DE2137774A1 - Verfahren zur Gewinnung einer gegen Amylase hochempfindlichen wasserlöslichen Amylose - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung einer gegen Amylase hochempfindlichen wasserlöslichen Amylose

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Description

ZELLtNTiN υ. LUYKEN
BOOO Möfjhsn 2 2
Ken Hayashibara 28. Juli 1971
Okajama / Japan SJ/Hu
kiio 7176
Verfahren zur Gewinnung einer gegen Amylase hochempfindlichen wasserlösuchen Amylose
Die Erfindung betrifft ein Vorfahren zur Gewinnung einer wasserlöslichen Amylose, die gegen Amylase hochempfindlich und daher als Substrat zur Bestimmung der Amylase-Aktivität vorzugsweise im Blutserum besonders geeignet ist.
Bisher wurde für die quantitative Analyse von Amylase Kartoffelstärke als solche oder deren gelöstes Partialhydrolysat verv/enaet, und war meist in Form einer 1 bis 2%igen Lösung, die man zuvor aufkochte und die derart homogenisierte Lösung lagerte. Während der Lagerung fiel jedoch oft die Stärke als schwerlösliche Masse aus und machte die Lösung unbrauchbar. AuLerdem waren die angewandten Stärken und deren Hydrolysate ,je nach Herkunft und Hydrol^rsebedingungen hinsichtlich ihrer 2ur;ammeηsetzung und Molekularstruktur sehr unterschiedlich, da die löslichen Stärken aus Gemischen von verzweigten und
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geradkettigen Molekülen mit verschiedenen Molekulargewichten und Molekularstrukturen bestanden, daher verschieden empfi/rdlich gegenüber Amylase und demzufolge als spezifische oubstrate für Amylase-BeStimmungen unzulänglich waren. Andererseits wird für diese Zwecke ein hochempfindliches Substrat bzw. eine besonders sensible Methode gerade in medizinischen Kliniken benötigt, da denen oft zur Analyse nur eine begrenzte Probemenge mit verhältnismäßig niedriger Amylase-Aktivitäb vorliegt.
Zwar wurde kürzlich eine verbesserte Methode für Amylase-Bestimmungen in Kliniken vorgeschlagen, gemäß welcher an Stelle von Stärke oder löslicher Stärke ein Stärke-Farbstoff-Komplex angewandt werden sollte. Jedoch waren die Ergebnisse hinsichtlich Gleichmäßigkeit und Wiederholbarkeit mangelhaft.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand in der Entwicklung eines Verfahrens zur Gewinnung einer P derartigen Amylose aus Stärke, weiche verhältnismäßig einheitlich in ihrer Kettenlänge und Struktur, in Wasser leicht löslich ist und eine eindeutige Empfindlichkeit gegen Amylase-Aktivität zeigt.
Die gestellte Aufgabe wurde in der V/eise gelöst, daß man erfindungsgemäß eine durch Erhitzen gelatinierte Stärke mittels Pullulanase oder Isoamylase hydrolysiert und aus dem Hydrolysat die.wasserlöslichen Amyloseanteile durch Kühlen, Fällen
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und .Fraktionieren von den Makromolekülen und Oligosacchariden abtrennt und aus der verbliebenen Lösung als rohe Mllung (A) isoliert.
I. Amyla se—Gewinnung«
Das neue Verfahren wird vorzugsweise wie folgt durchgeführt:
Gewöhnliche gelatinierte Stärke, die. eine langkettige Amylose enthält und zu etwa 80% verzweigt ist, wird durch Behandlung mit einer Alpha-1,6-glukosidase, z.B. einer Isoamylase der Pseudomonas-Gattung (z.B. ATGG 21 216) oder einer Pullulanase der Lactobacillus-Gattung (z.B. ATGG 8724) durch Abspaltung der Verzweigungen in eine kurzkettige Amylose vom Polymerisa^- tionsgrad (P.G.) von etwa 20 (Moleküle je Kette) überführt. Beim Stehenlassen der Reaktionsmischung bei 4-0 bis 50°0 erhält man in 1 bis 3 Stdn. in der überstehenden Lösung niedermolekulare Amylose, die durch wiederholtes Umkristallisieren gereinigt wird. Sie ist stark wasserlöslich, gibt beständige Lösungen, ist empfindlich gegen Amylase-und als Substrat zur Hydrolyse von Alpha-Amyläsen und Glukoamylase, die Alpha-1,4-glukosidbindungen abspaltet, geeignet.
