DE1643196C2

DE1643196C2 - Wasserlösliche aus Stärke, Amylose oder Amylopektin und einem Farbstoff bestehende Verbindungen sowie Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE1643196C2
Application number: DE1643196A
Authority: DE
Inventors: Arthur Lawrence Morristown N.J. Babson
Original assignee: Warner Lambert Pharmaceutical Co
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1966-01-20
Filing date: 1967-01-18
Publication date: 1985-02-21
Also published as: GB1167083A; DE1643196A1; US3597322A

Description

und einer Amylopekiinfrakilon der Struktur

CH₂OH CH₂OH H \ Ov H H λ Ov H

o—

besteht.

Amylasen sind Enzyme, die die Hydrolyse von Stärke katalysleren. Die a-Amylase vermag sowohl die ot-1,4-Blndungen der Amylose als auch die a-l,6-Blndungen des Amylopektlns und damit die Stärke als Ganzes zu hydrolysleren. Die ß-Amylase hydrolysiert lediglich die a-l,4-Blndung In der Stärke und läßt somit die a-1,6-Blndung des Amylopektins unverändert. Durch die Hydrolyse von Amylose und Amylopektin durch a-Amylase entstehen zunehmend kleinere Poiysaccharldfragmente, bis schließlich lediglich Maltose und In Einzelfällen etwas Glucose zurückbleibt. Die a-Amylase wird durch Chloridionen aktiviert und besitzt bei einem pH-Wert von ungefähr 7 die höchste Wirksamkeit.

Amylase tierischen Ursprungs 1st vom α-Typ. Sie wurde In vielen Geweben festgestellt. Insbesondere wird sie durch die Pankreasdrüse und die Speicheldrüsen gebildet. Die In den Sekreten dieser Drüsengewebe vorhandene Amylase fördert die Verdauung der Stärke, Indem diese zu kleineren und dadurch besser absorbierbaren und assimilierbaren Molekülen hydrolysiert wird.

Amylase findet man des weiteren in Pflanzen, wie in Hanfsamen und Malzgerste, In denen sie ebenfalls eine katalysierte hydrolytische Umwandlung von Polysacchariden In Glucose bewirkt.

Obwohl man seit mehr als 100 Jahren von der Existenz von Amylase Im Blut weiß, hat man noch nicht die genaue Quelle Im Körper für das Auftreten dieses Enzyms Im Normalserum feststellen können. Aus Pankreas- und Speicheldrüsen stammt diese Amylase offensichtlich nicht, da eine Entfernung dieser Drüsen keinen nennenswerten Einfluß auf den Amylasesplegel Im Normalserum hat. Man hat andererseits festgestellt, daß unter zahlreichen pathologischen Bedingungen und In besonders auffälligem Maße dieser Spiegel bei akuter Pankreatltls erhöht wird, wo ein plötzlicher Anstieg auf das 30- bis 40fache des Normalwertes nichts Ungewöhnliches darstellt. Bei chronischer Pankreatltls Ist die Zunahme gering. Manche Patienten haben möglicherweise einen Spiegel normaler Höhe. Die Erhöhung des Spiegels der Serumamylase beruht unter diesen Bedingungen anscheinend auf einer Hemmung des Sekretlonsausflusses In Verbindung mit elnern Zerfall der azinösen Zellen. Die bei aufgebrochenen Magengeschwüren und bei DarrnvcfschiuW beobachteten gemäßigten Steigerungen des

Spiegels der Serumamylase geht wahrscheinlich auf das Auslaufen des Enzyms aus dem Darrnkana! In die Bauchhöhle und auf die von dort her erfolgende Aufnahme in den allgemeinen Blutkreislauf zurück. Mäßige Erhöhungen des Spiegels treten auch bei Mumps, Niereninsuffizienz und Pankreaskrebs auf. Leber- und Gallenkrankheiten andererseits kennzeichnen sich durch einen niedrigen Spiegel der Serumamylase.

