DE2341538A1 - Verfahren zur gleichzeitigen bestimmung von enzymaktivitaeten - Google Patents

Verfahren zur gleichzeitigen bestimmung von enzymaktivitaeten

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DE2341538A1 DE19732341538 DE2341538A DE2341538A1 DE 2341538 A1 DE2341538 A1 DE 2341538A1 DE 19732341538 DE19732341538 DE 19732341538 DE 2341538 A DE2341538 A DE 2341538A DE 2341538 A1 DE2341538 A1 DE 2341538A1
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enzymes
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Description

"Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von Enzymaktivitäten" Priorität: 17. August 1972, Japan, Nr. 81 818/72
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von Enzymaktivitäten mehrerer Enzyme in einem einzigen
Reaktionssystem.
Im allgemeinen v/ird bei Verwendung der Enzymaktivitäten der Körperflüssigkeiten in der klinischen Diagnose der physiologische Zustand insgesamt aus den Akt ivitäts v/er ten mehrerer Enzyme und aus dem Gehalt anderer Komponenten und nicht aus dem Aktivitätswert eines einzigen Enzyms allein beurteilt. Die gleichzeitige Bestimmung einer Anzahl von Enzymen v/ird derzeit unter Verwendung eines Vielkanalanalysengeräts durchgeführt; das in.der Vielkanalanalyse verwendete System ist jedoch sehr kompliziert. Die gesamte gegenwärtig erhältliche Analysenausrüstung basiert' auf dem Prinzip der Bestimmung jeder Komponente "in einem unabhängigen System. Die Ausrüstung für die Vielkomponentenanalyse stellt eine bloße Kombination der Einrichtungen zur unabhängigen
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Bestimmung jeder Komponente dar·, die in geeigneter Weise zur
automatischen Bestimmung der verschiedenen Komponenten angeordnet' sind.
Die Bestimmung enzymatischer Aktivitäten kann auch durch, spektrophotometrische Analysen der Anfangsgeschwindigkeiten durch Messen der auf der enzymatischen Reaktion beruhenden optischen Änderungen in Abhängigkeit von der Zeit durchgeführt v/erden. Bei dieser Methode kann jedoch wegen der zeitlichen Beschränkung eine grössere Anzahl von Testproben nicht in brauchbarer Weise bestimmt
werden. Die Zeit-Differenzen-Analyse ist nämlich ein zeitlich
äußerst aufwendiger Vorgang, da eine chemische Reaktion in einem getrennten System durchgeführt v/erden muß, selbst wenn die übliche Vielkomponentenanalyse in einem unabhängigen System zur Bestimmung der Enzymaktivität angewendet wird.
Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren zur gleichzeitigen
Bestimmung der Aktivitäten mehrerer Enzyme in einem einzigen
Reaktionssystem zur Verfugung zu stellen, bei dem in einfacher
Weise rasch genaue und zuverlässige Werte erhalten werden. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein neues Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von Enzymaktivitäten mehrerer Enzyme, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in einem einzigen Reaktionssystem ein Substrat für jedes der zu bestimmenden Enzyme und gegebenenfalls weitere, zur Bestimmung der Enzymaktivitäten erforderliche Reagenzien mit einer wäßrigen, die zu bestimmenden Enzyme enthaltenden Lösung vermischt, die Absorptions- oder
Fluoreszenzänderungen des erhaltenen Reaktionssystems bei mehre-
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ren, voneinander verschiedenen Wellenlängen, deren Anzahl gleich der Zahl der zu bestimmenden Enzyme ist, gleichzeitig in Abhän- · gigkeit von der Zeit mißt, Simultangleichungen ersten Grades aufstellt , v/obei Dian die in Bezug auf jedes der Enzyme unabhängige Proportionalbeziehung: zwischen den Meßwerten und den Enzymaktivitäten ausnutzt und die' Aktivität jedes Enzyms mittels dieser Gleichungen bestimmt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren laufen die enzymatischen Reaktionen gleichzeitig unter denselben Bedingungen ab.