Als Ausgangsstoffe sind vorzugsweise anwendbar: klebrige Reisstärke und wächserne Maisstärke, die im wesentlichen aus Amylopektin bestehen und nur 20 bis 25% natürliche Amylose enthalten.
Man erhitzt 10 bis 20%ige wässrige Stärkeaufschlämmungen bei
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135 bis 1700O unter ßühren, kühlt die erhaltenen homogenen gelatinierten Stärkepasten schnell auf 50 bis 600O ab und setzt - bevor noch eine "Hückläufigkeit" (retrogradation) der gelatinierten Stärke eingetreten ist - zwecks Erzielung einer gleichmäßigen Hydrolyse Pullulanase oder Isoamylase zu. Am geeignetsten ist Hfeeudomonas amyloderamosa (ATOC 21 216), da hierbei die Abtrennung der Fällung leicht zu erzielen ist. Anwendbar sind aber auch Pullulanasen von Actinomyceten, b Nocardia (IFO 3584) oder ein Lactobacillus-Enzym (wie IFO Die Stärkehydrolyse mit hitzebeständigen Lactobacillus- und Actinomycetes-Enzymen erfolgt bei 6O0C und wird nach Abfall der Viskosität bei 500C beendet. Das pH-Optimumbeträgt für Pseudomonas-Enzyme 3,0 bis 5,0, für die anderen 5,0 bis 7,0. Die Hydrolyse wird in 30 bis 45 Stunden vollendet. Die Aufbereitung, d.h. die Auftrennung der Hydrolysate nach dem Molekulargewicht und Beinigung der Fraktionen kann in verschiedener Weise erfolgen.
™ 1). Aus dem allmählich gekühlten Hydrolysat werden die hochmolekularen Amylosen durch Ausfällen (Fällung A) und hierauf die niedermolekularen Amylosen durch Eindampfen und Kühlen der abgetrennten Lösung gewonnen (Fällung B). Diese Fällung B löst man in dest. Wasser, unterwirft die etwa 10%ige Lösung einem erneuten Ausfällen und Fraktionieren und erhält nach Abtrennung der ungelösten Makromoleküle und "xoickläufigen" Oligosaccharide Amylose mit einer Molekularverteiluiig vom P.G. 15 bis 50.
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2). Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß die Fällung B in Wasser unter Zusatz eines Alkanols, wie Äthanol oder Methanol, gelöst, in der Lösung durch Kühlen, Gefrieren und Auftauen eine "rückläufige" ßeaktion erzeugt wird und die ausgefällten natürlichen hochmolekularen Amylosen durch Schleudern oder ,''ilbrieren abgesondert werden. Die Abtrennung der langkaubi->:en Amylosen kann ersetzt werden durch Schleudern oder Filtrieren der Hydrolysate, die oft durch Gefrieren und Auftauen entartet werden. Diese erhaltenen Amylosen werden weiter gereinigt durch erneutes Auflösen in Wasser und Fällen durch Alkanolzusatz.
Die auf eine dieser Arbeitsweisen aufbereiteten Amylosen enthalten eine begrenzte Menge einer in warmem Wasser löslicher Amylose von P.G. 15 bis 50, die gegen Alpha-Amylasen sehr empfindlich ist, wobei unbegrenzte (no limited) Dextrine übrigbleiben. Das Verhalten dieser Amylosen zeigt, daß sie geeignet sind zur
