DE2640211C3 - Prüfvorrichtung zum Nachweis peroxidativ wirksamer Substanzen - Google Patents

Prüfvorrichtung zum Nachweis peroxidativ wirksamer Substanzen

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Description

(D
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in der
R1 ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkyl-,
Hydroxy- oder Thiophenylgruppe,
R2 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkyl-
gruppe,
R3 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe,
R4 ein Wasserstoffatom, eine Carboxy-, niedere
Alkyl- oder niedere Alkoxygruppe und
R5 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe ist,
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als Verstärkungsmittel enthält, dadurchgekennzeichnet, daß das Verstärkungsmittel als wasserlösliches Säureadditionssalz oder Addukt einer Mineralsäure oder einer organischen Säure aus der Gruppe Citronensäure, Malonsäure, Sulfosalicylsäure und Weinsäure vorhanden ist und dadurch hergestellt ist, daß die Matrix zunächst mit einem wäßrigen Gemisch, enthaltend mindestens ein Oxidationsmittel und das genannte Säureadditionssalz oder Addukt, imprägniert und anschließend getrocknet wird und die getrocknete Matrix mit einem zweiten Gemisch, enthaltend mindestens einen Indikator und ein organisches Lösungsmittel, imprägniert und erneut getrocknet wird.
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Der Nachweis kleiner Mengen peroxidativ wirksamer Substanzen, wie okkultem Blut, Hämoglobin, Myoglobin, Leukozyten und Bakterien usw. in Körperflüssigkeiten und Exkrementen wurde seit langem als unerläßliche Hilfe für den medizinischen Praktiker zur Diagnose verschiedener krankhafter (abnormer) Zustände angesehen. Zum Beispiel findet sich Blut im Mageninhalt, im Erbrochenen, im Urin und im Stuhl bei Krankheitszuständen, die oft verbunden sind mit einer Erosion der Schleimhautmembranen des Magens und Darms. Im Urin kann das Vorhandensein peroxidativ wirksamer Substanzen ein Zeichen für Erkrankungen wie Typhus, Skorbut, Purpura, Pyämie, Nephritis, Verbrennungen dritten Grades, karzinogene Zustände, Erkrankungen und Infektionen des Harnsystems, hämolytische Toxine und Zustände nach einem Herzinfarkt sein. Da peroxidative Substanzen üblicherweise in Köiperflüssigkeiten und Exkrementen nicht in makroskopischen Mengen vorhanden sind, ist es häufig schwierig, das Vorhandensein dieser Substanzen nur durch klinische Verfahren allein schnell nachzuweisen, selbst durch mikroskopische Untersuchungen. Daher wird es als äußerst wünschenswert angesehen, einen empfindlichen, schnellen und zuverlässigen Test für derartige Substanzen zur Verfügung zu haben.
In der Literatur sind verschiedene Verfahren, Mittel und Vorrichtungen zum Nachweis von okkulten, peroxidativ wirksamen Substanzen beschrieben. Zum Beispiel sind in den US-PS 22 90 436,27 99 660,28 38 377, 30 12 976, 30 92 463 und 30 92 464 verschiedene Prüfmittel beschrieben, die angewandt wurden, um einen einfachen und zuverlässigen Test für okkultes Blut zu ermöglichen. Diese Prüfmittel beruhen auf der peroxidativen oder katalytischen Aktivität der prosthetischen Gruppe, die im Blut vorhanden ist. Die peroxidativ wirksamen Substanzen, die in Hämoglobin identifiziert worden sind, gehören zu der allgemeinen Gruppe der Hämoproteine, konjugierte Proteine, die alle die gleiche prosthetische Gruppe besitzen, nämlich Eisenprotoprophyrin oder Häm. Diese prosthetische Gruppe besitzt die Fähigkeit, die Übertragung von Sauerstoff von einer Sauerstoffquelle an einen Akzeptor zu katalysieren, der oxidiert wird. Wenn der Akzeptor eine Farbstoffvorstufe ist, die bis sie oxidiert wird farblos und in der oxidierten Form gefärbt ist, wird das Vorhandensein einer peroxidativ wirksamen Substanz durch die Farbentwicklung angezeigt. Die Schnelligkeit der Farbänderung und die Tiefe oder Intensität der Farbe ist, wenn sie mit einer Reihe von Standards verglichen wird, dann ein Maß für die quantitative Abschätzung des vorhandenen Blutes.
