im Reaktionsgemische festgestellt wurden. Dementsprechend wurde die Menge der in dem Gesamtreaktionsgemisch erzeugten Glucose als 2,96 χ 3,85 = 11,4 ,ug berechnet. Aus diesem Wert wurde die Glucoamylaseaktivität in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wie folgt errechnet:

Glucoseamylase- _ ₁₁ . _{1 1}

aktivität χ 4 x ύ = o,oo21 Einheit/ml =2,1 munit/ml

Ί OO J IO

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Beispiel 3

In gleicher Weise, wie es vorstehend in Beispiel 1 beschrieben wurde, wurden zwei 3 ml-Teile einer dialysierten Urinprobe hergestellt und jeweils mit A und B bezeichnet. o,3 ml einer Maltotriitol7Lösung einer Konzentration von 1 mg/ml und o,3 ml einer 1 m Essigsäure-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 5,5 wurden zu A hinzugefügt, während zu B o,3 ml entionisiertes Wasser und o,3 ml einer 1 m Essigsäure-Pufferlösung eines pH-Wertes von 5,5 hinzugefügt wurden, wonach die jeweils resultierenden Gemische bei 4o C während 1o Minuten reagieren gelassen wurden. Hiernach wurden o,25 ml einer 1 m tris-Lösung hinzugefügt, um den pH-Wert auf 8,5 einzustellen, wodurch die Reaktion gestoppt wurde. Jedes Reaktionsgemisch wurde dreifach mit entionisiertem Wasser verdünnt und 3 ml-Anteile wurden aus jeder Probe entnommen, die als Versuchsproben A und B jeweils bezeichnet wurden. Zu jeder der Versuchsproben A und B wurden 1 ml einer Kaliumferricyanid-Lösung (Konzentration o,5 g/l) und 1 ml einer Natriumcarbonat-Lösunge (Konzentration 5,3 g/l) hinzugefügt und das resultierende Gemisch wurde in siedendes Wasser während 15 Minuten eingebracht, wonach mit fMessendem Wasser auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. 5 ml einer o,o5 η Schwefelsäurelösung, die 1,5 g/l Eisenalaun und 1 g/l Natriumdodecylsulfat enthielt, wurde sodann zu dem Gemisch hinzugegeben, wonach das Gemisch während 15 Minuten zur Beendigung der Farbausbildung stehen gelassen wurde. Die colorimetrische Bestimmung der hierdurch gebildeten blauen Farbe bei einer Wellenlänge von 69o nm zeigt, dass die Absorption von A und B bei o,244 und o,12o jeweils erfolgte. Bei Abzug von B von A ergab sich das Ergebnis o,124, welches das Ausmass der Farbbildung infolge der Glucose in dem Reaktionsgemisch anzeigte. Unter Anwendung des vorstehenden Wertes auf die

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Standardkurve der Fig. 2 wurde die Glucosekonzentration als 1,4 ,ug/ml ermittelt. Da das Reaktionsgemisch auf das 3-fache verdünnt worden war , wurde 1,4 mit 3 multipliziert, wodurch 4,2 ,ug/ml erhalten wurden, was der Glucosekonzentration in dem Reaktionsgemisch entspricht. Die Glucoamylaseaktivität im Urin wurde wie folgt berechnet:

Glucoamylase- _ Glucosekonezntration Menge des Reaktionsgemisches aktivität Glucosemolekulargewicht Menge des angewandten Urins