II. Bestimmung von An^/lase-Aktivitäten.
Den Untersuchungen lagen Blutseren von Mensch und Kaninchen sowie Harn und Zwölffingerdarmflüssigkeit von Kaninchen vor. Das Hurnanserum wurde vor der Prüfung in der 50 bis lOOfachen Konge einer 0,85%igen Kochsalzlösung gelöst, - entsprechend die übrigen drei Prüfstoffe in 100, 50 und 5000fachen Mengen. Jede Lösung versetzte man mit je 0,25 ml &er erfindungsgemäß berei-
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teten Substratlösung und einer Phosphat-Pufferlösung vom pH 6,9. Nach einem -jQ min dauernden Erwärmen bei p'7°G wurde im Wasserbad gekühlt, dann bei .Raumtemperatur 1,0 ml ^,5-Dinitrosalizylsäure-Reagenz zugegeben, 5 min bei 1"000C erhitzt und erneut mit Wasser gekühlt. Nach Zugabe von 2,0 ml Wass--r bestimmte man die Amylase-Aktivität der Amyla se-Einheit (AU) durch Messung der optischen Dichte (ü D) bei 5:>0 mit mittels eines photoelektrischen Kolorimeters und Berechnung des Akti- w vitätsgrades nach folgender Gleichung:
AU = K (OD1 - OD0),
worin K die Konstante des Kolorimeters, OD, die gemessene optische Dichte der jeweiligen Probe und OD0 diejenige der Leerprobe ist.
Vonden beiliegenden Diagrammen zeigen die Fig. 1 und 2 OD-Kurven der Human- bzw. Kaninchen-Seren bei Benutzung von Stärke und Amylose als Substrat. Fig. 3 zeigt 0D-Kurven verschieden konzentrierter Humanseren. Fig. 4 und 5 zeigen die Beziehungen zwischen den OD-Werten normaler und abnormaler Humanseren.
Zu Fig. 4 und 5 ist folgendes zu bemerken: Die Amylase-Aktivität des 5Ofach verdünnten Serums eines an der Bauchspeicheldrüse erkrankten Patienten wurde mit Substraten verschiedener Konzentration von 0,1 bis 2,0% gemessen. Hierbei erhöhten sich die OD-Werte mit der Erhöhung der Konzentration der beiden
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Substrate Amylose und "Stärke. Bei der Substratkonzentration ■von 0:,3 bis 2% sind jedoch die OD-Werte bei Amylose als Substrat etwa 10mal höher als bei Stärke als Substrat, wie nachstehende Aufstellung zeigt:
Substratkonzentration % Amylose
Stärke		 0,1 0,2 0,3 1,0 2,0
OD bei'
530 mu		 Amylo se-OD/Stärke-QD 0,039 0,179 0,443 0,819 1,644
0,035 0,059 0,099
Xi2,7 art 3*9 x16,6
Somit ist die Amylase-Wirksamkeit mit Amylose rund 10mal empfindlicher als mit Stärke.
Die Diagramme offenbaren nachstehende Versuchsergebnisse':
Fig. 1 und 2: Die Blutseren von Mensch und Kaninchen wurden 10Of ach verdünnt und in den I/ösungen unter Benutzung einer 2%igen Stärkelösung bzw. einer 0,2%igen Amyloselösung die Amylase-Aktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß die Amylose enthaltenen Proben wesentlich höhere - etwa lOfache OD-v/erte ergeben, als die Stärke aufweisenden Proben. Fig. 3: Die Messung der OD-Werte der normales Humanserum verschiedener Konzentration enthaltenden Proben mit 0,2% Amylose oder 2% Stärke zeigten eine gute Wechselbeziehung zwischen der OD-Intensität und dem Serumgehalt.
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BAD ORIGINAL
• · · O
Fig. 4- und 5: Die OD-Be Stimmungen des eine hohe Amjl a se -Aktivität aufweisenden Serums eines an der Bauciispeiclielarüse Erkrankten ergaben auch gleichartige Ergebnisse wie im normalen Serum, das unter Anwendung einer 0,2%igen Amyloselösung und einer 2%igen Stärkelösung als Substrat geprüft war, d.h. die OD-Werte erniedrigen sich mit Herabsetzung der Serumkonzentrationen. In den Amylose enthaltenden Proben besteht ein klares lineares Verhältnis zwischen der Enzymaktivität und OD, wogegen in den Stärke enthaltenden Proben die Geradlinigkeit eine unregelmäßige war. Die Ergebnisse zeigten wiederum die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Amylosesubstrats zur Bestimmung der Amylase-Aktivität.
Die OD-Werte der Proben erhöhen sich mit Abnahme der Reaktionszeit, die 15, 30 und 45 min betrug. Die Kurven, welche die Beziehung zwischen OD und Reaktionsdauer mit 0,16, 0,12 und 0,Obigen Amyloselösungen zeigen, geben parallele Strahlen (straight lines), welche anzeigen, daß die genannten Substratkonzentrationen und die Heaktionsdauer zur quantitativen Abschätzunp; der Amylaseaktivität anwendbar sind, wenn die Bedingungen in jedem Fall begrenzt sind.
