Verfahren zum Bestimmen von Kreatin-Phosphokinase
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestimmen von Kreatin-Phosphokinase durch Umsetzen von Adenosintriphosphat mit Kreatin in einer Lösung mit einem unbestimmten Gehalt an Kreatinphosphokinase unter Bildung von Adenosindiphosphat und Phosphokreatin.
Bei der Herstellung von Kreatin-Phosphokinase und bei der Herstellung von Reagenzien, die frei von Kreatin Phosphokinase sind, wie z.B. Milchsäuredehydrogenase und Pyruvat-Kinase, die bei der Prüfung auf/oder Untersuchung von Kreatin-Phosphokinase benutzt werden, ist es wichtig, ein einfaches aber wirksames Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins und des Gehaltes von Kreatin-Phosphokinase in tierischem Serum oder eines anderen biologischen Mediums aus dem Kreatin-Phosphokinase oder ein anderes Enzym extrahiert wird. Verfahren zur Extraktion von Kreatin-Phosphokinase sind von Noda, Kuby und Lardy in der Zeitschrift Biologische Chemie, Band 209, Zeile 291 ff und Seite 203 ff, 1954 beschrieben.
Vorübergehend erhöhte CPK-Werte wurden weiterhin von milden Herzmuskel-Infarkten berichtet, während bei Lungeninfarkten im wesentlichen normale Werte festgestellt wurden. Sowohl von mässig starker Muskelanstrengung als auch von Unterfunktion der Schilddrüse sind ebenfalls erhöhte CPK-Spiegel berichtet worden. Bei einer grossen Vielfalt von Störungen sind weiterhin im wesentlichen normale Werte festgestellt worden. Die CPK Bestimmung basiert auf der Tatsache, dass dasselbe einen spezifischen Katalysator für eine umkehrbare Reaktion darstellt, in der Adenosin-Triphosphat (ATP) und Kreatin unter Bildung von Adenosin-Diphosphat (ADP) und Kreatin-Phosphorsäure miteinander reagieren: (1) ATP + Kreatin fit ADP + Kreatin-Phosphorsäure.
Das Gleichgewicht der Reaktion (1) ist ausserordentlich pH abhängig. Der optimale pH-Wert für die nach rechts verlaufende Reaktion (Bildung von ADP und Kreatin Phosphorsäure) liegt bei etwa 9, während er für die umgekehrte Reaktion bei etwa 7,2 liegt.
Sowohl die nach rechts verlaufende als auch die Rückreaktion sind bei einer Vielzahl von Methoden zur Bestirnmung von CPK verwendet worden. Eine der zuerst benutzten Methoden [Ebashi et al, J. Biochem. (Tokyo), 46, 103 benutzte die nach rechts verlaufende Reaktion und bestimmte colorimetrisch den freien Phosphor, der durch Hydrolyse der Kreatin-Phosphorsäure gebildet wurde. Diese Methode hat sich als sehr einfach erwiesen; sie ist jedoch nicht sehr empfindlich. Weiterhin ist dabei erforderlich, dass die Serumproben bereits wenige Stunden nach der Probeentnahme für die Tests verwendet werden, weil sogar Proben, die beim Gefrierpunkt gelagert wurden, variierende Verminderungen der CPK-Aktivität zeigten, wenn sie nach dieser Methode geprüft wurden.
Wegen dieser Nachteile wurde eine Anzahl alternativer Methoden entwickelt. Tanzer und Gilvarg (J. Biol.
Chem. 234 - 3201) verbanden mit der vorgenannten Reaktion (1) die nachfolgenden Reaktionen: (2) Phospho (enol) pyruvat + ADP w Pyruvat + ATP (3) Pyruvat + DPNH + H Re Lactat + DPN
Die Geschwindigkeit der Oxydation von DPNH (dihydro diphosphopyridin nucleotido) wird mit einem UV Spektrophotometer bei 340 ma gemessen. Einige der mit dieser Methode verbundenen Schwierigkeiten sind sofort erkennbar. Es ist ein Spektrometer im Empfindlichkeitsbereich von 340 - 360 m'a erforderlich. Während der gesamten Zeit, in der Ablesungen gemacht werden, muss die Temperatur konstant auf 250C gehalten werden. Die Ablesungen müssen innerhalb genauer Zeitintervalle durchgeführt werden.