Die Aktivität der Amyiase in Serumproben wird In der Weise gemessen, daß entweder nach der Methode, die auf der Stärkespaltung beruht, der Rückgang gewisser Stäikeelgenschaften beobachtet wird, der durch das Enzym infolge der Hydrolyse der Stärke hervorgerufen wird. Auch kann eine Methode herangezogen werden, die auf der Zuckererzeugung beruht und wobei das Entstehen reduzierender Substanzen ausgewertet wird. Bei der zuerst genannten Methode beobachtet man die Viskcsltäts- bzw. auch Trübungsabahme einer Stärkesuspension Infolge Verflüssigung durch das Enzym und führt entsprechende Messungen durch. Häufiger zieht man auch als Maßstab für die stärkespaltende Wirksamkeit die Abnahme in der Blaufärbung heran, die durch Umsetzen der Stärke mit Jod nach einer willkürlichen Inkubationsdauer erhalten wird. Dieses erstmals 1908 von Wohlgemuth eingeführte grundlegende jodometrische Verfahren wurde Im Laufe der Jahre vielfältig modifiziert. Bei manchen dieser modifizierten Verfahren liegt die Inkubationsdauer fest. Der Farbrückgang wird photometrisch gemessen. Bei anderen modifizierten Verfahren setzt man die Inkubation solange fort, bis keine Färbung mehr vorhanden ist.

Das zuerst genannte Verfahren leidet unter dem Nachteil, daß die erhaltene optische Dichte nicht In linearem Verhältnis zum Ausmaß der enzymatischen Hydrolyse steht, weil die Farbreaktion zwischen Stärke und Jod beim Abbau der Stärkemoleküle eine Riihe von Farbänderungen von blau über violett, bernsteinfarben und rot bis zu farblos durchläuft. Bei den mit veränderlicher Inkubatlonsdauci arbeitenden Verfahren müssen dem Enzym und Starke enthaltenden Inkubationsgemisch zwecks Jodprobe zahlreiche Teilmengen zu verschledensn Zeiten entnommen werden, was insbesondere dann umständlich 1st, wenn mehrere Enzymproben zu untersuchen sind. Schließlich leiden alle jodometrlschen Verfahren daran, dafl mit unter dem Optimum liegenden Substratkonzentrationen gearbeitet werden muß, da die Zerstörung des Substrats den Analysenendpunkt anzeigt. Es wurde auch festgestellt, daß die scheinbare Aktivität der Amyiase je !lach der Herkunft der Stärke mehrfach variieren kann. So hat man sogar beobachtet, daß Serumproteine auf die Stärke und Jod enthaltende Probe stcVend einwirken können und zu hohe Aktivitätswerte der Amyl&se vorgetäuscht werden [vgl. CHn. Chem. Acta 8 (1963), S. 918]. So wurde des weiteren festgestellt, daß bloßes Erhitzen von mit Salzlösung verdünntem Serum die jodometrlsch bestimmte, scheinbare Aktivität der Stärkespaltung merklich höher liegt, die Aktivität im Hinblick auf die Zuckererzeugung dagegen verschwindet [vgl. ClIn. Chem. Acta 9 (1964), 3. 515].

Die Im Jahre 1938 eingeführte, auf der Zuckererzeugung basierende Methode von Somogyi (vgl. J. Biolog. Chem. 25, S. 3!>9) wird Insbesondere wegen späterer verbesserter Modifizierungen immer noch v.üitgehend angewandt. Dabei wird insbesondere eine Modifizierung empfohlen, bei der man eine 1-ml-Probe des eine unbekannte Menge an Amyiase enthaltenden Serums oder sonstigen Prüfmaterials 30 min bei 40° C mit 7 ml eines 5-mg-Stärke enthaltenden, gepufferten Substrats Inkubiert. Die Umsetzung wird mit Wolframsäure unterbrochen. Der reduzierende Zucker im Filtrat wird bestimmt. Als auch unter dem Namen »Somogyi-Elnheit« bekannte Amylaseaktivltütseinhelt gilt dabei die Menge der In der Inkubierten Probe enthaltenen reduzierenden Substanzen gegenüber einer nlcht-lnkubierten Vergleichsprobe von 1 mg Glucose. Normalerwelse Hegt Amyiase Im Blut in einer Menge von etwa 40 bis 140 Einheiten je 100 ml vor.