Die Prüfung von hämolysiertem Blut ergab bisxveilen einen höheren Wert; jedoch wurde keine unmittelbare Interferenz des Hämoglobins beim OD bei $0 ταμ gefunden.
Zusammenfassend ergaben die Vorsuche folgendes:
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BAD ORiGINAL
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a.). Die erfindungsgemäß bereitete Amylose ergibt in einer konzentration von etwa 1/10 derjenigen von Stärke ein gutes Substrat zur Bestimmung der Amylase-Aktivität.
b). Das Färben mit ^,5-Dinitrosalizylsäure ist der Anwendung von Stärkesubstrat überlegen und gibt genauere und verläßlichere Worte.
c). Die OD-Werte von Proben, die Amylose enthielten, werden durch Hämoglobin nicht beeinfluß; somit ist das vom hämolysierten Blut abgetrennte Serum analysierbar.
d). Die stark hydrophile Anrylose verdirbt nicht beim Lagern, d.h. eine Kristallisation kann zwar stattfinden, Jedoch v/erden die Kristalle durch Erwärmen wieder leicht gelöst.
Die orfindungsgemäß bereitete Amylose ist auch bei der Jodme-^ thode zur Prüfung der Amylaseaktivität anwendbar. OD-Werte von bei 60ü mil gemessenen Proben stimmen genau überein mit der Amylase-Aktivität und mit der Konzentration des Blutserums. Verschiedene andere biologische Materialien zeigen desgleichen, daß Amylose gemäß der Erfindung ein vorzügliches Substrat für die Anal7/se gewöhnlicher Amylasen wie auch für klinische Teste darstellt.
In den nachstehenden Beispielen betreffen die Mengenangaben Gewichtsmengen.
BAD
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213777Λ
Beispiel 1. I. Amylose-Gexvinnung.
Eine 10%ige Aufschlämmung von xtfächserner Kaisstärke wurde 10 min unter Rühren bei 15O bis 160°0 erhitzt, die homop;en gelatinierte Lösung schnell auf 5O0G gekühlt, auf pH 3,0 bis 5,0 eingestellt und mit 50 Einheiten eines gereinigten Pseudomonas-Enzyms je g Stärke versetzt, worauf man die innig verrührte Mischung bei A-O0G inkubierte. Nach Abschleudern der gebildeten geringen Fällung wurde die Lösung stufenweise auf 5°G gekühlt und aus roher Amylose bestehende Fällung (A) abfiltriert.
II. Amylose-Beinigunp;. Methode 1:
Eine 1 bis 2%ige Lösung der Fällung (A) wurde unter Druck filtriert, das Filtrat im Vakuum bis zu einer Konzentration von 10% eingedampft und dann langsam abgekühlt, worauf man die kristalline Fällung (B) abfiltrierte und bei 500G trock/nete. Die erhaltene Amylose vom P.G. 26 war im warmen V/asser von 50°0 leicht löslich und gab die blauviolette Farbe der Jodreaktion.
Methode 2:
Die Fällung A wurde mit 85% Feuchtigkeit bei -15°0 eingefroren, dann auf 500G aufgetaut, 60 min bei 500C gerührt und hierauf die unlöslichen Stoffe abgeschleudert. Die verbliebene Lösung kühlte man langsam, schleuderte die auskristallisierten
109887/1271 r\
BAD ORIGINAL
Anteile ab, wasch, diese Fällung (B) mit kaltem Wasser und trocknete im. Vakuum. Die Amylose vom P^G. 25 und der Reduzierbarkeit 45 hatte die vorgenannten Eigenschaften.
Methode ..5:
Die Fällung A oder B wurde mit Wasser in eine 5%ige Lösung übergeführt, diese 10 min bei 70°G unter Rühren erhitzt und dann die unlöslichen Anteile abgeschleudert. Die langsam abgekühlte Losung ließ man bei 5°C 10 h stehen, filtrierte die kristalline Fällung C ab, wusch, sie mit kaltem V/asser und trocknete sie unter erniedrigtem Druck bei 50 C* Ausbeute 75%5 P. G. im Durchschnitt 25; Reduzierbarkeit 4,8%. Bei der Jodreaktion gab das in warmem Wasser lösliche Produkt eine bläulichpurpurne Färbung.
