DE1648840B1 - Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden und peroxidatisch wirksamen Substanzen - Google Patents

Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden und peroxidatisch wirksamen Substanzen

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Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind diagnostische Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, aus denen durch eine vorgeschaltete Reaktion Wasserstoffperoxid oder andere Hydroperoxide freigesetzt werden, sowie von Peroxidase bzw. anderen peroxidatisch wirkenden Substanzen. Von besonderem diagnostischem Interesse ist der Nachweis von Glucose im Harn, Blut und Serum bei Diabetes sowie der Nachweis peroxidatisch wirkender Substanzen, wie Hämo- ro globin im Harn und Blut, und der Nachweis von Hydroperoxiden z. B. in der Milchwirtschaft, Kosmetik und Polymerchemie.
Es ist eine Reihe von Verbindungen bekannt, die von Wasserstoffperoxid mit Peroxidase als Katalysator zu einem Farbstoff oxidiert werden. Die Substanzen, die hierfür verwendet werden, sind z. B. Nadi-Reagenzien, p-Phenylendiaminderivate, Carboazine, Guajakharz, Aldazine usw. Bevorzugt eingesetzt werden bisher Benzidin, o-Dianisidin und o-Tolidin. Diese Verbindungen sind aber teilweise nicht sehr stabil und können nach den neuesten Erkenntnissen gesundheitsschädlich sein, so daß ihre Handhabung nicht ungefährlich erscheint.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die physiologisch unschädlichen Verbindungen der allgemeinen Formel I
C=N-N=C
N-C
i 1
R3
(I)
35
in der R1 eine niedere Alkylgruppe, R2 Wasserstoff, eine Sulfonsäuregruppe oder eine Alkalisulfonatgruppe, R3 Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe, X ein Schwefelatom, eine Vinylen- oder eine Iminogruppe, die gegebenenfalls durch niedere Alkylreste oder Arylreste substituiert ist, Y ein Stickstoffatom oder eine Methingruppe, welche auch zusammen mit R3 einen durch R2 substituierten Benzolring bildet, bedeutet, absolut beständig sind und sich besonders gut dazu eignen, Wasserstoffperoxid und andere Hydroperoxide sowohl im optischen Test als auch mit Hilfe von Reagenzpapieren und Reagenzfilmen zu bestimmen.
Es ist zwar bekannt, daß sich einige dieser Substanzen mittels starker Oxidationsmittel, wie Bleitetraacetat, Cer(IV)-sulfat und Kaliumpersulfat, oxidieren lassen und dabei gefärbte Oxidationsprodukte liefern (vgl. S. H ü η i g et al., Liebigs Ann. Chem., 676 [1964], S. 32 bis 65, sowie H. Lang et al., Z. analyt. Chem., 201 [1964], S. 321). Da jedoch mit Wasserstaffperoxid allein keine Reaktion erfolgt, war es nicht vorauszusehen, daß sich in Anwesenheit von Peroxidase oder peroxidatisch wirksamen Substanzen ebenfalls reproduzierbare deutliche Verfärbungen erzielen lassen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Bestimmen von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen, wie Hämoglobin, mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung ist demnach dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formel I verwendet werden.
Dabei ist das diagnostische Mittel zum Bestimmen von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen eine Substanz der' Formel I ist.
Das diagnostische Mittel zum Bestimmen von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen, bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen, ist dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen eine Substanz der Formel I ist.
Die Bestimmung von Hydroperoxiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist vorzugsweise für gekoppelte und ungekoppelte Enzymreaktionen geeignet, wie z. B. zur Bestimmung von Glucose, Galactose, Aminosäuren, Harnsäure, Peroxiden, Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen sowie Enzymaktivitäten. Die routinemäßige Bestimmung von derartigen Substraten ist wegen ihrer elementaren Wichtigkeit aus der klinischen Chemie und aus der Lebensmittelchemie nicht mehr wegzudenken. Bei der Bestimmung von Glucose beispielsweise wird diese von Glucoseoxidase zu Gluconsäure oxidiert, wobei der Luftsauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Das Wasserstoffperoxid oxidiert dann mittels Peroxidase oder einer peroxidatisch wirkenden Substanz den erfindungsgemäß verwendeten Indikator zum entsprechenden Farbstoff. Weitere Beispiele für derartige analytisch brauchbare Enzymsysteme, die unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid reagieren, sind i.-Aminosäureoxidase + L-Aminosäuren, u-Aminosäureoxidase + D-Aminosäuren, Uricase + Harnsäure, Xanthinoxidase + Hypoxanthin bzw. Xanthin, Glycinoxidase + Glycin, Monoaminooxidase + Monoamin (wie Adrenalin, Mescalin usw.), Diaminooxidase + Diamine (wie Histamin), Luciferase + Luciferin, D-Asparaginsäureoxidase + D-Asparaginsäure, Leber-Aldehydoxidase + Aldehyd, Galactoseoxidase + Galactose, Edsons Flavinenzym + Milchsäure.
