DE1598321A1 - Laboratoriumsreagens zur Bestimmung der Kreatin-Kinase - Google Patents

Laboratoriumsreagens zur Bestimmung der Kreatin-Kinase

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DE1598321A1 DE19671598321 DE1598321A DE1598321A1 DE 1598321 A1 DE1598321 A1 DE 1598321A1 DE 19671598321 DE19671598321 DE 19671598321 DE 1598321 A DE1598321 A DE 1598321A DE 1598321 A1 DE1598321 A1 DE 1598321A1
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Description

DR. ELISABETH JUNG UND DR. VOLKER VOSSlUS 1598321
PATENTANWÄLTE
8 MONCHEN23 . S I EG ESSTRASSE 26 · TELEFON 345067 · TELEGRAMM-ADRESSE: INVENT/MDNCHEN
u.Z*: ö 762 (Vo/He) München» den 30.6.1967
öalMoehea 1-2~D
GAIiBIOOHEM
los .Angeles, öalifomia,
"Laboratoriusisreagens sur Bestimmung der Kreatin-Kinaee"
Priorität: 30. Juni 1966, T.St.A., Ir. 561757
Die Erfindung betrifft ein laboratoriumsreagene zum Nachwöie und hut Bestimmung der Kreatin-Kinase in biologischen Flüssigkeiten, wie im Seiruia, und Methoden zum Seat solcher Flüssigkeiten mit Hilfe dieses Reegens.
Bas Reagens der Erfindung ist in trockener Form stabil, leicht und bequem verpackbar, es gibt reproduzierbare Ergebnisse und ist einfach im Gebrauch. Dieses Reagens dient jsur Arbeltserleichterung für Biochemiker und Forscher auf ähnliclien Gebieten.
ORIGINAL INSPECTED 209809/0354
Das Reagens» der Erfindung enthält in trockener Form:
Kreatiaphoephat und (Jluoos© als Substrat, Hexokinase und (Jluoose~6'--phosphat-I)©h5ärogenase als Enayme, Menoslndiphosphat und friphosphopyridinnucleotid als Coenzyme,
einen Paffer, um den p^-Wert zwischen 6,5 und 7»5 au halten» wenigstens einen Stabilisator aus der Gruppe Gummi arabicum, Itois-(hy4röxannotbyl5--eaaiaometlian-sulfat, Ammoniumsulfat und Cystein» ein Magnesiumsais als i&tivato? und als stabilisier renden Füllstoff Mannit.
2)as Reagens wird im allgemeinen in Einneitsmengen in Behältern aus Folie oder in Kapseln in den Handel gebracht. Jede dieser Einheiten enthält gerade eine genügende Menge des Reagens» um einen einzigen Tset einer Probe zu machen. Um einen Test durch-» stuf uhren, wird eine Packung ausgewählt, die dae Reagens für diesen bestimmten fest enthält · Das gesamte Reagens in der Packung let vorher gemessen und von festgelegter Aktivität, pemaufolg· kann es unmittelbar in einer Standardoenge Wasser gelöst werden und ergibt ein flüssiges Reagens. Dieses flüssige Reagens wird dann mit der biologischen Probe gemischt und führt m einer enzymatischen Reaktion. Das Ausmaö der Reaktion oder ihre Geschwindigkeit ist eine Funktion der Menge oder der Aktivität der «u bestimmenden
BAD ORIGINAL 209809/0354
Substaiug. Ia federn 5q3tj wird, unabhängig von der besonderen Art der Bestimmung, ein Coeneym aus einer Form la eine eader« überführt, wobei eine der "beiden Formen bei einer bestirnten ¥©lle&l£nge Lieht absorbiert. Dementsprechend wird die optische Monte der Probe bei dieser Wellenlänge als Funktion der *u bostlmmenden Substanz variieren, Buroh Messuixg der optischen Pichte des Ansatzes zu verschiedenen Zeiten kenn man daher Ale Menge oder die Aktivität der eu bestisstenden Subatane in der ursprünglichen Probe berechnen.
Das Beispiel erläutert die Herstellung und die Verwendung de· Reagens.
