DE3586336T2

DE3586336T2 - Triarylmethan-leukofarbstoffe enthaltende zusammensetzungen und elemente und verfahren zur verwendung derselben.

Info

Publication number: DE3586336T2
Application number: DE8585303521T
Authority: DE
Inventors: Bruce Edward Babb; Daniel Salman Daniel
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1984-05-21
Filing date: 1985-05-20
Publication date: 1993-02-11
Anticipated expiration: 2005-05-21
Also published as: JPS60256056A; EP0162685B1; EP0162685A2; US4670385A; EP0162685A3; DE3586336D1; CA1223512A

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Zusammensetzung, ein Element und ein Verfahren unter Verwendung eines besonderen Leucofarbstoffes zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid oder einem anderen Analyten, der bei der Analyse von Flüssigkeiten, z.B. biologischen Flüssigkeiten unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid reagiert. Die Erfindung ist besonders für die klinische Chemie geeignet.
Die Erkennung oder quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid in Verbindungen, die Wasserstoffperoxid als Folge von chemischen oder enzymatischen Reaktionen liefern, ist auf vielen Gebieten von Bedeutung. Beispielsweise sind sie von Bedeutung bei der Erkennung oder Ermittlung von Wasserstoffperoxid, das bei enzymatischen Bestimmungen von chemischen oder biologischen Substanzen erzeugt wird (gelegentlich als Analyten bezeichnet), wie beispielsweise Glucose, Cholesterin, Harnsäure, Triglyceriden, Creatinkinase und dgl. in Gegenwart von Sauerstoff. Die Menge an Analyten, der in einer Probe vorhanden ist, ist aus der Menge an Wasserstoffperoxid, die entwickelt wird, bestimmbar.
Bekannte Zusammensetzungen zur Ermittlung oder quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid bei solchen Methoden, umfassen im allgemeinen eine Substanz mit peroxidativer Aktivität, z.B. Peroxidase, sowie ein Material, das einer erkennbaren Veränderung unterliegt (z.B. einer Farbveränderung) in Gegenwaft von Wasserstoffperoxid und der peroxidativen Substanz. Zu den verschiedenen Materialien, die einer solchen erkennbaren Veränderung unterliegen, gehören Monoamine, Diamine, Phenole, Leucofarbstoffe und andere bekannte Farbstoffe oder Farbstoffbildner. Triarylmethanfarbstoffe und ihre Leucovorläufer sind auch als kommerziell verwendbare Verbindungen bekannt. Triarylmethanfarbleucofarbstoffe zum Beispiel sind bekannt als geeignete Indikatoren von Wasserstoffperoxid. Zu Beispielen von solchen Leucofarbstoffen gehören die folgenden Verbindungen: Leucomalachitgrün, Leucokristallviolett, Leuconaphthalingrün V, und Leucoform von Säure #3040.
Es hat sich jedoch gezeigt, daß solche Leucofarbstoffe leicht an der Luft oder in wäßrigen Lösungen mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität oxidieren (siehe z.B. das folgende Beispiel 1). Diese Instabilität macht sie ungeeignet für analytische Bestimmungen und insbesondere für die Durchführung trockener Bestimmungen, in welchem Falle die analytischen Zusammensetzungen für eine Zeitspanne vor ihrer Verwendung aufbewahrt werden.
Obgleich andere Farbstoffe liefernde Materialien die gewünschte Stabilität aufweisen und im allgemeinen als Indikatoren für Wasserstoffperoxid-Bestimmungen geeignet sind, liegen doch Fälle vor, in denen die Konzentration an Wasserstoffperoxid, das zu analysieren ist, zu gering ist, um eine ausreichend bestimmbare Farbe von solchen Indikatoren zu erzeugen. In manchen Fällen läßt sich dieser Nachteil beheben durch Verwendung erhöhter Mengen an Indikator. Ist jedoch die Analytkonzentration anfangs niedrig oder ist eine starke Verdünnung der Testprobe erforderlich, so sind derartige Indikatoren trotzdem nachteilig, da sie in solchen Fällen einen unzureichenden bestimmbaren Farbton liefern.
Derartige Probleme der Instabilität und geringen Analytkonzentration sind besonders akut, wenn eine Analytbestimmung unter Verwendung eines trockenen analytischen Elementes erfolgen soll, beispielsweise mit den in der Praxis erfolgreichen Elementen, die in der US-Patentschrift 3 992 158 beschrieben werden. In solchen Fällen ist die Indikator- oder Reagensschicht die in solchen Elementen vorhanden ist, notwendigerweise sehr dünn und die Farbstoffkonzentration relativ niedrig. Infolgedessen kann die Dichte des erzeugten Farbstoffes niedrig sein, sogar im Falle von hohen Analytkonzentrationen. Wünschenswert wäre es jedoch, wenn solche Elemente auch bei sehr niedrigen Analytkonzentrationen eingesetzt werden könnten.
Die US-A-Patentschrift 4 407 960 beschreibt Michler's Hydrolleucobenzotriazol als geeignet in Ethanol oder Aceton als Indikator der Sterilisation. Wünschenswert wäre es, wenn Leucofarbstoffe zur Verfügung stünden, die in wäßrigen Systemen verwendet werden könnten, die dazu eingesetzt werden können, um Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase zu bestimmen.
Die im vorstehenden angegebenen Probleme werden gelöst durch Verwendung einer Zusammensetzung für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid in einer wäßrigen Flüssigkeit mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität.
Die Zusammensetzung ist gekennzeichnet dadurch, daß sie einen tri-substituierten Methanleucofarbstoff der folgenden Struktur (I) enthält:
hierin bedeuten: R = Furyl, Thienyl, Selenophenyl, Pyridyl, Pyrindinyl, Pyrimidyl, Triazinyl, Thiazolyl, Oxyzolyl, Selenazolyl, Pyranyl, Pyrazinyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Tetrazinyl, Pyridazinyl, Chinazolinyl, Acridinyl, Benzothiazolyl, Chinoxalinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Pteridinyl, Phenazinyl, N-Methylpyrrol, N-Methylindol, N- Methylimidazol und N-Methylbenzimidazol, wobei jeder Rest substituiert oder unsubstitutiert sein kann,
R' und R" unabhängig voneinander offenkettige oder cyclische Amine und
X, X', Y und Y' unabhängig voneinander Wasserstoff, kurzkettiges Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, kurzkettiges Alkoxy mit 1 bis 4 Atomen, Halo oder Amino.
Der Leucofarbstoff liefert einen Farbstoff mit einer maximalen Absorption bei einer Wellenlänge gleich oder größer als 600 nm bei Einwirkung von Wasserstoffperoxid. Der zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Farbstoff kann als ein Triarylmethanleucofarbstoff beschrieben werden, der einen aromatischen heterocyclischen Rest aufweist, der an das zentrale Methankohlenstoffatom gebunden ist.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein trockenes analytisches Element für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid in einem Analyten, der unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid reagiert. Ein solches Element weist eine Substanz mit peroxidativer Aktivität auf und einen Triarylmethanleucofarbstoff wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben.
Ein Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid oder eines Analyten, der unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid reagiert in einer Flüssigkeit, umfaßt die Stufen:
A. Physikalisches Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und des oben beschriebenen Leucofarbstoffes und
B. Bestimmung des erhaltenen Farbstoffes bei einer Wellenlänge gleich oder größer als 600 nm.
Die vorliegende Erfindung verwendet eine besondere Klasse von Leucofarbstoffen, die in unerwarteter Weise stabil gegenüber Oxidation an der Luft sind sowie in Gegenwart einer peroxidativen Substanz, die jedoch in vorteilhafter Weise dazu verwendet werden können, um geringe Mengen an Wasserstoffperoxid oder von Analyten zu ermitteln, welche unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid sowohl in Lösung als auch bei trockenen Bestimmungen reagieren.
