DE1648840C2

DE1648840C2 - Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden und peroxidatisch wirksamen Substanzen

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Publication number: DE1648840C2
Application number: DE1967B0094944
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Dr.rer.nat.; Wielinger Hans Dr.phil.; Rieckmann Peter Dr.rer.nat.; 68OO Mannheim-WaldhQf. G06c 15-44 Rey
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1967-10-14
Filing date: 1967-10-14
Publication date: 1970-09-17
Also published as: DE1917996B2; DE1648840B1; DE1917996A1

Description

Il

Cicgcnstaiul der vorliegenden lirfindung sind diagnostische Mittel und Verfahren zur Iiestimmung von Hydroperoxidcn bzw. von Substanzen, aus denen durch eine vorgeschaltete Reaktion Wasserstoffperoxid oder andere Hydroperoxide freigesetzt werden, sowie von Peroxidase bzw. anderen peroxidatisch wirkenden Substanzen. Von besonderem diagnostischem Interesse ist der Nachweis von Glucose im Harn, Blut und Serum bei Diabetes sowie der Nachweis peroxidatisch wirkender Substanzen, wie Hämoglobin im Harn und Blut, und der Nachweis von Hydroperoxiden z. B. in der Milchwirtschaft, Kosmetik und Polymerchemie.

Es ist eine Reihe von Verbindungen bekannt, die von Wasserstoffperoxid mit Peroxidase als Katalysator zu einem Farbstoff oxidiert werden. Die Substanzen, die hierfür verwendet werden, sind z. B. Nadi-Reagenzien, p-PhcnyIendiaminderivale, Carboazine, Guajakharz, Aldazine usw. Bevorzugt eingesetzt werden bisher Benzidin, o-Dianisidin und o-Tolidin. Diese Verbindungen sind aber teilweise nicht sehr stabil und können nach den neuesten Erkenntnissen gesundheitsschädlich sein, so daß ihre Handhabung nicht ungefährlich erscheint.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die physiologisch unschädlichen Verbindungen der allgemeinen Formel I

Xx /X- -Y

C=N-N=C I
^xN-C

I I

R, R,

(I)

30

35

in der R₁ eine niedere Alkylgruppe, R₂ Wasserstoff, eine Sulfonsäuregruppe oder eine Alkalisulfonatgruppe, R₃ Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe, X ein Schwefelatom, eine Vinylen- oder eine Iminogruppe, die gegebenenfalls durch niedere Alkylreste oder AryIreste substituiert ist, Y ein Stickstoffatom oder eine Methingruppe, welche auch zusammen mit R₃ einen durch R₂ substituierten Benzolring bildet, bedeutet, absolut beständig sind und sich besonders gut dazu eignen, Wasserstoffperoxid und andere Hydroperoxide sowohl im optischen Test als auch mit Hilfe von Reagenzpapieren und Reagenzfilmen zu bestimmen.

Es ist zwar bekannt, daß sich einige dieser Substanzen mittels starker Oxidationsmittel, wie Bleitetraacetat, Cer(IV)-sulfat und Kaliumpersulfat, oxidieren lassen und dabei gefärbte Oxidationsprodukte liefern (vgl. S. H ü η i g et al., Liebigs Ann. Chem., 676 [1964], S. 32 bis 65, sowie H. L a η g et al, Z. analyt. Chem., 201 [1964], S. 321). Dajedoch mit Wasserstoffperoxid allein keine Reaktion erfolgt, war es nicht vorauszusehen, daß sich in Anwesenheit von Peroxidase oder peroxidatisch wirksamen Substanzen ebenfalls reproduzierbare deutliche Verfärbungen erzielen lassen.

Das erfindurtgsgemäße Verfahren zum Bestimmen von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw, peroxidatisch wirksamen Substanzen, wie Hämoglobin, mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung ist demnach dadurch gekennzeichnet, daß 'ils Chromogcn Substanzen dtrr allgemeinen Formel 1 verwendet werden.

