DE1623075A1 - Verfahren zum Bestimmen der Menge an Kreatinphosphokinase - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung der Menge an Kreatin- Phosphokinase (CFK) in Serum und anderen Tiermedien, wie z.B. Extrakten von Tiergeweben, im Unterschied zu gereinigtem Knzym«

Eine Erhöhung der CPK-Aktivität von Seren begleitet bestimmte Typen an progressiver muskulärer Dystrophie (Ernährungsstörung) und des Mykard.Infarktes, deshalb ist der CPK-Spiegel, selbst wenn keine Verschlechterung der Lebererkrankung oder des Lungeninfakts beobacgtet werden konnte, ein· wertvolle Hilfe bei der Different ialdiagnose, . ^:

Es sind bereit· mehrere Verfahren zum Beitimmen der CPK bekannt. Di· vorliegende Erfindung ist eine Verbesserung der Methoden, dl« von Enor und Stocken in Blochem. J 42,557 (1948); Ennor unJ Eoewoberg in Biochem. J 57, 203 (1954); von Chappel und Perry

in Biochem. J. 57, 421 (1954) und von Hughes L. '

009121/1002 BADORIG.NAL

in Klin. Chim. Acta, 7, 597-603 (1962) beschrieben wurden.

Das vorliegende Verfahren beruht auf der folgenden Reaktion:

1. Adenosindiphosphat + Phosphokreatin CPK w Adenosintriphosphat + Kreatin

2, Kreatin + aC-Naphtol + Diacetyl ■ - Farbkompiex

Die erste Reaktion ist reversibel, doch ist unter den Bedingungen des erfindungsgemässen Verfahrens die erzeugte Kreatin- Menge eine Funktion der vorhandenen CPK-Meηge.

Es sind Methoden bekannt, bei denen die obigen Reaktionen für die Bestimmung COK in Serum verwendet werden, wobei die Deproteinisierung der Testlösung nach der Methode von Somogy, J, Biol. Chera. 160 (1945) 69, oder nach seinem Äquivalent eine Rolle spielt, bei dem ein flockiger Niederschlag gebildet wird, mit dem das Protein herausgenommen wird.

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Bestimmen der CPK anzugeben, das einfach ist und weniger Zeit erfordert als die bekannten Verfahren,

Andere Aufgaben sind dem Fachmann im Licht der folgenden Beschreibung ohne weiteres verständlich.

Nach dem erf indunsrsgemäQen Verfahren besteht rl ie Methode zum Bestimmen der CPK-iConzentration in einem ungereinigten tierischen Medium in folgenden Stufen: Es wird zunächst eine genau bekannte Menge an Phospho'creatinlösung und eine genau bekannte Menge an tierischem Medium, die eine unbekannte

BAD ORäGiWÄL

010 9821/100 2

Menee an CFK enthält, gemischt; anschliessend wird eine p bekannte Menge an ADP und Glutathion zugegeben, worauf die Mischung eine reiiau bekannte Zeitspanne im Brutschrank auf einer genau bekannten Temperatur gehalten wird; anschliessend wird die ileaktion unterbrochen, man fügt eine bekannte Menge einer Verbindung hin-zu, die mit Kratin eine gefärbte Lösung bildet, wobei ihre Farbtiefe (gemessen als optische Dichte oder als prozentuale Durchlässigkeit) eine Funktion der Kreatinmenge ist, danach lässt man die Farbe entwickeln, worauf die Lösung ohne Deproteinlsierung derselben zentrifugiert wird; schliesslich wird die Farbtiefe und dealt die Menge an Kreatin und die Menge an CPK bestimmt. Die letzte Stufe erfolgt gewöhnlich graphisch.