In vorteilhafter Weise haben Farbstoffe, die von diesen Verbindungen erhalten werden, eine maximale Absorption bei oder über 600 nm, wodurch potentielle spektrale Störungen vermieden werden, die häufig bei biologischen Flüssigkeiten auftreten. Diese Verbindungen sind besonders geeignet für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid, das bei einer oder mehreren (d.h. gekuppelten oder nicht gekuppelten) enzymatischen Reaktionen auftreten, unter Ansprechen auf einen Analyten, wie z.B. Glucose, Galactose, Aminosäuren, Harnsäure, Triglyceriden, Creatinkinase, Cholesterin und anderen Analyten.
Die Leucofarbstoffe, die für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, sind Triarylmethanverbindungen, mit einem aromatischen heterocyclischen Rest, der an das zentrale Methankohlenstoffatom gebunden ist. Diese Leucofarbstoffe liefern in Gegenwart von Wasserstoffperoxid Farbstoffe, die eine maximale Absorption bei einer Wellenlänge gleich oder größer als 600 nm aufweisen. Die Leucofarbstoffe können auch zwei Phenylgruppen aufweisen, die an das zentrale Methankohlenstoffatom gebunden sind. Jede Phenylgruppe weist eine Aminogruppe auf (primäre, sekundäre und tertiäre), die an den Phenylring in para-Position gebunden ist. Vorzugsweise ist eine solche Aminogruppe eine tertiäre Aminogruppe.
Im Falle der vorliegenden Erfindung wird ein cyclisches Amin durch folgende Struktur dargestellt:
worin Z die Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- oder Selenatome darstellt, die zur Vervollständigung mit dem angegebenen Stickstoffatom eines 5- bis 15- gliedrigen mono-heterocyclischen Ringes erforderlich sind, wie weiter unten für R¹, R², R³ und R&sup4; angegeben.
Die Leucofarbstoffe, bei denen es sich um die in der Praxis dieser Erfindung bevorzugten Farbstoffe handelt, haben die Struktur (II):
worin R, X, X', Y und Y' die angegebene Bedeutung haben. R kann unsubstituiert sein oder substituiert sein mit einem oder mehreren Substituenten, wie Alkyl (vorzugsweise 1 bis 18 Kohlenstoffatomen), Aryl (vorzugsweise von 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Phenyl oder Xylyl), Alkoxy (vorzugsweise mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, z.B. Methoxy, Propoxy oder n-Pentoxy), Halo (z.B. Fluoro, Chloro, Bromo oder Iodo) Nitro, Cyano, Amino wie für R' und R" beschrieben, Carboxy, Sulfo, Carboxyestern, Carbonylalkyl (vorzugsweise mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, substituiert oder unsubstituiert), Sulfon und Sulfonamid.
Heterocyclische Reste, die nicht geeignet sind, sind solche mit einer -NH-Gruppe im Ring, z.B. solche, die sich ableiten von Pyrrol, Indol, Imidazol oder Benzimidazol. Bevorzugte heterocyclische Reste sind solche, die einen π-Mangel aufweisen, einschließlich Pyridyl, Pyridazinyl, Pyrimidyl, Pyrazinyl, Triazinyl, Tetrazinyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Chinazolinyl, Acridinyl, Chinoxalinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Pteridinyl, Phenazinyl und Pyrindinyl. Besonders bevorzugte R-Gruppen sind 3-Pyridyl und 4-Pyridyl. Bezüglich einer Definition von "π-Mangel" sei verwiesen auf das Buch von A. Albert, Hetercyclic Chemistry, 2. Ausgabe, Univ. London, Athlone Press, Kapitel 4 (insbesondere Seiten 67-70), 1968.
In der oben angegebenen Struktur II stehen R¹, R², R³ und R&sup4; unabhängig voneinander für
substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, vorzugsweise mit 1 bis 14 Kohlenstoffatomen (Methyl, Chlormethyl, Ethyl, n- Propyl, Isopropyl, Hexyl, Decyl und Tetradecyl),
substituiertes oder unsubstituiertes Alkaryl oder Aralkyl, vorzugsweise mit 7 bis 14 Kohlenstoffatomen (z.B. Benzyl, 2-Ethylphenyl, p-Methylbenzyl und Methylnaphthylen),
substituiertes oder unsubstituiertes Aryl, vorzugsweise mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen im aromatischen Kern (z.B. Phenyl, p-Nitrophenyl, Xylyl, Naphthyl und Anthryl) oder
einen aromatischen oder nichtaromatischen heterocyclischen Rest, vorzugsweise mit 5 bis 15 Atomen. Beispiele von aromatischen heterocyclischen Resten sind oben bei der Definition von R angegeben. Beispiele für nichtaromatische heterocyclische Reste sind Piperidinyl, Pyrrolidinyl und Morpholinyl.
Alternativ können R¹ und R² gemeinsam und R³ und R&sup4; gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, für die Atome stehen, die erforderlich sind, um einen substituierten oder nichtsubstituierten heterocyclischen Ring zu vervollständigen, vorzugsweise einen Ring mit 5 bis 15 Atomen (d.h. Kohlenstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Stickstoff-, Selen-Atomen), z.B. Piperidinyl, Morpholinyl, Julolidinyl oder Piperazinyl.
Vorzugsweise stehen R¹, R², R³ und R&sup4; unabhängig voneinander für substituierte oder unsubstituierte kurzkettige Alkyle mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (z.B. Methyl, Chlormethyl, Ethyl oder Hexyl). In besonders vorteilhafter Weise hat R¹ die gleiche Bedeutung wie R³ und R² die gleiche Bedeutung wie R&sup4;. In besonders vorteilhafter Weise hat jede dieser Gruppen die gleiche Bedeutung.
Die Arylringe der Leucofarbstoffe, die oben beschrieben wurden, können weiterhin substituiert sein, gegebenenfalls in den Positionen meta zum zentralen Methankohlenstoffatom, durch ein oder mehrere (bis zu 2 jeweils) Alkyle (1 bis 4 Kohlenstoffatome, substituiert oder unsubstituiert), kurzkettiges Alkoxy (1 bis 4 Kohlenstoffatome, substituiert oder unsubstituiert, z.B. Methoxy oder Ethoxy), Halo (z.B. Chloro oder Bromo), Amino oder andere Gruppen, die im Stande der Technik bekannt sind. Elektronen spendende Gruppe, wie kurzkettige Alkylgruppen und kurzkettige Alkoxygruppen, sind bevorzugt.
Bei Oxidation durch Wasserstoffperoxid und einer Substanz mit peroxidativer Aktivität (z.B. Peroxidase) werden die Leucofarbstoffe in bestimmbare Farbstoffe überführt, die eine maximale Absorption bei oder oberhalb 600 nm aufweisen. Dieses Merkmal ist vorteilhaft deshalb, weil eine Farbstoffbestimmung nicht durch bestimmte spektral störende Stoffe behindert wird, (beispielsweise Hämoglobin oder Bilirubin), die häufig in biologischen Flüssigkeiten vorkommen. Die folgende Gleichung veranschaulicht die Überführung des Leucofarbstoffes in einen positiv geladenen ermittelbaren Farbstoff: Hydrogenperoxid Peroxidase
worin X&supmin; ein geeignetes monovalentes Anion ist (z.B. Halogenid, Perchlorat oder p-Toluolsulfonat).
Repräsentative Leucofarbstoffe sind in Tabelle I unten unter Angabe der Verbindungsstruktur (II), die bereits angegeben wurde, angegeben: Tabelle I Verbindung Tabelle I Forts. gemeinsam * Dieser Leucofarbstoff ist ferner durch eine Methylgruppe an jedem Phenylenring in einer Position meta zum zentralen Methankohlenstoffatom substituiert.
Leucofarbstoffe I und II sind bevorzugt.
Die Leucofarbstoffe, die in der Praxis dieser Erfindung verwendbar sind, lassen sich leicht unter Verwendung von im Handel erhältlichen oder leicht herstellbaren Ausgangsmaterialien herstellen. Sie können hergestellt werden unter Verwendung von Syntheseverfahren, die in der Literatur bekannt sind, z.B. in der US-Patentschrift 3 995 088. Im allgemeinen lassen sich die Leucofarbstoffe der Struktur (II) herstellen durch Umsetzung eines Moles eines Aldehydes der Formel RCHO mit zwei Molen eines Amines oder einer Mischung von Aminen (d.h. 2 Molen von)
wenn R¹ die gleiche Bedeutung hat wie R³ und R² die gleiche Bedeutung wie R&sup4;, oder einer molaren Mischung im Verhältnis 1:1 von
(wenn R¹, R², R³ und R&sup4; verschieden sind) in Gegenwart eines geeigneten Katalysators (z.B. ZnCl&sub2;).
Die analytische Zusammensetzung dieser Erfindung läßt sich sowohl zu Bestimmungen in Lösung wie auch trockenen Elementen verwenden und umfaßt einen Leucofarbstoff, wie oben beschrieben, eine Substanz mit peroxidativer Aktivität und gegebenenfalls, jedoch vorzugsweise, einen Puffer, der einen pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9 in der Zusammensetzung aufrechterhält, wenn diese zu einer Lösungsbestimmung oder Trockenbestimmung eingesetzt wird.