Die Auswertung erfolgt beispielsweise durch optische Ausmessung im Spektralphotometer oder bei Verwendung von Testpapierstreifen bzw. Testfilmen durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zusammensetzung bzw. Farbtafeln. Besonders vorteilhafte und gut abgestufte Farbänderungen erhält man überraschenderweise, wenn man die Substanzen I zusätzlich mit Reduktionsmitteln der Formel II versetzt
Ar
in welcher Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern, V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe, V Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe, W eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe und W Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe sowie gegebenenfalls deren Alkalisalze bedeutet.
BAD ORIGINAL
Diese Substanzen, die als »Modifier« wirken, geben für sich allein keine oder nur sehr unspezifische Verfärbungen und sind deshalb als Indikatoren im allgemeinen nicht geeignet. Zusammen mit den Substanzen der allgemeinen Formel I erhält man aber besonders deutliche und gut abgestufte Farbumschläge. Bevorzugte Ausfiihrungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten daher eine Kombination der Substanzen I und II als Indikator.
Selbstverständlich läßt sich umgekehrt das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung der Chromogene gemäß Formel I sowie der Modifier gemäß Formel II mit Hilfe von Hydroperoxiden und einer peroxidatisch wirksamen Substanz benutzen, was bei der Produktionsüberwachung dieser Diagnostika sehr nützlich ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Mittel sind in den folgenden Beispielen näher erläutert:
20 Beispiel 1
Reagenzfilm zum Nachweis von Glucose
45 g Polyvinylpropionatdispersion, 35 g einer Lösung von 37 g Algipon in 21 eines 0.5 molaren Phosphat- oder Citratpuffers vom pH 5,7. 1 g organisches Natriumsulfat. K) ml Wasser, 0.075 g Peroxidase und 0,15 g Glucoseoxidase werden zu einem homogenen Brei verrührt. Zu dieser Mischung gibt man 6 ml einer 5°'()igen wäßrigen Lösung von 2,2'-Azinodi-[3-äthylbenzthiazolon-suIfonsäure(6)]. Mit den so hergestellten Mischungen, in denen jeweils 0,2 bis 0,3°/0 Indikator enthalten sind, werden Folien in einer Schichtdicke von 300 ;x beschichtet und getrocknet. Mit wäßrigen Lösungen verschiedener Glucosekonzentratiönen erhält man schwach abgestufte Grünfärbungen. Setzt man den obigen Mischungen an Stelle der wäßrigen Lösungen von 2,2'-Azino-di-[3-äthylbenzthiazolon-suIfonsäure(6)] 6 ml einer 5° „igen Lösung von p-Aminosalicylsäure zu, so erhält man Teststreifen, die sich beim Benetzen mit wäßrigen Glucoselösungen nur schwachgelb verfärben und keinerlei Abstufungen der Verfärbung aufweisen. Verwendet man jedoch 6 ml einer wäßrigmethanolischen Lösung des Gemisches von 5% 2,2'-Azino-di-£3-äthylbenzthiazolon-sulfonsäure(6)i und 5",, p-Aminosalicylsäure, so erhält man Teststreifen, die sich je nach der Glucosekonzentration in Abstufungen von Grün nach Violett verfärben.
Beispiel 2
Nachweis von Glucose in Blut, Harn oder Serum
In analoger Weise wie im Beispiel 1 beschrieben werden Reagenzfilme mit folgenden Substanzen gemäß Formel I hergestellt:
A = 2.2'-Azino-di-[3-äthylbenzthiazolon-
sulfonsäure(6)],
B = 2.2'-Azino-di-[l-äthyIchirjolin-suIfon-
säure(6)],
C = 2.2-Azino-di-[l,3-diäthylbenzimidazolon-
sulfonsäure(6)],
D = l-[3-Methylbenzthiazolon(2)]-2-[l-äthyl-
pyridon(2)]-azin,
E = I-[3-Äthylbenzthiazolon(2)]-2-[l-phenyl-
3-methyl-4-äthyl-l,2,4-triazolon(5)]-azin,
F = I-[3-ÄthylbenzthiazoIon(2)]-2-[l-äthyl-
chinolinon(2)]-azin.
