CH620472A5

CH620472A5 -

Info

Publication number: CH620472A5
Application number: CH735476A
Authority: CH
Inventors: Sigmar Dr Klose; Alexander Dr Hagen
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1975-06-13
Filing date: 1976-06-10
Publication date: 1980-11-28
Also published as: CA1072868A; DE2526558A1; AU505919B2; AT349647B; ATA232576A; BE842539A; DE2526558C2; US4102742A; IE42572L; DK241576A; SE7606668L; IE42572B1; HU172619B; GB1552697A; FR2314498A1; IL49570A0; FR2314498B1; ZA763469B; IT1061360B; AU1491276A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Analyse, welches eine wesentliche Einsparung an Enzymen ermöglicht und sich insbesondere für die Anwendung auf Analysenautomaten eignet.

In der Analyse von natürlichen Systemen wie biologischen Flüssigkeiten, insbesondere in der klinischen Chemie, hat man es mit einem Messgut zu tun, das eine Vielzahl von Substraten enthält, die einander zum Teil chemisch sehr ähnlich sind. Es hat sich erwiesen, dass in vielen Verfahren der Einsatz von Enzymen notwendig ist, um die erforderliche Spezifität und damit Störungsfreiheit einer Substratbestimmung zu gewährleisten. Enzyme wirken als Katalysatoren, d. h. sie werden während der Reaktion nicht verbraucht. Diese Tatsache führte zu Überlegungen, wie man diese z. T. sehr teuren Enzyme nach abgeschlossener Reaktion erneut in einer anderen Analyse zum Einsatz bringen kann.

Als recht gut geeignetes Mittel hat sich dafür die Fixierung der Enzyme auf inerte, unlösliche Trägermaterialien erwiesen; entweder man entfernte dieses feste Material nach der Analyse wieder aus der Reaktionslösung, z. B. durch Filtration, oder man lässt die Reaktionslösung durch einen Reaktor strömen, der dieses Material enthält. Daraus geht auch hervor, dass der Einsatz trägergebundener Enzyme in Analysenautomaten und da wiederum in den kontinuierlich durchströmten, am einfachsten und wirkungsvollsten ist (H. U. Bergmeyer: Methoden der enzymatischen Analyse, Weinheim 1974; H. U. Bergmeyer und A. Hagen: Z. Anal. Chem. 261 (1972) 333; D. J. Inman und W. E. Hornby: Biochem. J. 129 (1972) 255; L. P. Leon et al.: 26th Meeting of the American Association of Clinical Chemists 1974, Abstr. 92).

Bei kontinuierlich von Reagens durchströmten Analysenautomaten ist die sogenannte Verschleppung eines der Hauptprobleme. Durch Absorption des Substrates oder seiner Folgeprodukte an den Wänden des Fliesssystems kann es dazu kommen, dass Anteile aus einer Probe in den Lösungsbereich, in dem sich die nächstfolgende Probe befindet, verschleppt wer-, den. Dieser Effekt muss so klein wie möglich gehalten werden. Bei den bisher üblichen, weit verbreiteten Verfahren konnte man das dadurch erreichen, dass als Material, das von den Lösungen durchflössen wird, zwischen Probengefäss und Analysator nur Glas oder spezielle Kunststoffschläuche verwendet werden.

Der Hauptnachteil des Einsatzes eines Enzymreaktors mit trägergebundenem Enzym vor der Messeinrichtung besteht darin, dass das Verschleppungsproblem hierdurch wesentlich verschärft wird und häufig nur sehr schwer zu lösen ist. Probenfrequenz und Analysendauer sind nämlich bei Automaten weitgehend festgelegt. Eine Frequenz von 60/h ist bei den meisten Analysenautomaten die untere Grenze. Andererseits sollte, zumal bei Geräten, die mehrere parallel geschaltete Kanäle aufweisen, wie den sogenannten SMA-Geräten (Bestimmung von bis zu 12 verschiedenen Substraten), eine Reaktionszeit von 10 min nicht überschritten werden, da die bereits auf dem Gerät befindlichen Methoden unter dieser Reaktionszeit liegen und da die Resultate aller Kanäle gleichzeitig zur Anzeige gebracht werden müssen. Daher sind sehr hohe spezifische Aktivitäten bei trägergebundenen Enzymen nötig, damit der Reaktor klein und die Verschleppung gering gehalten werden können.