Selbst mit diesem abgewandelten Verfahren 1st die Bestimmung der Amyiase immer noch zeitraubend und komplex und leidet außerdem an den Nachtellen, daß eine große und variable Blindmenge an reduzierendem Zucker bestimmt werden muß. Außerdem ruft nlcht-hydrolyslerte Stärke In der Probe oftmals Trübung hervor und stört dadurch die Bestimmung von reduzierenden Zuckern.

Die DE-AS 12 06 876 beschreibt Polysaccharld/Farbstoff-Verbindungen, die entweder wasserunlöslich sind oder nicht von dem bei ihrer Herstellung nlcht-umgesetztt.i Farbstoff frei sind. Die Wasserlöslichkeit Ist jedoch für ein Reagens zur Bestimmung von Amyiase von wesentlicher Bedeutung, well diese nur In wäßrigen Flüssigkelten löslich 1st. Andererseits darf deshalb kein nlcht-umgesetzter Farbstoff vorhanden sein, da er eine spektralphotomettische Messung der zur Amylasekonzentratlon proportionalen optischen Dichte der lediglich noch die enzymatischen Spaltprodukte der Polysaccharid/Farbstoff-Verblndung enthaltenden Flüssigkeit beeinträchtigen und ein falscher Amylasewert erfüllt würde.

Die GB-PS 9 00 752 beschreibt porhydroxylterte polymere Farbstoffreaktionsprodukte, die In wäßrigen alkalischen Lösungen oder In Wasser löslich sind oder In Lösung gebracht werden können. Derartige Farbstoffreaktlonsprodukte sind zur diagnostischen Bestimmung von Amyiase auf der Grundlage spektralphntometrlscher Messungen ebenfalls ungeeignet, da sie nicht vollständig frei von nlcht-umgesetztem Farbstoff sind. In »Biochemical Journal«, Bd. 87 (1963) S. 90 bis 95, wird die Herstellung und Verwendung unlöslicher farbiger Cellcdextrlne als Substrate bei der Bestimmung cellulosischer Enzyme aus Schafpansenflüssigkeit beschrieben. Besondere Reinigungsmaßnahmen werden für dieses Produkt nicht In Betracht gezogen, da bei dem In dieser Literaturstelle beschriebenen enzymatischen Test das unveränderte Substrat ohne Schwierigkelten von den farbigen Produkten der enzymatischen Hydrolyse (die das Maß für die enzymatische Aktivität darstellt) durch Fällen mit bekannten Fällmitteln abgetrennt werden kann. Es werden auch keinerlei Angaben über die Möglichkeit des Anfärbens eines wasserlöslichen Polysaccharide zur Verwendung als Substrat bei der Amylasebestlmmung gemacht.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, wasserlösliche, von nlcht-umgesetztem Farbstoff freie, aus Stärke, Amylose oder Amylopektin und einem Farbstoff bestellende Verbindungen -'orzuschlagen, die zu einer einfachen, schnellen und zuverlässigen Bestimmung von Amyiase auf der Grundlage einer spektralphotometrlschen Messung besonders geeignet sind. Des weiteren soll die Erfindung ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung derartiger Materialien vorschlagen.

Gegenstand der Erfindung sind daher wasserlösliche, von nlcht-umgesetztem Farbstoff freie, aus Stärke,

Amylose oder Amylopektin und einem Farbstoff bestehende Verbindungen der allgemeinen Formel (C₆H,o0₅),,-D

worin bedeuten:

η eine für Stärke, Amylose oder Amylopektin übliche Zahl und

D den Rest eines zum Anfärben von Cellulosematerlal geeigneten Farbstoffs der allgemeinen Formel

NH

N N

C C

/\ •Ν

Cl N Cl

b)

	R
	NH
/ N h	C ' V N
I! C	C ^N

X N Cl

oder

NH

/ V

N C-C!

