DE69323591T2 - Zusammensetzung zum Nachweis von Peroxid-aktivem Material - Google Patents

Zusammensetzung zum Nachweis von Peroxid-aktivem Material

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zum Nachweisen oder quantitativen Messen eines Peroxid-aktiven Materials in einer Probe. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung zum Nachweisen oder quantitativen Messen eines Peroxid-aktiven Materials, das einen Einfluß einer in der Probe enthaltenen reduzierenden Verbindung wie Ascorbinsäure und dergleichen beseitigen kann.
    • Beschreibung des Standes der Technik
  • Wenn ein Peroxid-aktives Material in einer Probe nachgewiesen oder quantitativ gemessen wird, hat in der Probe enthaltene Ascorbinsäure mehrere nachteilige Auswirkungen auf die Messung des Peroxid-aktiven Materials, weil sie als starkes Reduktionsmittel wirkt. Um den Einfluß einer reduzierenden Verbindung wie Ascorbinsäure zu vermeiden, sind verschiedene Techniken der Verwendung eines Metallions als Oxidationsmittel entwickelt worden.
  • (1) J. Am. Chem. Soc., 89, 4176 (1967), 8% 7104 (1967), und 90, 3386 (1968) beschreiben eine dynamische Untersuchung der Oxidation von Ascorbinsäure in Abhängigkeit des pH- Werts in Gegenwart von Eisen- und Kupferchelaten und offenbarten, daß das Metallion Ascorbinsäure oxidierte. Diese Papiere betreffen jedoch nicht eine Untersuchung des Verhaltens von Ascorbinsäure in einem Assay-System.
  • (2) Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 39871/1988 (entspricht dem U. S.-Patent Nr. 4 288 541 und EP-A- 0 027 236) offenbart die Zugabe von Quecksilber(II)- sarcosinat zu einer zu analysierenden Zusammensetzung, um den nachteiligen Einfluß eines Ascorbinsäuresalzes zu vermeiden. Wenn jedoch ein solcher Metallkomplex zu einer zu analysierenden Zusammensetzung gegeben wird, die ein organisches Hydroperoxid und einen Initiator enthält, reagiert der Indikator mit dem Metallkomplex, wodurch ein falsches Positiv-Ergebnis erhalten wird. Darüber hinaus ist der Quecksilberkomplex aufgrund der Toxizität von Quecksilber nicht bevorzugt.
  • (3) Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 67139/1988 (entspricht EP-A-043 469) offenbart einen Co(III)-Komplex als Verbindung zur Entfernung einer störenden Funktion von Ascorbinsäure. Wenn der Co (III)-Komplex jedoch zu der zu analysierenden, das organische Hydroperoxid und den Initiator enthaltenden Zusammensetzung gegeben wird, reagiert der Indikator mit dem Metallkomplex, wodurch ein falsches Positiv-Ergebnis erhalten wird.
  • (4) Die japanische Kokai-Patentveröffentlichung Nr. 286099/1990 (entspricht U. S.-Patent Nr. 5 079 140 und EP- A-0 392 395) offenbart ein System, das ein erstes Oxidationsmittel, das ein wasserlösliches Polymer umfaßt, das einen Kupfer(II)-Komplex erzeugt, und ein zweites Oxidationsmittel enthält; das aus der Gruppe bestehend aus anorganischen oxidierenden Verbindungen, organischen Peroxiden und organischen N-Halogenderivaten ausgewählt ist. Die Oxidationsgeschwindigkeit des Kupfer(II)-Komplexes ist jedoch langsam, und das System ist nicht effektiv.
  • (5) Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 41233/1989 offenbart die Zugabe eines zweiwertigen oder dreiwertigen Eisenkomplexes einer Verbindung der Formel: R&sub1;R&sub2;NCH&sub2;COOH oder R&sub3;R&sub4;NXNR&sub5;CH&sub2;COOH oder eines zweiwertigen oder drei wertigen Eisenkomplexes von Gluconsäure zur Entfernung von Ascorbinsäure bei der Messung von Komponenten in Körperflüssigkeiten.
  • (6) Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 18630/1992 (entspricht dem U. S.-Patent Nr. 4 587 220 und EP-A- 0 123 115) offenbart die Zugabe eines Chelats eines Polycarboxyalkyamin-Derivats von dreiwerticjem Eisen zu einer Zusammensetzung zum Nachweis des Peroxid-aktiven Materials.
  • (7) Darüber hinaus offenbart das kanadische Patent Nr. 844 564 ein Teststück, das ein mit einem auf Glucose reagierenden Reagenz imprägniertes, poröses Teil und ein zusätzliches Teil umfaßt, das eine Urinprobe aufnimmt und ein ionentauschendes Material enthält, das Ascorbinsäure im Urin absorbieren kann. Das das Eisen-Austauschmaterial tragende Teststück weist eine komplizierte Struktur auf und erfordert zur Analyse mehr Zeit als herkömmliche Assaymethoden.