Beispiel
Das Tollstimdige Reagenö but BeBtinmang des OehAltes an Kxeatin-Kinase (auch Kreatin-PhospbÄkinaBs genannt, abgekürst CBC) In biologischen Proben besteht aus einer trockenen Mischung der folgenden feeten Substanzen*
Enzyme Hexokinase und Gluooss-6«-phoaphat-Dehydro-
genaee β
Paffer Sris-(hydroxymethyl)-amiaomethen-euacinat Stabilisator üiumfli arabicum» Triö-(hydroxyuiethyl)-aalno-
methan-ßulfat, Anmoniuiasulfat und Cystein
Substrate Kreatinphoephat und &luooa·
209809/ 035 U BAD ORIGINAL
Aktivator
Besehleuniger Insulin
Coenzyme Ädenoeindiphospliat wad !Driphogphopyrictia-·
nußleotid
Inhibitor Adenosinraonophosphat Füllstoff Mannit
Zur Herstellung eine? großen Zahl τοπ Kapseln dieses Reagens wird das folgende Verfahren angewendet» das am einer Charge an trockenem Reagens führt, die denn in kleine Portionen geteilt und in passende Kapseln abgefüllt wird. Wenn in diesem Beispiel Mengenangaben gegeben werden, so sind diese ausreichend für die Herstellung einer Charge eur Abfüllung in 10 000 Kapseln.
Der erste Schritt in diesem Verfahren ist die Bereitung der geeigneten Pufferlösung. Der verwendete Puffer besteht aue einer Mischung tob. Trie-(hydro:^ethyl)~amlnomethan und Bernsteinsäure. Diese Chemikalien werden in Sub stan« vermischt und ergeben ein trockenes Pufferpulver, weiches in Wasser gelöst au einem p^Wert »wischen 7t4 und 1,6 führt,
Tris-ChydrozymethyD-aioinoaetlian-sucoinat wird als Puffer vorgeeogenj jedoeh kann ^ede Verbindung, die den Pg-Wert ewisonen
2 09 80 97 0 3 5 U BAD ORIGINAL
6,5 und 795 kalten kann, verendet werden* a.B» Alkalimetallphosphate oder 2!riäthanolarain. Bin trockenes lyo~ philisiertes !Pulver β das die Enisyme Böxokinase und Glucose« ß-phoaphat-Dehydrogenase enthält, wird dann durch Vereinigen der folgenden Chemikalien in den angegebenen Mengen hergestellt·
Gummi arabicum 50 · 100 g
Trie- (fcydroagrmethyl )~aminome than-Puffer,
0>2 m, p^ 7,4 - 7,6 75 - 100 ml
1 xe> pH 7,5
(eingestellt mit Ammoniafc) 75 - TOO
Insulin 50 - 750 ag
Hexakinaae 100 ng
aiuoose-6~phospi]iat-D3hydrogeiiase 100 mg
Sie Trie~(ii}rdro3tgrinetiayl)-aiijinoiaQth€m.~sul£tat-I»ösung wird sunächet bereitet durch lösen von Tris-ChydroaymethylJ-aiBinomethan, das mit einer ausreichenden Menge an Schwefelsäure versetzt wird» so daß eine 0,2 molare Lösung mit einem pH-Vert von 7,4 bie 7»6 entsteht.
Gummi arabicum, Aomoniumsulfat und Insulin werden rollatändig gemischt mit dem Triß-ChydroxymethylJ-ajninomethÄTi-BUlfat au einer homogenen Löeung. Die Eneyiae Hexokinase und £lucoee-6~phoephat-Behydrogenaee werden mit dieser Lösung vereinigt. Die Lösung
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wird gründlieh gemischt. Die gleichmäßig vermischte Lösung wird vollständig gefroren,, hierauf lyophilisiert, wobei ein homogenes Sroekenpulver entsteht, das die S&Bva» enthält. Dieses lyophilisierte Pulver xvird dann getestet, um die .Aktivität der Eaeyiae zu bestimmen. Dazu werden die folgenden Chemikalien in den angegebenen Mengen zu einem Reagens vereinigt:
aiuooselösung 60 Mol/ml (1,08 g/100 ml) Kreatinphosphat 100 mg/ml
iris- (hydrosyjaetfejl )-aminomethan-sttccinat-« Pttfferlösimg
Adenosindiphospiiat 15 mg/ml
Magnesiumsulfat (hydratieiert) 1 g/10 ml Adenoainmonophosphat 60 mg/ml
TFS 10 mg/1 ml Wasser
Wasser lyophilieierte Ibsyznmiechung Cystein-hydrochlorid 12,5 mg/ml
Die Tris~(hydroxymetiiy-l)-aminoai9tliaB-Bucciiiat--Pufferlöeung wird hergestellt durch Lösen von 3,4 g des Puffers, der χα Beginn dieses Beispiels bereitet wurde, in 100 ml Wasser. Die angegebenen Mengen der übrigen Lösungen werden vereinigt und mit der angegebenen Menge Wasser gemischt. Nachdem das Reagens fertiggestellt istr wird seine optische Dichte bei 340 Millimicron bestimmt. Im Anschluß wird eine standardisierte Kreatin-
0,5 ml
0,2 ml
1,0 ml
0,2 al
0,4
8:1 		ml
0,4 ml
10 ag
0,2
20 9809/0354 BAD original
p die 0P02 Internationale Einheiten ent~ h&lt« der Mischung augesetst. Wenn das geschieht, läuft die I© Folgenden beschriebene Reaktion ab. Die seitliche Änderung der optischen Dichte bei 340 Millimicron wird gemessen. Durch Verfolgen der iünäersKg der optischen Dichte während der Reakiloa wird die Aktivität der OPK bestimmt.