Il I

Cl N Cl

In welchen R eine chromophore Gruppe aus der Klasse der Azo-, Anthrachinon-, Formazyl- oder Phthalocyaninfarbstoffe darstellt und X für ein Halogenatom oder einen gegebenenfalls eine löslichmachende Gruppe enthaltenden Rest steht. Diese Farbstoffe können Insbesondere auch eine Sulfogruppe enthalten. Das Halogenatom ist Insbesondere Chlor oder Brom.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen 1st dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Umsetzung

a) das die betreffende Polysaccharid/Farbstoff-Verbindung enthaltende Reaktionsgemisch neutralisiert,

b) gegebenenfalls die betreffende Polysaccharid/Farbstoff-Verblndung durch Methanolzugabe ausfallt, abfiltriert, in einer Phosphatpufferlösung löst und die erhaltene Lösung vom ungelösten Rückstand abzentrlfuglert,

c) den gesamten, nlcht-umgesetzten Farbstoff durch Dialyse oder Gelfiltration abtrennt und

d) die gereinigte Polysaccharid/Farbstoff-Verbindung entweder in Form ihrer wäßrigen Lösung oder in gefriergetrockneter Form gewinnt.

Beispiele der den erfindungsgemäßen Verbindungen einverleibten Farbstoffe finden sich in den US-PS 28 20 785, 28 89 316, 28 91 941, 28 92 828, 29 79 498, 30 54 795, 30 36 058, 31 49 100 und 31 27 232.

Der genaue chemische Aufbau der gefärbten erfindungsgemäßen Verbindungen Ist nicht bekannt, dürfte fcber von der Art sein, wie sich reaktionsfähige Farbstoffe in Alkall-behandelte Cellulose kuppeln, d. h. sie durften eine Farbstoffblndung an den freien Hydroxylgruppen der Ausgangsstärkesubstanz aufweisen, wie sie z. B. In den US-PS 18 86 480, 30 44 843 und 30 29 123 beschrieben wird. In diesem Sinne Ist die vorstehend erwähnte Formel (C₆Hi₀Os)_n-D zu verstehen.

Zur Herstellung der Ausgangsmaterialien des erflndur.gsgemäßen Verfahren kann zwar Stärke umgesetzt bzw.. angefärbt werden, wie Stärke aus Kartoifcln, Mals, Reis und Maranta. Vorzugswelse wird jedoch die Amylose·

^|l! oder Amylopektlnfraktlon der Stärke benutzt, die aus der Stärke selbst gewonnen wird und als sorgfältig standardisierte Handelsware zur Verfügung sieht. Die Auftrennung der Stärke In ihre Amylose- und Amylopektlnfraktlon kann durch übliche Vorbehandlung und durch Anwendung von Lösungsmitteln erfolgen. Wenn man beispielsweise eine verdünnte, d. h. 2- bis 3%lge Stärkepaste unter Druck erhitzt und die heiße Lösung mit einem Alkohol, wie Butanol oder Pentanol, sättigt, dann fällt eine hauptsächlich aus Amylose oder dem gerad-

¹^ kettigen Stärkeanteil bestehende Fraktion aus, die mit Jod eine Intensive Blaufärbung Hefen. Der In Lösung bleibende Hauptanieli besteht aus dem Amylopektin- oder verzwelgtkeüigen Siärkeaniell und gibt mit Jod eine Rotfärbung. Derartige hochreine Stärkefraktionen stellen Handelswaren dar. Sie werden In der sich mit Kohlenhydraten befassenden chemischen Literatur ausführlich beschrieben.
Die Ausgangsmaterialien für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, d. h. Stärke, Amylose

^:" oder Amylopektin, werden In alkalischer Lösung etwa 24 h bei etwa 20 bis 30° C mit einem der oben beschriebenen reaktionsfähigen Farbstoffe umgesetzt. Die In dem Reaktionsgemisch vorhandenen Alkalien werden mittels verdünnter Säure, z. B. mittels Salzsäure, neutralisiert. Die gefärbten Reaktionsprodukte In Forrn der Polysaccharld/Farbstoff-Verbindung werden durch Zugabe von Methanol ausgefällt. Der Niederschlag wird abgetrennt, in einer Phosphatpufferlösung aufgelöst und die erhaltene Lösung vom ungelösten Rückstand abzentrlfugiert.