Ferner erfordert diese Methode 2 ml Serum und gibt sehr geringe, daher ungenaue Ablesungen für Normalserum. Trotz dieser Nachteile scheint dies jedoch die am meisten verwendete Methode zu sein.
Andere Forscher haben die Rückreaktion (1) verwendet. Bereits im Jahre 1954 haben Ennor und Rosenberg (Biochem. J. 57, 203) über eine Reihe von Experimenten berichtet, bei denen sowohl die nach rechts verlaufende als auch die Rückreaktion (1) bei einem pH-Wert von 10,5 für die nach rechts verlaufende Reaktion (1) und einem pH-Wert von 7,2 für die Rückreaktion (1) verwendet wurden. Bei der Verwendung von gereinigten CPK aus Skelettmuskulatur von Schafen und bei der Bestimmung des verbleibenden oder gebildeten Kreatins berichteten sie u.a. über zwei wichtige Feststellungen. Sie fanden zunächst, dass trotz vieler Experimente fünfzigmal so viel CPK für die nach rechts verlaufende Reaktion (1) als für die Umkehrreaktion erforderlich war, um eine geeignete Reaktionsgeschwindigkeit zu erzielen.
Ferner fanden sie, dass der Zusatz von Cystein, obgleich er eine Beschleunigung der Reaktionsgeschwindigkeit der Umkehrreaktion (1) bewirkt, auf die Geschwindigkeit der nach rechts verlaufenden Reaktion keinen Einfluss aus übt. Jüngere Forscher haben die Lehre von Ennor und Rosenberg weiter verfolgt. Hughes Clinica Chemica Acta, 7, 597 (1962) verwendet die Umkehrreaktion (1), setzt eine Sulfhydryl-Verbindung zu und bestimmt das gebildete Kreatin. Er fand, dass diese Methode ein lineares Verhältnis zwischen der Menge des CPK und der Menge des gebildeten Kreatins ergibt und dass reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden, obgleich die Sulfhydryl-Verbindung auf die Berechnung des Kreatins störend einwirkt. Nielsen und Ludvigsen [j. Lab. & Clin.
Med., 62, 159, (1963)] verwenden noch eine andere Methode, die 1,75 ml Serum erfordert und sie zitierten Ennor und Rosenberg bezüglich des Lehrsatzes, dass vergleichbare Messungen unter Verwendung der nach rechts verlaufenden Reaktion (1) eine fünfzigmal so hohe Konzentration an CPK erfordert.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfaches und genaues Verfahren zum Bestimmen von Kreatin-Phosphokinase zu schaffen.
Eine andere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zu schaffen. bei dem die zu prüfenden Sera sowohl frisch als auch gelagert sein können.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man der ATP und Kreatin enthaltenden Testlösung eine Sulfhydrylverbindung, einen Puffer zuni Einhalten eines pH-Wertes von angenähert 9,0, Phosphoenolpyruvat, Pyruvatkinase, Milchsäuredehydrogenase und DPNH zusetzt, eine erste spektrophotome trische Massung der Lösung vornimmt etwa fünf Minuten nachdem alle Reaktionsteilnehmer der Lösung zugemischt worden sind, nach einer bestimmten Zeitspanne eine zweite spektrophotometrische Messung bei derselben Wellenlänge wie bei der ersten vornimmt und aus der Differenz der beiden Messwerte den Gehalt der Lösung an Kreatin phosphokinase ermittelt.
Ganz allgemein wird mit dem erfindungsgemässen Verfahren eine Verbesserung des bekannten Verfahrens zur Bestimmung von Kreatin-Phosphokinase angestrebt und erreicht, indem bei einem Verfahren der vorerwähnten Art die Konzentration von DPNH spektrophotometrisch gemessen und die Abnahme der DPNH Konzentration zu der Aktivität der Kreatinphosphokinase in der Lösung in Beziehung gesetzt wird. Im Gegenteil zu den vorstehenden Lehren von Ennor und Rosenberg wurde nämlich gefunden, dass unter den bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Reaktionsbedingungen bei einem pH von etwa 9 der Zusatz einer Sulfhydryl-Verbindung eine mehrfache Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit und weit besser reproduzierbare Ergebnisse sogar mit Serum, welches eine beträchtliche Zeit gelagert worden ist, ergibt.
Es wird daher ein hochempfindliches und reproduzierbares Verfahren zur Bestimmung der cPK geschaffen, bei dem nur eine geringe Menge Serum erforderlich ist.