Unter den oben beschriebenen üestbedingungen sollte eine Internationale Enzymeinheit tob 0?K bei 340 Millimicron eiae Änderung der optischen Diohte τοη 2„07 pro Minute bei 500C verursachen» Demzufolge sollten die 0,02 Einheiten der standardisierten Lbsimgj die in dieaei» SCest verwendet wurden, eine Indernng der optischen Diohte von 0,414 pro 10 Minuten bei 300O hervorrufen» Wenn eine solche Änderung in dem voranr gegangenen lest eingetreten ist» so haben die Ensyme dee Reagens eine ausreichende Aktivität, um die Fortsetzung der Heratellung des beschriebenen Reagens zu erlauben.
Um das lyophilisierte Polver für die Abfüllung in Kapseln bereiten, werden Ale folgenden Chemikalien in den angegebenen Mengen vereinigt:
209809/035A
BAD ORIGINAL
%* φ vat 1598321
(oben hergestellt) 100 -250 g
Dinatrium-Krsatiaphosphat» SetröhyAret 100 - 200 g
M©gnesituBsulfat, hydratisiert 80 - 120 g
Uatritifs-Adenosm-S-diphoephat,, Dihjdrat 15 - 30 g
. ΪΙ» 12- 18 g
Adenoßin~5~3ionoplio©pliats Moa@lija3?ät 60 - 120 g
S-Iiicoee, wasserfrei 25 - 100 g
öystein*™|jyd.roclilorid 5 -■ 20 g
iyophilieiert© ©isyEsaischung 80 - 200 g
Alle diese OJieaiilcalies li©s©a als trockene Pulver vor und werden taamittelfear xaiieiaander -renaiseht. Die Miso&img wird dasm la elasr SugeXißü&Xe dureii la^^fmdauer-ndes Kahlen in ein feines Pulver überführt. Bas Pulver ist nun fertig stm Seilen in passende Einheitemengen und zem Verpacken in Kapseln. Um die C-röjSes jeder Sinheitemenge ssu hegtljsmen,, muS sunäohst die Aktivität dee Pulvers getestet werden..Hieran* wird eine kleine Trohe das Anoatsjös in e$&®v geeigneten Menge Waese^, wie 2,9 ml gelöst. Der ohen beschriebene Test wird damit wiederholt. Itaroh Heas^ng der Ά&δ.$τνΐΆ$ζ &®? optischen Dichte, die durch die Testreaktion hervorgerufen wird, wird die Aktivität der Eaeyme in dem Pulver, bestimmt. Wird dieses Pulver in Wasser gelöst? so entsteht ein Beagens» das eine Reaktion verursachen wird mit dem Adenosintriphosphat (ΑΪΡ), welches disrch die OPK~Re«ktion
209809/0354
BAD 0R,G,NAL
eraewgt tstrd· Di© GeschwindigSceit dieser Reaktion wird ait steigendes Heagen an ΟΪΚ sstpasluaea, bis sie einen Grenzwert erreicht. Di® Meng© ttst OPE, die nötig ist, damit dieser !"all eintritt, hängt ab von &&v Aktivität der Easyme des Reagens. um die Menge an Sestgulver su berechnen, die In jede Kapsel gefüllt werden soll» m&B demzufolge eine vernünftige Maximalmeiige i^eiatgelegt waräe&s l>is au welcher OPK im S?est eiagesetst werden darf, Zusn Beispiel können dies 0,05 Alctivitätasein* Die Gr-ySe der Slaiieitsmengen, in weiche das geteilt wirde w*?· deaaai derart sein, daß die Reaktionsgeschwindigkeit proportional Isis su 0,05 Aktivitäte-Biiiheiten mit der Ksage sr Oi1K suninssit, Megt diese Proportionalität vor» so rufen 0,05 Einleiten bei 540 Millimicron tmd 300O in 5 Minuten eine Änderung der optischen Dichte von 0,518 hervor,
Man sieht also, dad eine große Zahl von identischen Kapseln hergestellt wird, die eine Bestimmung des Sreatin-Phoephokinaee (CPK)-Gehaltes ist Serum ermöglichen. Sie Stabilisatoren Tx'is-(hydroxymethyli-aminometham-sulfat,. Qwmi araMcum vmA Amrnoniumaulfat sind in der Lage, die Sneyme zu. stabilisieren und deren Aktivität über lange Zeiträume ssu erhalten« De? Puffer Tria-(hydrozyiaetbylj-aminomethan-succinat, das Substrat Glucose und das Ooensjm 1SW sorgen dafür, daß die Test-Reaktion abläuft·