Es hat sich nun in der Praxis häufig als schwierig erwiesen, einerseits eine genügend hohe auf Trägern gebundene Enzymaktivität im Reaktor zur Verfügung zu stellen und andererseits die geforderte hohe Probenfrequenz zu ermöglichen. Die enzy-matische Aktivität steigt direkt proportional mit der Oberfläche des Materials, mit der die Reaktionslösung in Berührung kommt. Andererseits aber wird an einer grossen Oberfläche, die man sich noch dazu bei enzymatisch aktivem Trägermaterial im Mikrobereich als porös und schwammartig vorstellen muss, mehr von dem Substrat und seinen Folgeprodukten absorbiert als von einer kleinen. Das heisst, die Verfälschung des Wertes einer nachfolgenden Probe durch Verschleppung wird grösser. Daraus folgt, dass man bei grossen Oberflächen den Auswaschvorgang zwischen den Proben intensivieren, d. h. verlängern muss, was nur auf Kosten der Probenfrequenz möglich ist.

Ein weiterer Nachteil einer solchen Verfahrensweise, d. h. Einsatz des Enzymreaktors vor dem Analysator, ist es, dass sich einige Enzyme zwar fixieren lassen, ihre katalytische Aktivität aber trotzdem nicht oder fast nicht zur Wirkung kommt, da ein direkter Kontakt mit dem Substrat nicht hergestellt werden kann. Dies gilt für Substrate wie die Triglyceride, die sich in lipophilen Mikrophasen befinden, während sich die zur Spaltung notwendigen Lipasen am Träger in einer hydrophilen

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Umgebung befinden. Ein Kontakt zwischen Enzym und Sub- Enzyme nicht in wesentlichem Ausmass adsorbiert werden sol-strat wird auf diese Weise stark erschwert, wenn nicht unmög- len. Diese Adsorption lässt sich z. B. durch vorausgehende Sät-lich gemacht. tigung des Reaktors mit gelösten Eiweissstoffen wie Albumin

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verhindern. Eine anfängliche Adsorption während der Einlauf-die oben genannten Schwierigkeiten zu beseitigen und den 5 phase ist jedoch zulässig, sofern sie nach einiger Zeit zum Still-Enzymverbrauch bei analytischen Verfahren, insbesondere bei stand kommt. Weiter ist es wesentlich, dass die störenden Reak-Verfahren auf Analysenautomaten, herabzusetzen unter Ver- tionsprodukte quantitativ entfernt oder umgewandelt werden, wendung eines gelösten Enzyms für die Umsetzung der zu Zu diesem Zweck können im Reaktor einzelne Substanzen bestimmenden Substanz. Insbesondere ist es ein Ziel der Erfin- anorganischer oder organischer Natur oder Mischungen meh-dung, die benötigte Enzymmenge für eine Reihe von wiederhol-10 rerer solcher Materialien verwendet werden. Bevorzugt werten Analysen verwendbar zu machen, ohne dass diese Enzyme den im Rahmen der Erfindung entweder adsorbierende Sub-hierzu immobilisiert werden. stanzen oder trägergebundene Enzyme, welche die weitere

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein Umsetzung der unerwünschten Reaktionsprodukte zu kataly-

Verfahren zur enzymatischen Analyse durch enzymatische sieren vermögen unter Bildung von nichtstörenden Folgepro-Umsetzung der zu bestimmenden Substanz und Messung der 15 dukten. Das im Reaktor verwendete Material soll vorzugsweise Zunahme bzw. Abnahme eines Reaktionspartners der Haupt- eine möglichst niedrige Löslichkeit aufweisen, um keine Verun-oder einer nachgeschalteten Hilfsreaktion, insbesondere in reinigungen in den Kreislauf abzugeben. Ferner sollte das Analysenautomaten, wobei einer Lösung, welche das zur Absorptions- oder Reaktionsmaterial im Reaktor so beschaffen

Umsetzung nötige Enzym und gegebenenfalls Hilfsenzyme sein, dass es während des Verfahrens seine Durchflusseigen-sowie Hilfsstoffe wie Puffer, Salze, Coenzyme, Farbbildner und 20 Schäften im wesentlichen beibehält. Materialien, die diesen dergleichen gelöst enthält, eine die zu bestimmende Substanz Bedingungen genügen, lassen sich vom Fachmann ohne grosse enthaltende Probelösung zugesetzt und ein bestimmter Reak- Schwierigkeiten auswählen.