Der Begriff "mehrere Enzyme" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen eine !Combination von Enzymen, die folgenden Anforderungen genügt:
a) Die enzymatischen Reaktionsbedingungen der einzelnen Snzyme sind einander ähnlich, und die Enzyme können mit ihren Substraten unter den gleichen Reaktionsbedingungen umgesetzt werden;
b) die Substrate für die Enzymreaktionen, die erhaltenen Reaktionsprodukte und die zur Messung der Enzymaktivitäten zum Reaktionssystem zuzusetzenden Reagenzien treten weder miteinander in Wechselwirkung noch beeinflussen sie nachteilig die Bestimmung der Enzymaktivitäten.
Spezielle Beispiele mehrerer Enzyme, deren Aktivitäten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, sind Kombinationen von (a) Leucin-aminopeptidase (nachstehend als "LAP" bezeichnet) oder Cholin-esterase mit (b) einer Dehydrogenase oder einer Transaminase, deren Aktivität durch Kuppeln mit der DehydroRjenase bestimmt werden kann.
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Zur Bestimmung der Aktivität von LAP kann als Substrat L-Leucyl-ßnaphthylamid verwendet werden; das bei der enzymatischen Reaktion erhaltene Reaktionsprodukt wird der Messung der Absorptionsoder Fluoreszensänderungen in Abhängigkeit von der Zeit unterworfen. In gleicher Weise kann bei der Bestimmung der Aktivität von Cholin-esterase als Substrat Acetylthiocholin verwendet werden; die Messung der Absorptions- oder Fluoreszenzänderungen wird an dem Reaktionsprodukt vorgenommen, das bei der Umsetzung des bei der enzymatischen Reaktion entstandenen Thiocholins mit ^-,^-♦-Dithiopyridin, oder Dithionitrobenzoesäure als Hilfsreagens zur Durchführung der Messung erhalten wird. Bei der Bestimmung der Dehydrogenase oder der vorgenannten Transaminase (deren Aktivität durch Kuppeln mit der Dehydrogenase bestimmt werden kann) wird die Messung der Absorptions- oder Fluoreszenzänderungen an Pyridinnucleotid als Coenzym der Dehydrogenase vorgenommen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann als Dehydrogenase in Verbindung mit LAP oder Cholin-esterase jede Dehydrogenase eingesetzt werden, die ein Pyridinnucleotid als Coenzym hat. Spezielle Beispiele von Dehydrogenasen sind nachstehend zusammengestellt:
1) Lactat-dehydrogenase (L-Lactat : NAD-oxidoreduktase ·, LDII) Pyruvat \ XNADH
Lactat *
LDH
2) 2-Hydroxybutyrat-dehydrogenase
2-Oxobutyrat \ /NADH 2-Hydroxybutyrat* . * NAD
2-Hydroxybutyrat-dehydrogenase
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Spezielle Beispiele von Transaminasen, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt und mit einer Dehydrogenase zur Bestimmung der Enzymaktivität gekuppelt werden können, sind nachstehend zusammengestellt:
1) Glutamat-oxalacetat-transaminase (L-Asparaginat : 2-oxogluta-
rat-aminotransferase; GOO?)
2-Oxoglutarat\ rL-Asparaginat Glutamat Y- * ^ Oxalacetat GOT
2) Glutamat-pyruvat-transaminase (L-Alanin : 2-oxoglutarat-amino-
transferase j GPT)
2-0xoglutarat"\ /L-Alanin
Glutamat
GPT
Pyruvat
Die enzymatische Aktivität der vorgenannten Transaminasen, d.h. Glutamat-oxalacetat-transaminase oder Glutamat-pyruvat-transaminase^ann durch Kuppeln mit Malat-dehydrogenase (MDH) bzw. Lactatdehydrogenase gemäß den nachstehend aufgeführten Schemata bestimmt werden:
2-Oxoglutaratl /L-Asparaginat Glutamat T Oxalacetat\ sNADH
Malat * ^ ^1NAD
MDH
GOT
2-Oxoglutarat\
Glutamat * T GPT
sL-Alanin
^ Pyruvat\
Lactat *
LDH
/KADH
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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ein Substrat für jedes Enzym und weitere, zur Bestimmung der Enzymaktivität en erforderliche Reagenzien mit einer wäßrigen, die zu bestimmenden Enzyme enthaltenden Lösung vermischt. Das Substrat und die Reagenzien können mit der Enzymlösung getrennt vermischt werden·, vorzugsweise werden diese Verbindungen jedoch in Form einer vorher hergestellten, für die Enzymreaktion geeigneten Pufferlösung zugesetzt.