Obwohl die oben beschriebenen Mittel geeignet sind zum schnellen Nachweis von okkultem Blut, sind sie verhältnismäßig unempfindlich besonders gegenüber sehr geringen Mengen von peroxidativ wirksamen Substanzen, entsprechend Blutverdünnungen von weniger als etwa 1 : 20 000, d. h. ungefähr 200 bis 300 intakten roten Blutkörperchen pro &mgr;&idiagr; Probe (RBC/&mgr;&Igr;). In der US-PS 3290 117 ist angegeben, daß die Empfindlichkeit dieser Prüfmittel zum Nachweis von okkultem Blut deutlich verbessert und potenziert werden kann durch Zugabe von Chinolin oder bestimmten Chinolinderivaten, wie Chinin. Durch Zugabe dieser Chinolinderivate zu den bekannten Mitteln zur Bestimmung von okkultem Blut ist es möglich, 5 bis 50 RBC/&mgr;&Igr; Probe nachzuweisen entsprechend einer so hohen Blutverdünnung wie 1 : 1 000 000. In der US-PS 38 53 472 ist die Verwendung kondensierter polycyclischer Derivate von Chinolin als Potentierungs- oder Aktivierungsmittel unter Erreichung ähnlicher Empfindlichkeiten angegeben.
In Zeitschrift für gerichtliche Medizin, Bd. 12, 1928, S. 216 werden Testlösungen zum Nachweis von Blut beschrieben die Chinolin, H2O2, Essigsäure und Benzidin als Indikator enthalten. Diese Lösungen sind zur Herstellung von Prüfvorrichtungen in Form von Teststreifen ungeeignet.
Viele der bekannten empfindlichen Prüfmittel sind aufgrund der Flüchtigkeit der zugesetzten Verstärkungsmittel bei Raumtemperatur oder leicht darüber liegenden Temperaturen instabil. Außerdem werden bei nahezu allen bekannten Mitteln Verstärkungsmittel angewandt, die in Wasser unlöslich sind und in organischen Lösungsmitteln suspendiert werden müssen,
bevor sie in ein Prüfmittel eingebaut werden. Zum Beispiel werden nach der US-PS 32 90 117 die bekannten Verstärkungsmittel in einem organischen Lösungsmittel, enthaltend die Indikatoren, suspendiert bzw. gelöst Dadurch werden die Indikatoren in Gegenwart dieser Verstärkungsmittel häufig schnell verfärbt und müssen verworfen werden.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Prüfmittel zur Verfügung zu stellen, die nicht nur schnelle Ergebnisse liefern und sehr empfindlich sind, sondern auch ihre Empfindlichkeit, ohne daß eine Verfärbung des Indikatorsystems eintritt, sowohl bei der Herstellung als auch bei längerer Lagerung, beibehalten.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Prüfvorrichtung zum Eintauchen und Ablesen für den Nachweis peroxidativ wirksamer Substanzen in Körperilüssigkeiten, Exkrementen und ähnlichem, insbesondere zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von okkultem Blut, bestehend aus einer Matrix, die einen Indikator, der in Gegenwart einer peroxidativ wirksamen Substanz unter Eintritt einer Farbänderung oxidiert wird, ein Oxidationsmittel, das den Indikator oxidieren kann und ein Chinolinderivat der allgemeinen Formel
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in der
(D
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R1 ein Wasserstoflätom, eine niedere Alkyl-, Hydro-
xy- oder Thiophenylgruppe,
R2 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkyl-
gruppe,
R3 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkyl-
gruppe,
R4 ein Wasserstoffatom, eine Carboxy-, niedere Alkyl-
oder niedere Alkoxygruppe und
R5 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe ist,
als Verstärkungsmittel enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Verstärkungsmittel als wasserlösliches Säureadditionssalz oder Addukt einer Mineralsäure oder einer organischen Säure aus der Gruppe Citronensäure, Malonsäure, Sulfosalicylsäure und Weinsäure vorhanden ist und dadurch hergestellt ist, daß die Matrix zunächst mit einem wäßrigen Gemisch, enthaltend mindestens ein Oxidationsmittel und das genannte Säureadditionssalz oder Addukt, imprägniert und anschließend getrocknet wird und die getrocknete Matrix mit einem zweiten Gemisch, enthaltend mindestens einen Indikator und ein organisches Lösungsmittel, imprägeniert und erneut getrocknet wird.