Bei einer bevorzugten Ausführungsfora des erflndungegemäiseB Verfahrens ist die Verbindung zur Bildung der gefärbten LW-sung dC-Naphtol und Diacetyl, die man 20 Min. lang bei 37°C

sich entwickeln lässt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das gesamte Verfahren in einem einzelnen Rohr oder Röhrchen durchgeführt, wobei das Glutathion und ADP zusamraengegeben und der Reaktion gleichzeitig zugeführt werden«

In einem AusfUhrungsbeispiel, das die bevorzugte Methode erläutert, wird die CPK-Aktivität in ^BSigaa"-Einheiten pro al Serua definiert. Eine Sigma-Einheit ist definiert als die Menge CPK, die ein Milliaicro-Mol Kreatin pro Minute bei 25°C phosphoryliert, wenn der ^xest, wie bei dea Ultraviolett-

00982 1/ '0 0 t BADOR₁Q₁NAL

Verfahren durchgeführt wird, das im Sigma Technical Bulletin Nr, 40-UV (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri) beschrieben ist. Dies macht die Einheiten des vorliegenden Verfahrene direkt vergleichbar mit den Einheiten, die nach des 40-UV-^est erhalten werden«

Die bevorzugten Methode wird in de· folgenden Beispiel erläutert:

Beispiel Die vorliegenden Reagenzien werden hergestellt:

A. Phosphokreatin*Lösung in Magnesium-Tris-Buffer, hergestellt wie folgt:

(45 mg Phosphokreetin, Natriumsalz, Hydrat, gelöst in 15 ml 0,0096 ra Magnesiumsulfat und 0,16 m Tris-(hydroxy tiethyl) -eminoniethan, die auf einen pH von 7,5 bei 25°C mit HCl eingestellt worden sind.

B. Adenoslndiphosphat-Glutathlon-Lö'sung (52 mg ADP, Natriumsalz, Hydratl 37mg Glutathion, reduzierte Form, in 6 ml Wasser.)

β. ρ—Hydroxymercuribenzoat-Lösung, 0,0 5M, hergestellt wie folgt: (2,1 g p-Hydroxymercurlbenzoat, NatriuBsalz, werden In 50 nl 1,0 η Natriuahydroxyd gelöst; man fügt 45 nl 1-n HCl langsam unter konstantem Rühren zu und verdünnt schllessllch mit Wasser auf 100 ml).

BAD ORIGiNAL

009821/1002

D. -Naphtol, 200 mg, gelöst in 10 al Alkalilösung.

( Die Alkali- Lösung besteht au* 0,60 g Natriumhydroxyd und 1,6- g Natriumkarbonat, wasserfrei, gelöst in 10 ml Wasser)·

E. Diacetyllösung ( ο,1 al Diacetyl in 2oo «1 Wasser)₀

F. Standard- Kreatinlösung (4,0 Micromol Kreatin in 10 ml Wasser).

Die Standard- Kreatinlöeung (Reagenz F ) dient dazu, unter Verwendung des bei den Versuchen üblichen Kolorimeters eine Kalibrierungskurve herzustellen· Es muss nur eine Kalibrierungskurve für irgend ein Kolorimeter bei einer bestimmten Wellen-* länge hergestellt werden, jedoch führen verschiedene lolorimeter und verschiedene Wellenlängen zu unterschiedlichen Ergebnissen. Infolgedessen sollte die Durchführung von Versuchereihen mit dem gleichen Kolorimeter bei der gleichen Wellenlänge erfolgen«

Als Beispiel einer Methode znm "erstellen einer Kälibrierungskurve werden 6 Proben einer Kreatinlöeung hergestellt, wie die· in der folgenden Tabelle angegeben ist:

BAD

009821/1002

Herstellung der Kreatin -CPK- Kalibrierungskurve

	U)	(2)	O)	U)	(5)	(6)	ex
	lökrohbon Nr,	Staadard-Kreatln- lbsung (Reagens F) ■1	Wasser ■1	Optische Dichte	Äquivalent Sigma-Einheiten (PK) ml Serum
O	1	0	1.0	0	0	Micromöl Kreatin in jeden Versuchs roh rc her
860	2	0.2	0,8	0.135	32
Mf	3	0.4	0.6	0.275	64	0
	4 5	0.6 0.8	0.4 0.2	0.413 0.550	96 128	0.08
O O K)	6	1.0	0	0,690	160	0.16
						0.24 0,32
	0,40