G = l-[3-Methylbenzthiazolon(2)]-2-[l-phenyl-
3-methyl-4-äthyl-l,2,4-triazoIon(5)]-azin,
H = l-[l-Äthylchinolinon(2)]-2-[l-äthyl-
pyridon(2)]-azin.
J = I-[3-Äthylbenzthiazolon(2)]-2-[l-äthyI-
pyridon(2)]-azin,
K = l-[3-Methylbenzthiazolon(2)]-2-[l-äthyl-
chinolinon(2)]-azin,
wobei diese mit einer Reihe von Substanzen gemäß Formel II kombiniert werden. Die Farbumschläge mit glucosehaltigen Lösungen (z. B. Blut, Harn oder Serum) werden nach kurzer Zeit abgelesen und sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:
Indikator I Iridikator-
konzentration
%		 Modifier II Modifier-
konzentration
%		 Gelöst in Farbreaktion je nach
Glucosekonzentration
A 0,2 — — — grün (abgestuft)
A 0,15 o-Aminophenol- 0,2 Wasser gelb-grün
p-sulfonsäure
A 0,2 (l-Aminonaphthol-8)- 0,2 Wasser gelbgrün-
2,4-disulfonsäure graurqsa
A 0,3 (7-Aminonaphthol-1 )- 0,05 Wasser rosa-griin '.'.'._.
3,6-dinatriumsulfonat
A 0,3 Naphthylamin( 1 )- 0,05 n/50-Natronlauge rosa-grün
sulfonsäure(6) -- - " "■:"-- ■
A 0,3 Naphthylamin(l)- 0,1 Dimethyl rosa-griin
sulfonsäure(S) formamid
A 0,3 p-Äminosalicylsäure .0,1 Methanol grün-violett
A 0,3 Q-Aminophenol 0,01 Methanol gelb-grün
A 0,3 m-Aminophenol 0,007 Wasser rot-braunrot
A 0,3 p-Phenetidin 0,05 Methanol violett-grün
A 0,15 2-Hydroxy-4-amino- 0,15 n/50-Natronlauge grün-grau
4'-methoxy-diphenylamin
ÖAD ORIGINAL Fortsetzung
Indikator I Indikalor-
konzcnlralion
O
Il
A 0,3
B 0,01
B 0,01
B 0,01
B 0,01
C 0,1
D 0,3
D 0,3
E 0,3
E 0,3
F 0,3
F 0,3
G 0,2
G 0.2
H 0,3
H 0.3
I 0,2
ι 0,2
K 0,3
K 0.3
Modifier II
«-Naphtholsulfonsäuren)
o-Aminophenolp-sulfonsäure
(l-Aminonaphthol-8)-2,4-disulfonsäure
Naphthylamin( 1 )-sulfonsäure(6)
p-Aminosalicylsäure
p-Aminosalicylsäure
p-Aminosalicylsäure p-Aminosalicylsäure
p-Aminosalicylsäure p-Aminosalicylsäure p-Aminosalicylsäurc p-Aminosalicylsäure
Die angegebenen Prozentzahlen beziehen sich auf die Gesamtmischung: die Verbindungen I A bis C werden in Wasser und D bis K in Methanol gelöst.
Beispiel 3 Nachweis von Blut im Harn
Ein Filterpapier wird mit einem 0,1 molaren Phosphatpuffer vom pH 7,0, in dem 1% organisches Natriumsulfonat gelöst ist, imprägniert und getrocknet. Danach wird das imprägnierte Papier mit einer wäßrigen Lösung des Indikatorgemisches (0,03° „ 2,2'-Azino-di-[l -äthylchinolin-sulfonsäuren)] und O1I0Q o-Aminophenol-p-sulfonsäure nochmals im- <« prägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Papier einen Tropfen eines bluthaltigen Urins und einen Tropfen 3%iges Wasserstoffperoxid, so färbt sich das Testpapier noch bei einer Verdünnung von 1:50000 rotviolett. Nimmt man statt *>5 o-Aminophenol-p-sulfonsäure. 1 -Amino-8-naphthol-2,4-disuIfonsäure, so färbt sich das Papier noch bei einer Verdünnung von 1:50 (XX) blauviolett.