  • (8) Das japanische Patent Nr. 39198/1981 und das U. S.-Patent Nr. 4 168 205 eliminieren den Einfluß von Ascorbinsäure durch die Zugabe von Ascorbinsäure-Oxidase zur einer Formulierung in einem Testreagenzpapier. Obwohl dieses Verfahren wirksam ist, ist es unwirtschaftlich, weil eine große Menge Ascorbinsäure-Oxidase zur Eliminierung der durch Ascorbinsäure bewirkten Störung erforderlich ist. Darüber hinaus reagiert Ascorbinsäure-Oxidase mit Ascorbinsäure, aber nicht mit anderen reduzierenden Materialien, und ist ein sehr instabiles Enzym.
  • (9) Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 4861/1990 (entspricht U. S.-Patent Nr. 4 743 559 und EP-A-0 037 056) offenbart die Zugabe eines Iodats (pH-Wert 5-9) in einer Menge von 0,5-2 g/dl zu einem Testreagens zur Eliminierung des Einflusses eines reduzierenden Materials wie Ascorbinsäure.
  • (10) Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 15280/1989 offenbart die Behandlung einer Probe mit Iodsäure oder Iodat zur Eliminierung des Einflusses des reduzierenden Materials. Jedoch oxidiert bei der Reaktion des Reduktionsmittels mit der Iodsäure oder dem Iodat freigesetztes Iod verschiedene Indikatoren, wodurch ein falsches Positiv-Ergebnis erhalten wird. Weiterhin oxidiert das Iodat den Indikator, wodurch der Hintergrund gefärbt wird.
  • FR 2 455 283 offenbart eine Zusammensetzung zur colorimetrischen Bestimmung von Ascorbinsäure in wässrigen Lösungen, insbesondere in organischen Flüssigkeiten. Es wird ein Metallkomplex, zum Beispiel Ammoniumeisen(III)-oxalat, beschrieben.
  • Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung einer neuen Zusammensetzung zum Nachweis oder quantitativen Messen eines Peroxid-aktiven Materials in einer Probe, wodurch die bei den oben beschriebenen Methoden des Standes der Technik beschriebenen Probleme gelöst werden können.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zum Nachweisen oder quantitativen Messen eines Peroxid-aktiven Materials in einer Probe verfügbar gemacht, umfassend ein organisches Hydroperoxid, ein Chromogen und einen Eisen(III)- Komplex der Formel:
  • [(OOC-X-COO)&sub3;Fe]M&sub3;, (I)
  • wobei X eine Alkylengruppe: -(CH&sub2;)n-, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, oder eine Allylgruppe ist und M ein einwertiges Kation ist.
  • Es ist bekannt, daß Kupfer(II)- und Eisen (III)-Ionen dank ihrer Fähigkeit zur Oxidation Ascorbinsäure unter Bildung von Dehydroascorbinsäure oxidieren. Weil das Kupfer(II)-Ion eine langsamere Oxidations-Reaktionsgeschwindigkeit als das Eisen- (III)-Ion aufweist, ist die Fähigkeit des Kupfer(II)-Ions zum Eliminieren der Störung von Ascorbinsäure schwächer als das des Eisen(III)-Ions. Es kann beabsichtigt werden, beim Assay von Komponenten in Körperflüssigkeiten eine Verbindung eines Eisen (III)-Ions zur Eliminierung der Störung von Ascorbinsäure zu verwenden.
  • Viele Eisen (III)-Verbindungen sind bekannt. Wenn eine herkömmliche, wasserlösliche Eisen(III)-Verbindung wie Eisenchlorid verwendet wird, reagiert das Eisen(III)-Ion sogar bei einem niedrigen pH-Wert schnell mit den in einer wässrigen Probe vorhandenen Wassermolekülen unter Bildung eines Aquaeisen- (III)-Komplexes. Weil der Aquaeisen(III)-Komplex ein sehr hohes Oxidations-Reduktions-Potential von 0,77 V aufweist, reagiert er mit einem Oxidations-Reduktions-Indikator, der im Assay der Körperflüssigkeits-Komponenten eingesetzt wird, wodurch ein falsches Positiv-Ergebnis erhalten wird. Daher ist eine solche einfache Eisen(III)-Ionenverbindung nicht bevorzugt.
  • Überraschenderweise ergibt der Eisen(III)-Komplex der Formel (I) kein falsches Positiv-Ergebnis und beseitigt den Einfluß von Reduktionsmitteln einschließlich Ascorbinsäure, wenn er zum Assay-Reagens für die Körperflüssigkeits-Komponenten gegeben wird.