D O

S >

CD KJ CO CD

cn

-T-

üb die Werte in der Spalte 4 zu erhalten, werden die an Standard-Kreatinltia^ng und Wasser, die in den Spalten 2 und 3 der Tabelle angegeben sind, in die Versuchsröhrchen gegeben (Spalte l). In jedes Höhrchen werden l,o ml oC-Naphthollösung, 1,0 ral Dlaretyllösung und 7,0 ml ffnaser gegeben« ^üer Inhalt wird vermischt und man lässt ihn bei Raumtemperatur (25°C - 5⁰C ) 15 Minuten zum Ausbilden der Farbe stehen* Die optische Sichte (oder prozentuale Durchlässigkeit^ jedes Reagenzglas·* wird dann erhalten und die Werte werden in die Spalte 4 eingetragen-Die Ablesungen sollten innerhalb 10 Mi₀. durchgeführt sein, nachdem die Entwicklungsperlode für die *arbe beendigt ist« Dann wird eine Kalibrierkurv· auf rechteckigen Koordinaten gezogen, von denen eine die optische Dichte (oder prozentuale Durchlässigkeit) und die andere die Sigma-*inheiten tob CPK pro ml Serum bedeutet. Die Varsuohsergebnitse werfen daaaf>bei Anwendung des erfindungsgemMssen Verfahrens atxf ungereinigte Tiermedien aus Einheiten der optischen Diehte (oder Proaent T) in Sigma-Einheiten CPK pro ml Serum mit Hilfe der Kalibrierungekurve umgewandelt·

Die Werte, aus' denen die Kurve aufgetragen wird, werden aus den Ergebnissen der beobachteten OD (oder ^T) (Spalte 4) erhalten, in denen zum Zwecke der Erläuterung eine Gruppe von typisohen Messwerten von einem Beokaan Dü-Koloriaeter bei einer Wellenlänge von 520 mu angegeben sind«

Danachi kann eine Bestimmung der CPK-Aktivitat in dem ungereinigten tierischen Medium durchgeführt werden, das im Falle dieses Beispiels Serum ist·

BAD ORIGINAL

009821/1002

1623Ö75

Zwei KUvetten fUr das Kolorimeter werden «it "Test" und "Bllndrersuch" bezeichnet. In beiden Rühren werden O_V5 al Phorfphokreatin· lösung (Reagens A) pipettiert. Nur in das "Test"<-ftöhrchen werden 0,1 al eines alt Wasser lo-fach verdünnten Seruae gegeben· In das «Blindversuch¹¹-Röhrchen werden 0,1 al Wasser pipettiert· Beide Röhrchen werden in ein Wasserbad mit 37°C gestellt, bit sie diese temperatur erreicht haben.

Die genaue Zeit der nächsten Stufe wird notiert« Bei dieser Stufe werden 0,2 ml ADP-Glutathionlösung (Reagens B) jedea Rohr zugegeben. Die Röhrchen werden kräftig geschüttelt und in das Wasserbad gestellt und nan lässt sie genau 3o Min« lang brüten.

Nach Ablauf der 3o Minuten Inkubationszelt werden zu jedea Röhrchen 0,2 ml p-Hydroxyraerkuribenzoatlösung (Reagens C) gegebei.* die gründlich damit vermischt werden, um die Reaktion zu unter* brechen.
Dann werden zu jedea Röhrchen 1,0 aloC-Naphtollösung (Reagens D)

1,0 al 0,05%-ige Diacetyllösung (Reagens E) und 7,0 al Wasser gegeben» Der Inhalt des Röhrebene wird nach der Zugabe jedes Reagens durch Schütteln gemischt«

Die Röhrchen werden dann erneut in das Wasserbad bei 37 C 15-20 Minuten lang eingestellt, daalt sich die Färb« entwickeln kann«

Beide Röhrchen werden dann 5 Minuten lang zentrifugiert« Die OD (oder prozentuale T) der überstehenden Flüssigkeit wird dann in dem Kolorimeter ermittelt, für das die Kalibrierungekurve hergestellt worden ist«

00 9821/100 2 bad original

Das "Blindversuch"-Röhrchen dient als Bezug für das gleiche Instrument und für die gleiche Wellenlänge, wie sei bei dir Herstellung der Kalibrierkurve und bei« Ermitteln der OD oder %T des YTesf-RHhrchens verwendet worden sind» Das Ablesen

sollte innerhalb von 10 Minuten nach dem Zentrifugieren beendigt sein.