Da die erfindungsgemäß zu verwendenden Verstärkungsmiüei, d. h. die Säureacditionssaize bzw. Addukte von bestimmten Chinolinen wasserlöslich sind, erfolgt die Herstellung des Prüfmittels in zwei Stufen wobei, wie in Beispiel 1 ausführlich gezeigt, in der ersten Stufe zunächst die Matrix mit einer wäßrigen Lösung, welche das Verstärkungsmittel enthält, imprägniert und erst in einer zweiten Stufe eine zweite und diesmal organische Imprägnierlösung, die den Indikator enthält, aufgebracht wird. Dadurch werden eine unerwünschte Verfärbung des Indikators bei der Herstellung und damit verbundene Ungenauigkeiten bei der Anwendung mit Sicherheit und auf einfache Weise vermieden. Außerdem sind die erfindungsgemäßen Prüfmittel besser lagerbeständig als die bekannten.
Die Verbindungen, die sich erfindungsgemäß als geeignet erwiesen haben, umfassen die Säure-Salze oder Addukte der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit den meisten Mineralsäuren oder den oben genannten organischen Säuren, vorausgesetzt, daß die Säure mit den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) unter Bildung eines Produktes, d. h. des wasserlöslichen Säure-Salzes oder Adduktes reagieren kann. Geeignete Mineralsäuren, die ein Addukt bilden können, sind unter anderem Salzsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und ähnliche. Die organischen Säuren sind Zitronensäure, Malonsäure, Sulfosalicylsäure und Weinsäure. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), die für die erfindungsgemäßen Mittel besonders geeignet sind, umfassen die Säure-Salze oder Addukte von in 4-, 6- oder 7-Stellung substituiertem Chinolin. Geeignete Mittel enthalten z. B. die Säuresalze oder Addukte von Chinolin 6-Methoxychinolin, 6-Methylchinolin, 7-Methylchinolin, 2,6-Dimethylchinolin und 4,6-Dimethylchinolin. Bevorzugte Mittel enthalten die: sauren Salze oder Addukte von Chinolin selbst und 6-Methoxychinolin. Andere geeignete Verbindungen sind Chinolinsulfat, 6-Methoxychinolinsulfat, 6-Methoxychinolinhydrochlorid, 6-Methoxychinolinphosphat, 6-Methoxychinolinmalonat, 6-Methoxychinolinsulfosalicylsäure und 6-MethoxychinolinweinsäuresaIz.
Die oben beschriebenen Säure-Salze sind entweder im Hände! erhältlich oder können leicht aus im Handel erhältlichen Substanzen hergestellt werden. Zum Beispiel können die Säure-Salze oder Addukte bequem hergestellt werden, indem man eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) in einem organischen Lösungsmittel, wie Äthanol, suspendiert und dazu eine ausreichende Menge einer der oben erwähnten Mineralsäuren oder organischen Säuren zusetzt. Es entsteht nahezu sofort ein starker Niederschlag des Säuresalzes oder Addukts. Der Niederschlag wird dann von dem organischen Lösungsmittel abgetrennt, wieder in neuem Lösungsmittel suspendiert, um überschüssige Säure auszuwaschen, erneut abgetrennt und getrocknet. Die so hergestellten Säuresalze oder Addukte können leicht durch übliche Verfahren identifiziert werden und ihre scharfen Schmelzpunkte zeigen, daß sie ohne weitere Reinigung verwendet werden können.