Spezielle Beispiele für Substrate lind Reagenzien zur Bestimmung von LAP, Cholin-esterase, Dehydrogenase und Transaminase sind nachstehend zusammengestellt:
a) LAP
L~Leucyl-ß-naphthylamid als Substrat;
b) Cholin-esterase
Acetylthiocholin als Substrat und 4-,4-»-Dithiopyridin oder Dithionitrobenzoesäure als Hilfsreagens zur Messung;
c) Dehydrogenase
Substrat entsprechend der betreffenden Dehydrogenase, d.h. ein Pyruvat und NADH für LDH, 2-0xobutyrat und NADH für 2-Hydroxybutyrat-dehydrogenase;
d) Transaminase
Substrat entsprechend der betreffenden Transaminase und eine Dehydrogenase (die mit der Transaminase gekuppelt v/erden kann) plus NADH als Hilfsreagenzien zur Messung, d.h. 2-Oxoglutarat und L-Asparaginat als Substrate und eine Malat-dehydrogenase und NADH als Hilfsreagenzien zur Messung für GOT; 2-0xoglutarat und L-Alanin als Substrate und eine Lactat-dehydrogenase und NADH als Hilfsreagenzien zur
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Messung für GPT
Bei der Durchführung der enzymatischen Reaktionen ißt es erforderlich, die optimalen Reaktionsbedingungen für jedes der Enzyme auszuwählen, unter denen die enzymatischen Reaktionen mehrerer zu bestimmender Enzyme gleichzeitig ablaufen, im allgemeinen können jedoch die enzymatischen Reaktionen der vorstehend beschriebenen LAP, Cholin-esterase, Dehydrogenase und Transaminase bei einem pH-V/ert von et v/a 7*0 und einer Temperatur von 25 bis 40°C, z.B. bei 25°C, 500C und 37°C, durchgeführt werden.
Die Messung der Absorptions- oder Pluoreszenzanderungen des erhaltenen Reaktionssystems kann nach jedem üblichen Verfahren unter Verwendung eines Spektrophotometers oder eines Pluoropliotometers vorgenommen werden. Die zur Messung benutzte Wellenlänge stellt keinen kritischen Paktor dar; um jedoch zuverlässigere
re
und genaue/Ergebnisse zu erhalten, werden vorzugsweise Wellenlängen verwendet, bei denen je nach der Art des Meßverfahrens große Absorptionsunterschiede erhalten v/erden können. So können z.B. bessere Ergebnisse erhalten werden, wenn bei der Bestimmung von LAP und einer Dehydrogenase oder einer Transaminase das Reaktionssystem bei 335 und 355 rau und bei der Bestimmung von Cholin-esterase und einer Dehydrogenase oder einer Transaminase bei 325 und 34-0 mu (bei Verwendung von 4,4*-Dithiopyridin als Hilfsreagens zur Messung) bzw. bei 34-0 und 400 mu (bei Verwendung von Dithionitrobenzoesäure) gemessen wird.
Nachstehend wird eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur gemeinsamen Bestimmung von in einer Probe enthaltener LAP und GOT beschrieben. Hiersu werden zunächst zur
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Herstellung einer Substratlösung HfADH, L-Asparaginat, MDH, 2-Qxoglutarat und Ii-Leucyl-ß-naphthylamid in einer Pufferlösung aufgelöst. Eine abgemessene Menge der so hergestellten Substratlösung wird dann in eine Meßzelle (Küvettenzelle) eingebracht und eine Weile inkubiert. Dann wird die Substratlösung in der Küvettenzelle mit einer geeigneten Menge einer Sestlösung vermischt, die mehrere ssu bestimmende Enzyme enthält.· Nach dem Vermischen werden sofort die Absorptions- oder Fluoreszenzänderungen der Probe in Abhängigkeit von der Zeit bei mehreren Wellenlängen gleichzeitig oder abwechselnd gemessen. Die Anzahl der Meßwellenlängen entöpricht der Anzahl der zu bestimmenden Enzyme. Die Aktivität der einzelnen Enzyme kann dann aus den so erhaltenen Absorptionsoder Fluoresaenzänderungen gegen die Meßzeit berechnet werden»
Die Enzymaktivitäten E-, und E2 in einem Zweikomponentensystem können z.B. wie nachstehend angegeben berechnet werden: Die Beziehungen zwischen den Absorptions- oder Fluoreszenzänderungen ΔΑ, und ΔΑρ bei spezifischen Wellenlängen A, und A2 und den Enzymaktivitäten E1 und Ep werden durch die nachstehenden Gleichungen(l) und(2) beschrieben; E, bzw. Eg können daher mittels der nachstehenden Gleichungen(5) bzw.(4) berechnet werden.