Substanzen mit peroxidativer Aktivität, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen, sind auch als peroxidative Substanzen bekannt und eignen sich dazu, die Oxidation einer anderen Substanz durch Wasserstoffperoxid und andere Peroxide zu katalysieren. Zu derartigen Substanzen gehören natürlich vorkommende und synthetische Peroxidasen, Cytochrome, Hämin, Formen des Hämoglobins, alkalisches Hämatin, Eisensulfocyanat, Eisentannat, Chromisalze und dgl.. Peroxidase ist eine besonders geeignete peroxidative Substanz.
Praktisch jeder Puffer eignet sich zur Bereitung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung. Geeignete Puffer liefern einen pH-Wert in der Zusammensetzung, der der Farbstoffbildung förderlich ist. Im allgemeinen liegt der pH-Wert innerhalb des Bereiches von 4 bis 9, doch hängt ein spezieller pH-Wert in gewissem Ausmaß von dem im Einzelfalle zu bestimmenden Analyten ab. Soll beispielsweise eine Bestimmung von Harnsäure unter Verwendung von Uricase erfolgen, so ist es bevorzugt, die Zusammensetzung auf einen pH-Wert zwischen 8 und 9 abzupuffern. Zu geeigneten Puffern gehören Carbonate, Borate, Phosphate, Glutarate, die Tris- Materialien, z .B. Tris(hydroxymethyl)aminomethan und andere, die aus der Literatur bekannt sind.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung können für die Verwendung zu einer Lösungsbestimmung bereitet werden durch Zusammenmischen der peroxidaten Substanz (im allgemeinen in einer wäßrigen Lösung) mit dem Leucofarbstoff. Da die Leucofarbstoffe eine begrenzte Löslichkeit in Wasser aufweisen, können sie in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst werden, beispielsweise einen Alkohol oder N,N-Dimethylformamid, bevor sie mit der peroxidativen Substanz vermischt werden. Die Details der Herstellung einer repräsentativen Zusammensetzung zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid werden in Beispiel 2 unten beschrieben.
Werden die Zusammensetzungen dieser Erfindung zu Lösungsbestimmungen verwendet, so liegt der Leucofarbstoff im allgemeinen in einer Konzentration von bis 0,1 und vorzugsweise von 0,02 bis 0,05 mg/ml Lösung vor. In entsprechender Weise liegt die peroxidative Substanz in einer Menge vor, die ausreicht, um die Leucofarbstoff-Farbstoffreaktion zu katalysieren. Beispielsweise liegt die Peroxidase in einer Menge bis zu 1, und vorzugsweise von 0,1 bis 0,5 I.E./ml vor. Die Menge der gegebenenfalls vorliegenden Komponenten der Zusammensetzung (z.B. Puffer, oberflächenaktive Stoffe und dgl.) sowie der reaktiven Zusammensetzung (wie unten beschrieben) liegen im Bereich des handwerklichen Könnens des Fachmannes.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung können zur Bestimmung eines Analyten eingesetzt werden, der Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag, d.h. sie können an einer Reaktion oder an einer Reihe von Reaktionen teilhaben, bei denen Wasserstoffperoxid erzeugt wird, in einer wäßrigen Flüssigkeit durch Zugabe einer interaktiven Zusammensetzung, die Wasserstoffperoxid bei Reaktion mit dem Analyten erzeugt. Analyten, die auf diese Weise bestimmt werden können, sind Glucose, Triglyceride, Harnsäure, Cholesterin, Galactose, Aminosäuren, Creatinkinase und andere Analyten, die dem Fachmann auf dem Gebiet der klinischen Chemie bekannt sind. Beispielsweise enthält eine reaktive Zusammensetzung für die Bestimmung von Harnsäure Uricase, und eine reaktive Zusammensetzung für die Bestimmung von Cholesterin enthält Cholesterinoxidase und Cholesterinesterhydrolase. Weiterhin enthält eine reaktive Zusammensetzung für die Bestimmung von Creatinkinase Glycerinkinase, Adenosintriphosphat und α- Glycerophosphatoxidase. Andere reaktive Zusammensetzungen für einen bestimmten Analyten lassen sich vom Fachmann zusammensetzen.
Die Zusammensetzungen und das Verfahren dieser Erfindung lassen sich anwenden auf Lösungsbestimmungen wie auch auf Bestimmungen mit trockenen Elementen. Bei der Lösungsbestimmung werden ganz allgemein der Leucofarbstoff, die peroxidative Substanz und die reaktive Zusammensetzung, sofern eingeschlossen, in physikalischen Kontakt miteinander gebracht und in einem geeigneten Gefäß mit einer flüssigen Testprobe vermischt (z.B. in einem Teströhrchen, einer Petrischale, einem Becher, einer Küvette und dgl.. Die erhaltene Lösung wird eine relativ kurze Zeitspanne lang inkubiert, und zwar bei einer geeigneten Temperatur. Die Probe wird dann untersucht durch Messung der Menge an erzeugtem Farbstoff nach Reaktion mit Wasserstoffperoxid. Die Menge an Farbstoff kann dann zur Menge an Wasserstoffperoxid, die entweder von Anfang an in der Probe vorhanden war oder als Folge des Vorhandenseins eines Analyten erzeugt wurde, in Relation gesetzt werden. Eine solche Bestimmung läßt sich unter Verwendung einer geeigneten kolorimetrischen Bestimmungseinrichtung und entsprechenden Verfahren durchführen.
In alternativer Weise kann die Zusammensetzung und kann das Verfahren dieser Erfindung in einem trockenen analytischen Element durchgeführt werden, welches aus einer absorbierenden Trägermatrix bestehen kann, d.h. einem dünnen Blatt oder einem selbsttragenden absorbierenden oder saugfähigen Material, z.B. Filterpapier oder Filterstreifen, die den Leucofarbstoff mit oder ohne die peroxidative Substanz enthalten. Vorzugsweise enthalten derartige Elemente auch die peroxidative Substanz. Solche Elemente sind in der Literatur als Teststreifen, diagnostische Elemente, Tauchstreifen, diagnostische Mittel und dgl. bekannt.
Bei Verwendung in "Trockenchemie"-Elementen können die Reagenzien in eine geeignete Trägermatrix durch Aufsaugen, Imprägnieren, Beschichten oder nach anderen geeigneten Techniken eingearbeitet werden. Eine geeignete Trägermatrix ist unlöslich und hält ihre strukturelle Integrität bei, wenn sie der Einwirkung von Wasser oder physiologischen Flüssigkeiten wie Urin oder Serum ausgesetzt wird. Eine geeignete Trägermatrix läßt sich herstellen aus Papier, porösen teilchenförmigen Strukturen, porösen Polymerfolien, Cellulose, Holz, Glasfasern, woven- und nonwoven-Fabrics (synthetisch und nichtsynthetisch) und dgl.. Ein geeignetes trockenes analytisches Element wird hergestellt durch Einsaugen einer Lösung der Reagens-Zusammensetzung in die Matrix und Trocknen. Geeignete Materialien und Verfahren zur Herstellung derartiger Elemente sind bekannt und werden beispielsweise beschrieben in den US-A-Patentschriften 3 092 465; 3 802 842; 3 915 647; 3 917 453; 3 936 357; 4 248 829; 4 255 384 und 4 270 920 sowie in der GB- Patentschrift 2 052 057.
Vorzugsweise weisen die trockenen analytischen Elemente dieser Erfindung mindestens eine poröse Ausbreitzone auf. Diese Zone kann eine selbsttragende absorbierende Trägermatrix sein (d.h. aus einem Material bestehen, das stark genug ist, um seine Integrität beizubehalten), vorzugsweise wird sie jedoch von einem separaten tragenden Substrat getragen (üblicherweise als Träger bezeichnet). Ein solcher Träger kann aus irgendeinem geeigneten dimensionsstabilen und vorzugsweise transparenten (d.h. für Strahlung transparenten) Material bestehen, das für elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen 200 und 900 nm durchlässig ist. Ein Träger der Wahl für ein spezielles Element soll verträglich sein mit der beabsichtigten Art der Bestimmung (Reflexions- oder Transmissionsspektroskopie). Zu geeigneten Trägermaterialien gehören Papier, Metallfolien, Polystyrol, Polyester [z.B. Poly(ethylenterephthalat)], Polycarbonate oder Celluloseester (z.B. Celluloseacetat).
Die poröse Ausbreitzone läßt sich aus irgendeinem geeigneten fasrigen oder nicht-fasrigen Material oder Mischungen von beiden herstellen. Das Porenvolumen und die durchschnittliche Porengröße dieser Zone lassen sich je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck variieren. Sollen beispielsweise Blut- oder andere Flüssigkeitsproben untersucht werden, die Materialien von hohem Molekulargewicht enthalten, so sind das Porenvolumen und die durchschnittliche Porengröße im allgemeinen größer als wenn Serum oder Urin zu untersuchen ist.