-⁵ Der gesamte nlcht-umgesetzte Farbstoff wird schließlich durch Dialyse oder Gelfiltration abgetrennt. Die gereinigte Polysaccharid/Farbstoff-Verblndung kann entweder in Form Ihrer wäßrigen Lösung verbleiben und zur Bestimmung der Amylaseaktlvltät herangezogen werden oder kann in gefriergetrockneter Form gewonnen werden, die selbst nach längerer Lagerung In wieder aufgelöstem Zustande brauchbar Ist.
Bei der Durchführung dsr Bestimmung der Amylaseaktlvltät kann wie folgt vorgegangen werden: Man puffert

■'" das gestärkte Stärkeprodukt mit einem geeigneten Puffersystem, z. B. einer Phosphatlösung, um dadurch einen pH-Wert von ungefähr 7 einzustellen, wobei die Farbtönung der gefärbten Lösung vom jeweils gewählten Farbstoff abhängt. Mit dieser Lösung bzw. diesem Substrat wird eine kleine Menge von 0,1 bis 0,2 ml einer auf die Amylaseaktlvltät zu untersuchenden Probe, z. B. die Körperflüssigkeit eines Patienten, wie Harn, Serum, Speichel, Magenspülflüssigkeit oder Liquor, etwa 10 min bei 37° C Inkubiert. Nach der Inkubation fällt das nicht

■^vs hydrolyslerte Material nebst unerwünschtem Protein durch Zugabe eines geeigneten Protein- und Stärkefällungsmlttels, z. B. durch eine alkoholische Lösung von Gerbsäure oder Alkohol allein, aus. Es schließt sich ein Zentrifugleren oder Filtrieren an, um den Niederschlag abzutrennen. Auf diese Weise wird eine gereinigte Lösung erhalten, die die gefärbten, alkohollöslichen, durch Hydrolyse entstandenen Fraktionen enthält. Schließlich mißt man die optische Dichte bzw. Absorption dieser Flüssigkeit Im Gebiete des Absorptionsmaximums des jeweils benutzten Farbstoffs, die der Konzentration der Amylase in der jeweils untersuchten Körperflüssigkeit proportional Ist und diese bei geeigneter Skalenkalibrierung direkt ablesen läßt. In entsprechender Weise prüft man andere amylasehaltlge Substanzen, wie Pflanzenextrakte oder Enzympräparate.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

Herstellung von gefärbtem Amylopektin

W g Amylopektin werden in 200 ml 1 η-Natronlauge gelöst. Der Lösung werden unter Rühren 2 g eines roten 5(] Trichlorpyrlmidylfarbstoffs (Reactone Red 2B 2,7-Naphthalln-dlsulfonsäure,4-hydroxy-3-[(...).. ]2-sulfophenyl)azo]-5-[(2,5,6-trlchlor-4-pyrimld!nyl)amlno]-, Dlnatrlumsalz) zugegeben. Diese Lösung wird Insgesamt 24 h bei 20 bis 30° C inkubieri. Das RcäkilünsgerrUscri wird mit 3 n-Salzsäure neutralisiert. Die neutralisierte Flüssigkeit wird zur Entfernung des nlcht-umgesetzten Farbstoffs durch eine geeignete Gelfilteranlage laufen gelassen. Gegebenenfalls wird eine Vorfällung mit einem Gemisch aus Methanol und Wasser (Mlschungsverhältnls: 50 : 50) zur Entfernung der Hauptmenge des nlcht-umgesetzten Farbstoffs vor der Gelfiltration durchgeführt. Die derartig erhaltene Lösung wird mit Hilfe eines geeigneten Puffers, z. B. eines Phosphat-Puffers, auf den pH-Wert von etwa 7 gepuffert. Sie kann dann entweder als solche für die Amylasebestlmmung gemäß Beispiel 2 benutzt oder zwecks Lagerungsverbesserung gefriergetrocknet werden.