A1 = E1 χ P1(A1) + E2 χ P2(A1) (l)
A2 m E1 χ P1(A2) + E2 χ P2(A2) (2)
AA1 χ P^(A0) - Ak0 χ Pp(A1)
1 P1(A1) χ P2(A2) - P1(A2) χ P2(A1) Δρ χ P1(A1) -AA1 χ P1(Ap)
E β —■£ ί—± ± ί-^ (4)
d P1(A1) χ P2(A2) - P1(A2) χ P2(A1)
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In diesen Gleichungen bedeuten P1(A-, ) und P-, (Ap) die molaren Extinktionskoeffizienten (Absorptionsindices) des Reaktionsproduktes P1 des Enzyms E1 bei den Wellenlängen A1 und A2 und Pg(A1) und P2(A2) die molaren Extinktionskoeffizienten des Reaktionsprodukts P2 des Enzyms E2 bei den Wellenlängen A1 und A2.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist im einzelnen an einem Zweikomponentensystem beschrieben worden, in dem zwei verschiedene Enzymarten nebeneinander "mehrere Enzyme" bilden. Es ist jedoch ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren auf Systeme angewandt werden kann, in denen mehr als zwei verschiedene Enzymarten vorliegen; hierbei wird eine zur gleichzeitigen Bestimmung der Enzymaktivitäten in einem einzigen Reaktionssystem geeignete Kombination von Heßverfahren angewendet. Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist solange möglich als die in dem System enthaltenen Enzyme den vorgenannten Anforderungen genügen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit in einfacher V/eise die rasche Bestimmung von Aktivitäten mehrerer Enzyme und den Erhalt genauer und zuverlässiger Ergebnisse.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Gleichzeitige Bestimmung von LDH und LAP
a) Reaktionssystem:
Blutserum 0,1 ml ■
gepufferte Substratlösung 2,9 ml
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b) Reagens:
Zusammensetzung der gepufferten Substratlösung L-Leucyl-ß-naphthylamid 0,4-5
Pyruvat ' 0,3
NADH ' 0,1 mM
enthalten in 0,2 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2) .
Die gepufferte Substratlösung mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung wird in eine Meßzelle eingebracht und auf 37°C erwärmt. Sodann wird das Blutserum in die Meßzelle' gegeben, und der Inhalt der Meßzelle wird vermischt. Sofort danach v/erden die Absorptionsänderungen des erhaltenen Gemisches abwechselnd bei 355 und 355 mja. gemessen. Die Ergebnisse sind in der Zeichnung dargestellt.
Die Zeichnung zeigt die Beziehung zwischen der Absorption und der Zeit bei der EnzymbeStimmung bei Wellenlängen von 335 355 ταμ.
' Die Absorptionsmessung wird mit einem automatischen Spektro photometer (Hitachi Modell 124) durchgeführt, das mit einem Wellenlängertprogrammierer versehen ist.
c) Berechnung:
Die folgenden Werte v/erden unter Verwendung einer authentischen Probe mittels der vorstehend angegebenen Gleichungen aus einem präparativen Versuch errechnet:
P1A1 : HADH 335 rau = 6,16 χ 105 P1A2 : NADH 355 mn = 4,94 χ ΙΟ5 P2A1 : ß-NA 335 ταμ = 1,78 χ ΙΟ5
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ϊ ß-K&
= °»54 χ ίο-
Aus flea v©3?geiiaBnten Werten wird die Enzymaktivitat von LDH bzw» LAP Mittels der vorgenannten Gleichungen{3) bzw. (4·) wie nächsteben*! "berechnet:
LBHi
0,5% - O.P.
1.78
6,16 χ 0,5% - *t9* x 1,78
LAP:
6,16 χ 0,5% - *»9% x 1,78
In derselben, ¥eise wie vorstehend beschrieben werden die Enzymaktivitäten von H)H und LAP gleichzeitig und unabhängig voneinander für verschiedene Blutserumproben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I susammengestellt.