Geeignete Ausbreitzonen lassen sich unter Verwendung fasriger Materialien, entweder vermischt mit einem geeigneten Bindematerial oder zu einem textilen Gebilde verwebt, wie in der US-A-Patentschrift 4 292 272 beschrieben, herstellen. Alternativ und vorzugsweise läßt sich die Ausbreitzone herstellen aus polymeren Zusammensetzungen (z.B. Blushpolymeren) oder teilchenförmigen Materialien, mit oder ohne bindenden Adhesiven, wie es in den US-A-Patentschriften 3 992 158 und 4 258 001 beschrieben wird. Andere geeignete Materialien für die Erzeugung von Ausbreitzonen werden in den DE-A 3 150 102 und in der JP-57(1982)-101760 beschrieben. Es ist wünschenswert, daß die Ausbreitzone isotrop porös ist, was bedeutet, daß die Porosität in jeder Richtung in der Zone gleich ist, was durch einander verbindende Räume oder Poren zwischen den Partikeln, Fasern, Polymerstreifen und dgl. hervorgerufen wird.
Die Elemente können mehrere als nur eine Zone aufweisen, z.B. eine oder mehrere Reagenszonen, Ausbreitzonen, Registrierzonen, Beizzonen, die Strahlung blockierende Zonen oder Filterzonen, Haftzonen, Trennzonen, Pufferzonen und dgl.. Die Zonen befinden sich dabei ganz allgemein in Flüssigkeitskontakt miteinander, was bedeutet, daß Flüssigkeiten, Reagenzien und Reaktionsprodukte übereinanderliegende Bereiche von benachbarten Zonen passieren können. Vorzugsweise handelt es sich bei den Zonen um separat aufgetragene Schichten, obgleich zwei oder mehrere Zonen eine Schicht bilden können oder obgleich eine Zone zwei oder mehrere separative Schichten enthalten kann. Abgesehen von den oben angegebenen Literaturstellen werden geeignete Elemente, Formate und Bestandteile oder Komponenten beispielsweise in den US-A-Patentschriften 4 042 335, 4 132 528 und 4 144 306 beschrieben.
Die Komponenten der Zusammensetzungen dieser Erfindung, d.h. die peroxidative Substanz, der Leucofarbstoff, die reaktive Zusammensetzung (sofern vorhanden), Puffer (sofern vorhanden) und dgl. können in jeder der Zonen der Elemente untergebracht werden, die für die spezielle Analyse geeignet ist. Die Lokalisierung der einzelnen Komponenten liegt im Bereich des Fachmannes auf dem Gebiet der klinischen Chemie.
In den Elementen dieser Erfindung kann die Menge an Leucofarbstoff weitestgehend variiert werden, doch liegt der Farbstoff im allgemeinen in einer Beschichtungsstärke von bis zu 5 und vorzugsweise von 0,01 bis 2,5 g/m² vor. Die Leucofarbstoffe können mittels einer Kugelmühle direkt in das Material für die Ausbreitschicht oder Reagensschicht eingearbeitet werden oder in einem hochsiedenden Kupplerlösungsmittel gelöst und in der Schicht dispergiert werden. Zu geeigneten Kupplerlösungsmitteln gehören Tri-m- cresylphosphat und Tri-o-tolylphosphat. Die peroxidative Substanz liegt in einer Beschichtungsstärke vor, die dem Durchschnittsfachmann bekannt ist. Beispielsweise liegt im Falle von Peroxidase die Beschichtungsstärke bei bis zu 150000 und vorzugsweise 50000 bis 100000 I.E./m². Eine Vielzahl von anderen wünschenswerten, jedoch gegebenenfalls zu verwendenden Reagenzien und Zusätzen kann in dem Element in den dem Fachmann bekannten Mengen vorliegen. Zu solchen Stoffen gehören oberflächenaktive Verbindungen, Puffer, Bindemittel, Pigmente, Aktivatoren, Reagenzien für die reaktiven Zusammensetzungen und dgl.. Eine Ausführungsform dieser Erfindung besteht aus einem mehrschichtigen trockenen analytischen Element für die Bestimmung eines Analyten.
Diese Element umfaßt einen Träger, auf dem sich in folgender Reihenfolge und in Flüssigkeitkontakt miteinander befinden eine hydrophile Schicht mit einem hydrophilen Bindemittel (natürlichen oder synthetischen Ursprungs), z.B. Gelatine oder Polyacrylamid und eine Ausbreit-/Reagensschicht mit: 1) einer reaktiven Zusammensetzung, die Wasserstoffperoxid bei Einwirkung eines Analyten erzeugt, 2) einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und 3) einem Leucofarbstoff, wie oben beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung läßt sich eine Vielzahl von verschiedenen Elementen in Abhängigkeit von der Art der Bestimmungsmethode herstellen. Die Elemente können eine Vielzahl von Formen aufweisen, einschließlich die Form verlängerter Bänder von jeder gewünschten Breite, die Form von Blättern, Slides oder Chips. Das Bestimmungsverfahren dieser Erfindung kann auf manuellem Wege durchgeführt werden oder automatisiert sein. Im allgemeinen erfolgt bei Verwendung der trockenen Elemente eine Bestimmung von Wasserstoffperoxid oder eines Analyten, indem das Element von einer Vorratsrolle entnommen wird, einem Chippaket oder einer anderen Quelle, worauf es in physikalischen Kontakt mit einer Probe (z.B. 1-100 ul) der zu untersuchenden Flüssigkeit gebracht wird. Ein solcher Kontakt kann in irgendeiner geeigneten Weise bewirkt werden, z.B. durch Eintauchen des Elementes in die Probe oder vorzugsweise durch Auftröpfeln oder Betröpfeln des Elementes mit der Hand oder einer Maschine mit einem Tropfen der Probe unter Verwendung eines geeigneten Verteilers.
Nach Aufbringen der Probe wird das Element irgendeiner Konditionierung unterworfen, beispielsweise Inkubierung, Erhitzen und dgl., die wünschenswert sein kann, um die Gewinnung des Testergebnisses zu beschleunigen oder in anderer Weise zu erleichtern.
Die Bestimmung von Wasserstoffperoxid oder einem Analyten wird erzielt, wenn der Leucofarbstoff unter Bildung eines bestimmbaren Farbstoffes oxidiert wird. Dieser Farbstoff kann mit dem unbewaffneten Auge oder auf spektrophotometrische Weise und entsprechenden Verfahren bestimmt werden. Im allgemeinen weisen die Farbstoffe, die in der Praxis dieser Erfindung erzeugt werden ein λmax, oder ein Absorptionsmaximum auf, das gleich oder größer als 600 nm ist.
Die folgenden Herstellungsverfahren und Beispiele sollen die Praxis der Erfindung näher erläutern. In den Beispielen wurde Estane erhalten von B.F. Goodrich (Cleveland, Ohio), Alkanol XC wurde erhalten von E.I. duPont (Wilmington, Delaware), Surfactant 10G wurde erhalten von Olin Mathieson Co. (Stamford, Connecticut) und Triton X-102, Triton X-100 und Triton X-200 wurden erhalten von Rohm & Haas (Philadelphia, Pennsylvania. Peroxidase wurde erhalten von Miles Laboratories, Elkhart, Indiana. Glycerinkinase wurde erhalten von Beckman Clinical Diagnostics Division (Carlsbad, Kalifornien). Alle anderen Reagenzien (einschließlich der Enzyme) wurden erhalten von Aldrich Chemicals Co. (Milwaukee, Wisconsin), Sigma Chemical Co. (St. Loui, Missouri) oder Eastman Kodak Company (Rochester, New York).
Die Luft-Stabilität von sowohl Leucofarbstoffen gemäß der Erfindung wie auch von bekannten Farbstoffen wurde dadurch ermittelt, daß eine Probe eines jeden Leucofarbstoffes mehrere Wochen lang der Luft exponiert wurde. Im Falle der Leucofarbstoffe, die im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden, wurde eine nur geringe Oxidation festgestellt, was anhand einer geringen Farbbildung festgestellt wurde. Die getesteten Leucofarbstoffe der folgenden Beispiele waren in den analytischen Lösungen und Elementen, hergestellt bis zur Oxidation durch Wasserstoffperoxid, in Gegenwart von Peroxidase stabil. Leucofarbstoffe außerhalb des Erfindungsbereiches, z.B. Leucomalachitgrün und Leucokristallviolet wurden an der Luft schnell oxidiert.
Die maximale Absorption der Farbstoffe, die ausgehend von den Leucofarbstoffen dieser Erfindung erzeugt wurden, wurden wie folgt bestimmt: Eine Vorratslösung von 1-5 mg des Leucofarbstoffes in 100 ml Methanol wurde hergestellt. 10 ml der Vorratslösung wurden mit 0,1 ml einer wäßrigen Lösung von Peroxidase (100 Internationale Einheiten pro ml Wasser) und 0,1 ml einer 0,1 molaren Wasserstoffperoxidlösung vermischt. Die erhaltene Lösung wurde auf 50 ml mit Methanol und Wasser verdünnt und nach 2 Stunden wurde das erhaltene Spektrum mittels eines üblichen Carey-Spectrophotometers bestimmt.