Geeignete Indikatoren sind solche, die in Gegenwart einer peroxidativ wirksamen Substanz unter Eintritt einer Farbänderung oxidiert werden können, und umfassen bekannte Substanzen wie o-Tolidin, o-Toluidin, p-Toluidin, o-Phenylendiamin, N,N'-Dimethyl-p-phenylendiamin, N,N'-Diäthyl-p-phenylendiamin, Benzidin, p-Anisidin, Dianisidin, o-Kresol, m-Kresol, ar-Naphthol,7?-Naphthol, Catechol, Guajacol, Pyrogallol oder solche der heterocyclischen Reihe z. B. Bis-(N-äthylchinol-2-on-)-azin oder (N-Methylbenzthiazol-2-on)-(l -ätriyl-j-phenyI-5-methriazol-2-on)-azin. Als Oxidierungsmittel können z. B. Cumolhydroperoxid, Diisopropylbenzolhydroperoxid, Paramethanhydroperoxid, 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid und andere bekannte Oxidationsmittel angewandt werden, die die Indikatoren oxidieren können.
Die durch die oben erwähnten Säureadditionssalze bzw. Addukte verbesserten Prüfmittel sind erfindunss-
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gemäß auf einer oder in eine Matrix eingebaut und werden in Form einer Prüfvorrichtung zum Eintauchen und Ablesen angewandt. Matrices, die angewandt werden können, umfassen Papier, Cellulose, HcJz, Bahnen aus synthetischen Harzen, Glasfaserpapier, Polypropylenvliesstoff, andere gewebte oder gefilzte Stoffe und ähnliches. Die Herstellungsart besteht darin, die Matrix in zwei getrennten Stufen zu imprägnieren. Die Matrix wird zunächst mit einem wäßrigen Gemisch imprägniert, enthaltend mindestens ein Oxidationsmittel und das Säuresalz oder Addukt der allgemeinen Formel (I) und anschließend getrocknet. Die getrocknete Matrix wird dann mit einem zweiten Gemisch imprägniert, enthaltend mindestens einen Indikator und ein organisches Lösungsmittel, und erneut getrocknet Die so hergestellte getrocknete imprägnierte Matrix wird vorteilhaft zur leichteren Anwendung an einem Träger befestigt.
Neben den oben angegebenen Bestandteilen des Prüfmittels, die aktiv an der Testreaktion teilnehmen, können in dem erfmdungsgemäßen Prüfmittel oder der Vorrichtung auch weitere Bestandteile, wie Verdikkungsmittel, Netzmittel, Puffer, Emulgatoren und andere bekannte Zusätze vorhanden sein. Zum Beispiel können als Verdickungsmittel verschiedene Substanzen, wie Gelatine, Algin, Carragenin, Casein, Albumin, Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon und ähnliches angewandt werden. Als Netzmittel wird vorzugsweise Natriumlaurylsulfat angewandt, aber es können auch andere langkettige organische Sulfate oder Sulfonate angewandt werden, wie Dioctylnatriumsulfosuccinat oderNatriumdodecylbenzolsulfonat. Als Puffersysteme sind unter anderem Tartrat-, Phosphot-, Phthalat-, Zitrat-, Acetat- oder Succinatpuffer geeignet. Vorzugsweise wird das Prüfmittel auf einen pH-Wert von ungefähr 4,0 bis 7,0 gepuffert. Als Emulgatoren kommen unter anderen Polyvinylalkohol, Gummi arabicum, Carboxyvinylpolymere und ähnliches in Frage. Die organischen Lösungsmittel, die geeignet sind den Indikator zu suspendieren, umfassen die meisten nicht reagierenden flüchtigen Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylendichlorid, Benzol, Äthylacetat und ähnliche.