Die erfindungsgemässe Methode kann auf zahlreiche Verfahren angewandt werden, die die nach rechts verlaufende Reaktion (1) und entweder ADP oder Kreatinphosphorsäure messen.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch auf eine Methode angewendet werden, bei der Kreatinphosphat hydrolysiert und der dabei in Freiheit gesetzte anorganische Phosphor kolorimetrisch bestimmt wird. Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich ferner auf die oben erwähnte Methode von Tanzer und Gilvarg in einer modifizierten Weise anwenden, die weit einfacher, empfindlicher und zuverlässiger als die nicht modifizierte Methode ist.
Bei dem modifizierten Verfahren werden die folgenden Reaktionen mit der obigen Reaktion (1) gekuppelt, in Gegenwart eines Sulfhydryls: (4) ADP + Phospho (enol) Brenztraubensäure
Pyruvat
ATP
Kinase
Milchsäure (5) Brenztraubensäure + ,3-DPNH
Dehydrogenase
Milchsäure + -DNP
Genau bekannte Mengen aller Reagenzien werden zur Herstellung einer Lösung mit bekanntem Volumen verwendet. Es ist zu erkennen, dass die Regenerierung von ATP in der Reaktion (4) nach einer kurzen Inkubationszeit zu einer konstanten Konzentration von ATP führt.
Unter den Bedingungen des modifizierten Verfahrens hat sich gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit nach einer kurzen Inkubationszeit linear wird. Deshalb besteht keine Notwendigkeit, die Reaktionsgeschwindigkeit durch häufige Ablesungen auf einem UV-Spektrophotometer zu messen: es ist lediglich eine Anfangsablesung nach der Inkubationszeit und eine abschliessende Ablesung nach Ablauf einer vorbestimmten Zeitspanne, z.B. nach 10 Minuten notwendig. Wegen der Instabilität einiger Reagenzien nach ihrem Einmischen in die Lösung wird eine Blindprobe hergestellt, die alle Reagenzien mit Ausnahme von Kreatin enthält; die Anfangs- und Abschlussablesungen am Spektrophotometer werden so durchgeführt, dass diese Blindprobe als Standard dient.
Wie bei der nicht modifizierten Methode wird das Spektrophotometer auf 340 mz eingestellt, eine Wellenlänge, bei der DPNH eine hohe Dichte besitzt. Die Abnahme der optischen Dichte ist proportional der CPK-Aktivität im Serum.
Die bevorzugte modifizierte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist folgende: Es wird so ausgeführt, dass die Lösungen bei einer Temperatur von 250C gehalten werden.
Die folgenden Reagenzien werden in eine Ampulle oder in einen Kolben pipettiert, der 1,0 mg ,3-DPNH enthält:
Beispiel I
0,5 ml Phospho (enol)-pyruvat-Lösung (60 Mikromol aktives Phospho (enol)-pyruvat, z.B. Tricyclohexylaminsalz in 10 ml Mg-tris-Puffer, d.h. 0,015 Mol Mg SO4 und 0,6 Mol Tris-(hydromethylamino)-methan, eingestellt mit HCI auf einen pH von 9,0 bei 250C)
3,5 ml Wasser 0,2 ml Serum 0,2ml ATP-Glutathionlösung (aliquoter Teil einer
Lösung, die 310 mg ATP, Na, 3H20, 190 mg Gluta thion, reduzierte Form, und 3,7 ml Wasser enthält)
0,1 ml PK :
LDH Enzyme (je 2 mg kristalline Pyru vatkinase und Milchsäure-dehydrogenase pro ml 2,2 molare Ammoniumsulfat-Lösung).
Die Ampulle wird mit einer Kapsel verschlossen und mehrmals gekippt, um das DPNH zu lösen. Dann werden 2,0 ml dieser Lösung in je 2 Küvetten mit einer Lichtstrecke von 1 cm pipettiert. In eine dieser Küvetten werden 1,0 ml Mg-Tris-Pufferlösung (0,015 Mol MgSO4 und 0,6 Mol Tris, eingestellt mit HCL auf einen pH von 9,0 bei 250C) pipettiert. Diese Küvette wird als die Bezugsküvette bezeichnet. In die andere Küvette, die Versuchsküvette, werden 1,0 ml Kreatinlösung, die 0,06 Mol Kreatin in Mg-Tris-Pufferlösung enthält, bei einem pH-Wert von 9,0 bei 250C pipettiert. Der Inhalt jeder Küvette wird durch Kippen bzw. Umdrehen vermischt und genau bei 250C gehalten.