Tabelle I .
jgleichseli
--fsF.		 LDH unabhängig LAP gleichzeitig unabhängig
Probe Hr. 480 ;ig 480 351 370
1 282 276 .337 349
2 3*1 545 404 421
5 453 450 118 125
% 551 546 67 69
5 455 449 489 499
6 628 652 625 636
7 18Ο 18O 135 135
8 195 199 101 121
9 935 920 101 106
10 237 249 219 227
11 124-5 1295 226 248
12 548 540 118 128
15
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ORfGfNAL INSPECTED
In der vorstehenden Tabelle ist die Einheit der Werte eine bei 370O bestimmte internationale Einheit.
Die Ergebnisse zeigen, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gleichzeitig bestimmten Werte sehr gut mit den entsprechenden unabhängig bestimmten Werten übereinstimmen.
Beispiel 2
Gleichzeitige Bestimmung von Cholin-esterase und LDH
a) Reaktionssystem:
Blutserum 20 nl
gepufferte Substratlösung 5i° ml
b) Reagens; ·
Zusammensetzung der gepufferten Substratlösung Acetylthiocholin 0,25 mM
4,4f-Dithiopyridin 0,1 mM
Pyruvat 0,3 mM
NADH 0,1 mM
enthalten in 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2).
In derselben Weise wie in Beispiel 1 beschrieben werden unter Verwendung der vorgenannten gepufferten Lösung zur Bestimmung der Enzymaktivitaten von Cholin-esterase und LDH die Absorptionsänderungen verschiedener Blutserumproben bei 325 und 34-0 ΐημ gleichzeitig und unabhängig voneinander gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengestellt.
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Tabelle II
LDH unabhängig Cholin-esterase unabhängig
Probe Nr. gleichzeitig 700 gleichzeitig 225a
1 720 155 215«X 229a
2 140 155 216a 215a
3 160 486 2QÖCC 143a
4- 492 940 165a 250a
5 945 320 267a 100a
6 320 95a
xa: Korrekturindex wegen der Verwendung eines Näherungswerts
als molarer Extinktionskoeffizient von 4,4*~Dithiopyridin
In der vorstehenden Tabelle ist die Einheit der Werte eine bei 37°0 bestimmte internationale Einheit.
Beispiel 3
Gleichzeitige Bestimmung von LAP und GPT
a) Reaktionssystem:
Blutserum 0,2 ml
gepufferte Substratiδsung 2,8 ml
b) Reagens:
Zusammensetzung der gepufferten Substratlösung L-Leucyl-ß-naphthylamid ' 0,45 raM
L-Alanin . * 74 mM
LDH 16 I.E.
2-Oxoglutarat 14 mM
NADH 0,1 mM
enthalten in 0,2 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2).
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In derselben Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wessien unter Verwendung der vorgenannten gepufferten losMng zrcr der Enzymaktivitäten von LAP und GPT die verschiedener Blutserumproben bei 335 ^nd 355 a*P gleichzeitig und unabhängig voneinander gemessen. Bie Scgeimiase ©lud in der nachstehenden Tabelle III zusammengestellt;.
Tabelle III
GH unabhängig M unabhängig
Probe Nr. gleichzeitig 18 gleicteeitig 13O
1 19 33 123 233
2 36 65 226 508
3 69
In der vorstehenden Tabelle ist die Einheit; der Werte eine feei 37 C bestimmte internationale Einheit.
Beispiele
bis 6
Die in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Tersaactee werden wiederholt, wobei in aedem Fall eine Kombination vom. IAT oder Cholin-e st erase mit einer Dehydrogenase oder ütansamiinase eingesetzt wird. Es v/erden in jedem Fall annähernd dieselben Ergebnisse erhalten. Die Versuche sind in der nsuehsbetowssäeia. Tabelle IV zusammengestellt.
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Tabelle 17
Beispiel Nr.
Enzyme
LAP oder Cholin-
Dehydrogenase oder Transaminas©
Reaktionssystem
Reagens; . .
Zusammensetzung der-Wt Substrat
•Temp.
Meßwellenlänge, ψ.