Herstellung von Leucofarbstoffe I (Tabelle I)

Eine Mischung von 4-Pyridincarboxaldehyd (11 g), N,N- Dimethylanilin (25 g) und Zinkchlorid (5 g) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zwei Stunden lang auf 150ºC erhitzt. Die erhaltene heiße Schmelze wurde in Wasser gegossen und die Mischung wurde durch Zusatz von verdünntem Natriumhydroxid stark alkalisch gemacht. Diese Mischung wurde dann dampfdestilliert, um übeschüssiges Dimethylanilin zu entfernen.
Nach Abkühlung wurde das Wasser von dem Rückstand abdekantiert, wodurch eine klebrige feste Masse erhalten wurde. Diese feste Masse wurde in Ethanol gelöst und zwecks Entfernung von Zinkoxid filtriert. Das Filtrat wurde abgekühlt, mit Wasser verdünnt und solange stehengelassen, bis die Kristallisation des Produktes vollständig war. Das Produkt wurde abgetrennt und aus Acetonitril umkristallisiert, wobei 10 g des Leucofarbstoffes I erhalten wurden. Eine spektrale Massenanalyse zeigte ein ursprüngliches Ion bei m/e 331 und keine feststellbaren Verunreinigungen. Der Leucofarbstoff erwies sich als an der Luft stabil und die maximale Absorption des entsprechenden Farbstoffes lag bei 630 nm.