^x To⁼ T§o ^x ^T^ ^X1o ^{= o}'°°³⁰ Einheit/ml

= 3,ο munit/ml

Beispiel 4

6 ml menschlichen Urins wurden durch eine Säule geführt, die mit 1 g Biogel P-1ο gefüllt war, welches zuvor in entionisiertem Wasser gequollen worden war, wobei die ersten 3 ml des Ausflusses verworfen wurden. Die letzten 3 ml des Ausflusses wurden in zwei 1,5 ml-Portionen geteilt, welche mit A und B jeweils bezeichnet wurden. 0,15 ml einer Maltotriitollösung einer Konzentration von 1 mg/ml und o,15 ml einer 1 m Essigsäure-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 5,5 wurden zu A gegeben, während o,15 ml entionisiertes Wasser und o,15 ml einer 1 m Essigsäure-Pufferlösung eines pH-Wertes von 5,5 zu B hinzugefügt wurden. Nachdem jederder Teile A und B bei 4o°C während 1o Minuten umgesetzt worden war , wurden o,125 ml einer 1 m tris-Lösung hinzugegeben um !.den pH-Wert auf 8,5 einzustellen, wodurch die Reaktion beendigt wurde. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde auf das 3-fache mit entionisiertem Wasser verdünnt. Die Menge der Glucose in einem 3 ml-Anteil jedes Gemisches wurde in gleicher Weise

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wie in Beispiel 3 beschrieben festgestellt. Die Absorption von A und B betrug o,22o und o,135 jeweils, wonach A minus B o,o85 ergibt, welches die Farbbildung anzeigt, die auf die Glucose in dem Reaktionsgemisch zurückzuführen ist. Dieser Wert wurde sodann in bezug zu der Standardkurve der Fig. 1 gesetzt, wonach sich die Glucosekonze/itration zu o,9 /Ug/ml ergab, welches mit 3 multipliziert wurde (entsprechend 2,7 ,ug/ml Glucosekonzentration in dem Reaktionsgemisch) . Nach der gleichen Gleichung, wie sie in Beispiel 3 angegeben ist, wurde die Glucoseamylaseaktivität im Urin wie folgt erhalten:

-Ιέ^ χ %^ χ ~ = o,o19 Einheit /ml = 1,9 munit / ml.

I OO ά IO

Beispiel 5

1o ml menschlichen Urins wurden gegenüber o,o2 m Essigsäure-Pufferlösung bei einer Temperatur von 5 bis Io C bei einem pH-Wert von 4,5 während 48 Stunden dialysiert. Zu 1,o ml des hierdurch erhaltenen dialysierten Urins wurden 2 ml einer o,oo5 m Essigsäure-Pufferlösung eines pH-Wertes von 5,o, die 1,5,um/ml Phenyl-^<A-glucosid enthielt, hinzugefügt, wonach bei einer Temperatur von 4o°C während 5 Minuten vermischt wurde. Die Zunahme der Absorption ΔOD/min bei einer Wellenlänge von27o nm wurde zu o,oo13 im Verlauf der Zeit ermittelt, und somit die Glucoamylaseaktivität nach dem molaren Absorptionsindex von Phenol (145o) als 1,71 munit ermittelt.

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Beispiel 6

In gleicher Weise, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, jedoch unter Verwendung von 2,4-Dinitrophenyl-oO-glucosid anstelle von Phenyl-°^-glucosid wurde der Zuwachs der Absorption ΔOD/min bei einer Wellenlänge von 362 nm als o,oo65 bestimmt. Die Glucoamylaseaktivität wurde aus dem molaren Absorptionsindex von 2,4-Dinitrophenol (122oo) als 1,59 munit ermittelt.

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Claims

Patentanspruch

Verfahren zur Bestimmung der Menge an Glucoamylase in menschlichem '.tlrin und in . Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet , dass die Substanzen niedrigen Molekulargewichtes aus einer Probe menschlichen Urins oder Körperflüssigkeit entfernt, zu der resultierenden Probe, die von Substanzen niedrigen Molekulargewichtes befreit ist, Maltotriitol, Phenyl-oC-glucosid oder 2,4-Dinitrophenyl-οίτ-glucosid hinzugefügt, von denen jedes ein spezifisches Substrat von Glucoamylase ist, und die Menge der Glucose, des Phenols oder von 2,4-Dinitrophenol gemessen werden, die die entsprechenden Zersetzungsprodukte der Substrate darstellen.

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