O CD OO O (D
XiAP
butyratdeaydrogenae®
Bluts§3?um 0,1 al gtpufferbt Sub·
stratlöiuag 2,9 ml
amid. . 0,45
-OasobtitjrÄt 1 mM NADH 0,1 nM
in 0.2 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2)
7,2
333 und
GOT
Blutserum 0,2
gepufferte Substratlösung 2,8
ml L-Leucyl-ß-naphthylamid 0,45 mM
ml 2-Oxoglutarat 6,6 >mM L-Asparaginat 3ö mM Mal at-^dehydrogenäse 30 I.E. NADH 0,1 mM in 0,2 M Phosphat- ' Pufferlösung (pH 7,2)
7,2
370O
Cholin- 2-Hydroxyesterase butyrat-
dehydrogenase
Blutserum £o pl gepufferte Substratlösung 3,0
Acetylthio*-
cholin
ml]4,4-».-Dithiopyridin
2-Oxobutyrat
NADH
0,25 mM
7,2
370C
325 und
0,1
0,1
mM mM mM
in 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2)

Claims (14)

Patentansprüche
1./Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von Enzymaktivitäten mehrerer Enzyme, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem einzigen Reaktionssystem ein Substrat für Jedes der zu bestimmenden Enzyme und gegebenenfalls weitere, zur Bestimmung der.Enzymaktivitäten erforderliche Reagenzien mit einer wäßrigen, die zu bestimmenden Enzyme enthaltenden Lösung vermischt, die Absorptions- oder Fluoreszenzänderungen des erhaltenen Reaktionssystems bei mehreren, voneinander verschiedenen Wellenlängen, deren Anzahl gleich der Zahl der zu bestimmenden Enzyme ist, gleichzeitig in Abhängigkeit von der Zeit mißt, Simultangleichungen ersten Grades aufstellt, wobei man die in Bezug auf jedes der Enzyme unabhängige Proportionalbeziehung zwischen den Meßwerten und den Enzymaktivitäten ausnutzt und die Aktivität jedes Enzyms mittels dieser Gleichungen bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aktivitäten von Leucin-aminopeptidase oder Cholin-esterase und einer Dehydrogenase oder einer Transaminase bestimmt, deren Aktivität durch Kuppeln mit einer Dehydrogenase gemessen werden kann.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Dehydrogenase Lactat-dehydrogenase und 2-Hydroxybutyrat-dehydrogenase bestimmt.
4·. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Transaminase Glutamat-oxalacetat-transaminase und
4098Q9/0987
7341538
Glutamat-pyruvat-transaminase bestimmt..
5>. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von Enzymaktivitäten, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem einzigen lieaktionssystem
a) L-Leucyl-ß-naphthylainid als -Substrat zur Bestimmung der Aktivität von Leucin-aminopeptidase,
b) Acetyltbiocholin als Substrat und 4-,4-'~Dithiopyridin oder Dithionitrobenzoesaure als Hilfsreagens zur Bestimmung der Akti\rität von Cholin-esterase,
c) ein Substrat zur Bestimmung der Aktivität einer Dehydrogenase und
d) ein Substrat für eine Transaninase und eine rnit der Transaminase kuppelbare Dehydrogenase plus NADH als Hilfsreagenzien zur Bestimmung der Aktivität der Transaminase
mit einer wäßrigen Losung vermischt, die Leucin-aminopeptidase oder Cholin-esterase und eine Dehydrogenase oder eine Transaminase enthält, deren Aktivität durch Kuppeln mit dieser Dehydrogenase bestimmt werden kann, die Absorptions- oder Fluoreszenzänderungen bei zwei verschiedenen Wellenlängen während einer bestimmten Zeitspanne in Abhängigkeit von der Zeit mißt, Simultangleichungen ersten Grades aufstellt, woboi man die Froportionalbeziehung zwischen den Absorptions- oder Fluoressenzänderungen bei Jeder der Wellenlängen in Abhängigkeit von der Zeit und für jede der Enzymaktivitäten ausnutzt und die Aktivität jedes· Enzyms mittels dieser Gleichungen best imnit.
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6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man
als Dehydrogenase Lactat-dehydrogenase und 2-Hyd.roxybutyratdehydrogenase bestimmt.
7. Verfahren nach Anspruch 5j dadurch gekennzeichnet, daß man
als Transaininase Glutamat-oxalacetat-transaminase und Glutaraatpyruvat-transaininase bestimmt.