tionspartner gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Im Reaktor können ausser den störenden Reaktionsproduk-

Enzymlösung im Kreislauf geführt und nach der Messung ten auch andere für die Durchführung der Analyse notwendige durch einen Reaktor geleitet wird, welcher das gemessene 25 Substanzen adsorbiert oder umgewandelt werden. Vorausset-Reaktionsprodukt vollständig aus der Lösung entfernt oder in zung ist jedoch, dass die Kreislauflösung unschwierig wieder ein nicht-störendes Produkt umwandelt und die danach erhal- mit diesen verbrauchten Reagentien aufgefrischt werden kann, tene Enzymlösung gegebenenfalls nach Ergänzung verbrauch- Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens geeignete ter Bestandteile erneut mit Probelösung versetzt wird. Reaktormaterialien sind Adsorbentien wie z. B. Aktivkohle,

Beim Verfahren der Erfindung werden also die Enzyme, die 30 Kieselsäuregel, Bleicherde, Kieselgur, aktiviertes Aluminiumdirekt an den Reaktionen beteiligt sind, nicht immobilisiert, d. h. oxid und aktivierter Bauxit, insbesondere für die Entfernung trägerfixiert, sondern man richtet einen Kreislauf ein, in dem von Farbstoffen. Vorzugsweise enthält der erfindungsgemäss die Reagentien und die Enzyme gelöst sind und vor dem Vermi- verwendete Reaktor ein oder mehrere immobilisierte Enzyme, sehen mit einer neuen Probe werden, nach zuvor erfolgter Mes- insbesondere ko valent an Träger fixierte Enzyme, welche das sung, alle die nächste Messung störenden oder verfälschenden 35 gemessene Reaktionsprodukt weiter umzuwandeln vermögen. Reaktionsprodukte entfernt. Verschleppungsprobleme treten bei dieser erfindungsgemäs-

Das Verfahren wird vorzugsweise auf Analysenautomaten sen Anwendung trägergebundener Enzyme nicht auf, so dass eingesetzt und macht es möglich, den dabei benötigten Reaktor hinsichtlich der Dimensionierung des Enzymreaktors praktisch an einer Stelle im Verfahrensgang einzusetzen, wo er die Pro- keine Beschränkungen bestehen. Ein bevorzugtes Beispiel für bendifferenzierung nicht mehr ungünstig beeinflussen kann, 40 diese Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung was ausserhalb des Weges zwischen Probeneingabe und Mess- trägerfixierter Dehydrogenasen wie Lactatdehydrogenase stelle (Analysator, im allgemeinen eine Küvette) der Fall ist. (LDH) bei Reaktionen, die unter Bildung von NADH verlaufen Weder die Form noch die Oberfläche des Reaktors können und die gebildete Menge des letzteren bestimmt wird. In daher die Probenfrequenz beeinflussen und Verschleppung Gegenwart von reduzierbaren Stoffen wie Pyruvat wird wird vermieden. 45 NADH wieder in NAD überführt und steht damit im nächsten

Das Verfahren der Erfindung kann bei Anwendung auf Kreislauf erneut zur Reduktion zur Verfügung. Diese Ausfüh-

Analysenautomaten sowohl auf solchen mit eingeschalteter rungsform eignet sich für sehr viele verschiedene Substrate, die Dialyse als auch ohne solche eingesetzt werden. Vorzugsweise im UV-Test mit NADH oder NADPH gemessen werden, beiwird es bei Verfahren mit Dialyse eingesetzt, wobei die Entfer- spielsweise zur Bestimmung von Glucose.

nung der störenden Reaktionsprodukte ausser im Primärkreis 50 Eine zweckmässige Ausführungsform des Verfahrens, ins-auch im Sekundärkreis erfolgen kann und hierzu zweckmäs- besondere bei Verwendung von trägergebundenem Enzym im sigerweise unterschiedliche Reaktoren eingesetzt werden. Reaktor, besteht in der intermittierenden Rückführung der