  • In der Formel (I) stellt M ein einwertiges Kation dar, und bevorzugte Beispiele für das einwertige Kation sind das Ammoniumion, das Monoalkylammoniumion, das Dialkylammonlumion, das Trialkylammoniumion, das Tetraalkylammoniumion, das Pyridiniumion, das Pyrroliumion, das Aniliniumion, das Hydraziniumion und dergleichen. Das Alkyl ist vorzugsweise ein Niederalkyl, insbesondere Methyl oder Ethyl.
  • In der Alkylengruppe -(CH&sub2;)n- ist n gewöhnlich eine ganze Zahl von 0 bis 5, vorzugsweise 0 bis 3, noch mehr bevorzugt 0.
  • Ein bevorzugtes Beispiel für den Eisen(III)-Komplex ist Ammoniumeisen (III) oxalat. Im Fall von Ammoniumeisen (III) oxalat ist dieses in einer Konzentration von wenigstens 1 mmol/l, vorzugsweise von 20 bis 100 mmol/l in einer Imprägnierungsflüssigkeit enthalten, die zur Herstellung eines Stücks Testpapier verwendet werden soll.
  • Mit einer Lösung, die die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthält, wird vorzugsweise ein poröser Träger wie ein Papierblatt imprägniert und dieses getrocknet, und ein kleines Stück des imprägnierten Trägers wird auf einem Abstützelement wie einem Kunststoffstreifen gehalten.
  • Der pH-Wert des Assaysystems beträgt gewöhnlich 3-8, vorzugsweise 5-7.
  • Hier wird das Peroxid-aktive Material in einer herkömmlichen Bedeutung verwendet und umfaßt Wasserstoffperoxid, organische Hydroperoxide, daraus erzeugte Radikale und aktiven Sauerstoff.
  • Das organische Hydroperoxid und das Chromogen sind im Fachgebiet ebenfalls wohlbekannt.
  • Bevorzugte Beispiele für das organische Hydroperoxid sind Cumolhydroperoxid, 2,5-Dimethyl-2,5-bis(hydroperoxy)hexan, p- Menthanhydroperoxid, Acetylcyclohexylsulfonylperoxid und dergleichen.
  • Bevorzugte Beispiele für das Chromogen sind o-Tolidin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, Kombinationen von Trinder- Reagenzien (z. B. Phenol, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)- anilin, N-Sulfopropylanilin etc.) und Kupplungsmittel (z. B. 4-Aminoantipyrin etc.) und dergleichen.
  • Beispiele für die Proben, die das Peroxid-aktive Material enthalten, sind Körperflüssigkeiten, wie Urin, Blut, Speichel, Schweiß, Ascites, Tränen und Fäkalien, und andere flüssige Proben wie Fruchtsaft, Gemüsesuppe etc.
    • BEISPIELE
  • Die vorliegenden Erfindung wird weiter ausführlich durch die folgenden Beispiele erläutert.
    • Beispiel 1 Herstellung eines Teststücks zum Nachweis von okkultem Blut in Urin (1) Teststück
  • Ein Whatman-Filterpapier (3 MMChr; 20 · 20 cm) wurde mit Lösung 1 mit der folgenden Zusammensetzung imprägniert und 30 min lang bei 80ºC getrocknet. Weiterhin wurde das Filterpapier mit Lösung 2 mit der folgenden Zusammensetzung imprägniert und 15 min lang bei 50ºC getrocknet.
  • Lösung 1: enthält 26 mmol/l Ammoniumeisen(III)oxalat
  • 3M Trismalonsäure-Puffer (pH-Wert 6,5) 36,6 ml
  • Natriumlaurylsulfat 300 mg
  • Cumolhydroperoxid 4 ml
  • Ammoniumeisen(III)-oxalattrihydrat 1,12 g
  • Gereinigtes Wasser 9,4 ml
  • Ethanol 50 ml
  • (Insgesamt 100 ml)
    • Lösung 2
  • 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin 2 g
  • 6-Methoxychinolin 1 ml
  • 20% PVP- (K-30-)Ethanollösung 30 ml
  • Toluol 69 ml
  • (Insgesamt 100 ml)
  • Das imprägnierte Filterpapier wurde zu einem Stück von 5 mm · 5 mm geschnitten und mit einem doppelseitigen Klebeband an ein Ende einer Polyethylenterephthalatfolie mit der Größe 5 mm · 50 mm geklebt, wodurch ein Teststück erhalten wurde, das ein Testpapierstück trug.
    • (2) Probe
  • Zu Urin wurden Rinderblut-Hämoglobin und gegebenenfalls Ascorbinsäure gegeben und gelöst, wodurch eine Proben-Urinlösung hergestellt wurde.