Die CPK-Aktivität des Serues, welche die von der Kurve angegebene CPK-Aktivität ist, minus irgend einer offensichtlichen CPK'Aktivität des Blindversuches, kann dann direkt bestimmt werden.

Wenn die Aktivität der Testprobe 160 Sigma-Einheiten pro Milliliter übersteigt, sollte die Bestimmung unter Verwendung einer stärkeren Verdünnung des Serums und durch Multiplizieren der Ergebnisse mit dem entsprechenden Faktor wiederholt werden» Wenn beispielsweise eine zweifache Verdünnung angewendet wird, sollte die CPK-Aktivität mit 2 multiplziert werden· Andererseits kann die Inkubationsperiode verringert werden und die Ergebnisse müssten dann mit de« gleichen Faktor multipliziert werden. So kann man die Mischung 5 Minuten bebrüten, anstelle von 30 Minuten; man muss dann das Ergebnis mit 2 multiplizieren·

Für eine beliebige Anzahl von Versuchen, die bei einer Sltsung unter Verwendung der gleiohen Reagenzien und dee gleichen KoIorimeters durchgeführt werden, ist nur ein Blindvereuch erforderlich·

Man wird beobachtet haben, dass die Farbentwicklung der Proben für die Kalibrierungskurve bei 25⁰C durchgeführt wurde, während die Farbentwicklung für die Testprobe während der gleichen

0 0 9 8 21/10 0 2 ^BAD o^RiGINAL

spanne bei 37°C erfolgte. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sich die Farbe in Abwesenheit von Serueproteinen und anderen Komponenten der Testreaktionsmischung schon bei 25⁰C voll entwickelt, während die höhere Temperatur wesentlich ist für die richtige Entwicklung der Farbe in der Testreaktionsmischung innerhalb der vorgeschriebenen 2eit.
Aufgrund der obigen Beschreibungen kann der Fachmann zahlreiche

Variationen bei dem erf indungsgemä'ssen Verfahren durchführen, ohne den Bereioh der Erfindung zu verlassen«, Wenn auch beispielsweise die Verwendung von Glutathion als Sulfhydral zahlreiche und wichtige Vorteile mit sich bring, besonders in der Kombination von Glutathion und ADP, so können doch auch ohne Deproteinisierung Cystein und 2-4ierkaptorathanol verwendet werden, wenn es sich um frische Präparate handelt und die gesondert zugegeben werden«

009821/100 2

Claims (2)

Patentansprüche 1623078

1. Verfahren zum Bestimmen der CPK-Konzentrationen in dicht gereinigte« tierisches Medlua, dadurch gekennzeichnet, daü

nan eine genau bekannte Menge an Phosphokreatinlösung Und ein· bestimmte Menge an tierischem Medlua, welches eine unbestlaate Menge an CPK enthält, miteinander aischt, dann eine bestiaat« Menge an ADP und eine SuIfydrllverbindung hier zufUgt, danach die Mischung eine bestiaate Zeit lan bebrütet, schließlich die Reaktion unterbricht, dann eine bekannte Menge einer Verbindung zufUgt, die mit Kreatin eine gefärbte Lösung bildet^ wobei deren Farbtiefe eine Funktion der Kreatinaenge ist und ■an dann die Farbe sich entwickeln lässt, die Lösung ohne Deprotelnlsierung der Lösung zentrifugiert, die *arbtiefe und damit die Kreatinmenge sowie die CPK-Menge bestiaat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Verbindung, welche die gefärbte Lösung bildet,

aC -Naphtol und Diacetyl verwendet und die Farbe sich 2o Min« lang bei 37⁰C entwickeln lässt

3» Verfahren nach Anspruoh 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet dass aan das gesaate Verfahren in eine· einzelnen Versuchsrtthrchen durchführt«

4« Verfahren nach Anspruoh 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass aan als Sulfhydryl Glutathion, Cystein oder 2-Merkaptoäthanol verwendet

BAD ORlQiML

009821/1002

■_■-■- 12 -

5« Verfahren nach Anspruch i bis 4, dadaroh gekennzeichnet, dass man zunächst Glutathion und ADP miteinander rermischt und diese Substanzen dann zusammen der Lösung zufügt»

BAD ORIGINAL

009821/1002