DE3642804A1 - Verfahren zur bestimmung von ammoniak oder atp in einer probeloesung - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von ammoniak oder atp in einer probeloesung

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Description

Die Erfindung betrifft eine enzymatische Methode zur Bestimmung von Ammoniak oder ATP (Adenosintriphosphat)
Ammoniak wurde bisher hauptsächlich nach einer chemischen Methode (der sogenannten Idophenolmethode) bestimmt. Ammoniak kann auch nach verschiedenen enzymatischen Methoden bestimmt werden. Diese umfassen eine Methode unter Verwendung von Glutamatdehydorgenase (vgl. beispielsweise die japanische Patentveröffentlichung 21 995/82), welche eine große Menge an Enzym zur Messung infolge des hohen Kn-Wertes für Ammoniak erfordert. Eine andere enzymatische Methode verwendet Carbamatkinase (JP 2 13 399/84). Dieses Enzym, das im allgemeinen instabil ist und zu einem Verlust seiner Aktivität nach einer Dialyse und anderen Behandlungen neigt, muß in Gegenwart eines SH-Gruppen- Schutzmittels, wie reduzierte Glutathion und 2-Marcaptoethanol, gereinigt und gelagert werden. Bei der Bestimmung von Ammoniak in einer Lösung, welche das Oxidase/ Peroxidase/Chromogen-System enthält, inhibiert das Vorliegen eines derartigen SH-Gruppenschutzmittels in der Carbamatkinasezubereitung das Farbreaktionssystem, wobei negative Fehler erzeugt werden und keine genauen Messungen möglich sind. Da ferner sich das Gleichgewicht zu Gunsten der Ammoniakbildung verschiebt, erfolgt die Ammoniak verbrauchende Reaktion nur in sehr geringen Umfange und macht diese Methode zur Bestimmung von kleinen Mengen an Ammoniak in lebenden Körpern ungeeignet. Eine dritte bekannte enzymatische Methode verwendet Carbamoylphosphatsynthetase (JP Kokai 47 698/85). Diese Synthetase kann nur aus Säugetierorganen erhalten werden und eine garantierte Zufuhr in größeren Mengen ist nicht zu erwarten.
Es sind zwei Methoden zur Bestimmung von ATP bekannt: eine besteht darin, Hexokinase mit ATP in Gegenwart von Glukose unter Bildung von Glukose-6-phosphat umzusetzen, und dann Glukose-6-phosphatdehydrogenase mit diesem Phosphat in Gegenwart von NADP zur Umsetzung zu bringen und colorimetrisch die Menge an NADPH bei 340 nm zu messen [Methods of Enzymatic Analysis, 7, 346 (1985)], während die andere darin besteht, Luciferase mit ATP in Gegenwart von Luciferin und Mg2+-Ionen umzusetzen und die Menge an ATP durch Messen der Luminozität bei 562 nm zu bestimmen [ibid., 7, 357 (1985)]. Die erstere Methode leidet unter einer geringen Empfindlichkeit, da nur ein Molekül NADPH aus einem Molekül ATP gebildet wird, während der Nachteil der letzteren darin liegt, daß Luciferin und Luciferase sehr teuer sind.
Unter diesen Umständen wurde eine neue Methode zur Bestimmung von Ammoniak oder ATP unter Einsatz von Glutaminsynthetase bekannt (JP-Anmeldung 1 41 241/85). Diese Methode besteht darin, Glutaminsynthetase auf eine Probelösung, die Ammoniak oder ATP enthält, in Gegenwart von L-Glutamin und ATP oder Ammoniak unter Bildung von ADP einwirken zu lassen, dann eine Kinase (beispielsweise Pyruvatkinase) auf das ADP in Gegenwart eines Kinasesubstrats (beispielsweise von Phosphoenolbrenztraubensäure) einwirken zu lassen und die Menge des erhaltenen Produkts der Kinasereaktion (beispielsweise Brenztraubensäure) zu messen. Beispielsweise kann Brenztraubensäure nach der UV-Methode unter Verwendung von Lectatdehydrogenase oder nach der colorimetrischen Methode unter Einsatz von Pyruvatoxidase bestimmt werden. Von diesem Methoden besitzt die colorimetrische Methode unter Einsatz von Pyruvatoxidase die höhere Empfindlichkeit gegenüber der UV-Methode und ist besonders geeignet zur Bestimmung von kleinen Mengen an Ammoniak oder ATP.