Modificrkonzentration
'Gelöst in Farbreaktion je nach
Glucosckonzentralion
Wasser rotviolett-
dunkelrol-
violett
— violett
(abgestuft)
Wasser gelb-braun
violett
Wasser grauviolett-
blau
n/50-NaOH grauviolett
Methanol blau-rot
Methanol grün-dunkel
grün
Methanol grauviolelt-
violett
Methanol rosa
Methanol rosa-rotviolett
Methanol fliederfarben
Methanol rosa-rotviolell
Methanol graugrün-
grauviolett
Methanol fleischfarben
orange
Methanol fliederfarben
Methanol hell-dunkel-
violett
Methanol blaß-rosa
Methanol rosa-dunkel-
rosa
Methanol blaß-rosa
Methanol rosa-rotviolctt
Beispiel 4
0.25 0,3
Nachweis von Hydroperoxiden in Flüssigkeiten
Ein Filterpapier wird mit 50 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffcrs vom pH 6.0; in dem 25 mg Peroxidase und 0,25 ml organisches Natriumsulfonat gelöst sind. imprägniert und getrocknet. Danach wird das Papier mit einer Lösung von 0.01 g 2,2'-Azino-di-[l-äthylchinolin-sulfonsäurc(6)] und 0,1 g o-Aminophenylp-sulfonsäurc in KX) ml Wasser imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Testpapier einen Tropfen einer wäßrigen Hydroperoxidlösung. so zeigt das Papier noch bei einer Konzentration von 0.2 ;■ ml eine rotviolette Färbung.
Beispiel 5 Nachweis von Glucose in Flüssigkeiten
Jeweils 0.01 ml von Glucosclösungen mit Konzentrationen von 0 bis 300 mg0 o werden zu 2 ml einer wäßrig-methanolischen 0,00125molaren Indikatorlösung von äquimolaren Mengen 2.2'-Azino-di-[3-äth\ 1-
SAP ORIGINAL
benzthiazolon-sulfonsäure(6)] und p-Aminosalicylsäure pipcttiert. Hierzu gibt man 2 ml einer Lösung von 10 mg Peroxidase und 20 mg Glucoseoxidasc in 100 ml eines 0,5molaren Phosphat puffers vom pH 5,7,' schüttelt um, mißt bei einer Wellenlänge von 490 nm und berechnet mit Hilfe einer Eichkurve die entsprechenden Glucosewerte.
Verwendet man als Indikatorgemisch 2,2'-Azinodi-[l-äthylchinolin-sulfonsäure(6)] und m-Aminophcnol, so liegt das Absorptionsmaximum bei 510 nm.
B c i s ρ i c 1 6
Ein gemäß Beispiel 1 hergestellter Reagenzfilm, der 0,02% Z2'-Azino-di-[l-äthylchinoIin-sulfonsäure(6)] und 0,3% Z2'-Azino-di-[3-äthylbenzthiazolon-sulfonsäurc(6)] als Indikatorgemisch enthält, verfärbt sich mit steigender Glucosekonzentration von Violett nach Grün; dieser Farbumschlag läßt sich gut beobachten, da das menschliche Auge auf Änderungen in diesem Farbbereich empfindlich reagiert.

Claims (5)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Bestimmen von Hydroperoxide!! bzw. von Substanzen, die unter Frei-Setzung von Hydroperoxid reagieren, sowie \on Peroxidase bzw. pcroxidatisch wirksamen Substanzen, wie Hämoglobin, mit Hilfe eines Chromogcns unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den pcroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formel I
C=N-N=C
/X-Y
35
(D
40
stoff, eine Sulfonsäurcgruppe oder eine Alkalisulfonatgruppe, R3 Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe, X ein Schwefelatom, eine Vinylen- oder eine Iminogruppe, die gegebenenfalls durch niedere Alkylreste oder Arylreste substituier! ist, Y. ein Stickstoffatom oder eine Methingruppe, welche auch zusammen mit R3 einen durch R2 substituierten Benzolring bildet, bedeutet, verwendet werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich eine Substanz der allgemeinen Formel II
Ar
W'
in der R1 eine niedere Alkylgruppe. R2 Wasserin welcher Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern, V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe. V Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte oder aryiierte Hydroxyl- oder Aminogruppe. W eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe und Vv" Wasserstoff oder eine Amino-. Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe bedeutet sowie gegebenenfalls deren Alkalisalze, verwendet wird.
3. Diagnostisches Mittel zum Bestimmen von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen eine Substanz der Formel I ist.
4. Diagnostisches Mittel zum Bestimmen von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen, bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen. dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen eine Substanz der Formel I ist.
5. Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 3 oder 4. dadurch gekennzeichnet, daß der Substanz der Funnel I eine Substanz der Formel Il zugegeben ist.
SAD ORIGINAL
909 587/170
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EP0161436A1 (de) * 1984-03-31 1985-11-21 Roche Diagnostics GmbH Neue Redox-Indikatoren

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