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Lösung im Kreislauf anstelle einer kontinuierlichen Rückfüh-wird daher ein zu messendes Reaktionsprodukt zur Messung rung. Bei der intermittierenden Rückführung wird die Lösung teilweise aus dem Lösungskreislauf abdialysiert und der nicht 55 nach der Messung in einzelnen Fraktionen gesammelt und jede abdialysierte Anteil dieses Produktes wird in ein nicht stören- Fraktion einzeln in einem Reaktor solange behandelt, bis die des Produkt umgewandelt oder entfernt. Störprodukte völlig beseitigt sind. Diese Ausführungsform ist

Unter «Reaktor» wird im Rahmen der Erfindung eine im besonders dann von Vorteil, wenn die Aktivität des trägerge-Reaktionskreislauf angeordnete Strecke bezeichnet, in der die bundenen Enzyms relativ gering ist und daher eine lange Entfernung oder Umwandlung aller die nächste Messung stö- ao Behandlungsdauer im Reaktor bei der kontinuierlichen Rück-renden oder verfälschenden Reaktionsprodukte erfolgt. Dies führung erforderlich wäre. Durch die intermittierende Rückkann sowohl chemisch als auch physikalisch erfolgen. Physikali- führung mit mehreren parallel eingesetzten Reaktoren kann sehe Abtrennung kann erfolgen durch Adsorption an geeigne- die Reaktorgrösse gering gehalten werden, ohne dass die ten Adsorbentien oder Photolyse, die chemische Umsetzung Behandlungsdauer verkürzt wird.

durch chemische Bindung an geeigneten Materialien oder 65 Eine andere Anwendungsmöglichkeit der Erfindung durch chemische Umsetzung unter Bildung von nicht mehr stö- besteht z. B. bei solchen Reaktionen, die unter Beteiligung einer renden Folgeprodukten. Bei der Wahl des Reaktors ist vor Oxidase und damit unter Bildung von H2O2 verlaufen. H2O2

allem darauf zu achten, dass die im Kreislauf strömenden wird meistens durch eine Farbreaktion nachgewiesen. Diese

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Farbreaktion kann im Enzymkreislauf erfolgen, wobei die gebildete Farbe nach erfolgter Messung wieder entfernt wird, z. B. durch Adsorption des Farbstoffes in einem Holzkohlereaktor. Wahlweise ist es auch möglich, einen Teil des H2O2 abzudialy-sieren und nur die abdialysierte Menge zu messen, während die im Kreislauf verbliebene Menge durch ein trägergebundenes Enzym, beispielsweise trägergebundene Katalase, zerstört wird.

Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich auf handelsüblichen Analysenautomaten wie z. B. den Auto Analyzer •-Geräten, aber auch anderen Fabrikaten durchführen, ohne dass die in diesen Geräten festgelegten Analysenparameter geändert werden müssen. Durchgeführte Versuche haben gezeigt, dass die im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten gelösten Enzyme vielfach wieder verwendet werden können und damit die Menge an benötigten gelösten Enzymen mindestens um den Faktor 10 gesenkt werden kann. Die Wiederverwendbarkeit der Enzyme ist dabei nur begrenzt durch die allmähliche Anhäufung von Abbauprodukten und durch die zunehmende Verdünnung der Lösung durch die zugegebenen Proben.

Zu den Vorteilen des erfindungsgemässen Verfahrens bei Verwendung trägergebundener Enzyme im Reaktor gehört die Möglichkeit, enzymatisch aktives Granulat einzusetzen anstelle eines in der Herstellung wesentlich problematischeren Schlauchreaktors, mehrere Enzyme durch Granulatmischung einzusetzen und damit eine Simultanfixierung mit ihren Problemen überflüssig zu machen und den Einlaufvorgang für das System so zu gestalten, dass keine Reagentien verbraucht werden, indem man nur Reagentien, aber keine Probe in den Kreislauf gibt. Ferner können erfindungsgemäss die Reaktoren,

wenn sie immobilisierte Enzyme enthalten, bei denjenigen Temperaturen betrieben werden, die für die Stabilität der gebundenen Enzyme am günstigsten sind. Eine Enteiweissung der Probe ist nicht nötig. Auch die vielfach angewandte Segmentierung der einzelnen Proben durch Luftblasen kann angewendet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Cholesterinbestimmung

Die Bestimmung wird auf einem handelsüblichen Analysenautomaten mit durch Luftblasen segmentierten Proben durchgeführt.

a) Übliche Methode

Das Verfahren verläuft nach folgenden Reaktionsgleichungen: »

CholesterinesterCholesterase Cholesterin + Fettsäure

Cholesterin + 02<holoxidaseCholestenon + H2O2

H2O2 + Phenol + 4-Aminoantipyrin p00 chinoider Farbstoff

C6H5

CH, N 0

4-Aminoantipyrin =

CR3 ch3

chinoider Farbstoff = CH-,

NH.