In neuerer Zeit wurde enzymatische Aktivitäten in Seren als Hinweise für verschiedene Krankheiten verwendet, was eine Methode erfordert, die dazu in der Lage ist, kleinere Mengen an Ammoniak oder ATP zu bestimmen. Die vorstehend in der JP-Veröffentlichung 1 41 241/85 vorgeschlagene Methode reicht nicht bezüglich der Empfindlichkeit aus und erfüllt nicht vollständig den angestrebten Zweck, da, wenn ADP (gebildet durch Glutaminsynthetase) in dem Pyruvatkinase- oder Pyruvatoxidassystem gemessen wird, nur ein Molekül Wasserstoffperoxid aus einem Molekül Ammoniak oder ATP gebildet wird.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines sehr empfindlichen, einfachen und billigen Verfahrens zur Bestimmung von Ammoniak oder ATP.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren des Patentanspruchs 1 gelöst.
Die Erfindung beruht als Ergebnis intensiver Arbeiten zur Bestimmung von Spurenmengen an Ammoniak oder ATP in Probelösungen auf der Erkenntnis, daß diese Aufgabe unter Einsatz von Glutaminsynthetase (EC6.3.1.2) gelöst werden kann.
Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von Ammoniak oder ATP in einer Probelösung und besteht darin, Glutaminsynthetase auf die Probelösung in Gegenwart von L-Glutaminsäure und ATP oder Ammoniak einwirken zu lassen, dann Purinnukleosidphosphorylase auf das dabei in Gegenwart von Purinnukleosid gebildete anorganische Phosphat einwirken zu lassen und die Menge des erhaltenen Purinderivats mit Xanthinoxidase zu bestimmen.
Jede Probelösung, die Ammoniak oder ATP enthält, kann zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden. Erwähnt seien Lösungen, die Ammoniak oder ATP enthalten, die durch enzymatische Reaktion gebildet werden. Nachfolgend sind typische enzymatische Reaktionen, die Ammoniak bilden, zusammengefaßt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in erfolgreicher Weise zur Messung der Aktivität dieser Enzyme und zur Bestimmung der Substrate und Produkte dieser Reaktionen eingesetzt werden.
1. Asparaginase (EC3.5.1.1)
L-Asparagin + H2O → L-Asparaginsäure + NH3
2. Aspartase ( EC4.3.1.1 )
L-Asparaginsäure → Fumarsäure + NH3
3. Adenindeaminase ( EC3.5.4.2 )
Adenin + H2O → Hypoxanthin + NH3
4. Adenosindeaminase (EC3.5.4.4)
Adenosin + H2O → Inosin + NH3
5. Adenosinmonophosphatdeaminase (EC3.5.4.6)
AMP + H2O → IMP + NH3
6. Adenosinphosphatdeaminase (EC3.5.4.17)
Adenosinphosphat + H2O → Inosinphosphat + NH3
7. Amindehydrogenase (EC1.4.99.3)
Amin + oxidiertes Phenazinmethosulfat +H2O → Aldehyd + reduziertes Phenazinmethosulfat + NH3
8. Arginindeaminase (EC3.5.3.6)
L-Arginin → L-Citrulin + NH3
9. Amidase (EC3.5.1.4)
Monocarbonsäureamid + H2O → Monocarbonsäure + NH3
10. ω-Amidase (EC3.5.1.3)
2-Ketoglutaraminsäure + H2O → 2-Ketoglutarsäure + NH3
11. Urease (EC3.5.1.5)
Harnstoff + H2O → 2NH3 + CO2
12. Ureidosuccinase (EC3.5.1.7)
N-Carbamoyl-L-asparginsäure + H2O → L-Asparsäure + CO2 + NH3
13. Guanindeaminase (EC3.5.4.3)
Guamin + H2O → Xanthin + NH3
14. Guanosindeaminase (EC3.5.4.15)
Guanosin + H2O → Xanthosin + NH3
15. Glutaminase (EC3.5.1.2)
L-Glutamin + H2O → L-glutaminsäure + NH3
16. Creatinindeiminase (EC3.5.4.21)
Creatinin + H2O → N-Methylhydantoin + NH3
17. Cytidindeaminase (EC3.5.4.5)
Cytidin + H2O → Uridin + NH3
18. Cytosindeaminase (EC3.5.4.1)
Cytosin + H2O → Uracil + NH3
19. Citrullinase (EC3.5.1.20)
L-Citrullin + 2H2O → L-Ornitin + CO2 + NH3
20. Trans-glutaminase (EC2.3.2.13)
N2-R-glutaminylpeptid + RNH2 → NH3 + N2-R-N5-R-glutaminylpeptid
21. Threonindehydratase (EC4.2.1.16)
L-Threonin + H2O → 2-Ketobuttersäure + NH3 + H2O
22. Nikotinamidase (EC3.5.1.19)
Nikotinamid + H2O → Nikotinsäure + NH3
23. Nikotinamidnukleotidamidase (EC3.5.1.42)
Nikotinamidmononukleotid + H2O → Nikotinsäure-D-ribonucleotid + NH3
24. L-Histidinammoniaklysase (EC4.3.1.3)
L-Histodin → Urocansäure + NH3
25. Penylalaninammoniaklyase (EC4.3.1.5)
L-Phenylalanin → Trans-zimtsäure + NH3
Nachfolgend werden einige typische enzymatische Reaktionen, die ATP bilden, genannt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in erfolgreicher Weise zur Messung der Aktivität dieser Enzyme sowie zur Bestimmung der Substrate und Produkte dieser Reaktionen angewandet werden.