Herstellung von Leucofarbstoff II (Tabelle I)

Diese Verbindung wurde in einer Weise ähnlich der Herstellung von Leucofarbstoff I hergestellt, jedoch unter Verwendung von 3-Pyridincarboxaldehyd. Das erhaltene Produkt hatte einen Fp. von 187 bis 189ºC und die spektrale Massenanalyse zeigte ein ursprüngliches Ion bei m/e 331 und keine erkennbaren Verunreinigungen. Der Leucofarbstoff erwies sich als an der Luft sehr stabil und der entsprechende Farbstoff wies eine maximale Absorption bei 632 nm auf.

Herstellung von Leucofarbstoff III (Tabelle I)

Eine Mischung von 2-Furaldehyd (10 g), N-N-Dimethylanilin (30 g) und wasserfreiem Zinkchlorid (14 g) wurde unter einer Stockstoffatmosphäre auf 100ºC erhitzt bis praktisch sämtlicher Aldehyd verbraucht war, wie durch eine Dünnschichtchromatographie (TLC) (Kieselsäure, Verhältnis von Toluol/Ethylacetat 4:1) festgestellt wurde. Die Reaktionsdauer betrug etwa 2 Stunden. Dann wurde verdünnte Kaliumhydroxidlösung zugesetzt und die erhaltene Lösung wurde dampfdestilliert, um überschüssiges N,N-Dimethylanilin zu entfernen. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert, filtriert und die organische Schicht wurde abgetrennt. Nach Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand kristallisierte beim Abkühlen und wurde aus Ethylalkohol umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 15 g und die Dünnschichtchromatographie-Analyse zeigte einen Haupt- Spot. Die spektrale Massenanalyse zeigte ein ursprüngliches Ion bei m/e 336 und keine erkennbaren Verunreinigungen. Dieser Leucofarbstoff erwies sich als an der Luft sehr stabil. Die maximale Absorption des entsprechenden Farbstoffes lag bei 628 nm.