Dabei ist das diagnostische Mittel zum Bestimmen von llydroperoxiden b/.w. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen eine Substanz der Formel I ist.

Das diagnostische Mittel zum Bestimmen von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen, bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen, ist dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen eine Substanz der Formel I ist.

Die Bestimmung von llydroperoxiden nach dem erlindungsgemäßen Verfahren ist vorzugsweise für gekoppelte und ungekoppclte Enzymreaktionen geeignet, wie z. B. zur Bestimmung von Glucose. Galactose, Aminosäuren, Harnsäure, Peroxiden, Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen sowie Enzymaktivitäten. Die routinemäßige Bestimmung von derartigen Substraten ist wegen ihrer elementaren Wichtigkeit aus der klinischen Chemie und aus der Lebensmittelchemie nicht mehr wegzudenken. Bei der Bestimmung von Glucose beispielsweise wird diese von Glucoseoxidase zu Gluconsäure oxidiert, wobei der Luftsauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Das Wasserstoffperoxid oxidiert dann mittels Peroxidase oder einer peroxidatisch wirkenden Substanz den erfindungsgemäß verwendeten Indikator zum entsprechenden Farbstoff. Weitere Beispiele für derartige analytisch brauchbare Enzymsysteme, die unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid reagieren, sind L-Aminosäureoxidase + 1.-Aminosäuren, D-Aminosäurcoxidase + »-Aminosäuren, Uricase + Harnsäure, Xanthinoxidase + Hypoxanlhin bzw. Xanthin, Glycinoxidase + Glycin, Monoaminooxidase + Monoamin (wie Adrenalin, Mescalin usw.), Diaminooxidase + Diamine (wie Histamin), Luciferase + Luciferin, D-Asparaginsäureoxidase + D-Asparaginsäure, Leber-Aldehydoxidase + Aldehyd, Galactoseoxidase + Galactose, Edsons Flavinenzym + Milchsäure.

Die Auswertung erfolgt beispielsweise durch optische Ausmessung im 3peküalphotometer oder bei Verwendung von Testpapierstreifen bzw. Testfilmen durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zusammensetzung bzw. Farbtafeln. Besonders vorteilhafte und gut abgestufte Farbiinderungeit erhält man überraschenderweise, wenn man die Substanzen I zusätzlich mit Reduktionsmitteln der Formel II versetzt

Ar

w/ \w'

in welcher Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern, V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe, V Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe, W eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe und W' Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe sowie gegebenenfalls deren Alkalisalze bedeutet.

Diese -Subslahzen,' die als »Modificr« Wirken, geben Rir sich allein keine oder nur sehr iinspezifisclie .■Verfiirhungen und sind deshalb als Indikalorcn im allgemeinen nicht geeignet. Zusammen mil den Substanzen der allgemeinen I urmel 1 erhall man aber besonders--deutliche und gut■■■ abgestufte Farbimi- - schlüge: Bevbrzuglc Ausfiihrungsfornien der vorliegenden Erfindung enthalten daher eine Kombination der Substanzen I und II als Indikator.

Selbslversliindlich iäßl sich umgekehrt das eründuiigsgemäße Verfahren auch zur Ucstimmung der Chromogene gemäß Formel I sowie der Modifier gemäß Formel II mit Hilfe von Hydroperoxiden und einer peroxidaliseh wirksamen Substanz benutzen, was bei der IYodtiktionsubcrwachung dieser Diagnosiika sehr nützlich ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Mittel sind in den folgenden Ueispielen näher erläutert:

Beispiel 1
Reagenzfilm zum Nachweis von Glucose

45 g Polyviiiylpropionaldispersioii, 35 g einer Lösung von .37 g Algipon in 2 I eines 0,5molaren Phosphat- oder Cilratpurfcrs vom pH 5,7, I g organisches Natriumsulfohat,. IOmI Wasser, 0,075 g Peroxidase und 0,15 g Glucoseoxidase werden zu einem homogenen Brei verrührt. Zu dieser Mischung gibt man 6 ml einer 5%igen wäßrigen Lösung von 2,2'-Azinodi-[3-älhylbenzthiazolon-sulfonsäure(6)]. Mit den so hergestellten Mischungen, in denen jeweils 0,2 bis 0,3% Indikator enthalten sind, werden Folien in einer Schichtdicke von 300 μ beschichtet und getrocknet. Mit wäßrigen Lösungen verschiedener Clucosekonzentrationen erhält man schwach abgestufte Grunfärbungen. Setzt man den obigen Mischungen an Stelle der wäßrigen Lösungen von 2,2'-Azino-di-[3-äthylbenzthiazolon-sulfonsäuren)] 6 ml einer 5%igcn Lösung von p-Aminosalicylsiiurc zu, so erhält man Teststreifen, die sich beim Benetzen mit wäßrigen Gliieoselösuiigcn nur schwachgelb verfärben und küinciIei 'Abstufungen der Verfärbung aufweisen. Verwendel man jedoch 6 ml einer wäßrigmelhanolischen Lösung des Gemisches von 5"„ 2,2'- Aziiio-di-f 3-äthy Ibenzlhiazolon - sulfonsäuren) J und 5"_n p-Aminosalicylsälire, so erhält man Teststreifen, die sich je nach der Glucosekortzentralion in Abslufungen von Ciriin nach Violell verfärben.

ίο B e i s ρ i e I 2

Nachweis von Glucose in Blut. Harn oder Serum

In analoger Weise wie im Beispiel I beschrieben werden Rcagcnzlilnie mil folgenden Substanzen ge-/5 maß Formel I hergestellt:

A = 2.2'-Azino-di-[3-äthylbenzihiazolon-

sulfonsäurei6)],
B = 2,2^,-Azino-di-[i-älhylchinolin-sulfonsäure(6)],

^>0 C = 2₍2-Azino-di-[l,3-diäthylbcnzimidazolonsulfonsäure(6)],
D = l-[3-MclhyIbenzthiazolon(2)]-2-[l-äthyl-

pyridon(2)]-azin,
E = i-[3-Äthylbcnzthiazolon(2)]-2-[l-phenyl-3-methyl-4-äthyl-1,2,4-triazolon(5)]-azin, F = l-[3-Äthylbenzthiazolon(2)]-2-[l-äthyl-

chinolinon(2)]-azin,
G = l-[3-Mcthylbeiizthiazolon(2)]-2-[l-phenyl-

3-metbyl-4-äthyl-1,2,4-triazolon(5)]-azin, H = l-[l-Äthylchinoiinon(2)]-2-[l-äthyl-

pyridon(2)]-azin,
J = l-[3-Äthylbcnzthiazolon(2)]-2-[l-Uthyl-

pyridon(2)]-azin,
K = l-[3-Methylbenzthiazolon(2)]-2-[l-älhylchinolinon(2)]-azin,

wobei diese mit einer Reihe von Substanzen gemäß Formel II kombiniert werden. Die Farbumschläge mit glucosehaltigen Lösungen (z. B. Blut, Harn oder AO Serum) werden nach kurzer Zeit abgelesen und sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:

Indikator I	Iridikator- konzentration %	Modifier II	Modifier- konzentration la	Gelöst in	Farbreaktion je nach Glucosekonzentralion
A	0,2				grün (abgestuft)
A	0,15	o-Aminophenol- p-sulfonsäure	0,2	Wasser	gelb-grüh
A	0,2	(l-Aminonaphthol-8)- 2,4-disulfonsäure	0,2	Wasser	gelbgrün- grau rosa
A	0,3 '	(7-Aminonaphthol-1 )- 3,6-dinatriumsulfonat	0,05	Wasser	rosa-grün
A	0,3	Naphthylamin(I)- sulfonsäure(6)	0,05	n/50-Natronlauge	rosa-grün
A	0,3	Naphthylamin(I)- sulfonsäure(8)	0,1	Dimethyl formamid	rosa-grün
A	0,3	p-Aminosalicylsiiure	0,1	Methanol	grün-violett
A	0,3	o-Aminophenol	0,01	Methanol	gelb-grün
A	\ 0,3	m-AminophenoI	0,007	Wasser	rot-braunrot
A	0,3	p-Fhenetidin	0,05	Methanoi	violett-grün
A	0,15	2-Hydroxy-4-amino- 4'-rnethoxy-diphenylamin	0,15	n/50-Natronlauge	grün-grau

1 648 8 Λ

Fortsetzung

'IniIikiitKr I

E E F F G

ItKlikiin»- koii/eiilniliim

0.3

0.01 0.01 0,01 0,01

0,1

0,3

0,3 0,3 0,3 0,3 0,2

0,2

0,3 0.3

0.2 0,2

0.3

0,3

Motlilier Il

ii-Naphtholsulfonsiiure(2)

o-Aminophcnolp-sulfoiisiiurc

(l-Aminpn:iphthol-K)-2.4-disulfonsiture

NaphlIiyIamin(I)-sulfonsäurc(6)

p-Aminosalicylsäurc

p-Aminosaläcylsäurc

p-Aminosalicylsäure p-Aminosalicylsäure

p-Aminosalicylsäurc

p-Aminosalicylsäure

Mocliliurkon/ciilralnm

0.25 0.3

(ieltisl ill

Wasser

n/50-NaOH

Mclhanol Methanol

Methanol

Methanol Methanol Methanol Methanol Methanol

Methanol

Methanol Methanol

Farbreaktion je nach (ilucnKekOii/enlra Iinn

rolvioletldunkelrolvioletl

violett (abges(uii>

gelb-braiinviolctl

grau violettblau

grau viplel I

blau-rot

grün-dunkelgrün

grauvioleitviolclt

rosa

rosa-rotviolell

fliederfarben

rosa-rotviolett

graugrüngrauviolctt

fleischfarbenorange

fliederfarben

hcll-dunkclviolctt

blaß-rosa

rosa-dunkclrosa

blaß-rosa

rosa-rotviolett

5°

Die angegebenen Prozentzahlen beziehen sieh auf die Gesamtmischung: die Verbindungen 1 A bis C werden in Wasser und D bis K in Methanol gelöst.

Beispiel 3 Nachweis von Blut im Harn

Ein Filterpapier wird mit einem 0,1 molaren Phosphatpuffer vom pH 7,0, in dem 1% organisches Natriumsulfonat gelöst ist, imprägniert und getrocknet. Danach wird das imprägnierte Papier mit einer wäßrigen Lösung des Indikatorgemisches (0.03" „ 2,2'-Azino-di-[l -äthylchinolin-sulfonsäuren)] und O l⁰ ₀ o-Aminophenol-p-sulfonsäure) nochmals imprägnicrt und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Papier einen Tropfen eines bluthaltigen Urins und einen Tropfen 3%iges Wasserstoffperoxid, so färbt sich das Testpapier noch bei einer Verdünnung von 1:50000 rot violett. Nimmt man statt <·5 o-Arninophenol-p-sulfonsäure, l-Amino-8-naphthol-2.4-disulfonsaure.'so färbt sich das Papier noch bei einer Verdünnung von 1 : 50 000 blauviolett. B c i s ρ i c I - 4

Nachweis von Hydroperoxiden in Flüssigkeiten

Ein Filterpapier wird mit 50 ml eines 0,1 molaren Phosphatpufifers vom pH 6,0, in dem 25 mg Peroxidase und 0.25 ml organisches Natriumsulfonat gelöst sind, imprägniert und getrocknet. Danach wird das Papier mit einer Lösung von 0,01 g 2.2'-Azino-di-[l-äthylchinolin-sulfonsäure(6)] und 0.1 g o-Aminophenolp-sulfonsäure in 100 ml Wasser imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Tcstpapicr einen Tropfen einer wäßrigen HydrOperoxidlösung. so zeigt das Papier noch bei einer Konzentration von 0,2 ·/ml eine rotviolette Färbung.