Methode 4:
Eine 5%ige wäßrige Lösung der Fällung A oder B wurde mit 5% Äthanol versetzt, die geringfügigen unlöslichen Anteile abgeschleudert, hierauf in der Lösung der Alkoholgehalt auf 50% erhöht, die kristalline Fällung abgeschleudert und getrocknet.
Beispiel 2.'
Eine 25%ige wässrige Aufschlämmung von Kartoffelstärke erhitzte man unter starkem Rühren 20 min bei 160 bis 1700G, kühlte schnell auf 600C, verdünnte mit Wasser auf 15% und versetzte mit einem Lactobacillus-Enzym. Die Hydrolyse wurde in 40 h bei 50 G unter gutem Rühren vollendet. ^
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...12
H3 Das erhaltene Hydrolysat wurde auf -15 C eingefroren, bei ;>0uC aufgetaut und 30 min bei 55°G stehengelassen, dann die
gebildete !fällung abgeschleudert, 10 h bei O0C stehengelassen, auf 55°G erhitzt und die unlöslichen Anteile abgeschleudert. Durch Kühlen der Lösung kristallisierte Amylose aus, die mit Wasser gewaschen und getrocknet wurde. Ausbeute etwa ;.;-ü/u>; P.G-. im Durchschnitt 17-52 (bestimmt durch Fraktionierung mit "Sephadex G-100")· Die Amylose war wasserlöslich und ergab gut " reproduzierbare Werte bei Anwendung als" Substrat zur Amylase-Bestimmung gemäß der Somogyi-Methode.
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Claims (5)

ti f ■£ ·■, hi Γ, ■-.-/ .. i Je: ^ ZELLEN'HN u. LUYKEN 8000 München 22 Patentansprüche 28„ Juli 1971 SJ/Hu kho 7176
1. Verfahren zur Gewinnung einer gegen Amylase hochempfindlichen wasserlöslichen Amylose aus Stärke, dadurch gekennzeichnet s daß man eine durch Erhitzen gelatinierte Stärke mittels Pullulanase oder Isoamylase hydrolysiert und aus dem Hydrolysat die wasserlöslichen Amyloseanteile durch Kühlen^ Fällen und Fraktionieren von den Makromolekülen und Oligosacchariden abtrennt und aus der verbliebenen Lösung als rohe Fällung (A) isoliert»
2. Verfahren nach Anspruch 19 dadurch gekennzeichnete, daß man von wächserner Maisstärke oder klebriger Reisstärke ausgeht.
5= Verfahreil nach Anspruch 1 und 29 dadurch gekennzeichnet9 daL man als Isoamylase das mittels Pseudomonas amyloderamosa (ATOO 21 216) gewonnene Enzym anwendet.
4·. Verfahren nach Anspruch 1 bis 39 dadurch gekennzeichnet9 daß raan die aus dem Hydrolysat isolierte rohe Fällung (A) gefrier-t9 wiederauftaut9 di© bei etwa ^Q0G abgetrennte Lö«=- oung kühlt und die gebildete Fällung (B) absondert»
5. Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß man die erhaltene Fällung (B) in etwa 20fachem Volumen V/asser auf schlämmt, die Aufschlämmung unter Rühren bei etwa 700G erhitzt und die durch Ki
bildete Fällung (G) abtrennt,
700G erhitzt und die durch Kühlen der gelösten Anteile ge-
S„ Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Fällung (B) in etwa 20fachem Volumen Wasser löst, " die durch Zugabe von etwa 5% (Volumen/Volumen) Alkanol ausgefallenen unlöslichen Anteile abtrennt und die in der Lösung durch Zugabe gleicher Alkanalmengen gebildete Fällung (G) absondert.
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DE2137774A 1970-07-28 1971-07-28 Verwendung von Amylose mit einem Polymerisationsgrad von 15 bis 50 Glucose-Molekülen je Kette zur Bestimmung der Amylase-Aktivität Expired DE2137774C2 (de)

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