Herstellung von Leucofarbstoff V (Tabelle I)

Aceton (58 g) wurde nach dem Verfahren von C. Rappe in Arkiv För Kemi, 21(46), 512 (1963) bromiert, unter Erzeugung von 153 g der Zwischenverbindung A,
Diese Verbindung (145 g) wurde umgesetzt mit
(69 g) nach dem Verfahren, wie es beschrieben wird von Baganz und Rüger in Chem. Ber., 101, Seiten 3872-3882 (1968) unter Gewinnung von 203 g der Zwischenverbindung B
Die Zwischenverbindung B (44 g) wurde zu 29 g der Zwischenverbindung C überführt,
und zwar in Gegenwart von Schwefelsäure, wie von Baganz und Mitarbeitern oben beschrieben. Die Zwischenverbindung C (29 g) wurde dann in 14 g der Zwischenverbindung D überführt
und zwar nach Baganz und Mitarbeitern, wie in der oben angegebenen Literaturstelle beschrieben. Durch Dünnschichtchromatographie (TLC) (Kieselsäure, Toluol/Ethylacetat 4:1) wurde ein Produkt festgestellt.
Eine Mischung der Zwischenverdindung D (13 g) N,N- Dimethylanilin (20 g) und wasserfreiem Zinkchlorid (10 g) wurde auf 120ºC erhitzt. Es setzte eine kräftige Reaktion ein, und aus der Mischung trat Wasser aus. Nach erfolgter Reaktion wurde die Mischung wenige Minuten lang auf 150ºC erhitzt. Der erhaltene Viskosesirup wurde dann in eine verdünnte Kaliumhydroxidlösung unter Rühren gegossen. Die erhaltene Mischung wurde dann mit Ethylacetat extrahiert, worauf das Lösungsmittel getrocknet und bei vermindertem Druck konzentriert wurde. Der Rückstand wurde bei Zugabe einer kleinen Menge von Ethylalkohol fest. Durch Umkristallisation aus Acetonitril wurden 15 g Leucofarbstoff V erhalten. Eine Dünnschichtchromatographie (Kieselsäure, Toluol/Ethylacetat 4:1) ergab ein Produkt. Die spektrale Massenanalyse zeigte ein ursprüngliches Ion bei m/e 413 und keine feststellbaren Verunreinigungen. Der Leucofarbstoff erwies sich als an der Luft sehr stabil. Die maximale Absorption des entsprechenden Farbstoffes lag bei 635 nm.

Beispiel 1: Vergleich von Leucofarbstoffen

Dies ist ein Vergleich der Stabilität eines Leucofarbstoffes, der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird mit einem bekannten Leucofarbstoff, Leuctonaphthalingrün V der folgenden Struktur:
Eine Testlösung wurde aus 0,1 ml einer 5 mmolaren Lösung von Leuconaphthalingrün V und 0,8 ml eines 50 mmolaren Phosphatpuffers (pH 7) hergestellt Nach Zusatz von 0,01 ml Peroxidase (2 ug/ml) wurde eine Farbstoffbildung innerhalb von 5 Minuten beobachtet, was eine Instabilität des Leucofarbstoffes in Gegenwart des peroxidativen Materials anzeigte. Im Gegensatz hierzu erzeugte der Leucofarbstoff II, der zur Durchführung der Erfindung geeignet ist, keine Farbstoffbildung nach einer Stunde, wenn er in entsprechender Weise behandelt wurde.

Beispiel 2: Lösungsbestimmung von Wasserstoffperoxid

Ein Leucofarbstoff gemäß der Erfindung wurde dazu verwendet, um Wasserstoffperoxid in Lösung in folgender Weise zu bestimmen. Ein 0,3 ml aliquoter Teil einer Methanol-Vorratslösung von Leucofarbstoff II (5 mmolar) wurde unter Verwendung einer wäßrigen Pufferlösung im Verhältnis 10:1 verdünnt (pH-Wert 7), worauf 0,1 ml einer wäßrigen Peroxidaselösung (100 Internationale Einheiten von Peroxidase pro ml Wasser) und 0,1 ml einer 0,1 molaren Wasserstoffperoxidlösung zugesetzt wurden. Im Falle dieser Zusammensetzung wurde eine Farbstoffbildung nach etwa 5 Minuten festgestellt. Im Gegensatz hierzu wurde keine Farbstoffbildung nach 60 Minuten festgestellt, wenn der Farbstoff mit lediglich dem Puffer oder der Peroxidase oder beidem vermischt wurde.

Beispiel 3: Lösungsbestimmung von Glucose

Ein Leucofarbstoff, der für die Durchführung der Erfindung geeignet ist, wurde zur Bestimmung von Glucose in Lösung nach dem folgenden Verfahren verwendet. Zwei Vorratslösungen wurden hergestellt. Die Vorratslösung A enthielt 50 ml eines Kaliumphosphatpuffers (pH 7) und 10 ml einer methanolischen Lösung des Leucofarbstoffes II (21,9 mg Leucofarbstoff/100 ml Methanol). Die Vorratslösung B enthielt 5 ml eines Kaliumphosphatpuffers (pH 7) Peroxidase (120 I.E./ml) und Glucoseoxidase (100 I.E./ml).
Aus 1 ml der Lösung A,1 ml der Lösung B und 1,4 ml destilliertem Wasser wurde eine Vergleichslösung hergestellt. Eine Testlösung wurde hergestellt aus 1 ml Lösung A, 1 ml der Lösung B, 1 ml destilliertem Wasser und 0,4 ml Glucoselösung (10 mmolar). Die optische Dichte der Vergleichslösung und der Testlösung wurden gemessen bei 25ºC bei 632 nm in einem handelsüblichen Carey-Spectrophotometer. Die Differenz in der Dichte zwischen den beiden Lösungen nach 1 Minute betrug 0,12 optische Einheiten, was anzeigt, daß die Testlösung dieser Erfindung für die Bestimmung von Glucose geeignet ist.