Im Idealfall ist das für diese Methode verwendete Spektrophotometer mit einer die Temperatur konstant haltenden Einrichtung versehen, damit die Temperatur von 250C konstant gehalten werden kann und die Küvetten werden sofort in das Spektrophotometer gestellt.
Wenn das Spektrophotometer nicht mit einem Thermostat ausgestattet ist, können die Küvetten in ein Bad von konstanter Temperatur gestellt werden. Nach ungefähr 5 Minuten wird das Spektrophotometer so eingestellt, dass sich bei der Bezugsküvette im Lichtweg bei 340 mu ein Wert von 0,400 für die optische Dichte ablesen lässt.
Die optische Dichte der Versuchsküvette wird dann abgelesen und notiert. Dies ist die Ablesung Null-Zeit (To). Genau zehn Minuten nach der Ablesung der Null Zeit wird das Spektrophotometer auf den Wert 0,400 optische Dichte eingestellt, wenn sich die Bezugsküvette im Lichtweg befindet und die optische Dichte der Versuchsküvette wird erneut abgelesen. Dies ist dann der 10 Minuten Wert (Tlo). Die Differenz zwischen T0 und T1, ist direkt proportional der Aktivität der cPK in dem Serum.
Obwohl die Differenz zwischen To und Tla selbst ausreichend sein kann, um den Aktivitätsgrad der cPK in dem geprüften Serum nach einer grossen Anzahl von Bestimmungen anzuzeigen, will man oft die CPK-Aktivität in Abhängigkeit einer Standardeinheit für diese Methode bestimmen. Diese Einheit kann bestimmt werden als die Aktivität von CPK, welches 1 Milli(mikro)mol Kreatin pro Minute bei 250C unter den Bedingungen des hier beschriebenen Verfahrens phosphorylisiert. Diese Definition erlaubt es, dass die Ergebnisse von verschiedenen Personen, die diese Methode angewandt haben, verglichen werden können und gewährleistet, dass es sich um einen brauchbaren Standard handelt, auf den andere Einheiten für andere Methoden mit Hilfe eines einfachen Umrechnungsfaktors umgewandelt werden können.
Die Einheiten der CPK-Aktivität bei dem erfindungsgemässen Verfahren können durch die folgende Formel erhalten werden:
Einheiten der CPK pro ml Serum = (OD) x (3,0) X (1000) (6,22) X (0,089) X (10) = 540 (hOD)
Der Ausdruck AOD gibt die Differenz zwischen dem T,- und Tl0-Wert an; 3,0 bedeutet das Volumen der Flüssigkeit in jeder Küvette; der Faktor 1000 ist erforderlich für den Übergang von 1l Mol auf m Mol; 6,22 die Extinktion pro m Mol für B-DPNH bei 340 mu; 0,089 stellt das Volumen des Serums in jeder Küvette in ml dar und 10 ist die Zeit in Minuten.
Wenn OD grösser als 0,30 ist, sollte die Bestimmung unter Anwendung einer geeigneten Verdünnung des Serums wiederholt werden und das neue Ergebnis mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert werden.
Hess und Mac Donald haben empfohlen, die Verdünnung mit einem Wärmeinaktivierten Serum (Serum bei 560C 15 Min. lang erhitzt) vorzunehmen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass kein nennenswerter Unterschied besteht, gleichgültig, ob die Verdünnung mit einer Sole (0,9%ige NaCl-Lösung) oder mit einem Wärmeinaktivierten Serum erfolgt.
Obwohl die Interpretation der erhaltenen Ergebnisse keinen Teil der Erfindung darstellt, kann angenommen werden, dass ausgedrückt in Einheiten, wie sie für dieses Verfahren definiert worden sind, normales Serum 0 - 12 Einheiten enthält, wobei die Grenzaktivität bei 12-20 Einheiten pro ml und eine zu hohe Aktivität oberhalb von 20 Einheiten pro ml liegt.
Die Verwendung der Standardlösung ist bei diesem Verfahren erforderlich, weil sogar in Abwesenheit von zugesetztem Kreatin eine Verringerung der optischen Dichte auftritt. Der grösste Anteil dieser Verringerung wird durch die spontane Zersetzung von ATP und DPNH und durch die Gegenwart der folgenden Enzyme im Serum verursacht:
ATPase, DPNH-Oxidase und alkalische Phosphatase.