C6H5 I

O

N =

= 0

Das Verfahren wird unter Verwendung einer Lösung mit nachstehenden Konzentrationen bzw. Aktivitäten durchgeführt:

0,4 M Kaliumphosphatpuffer, pH = 7,2; 4% Methanol (v/); 5 0,4% Hydroxipolyäthoxidodecan; 0,6 mg 4-Aminoantipyrin/ml; >0,1 U/ml Cholesterinoxidase; >0,1 U/ml Cholesterinesterase; >2,5 U/ml Peroxidase; 1,2 mg/ml Phenol.

Das Fliessschema ist aus Fig. 1 der beigefügten Abbildung zu ersehen.

10 b) Erfindungsgemässes Verfahren

Es werden folgende Reagentien verwendet:

Reagens 1:0,4 M Kaliumphosphatpuffer, pH = 7,2; 4% me-thanol (v/v); 0,1 U/ml Cholesterinoxidase; 0,1 U/ml Cholesterinesterase; 2,5 U/ml Peroxidase.

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Reagens 2:1,2 g 4-Aminoantipyrin, 0,6 g Phenol, 5 ml Hydroxipolyäthoxidodecan in 100 ml bidest. Wasser.

Gemäss dem in Fig. 2 der Zeichnung dargestellten Fliess-20 schema wird ein Lösungskreislauf eingerichtet, in dem ein mit 20 g Holzkohle beschickter Reaktor angeordnet ist. Die Holzkohle wurde 2 Std. in einer 6%igen Albuminlösung inkubiert und anschliessend in eine senkrecht stehende Säule, die als Reaktor dient, gefüllt. Das Reagens, das den während der Reak-25 tion gebildeten chinoiden Farbstoff enthält, läuft über die Säule. Dort werden der Farbstoff sowie 4-Aminoantipyrin sowie teilweise Phenol und Hydroxipolyäthoxidodecan adsorbiert. Die Enzyme laufen ungehindert durch. Reagens 2 wird kontinuierlich zugesetzt, um die notwendigen Konzentrationen an Phe-30 noi, 4-Aminoantipyrin und Detergens aufrechtzuerhalten.

Mit dieser Arbeitsweise konnte unter Verwendung von 30 ml Reagens 1, die im bekannten Verfahren für 30 min Laufzeit entsprechend 30 Bestimmungen ausreichen, das Verfahren 390 min lang durchgeführt werden, ohne dass ein Nachlassen der 35 Enzymaktivität zu beobachten gewesen wäre. Während dieser Zeit wurden 130 wässrige Cholesterinstandards mit je 50 bis 400 mg Cholesterin/100 ml und 140 Serumproben mit unveränderter Richtigkeit analysiert. Die restliche Zeit wurde für die Beobachtung der Grundextinktion der Reagentien (= Basisli-40 nie) verwendet. Hierbei konnte keine Veränderung festgestellt werden, woraus folgt, dass der chinoide Farbstoff quantitativ adsorbiert wurde.

Die Enzyme wurden bei diesem Versuch 13 mal wiederverwendet und damit der Anteil der Enzymkosten, die an den 45 Kosten dieses Tests etwa zwei Drittel ausmachen, um den Faktor 13 gesenkt.