Bei der Anwendung wird die imprägnierte Matrix der Prüfvorrichtung in die Flüssigkeit oder flüssige Suspension der nachzuweisenden Substanz eingetaucht und sofort daraus entfernt. In Gegenwart einer peroxidativ wirksamen Substanz ergibt das Prüfmittel eine positive Farbreaktion. Die entstehende Farbe wird dann mit vorher hergestellten und geeichten Farbstandards verglichen zur Abschätzung der quantitativen Mengen an peroxidativ wirksamer Substanz in der Probe. Intakte peroxidativ wirksame Substanzen, wie intakte rote Blutzellen, erscheinen als Punkte oder Flecken auf der sonst nicht gefärbten Matrix. Hämolysierte peroxidativ wirksame Substanzen färben die Matrix einheitlich und können leicht von intakten peroxidativ wirksamen Substanzen unterschieden werden. Neben dem visuellen Vergleich können verschiedene instrumenteile Verfahren angewandt werden, um die Art der entwickelten Farben zu bestimmen, wodurch die Genauigkeit des Test
Farben durch das menschliche Auge vermeidet.
Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen verbesserten Prüfmittel und Vorrichtungen nicht nur stabil, sondern auch hoch empfindlich sind. Sie sind geeignet zum Nachweis selbst von einzelnen intakten peroxidativ wirksamen Substanzen in so geringen Konzentrationen wie 5 bis 50 RBC/&mgr;&idiagr; Probe, entsprechend einer so hohen Blutverdünnung wie 1 :1 0Ü0 000. Diese hohe Empfindlichkeit der Prüfmittel enthaltend die Säuresalze oder Addukte der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) war nicht vorherzusehen. Aufgrund der Wasserlöslichkeit der Säuresalze oder Addukte der Verbindung der allgemeinen Formel (I) lassen sich von diesen Verbindungen wäßrige Lösungen herstellen. Auf diese Weise kann bei der Herstellung der Prüfmittel ein direkter Kontakt in Lösung mit dem Indikator, der ein organisches Lösungsmittel erfordert, um in Lösung zu gehen, vermieden werden. Dadurch kann die Gefahr der Verfärbung des Indikatorsystems wesentlich verringert werden. Die erfindungsgemäßen Prüfmittel sind daher sehr viel zuverlässiger als die bekannten.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Dieses Beispie] beschreibt ein typisches Verfahren zur Herstellung eines Säuresalzes oder Adduktes von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und den Einbau eines verbesserten Prüfmittels in einen Träger.
5 g Chinolin wurden in ungefähr 50 ml absolutem Äthanol suspendiert. Zu dieser Lösung wurden dann 2 ml konzentrierte Schwefelsäure unter Mischen zugegeben. Es entstand sofort ein reichlicher weißer Niederschlag, der von dem Lösungsmittel abfiltriert wurde. Der Niederschlag wurde in neuem Äthanol suspendiert, wieder abgetrennt und getrocknet. Das so gewonnene Material war Chinolinsulfat, Fp. 13O0C.
Die folgenden Bestandteile wurden nacheinander vermischt, um eine erste Imprägnierlösung zu erhalten.
50 Bestandteil
Menge
(1) Gummi arabicum
(2) Gelatine
(3) Natriumlaurylsulfat
(4) Cumolhydroperoxid
(5) Natriumeitrat
(6) Zitronensäure, wasserfrei
(7) Chinolinsulfat
(8) destilliertes Wasser
pH des Gemisches
15 g
0,5 g
1,0 g
3,0 ml
8,92 g
1,86 g
0,75 g
auf 100,0 ml
4,8
Whatman 3MM-Filterpapier wurde mit der Lösung imprägniert und bei einer Temperatur von ungefähr 100°C getrocknet. Das trockene Papier wurde dann in eine zweite Imprägnierlösung, bestehend aus 0,4 g o-Tolidin, in 100 ml Chloroform getaucht und 5 bis 10 min bei einer Temperatur von ungefähr 500C getrocknet. Das imprägnierte Papier, das weiß bis cremefarben war, wurde in Quadrate von ungefähr 5x5 mm geschnitten, die dann jeweils an einem Polystyrolträgerstreifen befestigt wurden, um eine Prüfvorrichtung zu erhalten.