Beispiel 4: Mehrschichtige Elemente mit den Leucofarbstoffen I-VI für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid

Die Leucofarbstoffe I-VI wurden zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid in einzelnen mehrschichtigen analytischen Elementen verwendet, indem jeder Leucofarbstoff in ein einzelnes Element eingebracht wurde, worauf die Elemente mit Lösungen in Kontakt gebracht wurden, die Wasserstoffperoxid enthielten und worauf die Reflexionsdichte der erhaltenen Farbstoffe gemessen wurde.
Jedes analytische Element entsprach dem folgenden Aufbau: Ausbreit-/Reagensschicht Hydrophile Schicht Bariumsulfat Celluloseacetat Estane -Elastomer Triton X-102 oberflächenaktives Mittel Dimedone 4-Hydroxypyrimidin Leucofarbstoff Peroxidase Gelatine Surfactant 10G Poly(ethylenterephthalat)Träger
Die Elemente wurden unter Verwendung von zwei Wasserstoffperoxid-Testlösungen ausgewertet. Testlösung A (pH 5) enthielt eine 5 x 10&supmin;² molare Menge von Dimethylglutarsäure und war bezüglich Wasserstoffperoxid 10&supmin;² molar. Die Testlösung B (pH 7) enthielt eine 5 x 10&supmin;² molare Menge an Natriumdihydrogenphosphat, eine 5 x 10&supmin;² molare Menge von Kaliumhydrogenphosphat und war bezüglich Wasserstoffperoxid 10&supmin;² molar. Als Vergleichsflüssigkeit wurde Wasser verwendet. 10 ul einer jeden Lösung wurden auf einzelne Proben der Elemente, die die entsprechenden Leucofarbstoffe enthielten, aufgeträufelt. Nach einer Inkubationsdauer von 5 Minuten bei 37ºC wurden die Reflexionsdichten in einem modifizierten üblichen Reflektometer bei 630 nm gemessen. Tabelle II unten zeigt die Anderungen in der Reflexionsdichte (ΔDR) zwischen dem Vergleichswasser jeder Testlösung mit jedem Leucofarbstoff. Aus den Daten ergibt sich, daß jeder Leucofarbstoff wirksam bei der Bestimmung von Wasserstoffperoxid bei sowohl pH 5 als auch pH 7 in einem trockenen Element war. Tabelle II Leucofarbstoffe ΔDR bei 630 nm Lösung

Beispiel V: Mehrschichtiges Element für die Bestimmung von Triglyceriden

Es wurde ein analytisches Element des folgenden Aufbaues hergestellt: Ausbreitschicht Haftschicht Hydrophile Schicht Lipase M Triton X-100 Titandioxid Celluloseacetat Estane Polyurethanharz Poly(N-isopropylacryl)amid Gelatine (gehärtet) Borsäure Reagensschicht Ascorbinsäureoxidase Gelatine (gehärtet) Poly(methylacrylat-co-2-acrylamido-2-methylpropansulfonsäure-co-2-acetoacetoxymethacrylat) Leucofarbstoff I Tricresylphosphat Alkanol XC Magnesiumchlorid Borsäure Adenosintriphosphat (ATP) Triton X-200 Glycolsäure Peroxidase Glycerinkinase Glycerophosphatoxidase Poly(ethylenterephthalat Träger
Um dieses beschichtete Element auszuwerten, wurde eine Reihe von Triglycerid-Kalibratorflüssigkeiten mit unterschiedlichen Analyt-Konzentrationen von 17,4 mg/ml bis 565,8 mg/dl hergestellt, worauf Proben des Elementes mit 10 ul Tropfen einer jeden Kalibratorflüssigkeit betröpfelt wurden. Nach einer Inkubationsdauer von 5 Minuten bei 37ºC wurde die Reflexionsdichte (DR) bei 650 nm in einem modifizierten üblichen Reflektometer gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III unten zusammengestellt. Diese Daten zeigen, daß das Element der Erfindung, das in diesem Beispiel beschrieben wird, für die Bestimmung von Triglyceriden geeignet ist. Tabelle III Kalibrator-Flüssigkeit-Triglycerid-Konzentration (mg/dl) DR bei 650 nm

Claims

1. Zusammensetzung für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung einen trisubstituierten Methanleucofarbstoff der folgenden Struktur enthält:

in der bedeuten: R gleich Furyl, Thienyl, Selenophenyl, Pyridyl, Pyridinyl, Pyrimidyl, Triazinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Selenazolyl, Pyranyl, Pyrazinyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Tetrazinyl, Pyridazinyl, Chinazolinyl, Acridinyl, Benzothiazolyl, Chinoxalinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Pteridinyl, Phenazinyl, N-Methylpyrrol, N-Methylindol, N-Methylimidazol und N-Methylbenzimidazol, wobei jede dieser Gruppen substituiert oder unsubstituiert sein kann,

R' und R" unabhängig voneinander offenkettige oder cyclische Amine und

X, X', Y und Y' unabhängig voneinander Wasserstoff, kurzkettige Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, kurzkettige Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Atomen, Halogenatome oder Aminogruppen.

2. Trockenes analytisches Element für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß das Element einen trisubstituierten Methanleucofarbstoff gemäß Anspruch 1 enthält.

3. Verwendung eines trisubstituierten Methanleucofarbstoffes gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid oder eines Analyten, der unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid zu reagieren vermag.

4. Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid oder eines Analyten, der in einer Flüssigkeit unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid reagiert, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

A. Physikalisches Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einem trisubstituierten Methanleucofarbstoff gemäß Anspruch 1, und

B. Bestimmung des Farbstoffes bei einer Wellenlänge gleich oder größer als 600 nm.

5. Die Erfindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der R' und R" für R¹R²N- oder R³R&sup4;N- stehen, worin R¹, R², R³ und R&sup4; unabhängig voneinander sind Alkyl-, Alkaryl-, Aryl-, Aralkyl - oder heterocyclische Gruppen, oder

R¹ und R² oder R³ und R&sup4; unabhängig voneinander, mit dem entsprechenden Stickstoffatom die Atome darstellen, die zur Vervollständigung eines heterocyclischen Ringes erforderlich sind.

6. Die Erfindung nach Anspruch 5, in der R¹ die gleiche Bedeutung wie R³ und R² die gleiche Bedeutung wie R&sup4; hat.

7. Die Erfindung nach Anspruch 5 oder 6, in der R¹, R², R³, und R&sup4; die gleiche Bedeutung haben.

8. Die Erfindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in der R ein substituierter oder unsubstituierter 3-Pyridyl- oder 4-Pyridylrest ist.

9. Die Erfindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Leucofarbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe folgender Farbstoffe:

10. Die Erfindung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 5 bis 9, mit einer reaktionsfähigen Zusammensetzung, die bei Reaktion mit einem Analyten Waserstoffperoxid erzeugt.