Beispiel 5 Nachweis von Glucose in Flüssigkeiten

Jeweils 0.01ml von Glucoselösungen mit Konzentrationen von O bis 300 mg" „ werden 711 2 m! einer wäßrig-niethanolischcn 0.00125molaren Indikatorlösung von äquimolareiiMengen 2.2'-A/ino-di-[3-äthyl-

Claims

benzthia/,olon-sulfonsäurc(6)"J und p-Aminosalicylsäurc pipettiert. Hierzu gibt man 2 ml einer Lösung von IO mg Pcroxidiise und 20 mg Glucoscoxidasc in I(X) ml eines O.Smohiren Pliosphiitpuffers vom pH 5,7, schüttelt um, mißt bei einer Wcllenliinge von 490 nm und berechnet mit Hilfe einer Eichkurvc die entsprechenden Glueosewerte.

Verwendet man als Indikatorgemisch 2,2'-Azinodi-[ I -üthylchinolin-sull'onsäurc(6)] und m-Amiiiophciiol. so liegt das Absorptionsmaximum bei 510 nm. iu

I) e i s ρ i e I 6 Ein gemäß Beispiel I hergestellter Rcagcnzhlm, der 0,02",',, 2.2'-Azino-di-| I •älhylchinolin-sulfonsäure(6)] und 0,3",ι 2.2'-Azino-di-[3-äthylbeiizihia- zolon-sulfonsäurc(it)] als Indikatorgcmisch enthält, verfärbt sich mit steigender Glucosckonzcnlration von Violett nach Grün; dieser Farbumschlag läßt sich gut beobachten, du das menschliche Auge auf Änderungen in diesem Farbbcrcich empfindlich reagiert.

Patentansprüche:

I. Verfahren zum Bestimmen von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Frei- sctzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen, wie Hämoglobin, mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mil Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formel I

Γ Ij V = N - N = C' |i (I) V v_N/ ; N C

! I

R₁ R. Ki

in der R₁ eine niedere Alkylgruppe. R₂ Wasser-

stoff, eine Sulfoiisiiuregriippe oder cine Alkalisulfonatgruppe. R, Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe, X ein Schwefelatom, eine Vinylene oder eine Iminogruppe, die gegebenenfalls durch niedere Alkylreste oder Arylrcste substituiert ist,

Y ein Slicksloffatom oder eine Methingruppe, welche auch zusammen mit R, einen durch R₂ substituierten Benzolring bildet, bedeutet, verwendet werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich eine Substanz der allgemeinen Formel Π

V. ,V

V/

w Ήν

in welcher Ar einen Heiizol- oder Naphllialiiikern. V eine Hydroxy!- oder Aininogiuppe.

V Wasserstoff oder cinu gegebenenfalls alky-Iierte oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe. W eine Amino-. Alkoxy-. Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsiiureyruppe und W' Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsätiregruppe bedeutet sowie gegebenenfalls deren Alkaüsalze. verwendet wird.
3. Diagnostisches Mittel zum Bestimmen von Hydroperoxideii bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidase oder einer peroxida'isdi wirksamen Substanz und einem Chromocen, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen eine Substanz der Formel I ist.
4. Diagnostisches Mittel zum Bestimmen von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen, bestehend aus Hydropeioxkl oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Clironiogen. dadurch gekennzeichnet, daß das (,■Iironiogeii eine Substanz der !•Orinel I ist.
5. Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 3 oder 4. dadurch gekennzeichnet, daß der Substanz der Formel I eine Substanz der Formel II zugegeben ist.

C09 638 177