en Beispiel 2

Bestimmung des Amylasegehaltes

Eine 0,2-ml-Probe von Blutserum wird 10 min lang bei 37° C mit 1 ml der gemäß Beispiel 1 erhaltenen gepuffeiten Lösung Inkubiert. Danach werden 5 ml einer l&lgen Gerbsäurelösung in 50%lgem Methanol hinzugege ben. Die entstandene alkoholische Lösung wird bei etwa 2000 U/mln zentrifugiert, um samtliche ausgefällten Substanzen zu entfernen. Die optische Dichte der überstehenden Lösung wird bei 5000A bestimmt. Eine entsprechende Gegenprobe wird mit einem Standardserum bekannten Amylasegehalts durchgeführt. Da die

Menge des alkohollösllchen Farbstoffs, der bei der Hydrolyse der gefärbten Ausgangsverbindungen durch die anwesende Amylase freigesetzt wird, der Konzentration der Amylase direkt proportional ist, gilt dies auch für die optische Dichte, aus der dann der Amylasegehalt In der unbekannten Probe errechnet wird.

Beispiel 3

Das Beispiel 2 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle einer gefärbten Verbindung mit Amylopektlnantell eine solche mit Amyloseantei! verwendet wird. Es werden gleichermaßen zufriedenstellende Ergebnisse erzielt.

Beispiel 4

Das Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der gefärbten Verbindung mit Amylopektlngehalt eine soiche Verbindung mit Maisstärkeanteil herangezogen wird. Auch hler werden gleichermaßen zufriedenstellende Ergebnisse erzielt.

Claims

Patentansprüche:

1. Wasserlösliche, von nlcht-umgesetztem Farbstoff freie, aus Stärke, Amylose oder Amylopektin und einem Farbstoff bestehende Verbindungen der allgemeinen Formel

(C₆H₁₀Os)_n-D

worin bedeuten:

η eine für Stärke, Amylose oder Amylopektin übliche Zahl und

D den Rest eines zum Anfärben von Cellulosematerlal geeigneten Farbstoffs der allgemeinen Formeln

^a) R

NH

N N

Il I

C C

Cl N Cl

b)

/
X N
Il R N ~N C
I \
Cl Il
C
/ \ NK
I I
C
\ /
N \ I
C R NH
I I
C -Cl oder Cl' Cl c) /
N
h Il
C

In welchen R eine chromophore Gruppe aus der Klasse der Azo-, Anthrachlnon-, Formazyl- oder Phthalo- ;'j

cyaninfarbstoffe darstellt und X für ein Halogenatom oder einen gegebenenfalls eine löslichmachende Gruppe |:

enthaltenden Rest steht. $

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 durch Umsetzung von Stärke, Amylose %

oder Amylopektin mit dem jeweiligen Farbstoff In wäßriger alkalischer Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß | man nach der Umsetzung

a) das die betreffende Polysaccharld/Farbstoff-Verblndung enthaltende Reaktionsgemisch neutralisiert,

b) gegebenenfalls die betreffende Polysaccharld/Farbstoff-Verblndung durch Methanolzugabe ausfällt, abflltrlert. In einer Phosphatpufferlösung löst und die erhaltene Lösung vom ungelösten Rückstand abzentrlfuglert,

c) den gesamten, nlcht-umgesetzten Farbstoff durch Dialyse oder Gelfiltration abtrennt und

die gereinigte Polysaccharld/Farbstoff-Verblndung entweder in Form ihrer wäßrigen Lösung oder in gefriergetrockneter Form gev/Innt.

Die Erfindung betrifft wasserlösliche, von nlcht-umgesetztem Farbstoff freie, aus Stärke, Amylose oder Amylopektin und einem Farbstoff bestehende Verbindungen sowie ein Verfahren zu deren Herstellung durch Umsetzung von Stärke, Amylose oder Amylopektin mit dem jeweiligen Farbstoff In wäßriger alkalischer Lösung.

Stärke stellt ein polymeres Material der allgemeinen Formel (CtHmOs), dar, das hauptsächlich aus einer Amyiosefraktlon der Struktur

CH₂OH

OH

CH-OH

OH