Ein Vorteil des Verfahrens ist darin zu sehen, dass es sehr leicht einwandfrei geprüft werden kann, ob sich die Reagenzien befriedigend verhalten. Dieses Prüfverfahren kann gelegentlich als Teil der Bestimmung vorgenommen werden. Kurz vor der Ablesung der O-Zeit wird die optische Dichte der Standardlösung unter Verwendung von Wasser als Bezugssubstanz abgelesen. Wenn die optische Dichte der Standardlösung niedriger als 0,8 ist, dann befindet sich zuviel ADP in der ATP oder es befindet sich zuviel freies Pyruvat in der Phospho (enol) -pyruvat-Lösung oder es ist zu wenig -DPNH in der Ampulle. Eine zweite Prüfung wird vorgenommen, indem man die Ablesung 5 Min. nach der O-Zeit (T sowie die gewöhnliche Ablesung nach 10 Min. Tlo) vornimmt.
Der Unterschied zwischen T0 und T, sollte im wesentlichen der gleiche sein, wie der Unterschied zwischen Ta und T10. Wenn dies nicht der Fall ist, ist es wahrscheinlich, dass die Temperatur nicht konstant ist oder dass möglicherweise eines der Reagenzien wie bei der ersten Prüfung versagt hat. Eine dritte Prüfung folgt dann der Ablesung nach 10 Min., indem man wiederum die optische Dichte der Standardlösung unter Verwendung von Wasser als Bezugssubstanz abliest. Eine optische Dichte unterhalb 0,7 zeigt an, dass eines der gleichen Probleme, wie bei der ersten Prüfung vorliegt. Eine vierte Prüfung wird gemacht, indem man etwa ein halbes mg ADP zu der Standardlösung gibt. Nach 2 oder 3 Min. sollte die optische Dichte um 0,4 oder mehr gesunken sein.
Wenn dieser Abfall der optischen Dichte nicht beobachtet wird, und wenn die optische Dichte vor der Zugabe von ADP oder höher war, ist die PK/LDH-Enzymlösung inaktiv.
Aufgrund der obigen Beschreibung sind dem Fachmann zahlreiche Variationsmöglichkeiten des erfindungsgemässen Verfahrens unter Verwendung eines Sulfhy drils bei der obigen Reaktion (1) bei einem pH von etwa 0,9 geläufig. Das im einzelnen näher beschriebene Verfahren kann ebenfalls beträchtlich variiert werden. Beispielsweise kann der Anteil an Phospho (enol)-pyruvat -Lösung beträchtlich erhöht werden. Andere Puffer, z.B.
ein Glycinpuffer können ebenfalls verwendet werden, um den pH bei etwa 9,0 zu halten. Auch Küvetten mit einem anderen Lichtweg als der Küvette mit einem Lichtweg von 1 cm können verwendet werden, wobei in diesem Fall die berechneten Einheiten der CPK-Aktivität dividiert werden müssen durch den tatsächlichen Lichtweg in cm, um die Aktivität in den hier definierten Einheiten zu erhalten. Wenn man ungefähr 5 Min. wartet, bevor die O-Zeit-Ablesung erfolgt, so ermöglicht dies der Reaktion eine lineare Geschwindigkeit zu erreichen.
Durch Erfahrung wird man lernen, wie diese Anfangswarteperiode mit nur geringer Beeinflussung der Ergebnisse verkürzt oder beseitigt werden kann. Obwohl die Temperatur genau bei einem konstanten Wert gehalten werden sollte, kann auch eine andere Temperatur als 250C angewendet werden. Die berechneten Einheiten der Aktivität sollten dann mit einem geeigneten Korrektionsfaktor für die Temperatur (TC) multipliziert werden, wie dies in der folgenden Tabelle dargestellt ist.
Reaktions- (TC) Reaktions- (TC) Reaktions- (TC) temperatur temperatur temperatur 200 C 1.55 260 C 0,93 320 C 0.67
210 C 1.39 270 C 0.88 330 C 0.64 220 C 1.27 280 C 0.86 340 C 0.61
230 C 1.16 290 C 0.78 350 C 0.58
240 C 1.08 300 C 0.74 360 C 0.56 250 C 1.00 310C 0.70 370 C 0.54