Um die Empfindlichkeit des Prüfmittels zu untersuchen, wurde der Matrixteil der entstehenden Prüfvorrichtung augenblicklich in Ur'nnrnhen getaucht und daraus entfernt, die verschiedene Mengen an intakten roten Blutzellen enthielten. Es zeigte sich, daß das Prüfmittel mit intakten roten Blutzellen unter Bildung grün bis blauer Flecken auf dem imprägnierten Papier reagierte und damit eine positive Reaktion anzeigte. Dieses Prüfmittel erwies sich empfindlich bis heran zu einer Menge von 2 bis 5 intakten Blutzellen pro &mgr;&idiagr; Urin, ent-
7
sprechend einer Blutverdünnung von 1:1 000 000. Ahnlich hergestellte Prüfmittel erwiesen sich als ähnlich empfindlich gegenüber hämolysierten Blutzellen, reagierten in diesen Fällen jedoch durch eine gleichmä- i
ßige Verfärbung des imprägnierten Papiers. 5 *
Beispiel 2 i
Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zur Herstellung des Sä.uresalzes oder Adduktes wurde 6-Methoxychinolin in Äthanol suspendiert und mit 50 ml Äthanol, enthaltend 7 g Sulfosalicylsäure, vermischt. Der entstehende Niederschlag wurde auf ähnliche Weise abgetrennt, gewaschen und getrocknet. Die gewonnene Substanz: wurde identifiziert als 6-Methoxy- !5 i
chinolinsulfosalicylüäuresalz, Fp. 2250C. f
Verbesserte Prüfmittel wurden dann entsprechend Beispiel 1 hergestellt, wobei anstelle des Chinolinsulfats 0,75 g o-Methoxychinolinsulfosalicylsäuresalz verwendet wurde. Die Empfindlichkeit gegenüber intakten roten Blutzellen und hämolisiertem Blut der Prüfvorrichtung, enthaltend dieses Prüfmittel, erwies sich als in der gleichen Größenordnung wie diejenige des Prüfmittels nach Beispiel 1.
25
Beispiel 3
Entsprechend Beispiel 1 wurden Prüfmittel hergestellt unter Ersatz des Chinolinsulfats durch eines der im folgenden angegebenen Säuresalze oder Addukte:
Säuresalz oder Addukt Fp.
ö-Methoxychinolin-liydrochlorid 212°C 3S
o-Methoxychinolin-phosphat 180°C
6-Methoxychinolin-irnalonat 116°C
o-Methoxychinolin-weinsäuresalz 1050C
6-Methoxychinolin-sulfat 2150C
6-Methylchinolin-sulfat 93°C
7-Methylchinolin-sulfat 92°C
Die Empfindlichkeit gegenüber intakten roten Blutzellen und hämolysiertem Blut der Prüfvorrichtungen, enthaltend die entsprechenden Prüfmittel, war in der gleichen Größenordnung wie diejenige der Prüfvorrichtung nach Beispiel 1.
50
55
60

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Prüfvorrichtung zum Eintauchen und Ablesen für den Nachweis peroxida iv wirksamer Substanzen in Korperflüssigkeiten, Exkrementen und ähnlichem, insbesondere zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von okkultem Blut, bestehend aus einer Matrix, die einen Indikator, der in Gegenwart einer peroxidativ wirksamen Substanz unter Eintritt einer Farbänderung oxidiert wird, ein Oxidationsmittel, das den Indikator oxidieren kann und ein Chinolinderivat der allgmeinen Formel
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