8. Verfahren nach Anspruch 5 bis 7^ dadurch gekennzeichnet, daß man die Aktivität jed.es Enzyms aus den Keßv/erten de.r Absorptions- oder Fluoreszenzänderungen bei verschiedenen Wellenlängen in Abhängigkeit von der Zeit mittels nachstehender Gleichungen berechnet:
>r p f Λ ^ _ A Δ "ν *P f Δ ^
cL C. C— t._ JL
A1) χ P2(A2) - P1(A2) χ P2(A1) χ P1(A1) -A-^1 x P1(A2)
^ P1(A1) χ P2(A2) - P1(A2) χ P2(A1)
in denen E1 und E2 d.ie Aktivitäten der su bestimmenden Enzyme, Λ Α-, und Δ Ap die Absorptions- oder Pluoreszenzänderungen bei d.en Wellenlängen A1 und Ap in Abhängigkeit von der Zeit, P1(A-, und P1(A2) die molaren Extinktionskoeffizienten des Produkts der enzymatischen Reaktion des Enz^-ms mit der Aktivität ΕΊ bei den Wellenlängen ΑΊ und A0 und P0(An) und P0(A0) die
X _ J- d. c- X cL d.
molaren Extinktionskoeffizienten des Produkts der enzymatischen Reaktion des Enzyms mit der Aktivität E0 bedeuten.
9. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung eier Enzymaktivitäten von Leucin-aminopeptidase und Lactat-dehydrogenase, dadurch
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gekennzeichnet, daß man in einem einzigen Reaktionssystem
a) L-Leucyl-ß~naphthylamid als Substrat zur Bestimmung der Leucin-aminopeptidase und
b) ein Pyruvat und eine reduzierte Form von iiiacin-adenin-dinucleotid (UADH) als Substrate zur Bestimmung der Lactatdehydrogenase
mit einer Probe einer wäßrigen Lösung vermischt j die Leucinaminopeptidase und Lactat-dehydrogenase enthält, die Absorptions- oder Fluoreszenzänderungen des Reaktionssystems in Abhängigkeit von der Zeit bei 335 und 355 ψ mißt, Simultan- ■ gleichungen ersten Grades aufstellt, wobei man die in Bezug auf jedes der Enzyme unabhängige Proporbionalbeziehung zwischen den Meßwerten und den Aktivitäten der Enzyme in der Lösung ausnutzt und die Aktivität jedes Enzyms mittels dieser Gleichungen bestimmt.
10. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Enzymaktivitäten von Leucin-aminopeptidase und 2-Hydroxybutyrat-dehydrogenase, dad.urch gekennzeichnet, daß man in einem einzigen Reaktionssystem
a) L-Leucyl-ß-naphthylamid als Substrat zur Bestimmung der Leucin-aminopeptidase und
b) 2-Oxobutyrat und eine reduzierte Form von Niacin-adenindinucleotid (NADH) als Substrate zur Bestimmung der 2-Hydroxybutyrat-dehydrogenase
mit einer Probe einer wäßrigen Lösung vermischt, die Leucinaminopeptidane und 2-Hydroxybutyrat-dehydrogenase enthält, die Absorptions- oder Fluoreszenzänderungen des Reaktionssystems in Abhängigkeit von der Zeit bei 335 und 355 mu mißt,
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Simultangleichungen ersten Grades aufstellt, wobei man die in Bezug auf jedes der Enzyme unabhängige Proportionalbeziehung zwischen den Meßwerten und den Aktivitäten der Enzyme in der Lösung ausnutzt und die Aktivität jedes Enzyms mittels dieser Gleichungen bestimmt.
11. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Enzymaktivitäten von Leucin-aminopeptidase und Glutamat-oxalacetat-transaniinase, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem einzigen Reaktionssystem
a) L-Leucyl-ß-naphthylamid als Substrat zur Bestimmung der Leucin-aminopeptidase und
b) 2-Oxoglutarat und L-Asparaginat als Substrate zur Bestimmung..der Glutamat-oxalacetat-transaminase und weiterhin eine Halat-dehydrogenase und eine reduzierte Form von Niacin—adenin-dinucleotid (KADH) als Hilfsreagenzien zur Bestimmung der Transaminase
mit eir^r Probe einer wäßrigen Lösung vermischt, die Leucinaminopeptidase und Glutamat-oxalacetat-transaminase enthält, die Absorptions- oder Fluoreszenzänderungen des Reaktionssystems in Abhängigkeit von der Zeit bei 535 und 355 πιμ mißt, Simultangleichungen ersten Grades aufstellt, wobei man die in Bezug auf jedes der Enzyme unabhängige Proportionalbeziehung zwischen den Meßwerten und den Aktivitäten der Enzyme in der Lösung ausnutzt und die Aktivität jedes Enzyms mittels dieser Gleichungen bestimmt.
12. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Enzymaktivitäten von Leucin-aminopeptidase und Glutamat-pyruvat-transaminase,
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dadurch gekennzeichnet, daß man in einem einzigen Reaktionssystem
a) L-Leucyl-ß-naphthylamid als Substrat zur Bestimmung der Leucin-aminopeptidase und
b) 2-Oxoglutarat und L-Alänin als Substrate zur Bestimmung der Glutaraat-pyruvat-transaminase und weiterhin eine Lactat-dehydrogenase und eine reduzierte Form von Niacinadenin-dinucleotid (NADH) als Hilfsreagenzien zur Bestimmung der 3?ransaminase
mit einer Probe einer wäßrigen Losung vermischt, die Leucinaminopeptidase und Glutamat-pyruvat-transaminase enthält, die Absorptions- oder Fluoreszenzänderungen des Reaktionssystems in Abhängigkeit von der Zeit bei 335 und 355 πιμ mißt, Simultangleichungen ersten Grades aufstellt, wobei man die in Bezug auf jedes der Enzyme unabhängige Proportionalbeziehung zwischen den Meßwerten und den Aktivitäten der Enzyme in der Lösung ausnutzt und die Aktivität Jedes Enzyms mittels dieser Gleichungen bestimmt.
13. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Enzymaktivitäten von Cholin-esterase und Lactat-dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem einzigen Reaktionssystem
a) Acetylthiocholin als Substrat zur-Bestimmung der Cholinesterase und ^-,^M-Dithiopyridin oder Dithionitrobenzoesäure als Hilfsreagens zur Bestimmung der Aktivität der Cholin-esterase und
b) Pyruvat und eine reduzierte Form von Niacin-adenin-dinucleotid (NADH) als Substrate zur Bestimmung der Lactat-dehydrogenase
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mit einer Probe einer wäßrigen Lösung vermischt, die Cholinesterase und Lactat-dehydrogenase enthält, die Absorptions-• oder Fluoreszenzänderungen des Reaktionssystems in Abhängigkeit von der Zeit bei 325 und 34-0 mu mißt, Simultangleichungen ersten Grades aufstellt, v/obei man die in Bezug auf jedes der Enzyme unabhängige Proportionalbeziehung zwischen den Meßwerten und den Aktivitäten der Enzyme in der Lösung ausnutzt und die Aktivität jedes Enzyms mittels dieser Gleichungen bestimmt.
14. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Enzymaktivitäten von Cholin-esterase und 2~Hydroxybutyrat-dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem einzigen Reaktionssystem
a) Acetylthiocholin als Substrat zur Bestimmung der Cholinesterase und 4,4t-Dithiopyridin oder Dithionitrobenzoesäure als Hilfsreagens zur Bestimmung der Aktivität der Cholin-esterase und
b) 2-Oxobutyrat und eine reduzierte Form von Niacin-adenindxmicleotid (NADH) als Substrate zur Bestimmung der 2-Hydroxybutyrat-dehydrogenase
mil; einer Probe einer wäßrigen Lösung vermischt, die Cholinesterase und 2-Hydroxybutyrat-dehydrogenase enthält, die Absorptions- oder Fluoreszenzanderungen des Reaktionssystems in Abhängigkeit von der Zeit bei 325 und 340 mu mißt, Simultangleichungen ersten Grades aufstellt, v/obei man die in Bezug auf jedes der Enzyme unabhängige Proportxonalbeziehung zwischen den Meßwerten und den Aktivitäten der Enzyme in der Losung ausnutzt und die Aktivität jedes Enzyms mittels dieser
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Gleichungen bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 9 bis 3A1 dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Reaktion bei einem pH-Wert von 7»2 und einer Temperatur von 37°C durchführt.
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