    • (3) Messung
  • Das Teststück wurde in die Proben-Urinlösung eingetaucht und für einen vorbestimmten Zeitraum (1 min) reagieren gelassen, und dann wurde mittels eines Farbdifferenz-Meßgeräts SZΣ80 (hergestellt von Nippon Denshoku Kogyo Co., Ltd.) das Reflex ionsvermögen des Testpapiers bei einer Wellenlänge von 640 nm gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
  • Die beiden Teststücke wurden mit und ohne Ammoniumeisen(III)- oxalat von der 0,08 mg/dl Rinderblut-Hämoglobin enthaltenden. Proben-Urinlösung in Abwesenheit von Ascorbinsäure gut blau gefärbt.
  • Wenn 20 mg/dl Ascorbinsäure zugegeben wurden, wurde das Teststück, das kein Ammoniumeisen(III)-oxalat enthielt, nicht gut blau gefärbt. Andererseits wurde das Teststück, das gemäß der Erfindung Ammoniumeisen (III) oxalat enthielt, nicht von Ascorbinsäure beeinflußt und sogar bei einem Ascorbinsäuregehalt von 50 mg/dl gut gefärbt.
    • Beispiel 2 Herstellung eines Teststücks zum Nachweis von okkultem Blut
  • Die folgende Lösung A wurde mit einer Naßdicke von 200 um auf eine opake Polyethylenterephthalatfolie aufgetragen und 15 min lang bei 50ºC getrocknet.
    • Lösung A
  • 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin 2 g
  • 6-Methoxychinolin /ml
  • 20% PVP- (K-90-)Ethanollösung 30 ml
  • Toluol 69 ml
  • (Insgesamt 100 ml)
  • Mit der folgenden Lösung B wurde ein Baumwollgewebe oder ein Gewebe aus Polyester-Nylon-Mischgewebe imprägniert und 30 min lang bei 50ºC getrocknet.
    • Lösung B: enthält 26 mmol/l Ammoniumeisen(III)oxalat
  • 3M Trismalonsäure-Puffer (pH-Wert 6,5) 36,6 ml
  • Natriumlaurylsulfat 300 mg
  • Cumolhydroperoxid 4 ml
  • Ammoniumeisen(III)-oxalattrihydrat 1,12 g
  • Gereinigtes Wasser 9,4 ml
  • Ethanol 50 ml
  • (Insgesamt 100 ml)
  • Das Gewebe, das das Reagens enthielt, wurde mit einer 0,01%igen wässrigen Lösung von Triton X-100 benetzt und auf die auf der Polyethylenterephthalat-Folie gebildeten Reagensschicht gepreßt.
  • Das Laminat wurde zu einer Größe von 5 mm · 7 mm geschnitten und mit doppelseitigem Klebeband an ein Ende einer opaken Polyethylenterephthalatfolie mit einer Größe von 5 mm · 80 mm geklebt.
    • Proben
  • Zur Herstellung der Proben wurde in gereinigtem Wasser, das 0,08 mg/dl Rinderblut-Hämoglobin enthielt, Ascorbinsäure in einer Konzentration von 0, 5, 10 und 20 ml/dl gelöst.
    • Messung
  • 6 ul von jeder Probe wurden auf das Reagenslaminat des Teststücks getupft und bei 37ºC inkubiert. 5 bis 7 min nach Beginn der Inkubation wurde das Reflexionsvermögen auf der Oberfläche des Reagenslaminats gemessen. Unter Bezugnahme auf das Reflexionsvermögen des Reagenslaminats, auf das die keine Ascorbinsäure enthaltende Probe aufgetupft wurde, und das als 1 festgelegt wurde, wurde das relative Reflexionsvermögen des Laminats gemessen, auf das die jeweiligen Proben getupft waren. Das relative Reflexionsvermögen lag zwischen 1,00 und 1,05.
  • Aus den obigen Ergebnissen geht hervor, daß der Einfluß von Ascorbinsäure durch bei jeder beliebigen Ascorbinsäure-Konzentration unterdrückt wurde.

Claims (3)

1. Zusammensetzung zum Nachweisen oder quantitativen Messen eines Peroxid-aktiven Materials in einer Probe, umfassend ein organisches Hydroperoxid, ein Chromogen und einen Eisen(III)-Komplex der Formel:
[(OOC-X-COO)&sub3;Fe]M&sub3;, (I)
wobei X eine Alkylengruppe: -(CH&sub2;)n-, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, oder eine Allylgruppe ist und M ein einwertiges Kation ist.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem einwertigen Kation um ein Ammoniumion handelt.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Eisen(III)-Komplex um Ammoniumeisen(III)-oxalat handelt.
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