Um eine der Kapseln ssu verwenden sur Bestimmung der Aktivität
09809/0354 BAD OR.G.NAU
der iiTeatin-Phosplio&iass© in ainsia Sorum, TJiird gunäebet eine passende Srobe des Serums bereitet. Die optische Biohte der
Probe wird bei 540 HilXisiicgoa gem@sa©a. Mae der Kapseln wird dann in einer,Stanäard~Menge Wasser» wie 3 ml gelöst. Man erhält ein zmssigBs Heagsas te ricäitlg@a'-&suee imd JÖctivität, um eiaen 5?es*fc der Ssriämprolss a« mache». Biases flüssige Reagens kann dann mit der Sertamprebe vereinigt winden, wobei folgende Reaktionen ablauf «a: . ... /
Sreatiia -f Adenosintripfcioapliat
Adenosintripliospliat *
Wenn diese Reaktionen ablaufen, wird sich:Adenosintriphosphat bildes und wieder verachwinäea, während TPIi in TfNH umgewandelt wird. Da die Komponenten* die duroh das Eeagsns g&lie-fest- herden, iia ÜberscnuS vorliegen, wird die Reaktionsgeschwindigkeit durch die vorhandene Ereatin-Phosphoicinasa bestimmt werden.
Demzufolge wird die Geschwindigkeit der Umwandlung von TPN in TPNH eine Funktion des Gehaltes an GTK in der biologischen Probe sein»
BADORiGiNAL
209 8 09/03 54
Man läßt die Reaktionen für.die Dauer eines normalen Testes (5 bis 10 Minuten) ablauf-se. Tor Ende dieses 2eltraumes je&ooh die Eeeacbionsgesehwindigkeit bestimmt worden» Am BoAb d«s
wird die optisch© Dichte der Prc&e erneut feei 340 Millimicron gsmessen. Da 3EPHH bei dieser Wellenlänge Licht absorbiert* wird die Differens der optischen Dichte vor und nach Ablauf der Reaktionen aus der Änderung der Menge dee gebildeten ÜJPNH resultieren. Ba die Änderung der Menge an TPM mit der Seit eine Funktion der Menge an ΌΈΚ. in der Probe ists kann diese i&tivitSt der Ereatin-Bioaphokinase aus der "Änderung der optischen Dichte berechnet werden*
Adeixosinmonophosphat (MS) wird dem Reagens ssugeäetst, ua die Aktivität &®v Myokinase (auch Ädenylat-Sinaae genannt) au J?edusisren, die gelegentlich in biologischen Proben vorliegt· Myokinase -iifürde folgende Reaktion verursachenϊ
2 Adenosinraonophogphat ~
Adenosintacmophosphat
Das in dieser Reaktion gebildete Aäenosintriphosph&t vUrde au falschen Werten bei der GPK-Beetiramung führen. AMP wird auge~ setstj da es die Bildung von Adenosintriphosphat in dieser Reaktion hemmt.
BAD ORIGINAL 20 9809/03 54
- ta -
Cystein wird angefügts -xm fcei beeiiisiiaten BeMn0mgen die Aktivität der Sreatirs-Phosplioiciiaeee zu scMitseii oder zu
209 809 /03 5 A.BAD ORIGINAL

Claims (2)

P a ten ta 2i sprüche
1) febor&toriiuareagesis sur BGstiffimuag der Kreatia-Sinase in * ■biologischen !Flüssigkeiten* enthaltend in trockener Form a) Kreatiiiphosphat und ßliieose ale Substrat. "b) Hexokinass und Crliico3©~6~piiospiiat~DehydroseBase als Enzyme,, c) Ädenosinüiphosphat raad Sripiioepliopyriaianuolaotid als
d) einen Puffer, ism aera p^~Wert sw5.echeii 6,5 tmd 7?5 su haltent
e) wsziigstens einen Stabilisator aus dei* Gruppe ßuiaaii arabicum,
Cystei»,
ν f) siia MagnesiusasalE sils Atccivator imd . .
g) ifeaait ale ffüllstoff.
2) LalaoratoriiamsreagsaB Bach Anspruch 1, dadurch g e Ii 8 η a ζ e i c h η e ΐ, daß d^r Puffer aue Glycia toad v Hatriumearbonat besteht.
209809/035A
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