Beispiel 2

Glucosebestimmung nach der Hexokinase-Methode 50 Die Bestimmung verläuft gemäss folgenden Reaktionsgleichungen:

Glucose + ATP HK Glucose-6-P + ADP Glucose-6-P + NAD g-w-dh (ieUc.) Gluconat-6-P + NADH Das Verfahren wurde auf einem handelsüblichen Analysen-55 automaten mit Dialyse und Segmentierung der Proben mittels Luftblasen durchgeführt.

a) Übliche Methode

Es wurde ein Reagens mit folgenden Reaktionen und Akti-60 vitäten verwendet:

0,075 M Triäthanolaminpuffer, pH = 7,8; 1 mM Magnesiumsulfat; 3,5 mM NAD; 0,455 mM ATP; 1 U/ml HK; 1 U/ml G-6-P-DH (leuc.); 0,1% Detergens (Polyäthylenglycoläther). Das Fliessschema zeigt Fig. 3 der Zeichnung. 65 b) Erfindungsgemässe Methode

Es wurde das in Fig. 4 der Zeichnung dargestellte Fliessschema angewendet. Folgende Reagentien kamen zum Einsatz:

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Reagens 1:1 mM Tris/HCl-Puffer, pH = 7,8; 5 mM Pyruvat; 0,1% Detergens.

Reagens 2:0,075 M Triäthanolaminpuffer, pH = 7,8; 1 mM Magnesiumsulfat; 3,5 mM NAD; 0,455 mM ATP; 1 U/ml HK; 1 U/ml G-6-P-DH (leuc.); 0,1% Detergens.

Der Reaktor bestand aus einem 2 m langen Schlauch, an dessen innerer Oberfläche ca. 4 U/m LDH fixiert waren. Im Schlauch läuft folgende Reaktion ab:

Pyruvat + NADH LDH Lactat + NDA Es wird also das in Abhängigkeit von der Glucosekonzen-tration gebildete NADH in NAD zurückverwandelt. Das für die Reaktion benötigte Pyruvat diffundiert aus dem Primärkreis durch die Dialyse.

Mit 20 ml von Reagens 2, die im üblichen Verfahren für 20 min Laufzeit entsprechend 20 Bestimmungen ausreichen, wurde das Verfahren 200 min lang durchgeführt. Ein Absinken der Empfindlichkeit (Extinktion/100 mg Glucose) war nicht zu 5 beobachten in diesem Zeitraum. Während dieser Zeit wurden 96 wässrige Standardlösungen (von 50 bis 400 mg Glucose/100 ml) und 40 Kontrollseren mit unveränderter Richtigkeit analysiert. Der Rest der Zeit wurde dazu verwendet, die Konstanz der Grundextinktion der Reagentien (= Basislinie) zu kontrol-lo lieren.

Dieses Verfahren lässt sich auch mit anderen Dehydrogenasen anstelle der Lactatdehydrogenase in gleicher Weise durchführen.

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1 Blatt Zeichnunger

Claims

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1. Verfahren zur enzymatischen Analyse durch enzymati-sche Umsetzung der zu bestimmenden Substanz und Messung der Zunahme bzw. Abnahme eines Reaktionspartners der Haupt- oder einer nachgeschalteten Hilfsreaktion, insbesondere in Analysenautomaten, wobei einer Lösung, welche das zur Umsetzung nötige Enzym gelöst enthält, eine die zu bestimmende Substanz enthaltende Probelösung zugesetzt und ein bestimmter Reaktionspartner gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass man die Enzymlösung im Kreislauf führt und nach der Messung durch einen Reaktor leitet, welcher das gemessene Reaktionsprodukt vollständig aus der Lösung entfernt oder in ein nicht-störendes Produkt umwandelt und die danach erhaltene Enzymlösung erneut mit Probelösung versetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Enzymlösung verwendet, die Hilfsenzyme sowie Hilfsstoffe, wie Puffer, Salze, Coenzyme und Farbbildner, enthält.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in der aus dem Reaktor erhaltenen Enzymlösung die verbrauchten Bestandteile ersetzt und dann mit Probelösung versetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zu messendes Reaktionsprodukt zur Messung teilweise aus dem Lösungskreislauf abdialysiert und der nicht abdialysierte Anteil dieses Produktes in ein nicht-störendes Produkt umwandelt oder entfernt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass man es in automatisierter Form unter Segmentierung der Proben mittels Luftblasen durchführt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man einen mit einem Adsorbens beschickten Reaktor verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Aktivkohle verwendet.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Reaktor mit immobilisiertem Enzym verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man eine immobilisierte Dehydrogenase verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man eine immobilisierte Katalase verwendet.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Konstanthaltung des Volumens der Kreislauflösung überschüssiges Lösungsmittel kontinuierlich oder intermittierend, insbesondere durch umgekehrte Osmose, abtrennt.