1. Tyrosyl-tRNA-Synthease (EC6.1.1.1)
L-Tyroscyl-tRNA + AMP + PPi ⇆ L-Tyrosin + ATP + tRNA
2. Acetyl-CoA-Synthetase (EC6.2.1.1)
AMP + PPi + Acetyl-CoA ⇆ ATP + Essigsäure + CoASH
3. Asparagin-Synthetase (EC6.3.1.1)
L-Asparagin + AMP + PPi ⇆ L-Asparaginsäure + NH3 + ATP
4. NAD-Synthetase (EC6.3.1.5)
AMP + Pyrophosphorsäure + NAD ⇆ATP + Deamido-NAD + NH3
5. Ribosephosphatpyrophosphokinase (EC2.7.6.1)
AMP + 5-Phospho-α-D-ribosylpyrophosphat ⇆ATP + D-Ribose-5-phosphat
6. Pyruvateorthophosphatdikinase (EC2.7.9.1)
AMP + Phosphoenolbrenztraubensäure + PPi ⇆ATP + Brenztraubensäure + Pi
Die vorstehend angegebenen enzymatischen Reaktionen werden nur zu Erläuterungszwecken genannt und sollen die Erfindung nicht beschränken.
Die Glutaminsynthetase, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, findet sich in Hirn oder der Leber von verschiedenen höheren Tieren, in dem Saatgur von Leguminosen sowie in Escherichia coli und anderen Mikroorganismen. Von diesen sind die Glutaminsynthetase erzeugenden Spezies, die zu dem Genus Micrococcus oder Brevivacterium gehören, die vorteilhaftesten Quellen bezüglich der Verfügbarkeit in größeren Mengen bei niedrigen Kosten (vgl. JP Kokai 33 594/82 bezüglich der Herstellungsverfahrens dieses Enzyms). Die Glutaminsynthetase, die auf Brevibacterium Flavum ATCC 14067 zurückgeht, wird in den folgenden Beispielen verwendet.
Die Wirkung dieser Glutaminsynthetase und das Verfahren zur Messung seiner Enzymaktivität werden nachfolgend beschrieben.
(1) Wirkung
Dieses Enzym katalysiert die Biosynthese von L-Glutamin aus L-Glutaminsäure und Ammoniak unter Anwendung der chemischen Energie von ATP.
L-Glutaninsäure + Ammoniak + ATP → L-Glutamin + ADP + anorganisches Phosphat.
(2) Messung der Enzymaktivität
Eine Mischung aus 0,1 ml einer 500 mM Natriumglutamatlösung, 0,1 ml einer 250 mM Ammoniumchloridlösung, 0,1 ml einer 75 mM ATP-Lösung, 0,1 ml einer 300 mM MgCl2-Lösung, 0,1 ml eines 1M Imidazol-HCl-Puffers (pH 7,0), 0,4 ml destilliertem Wasser und 0,1 ml einer Enzymlösung mit geeigneter Konzentration wird bei 37°C während 10 Minuten stehengelassen. Nach Beendigung der Reaktion wird die Menge an gebildetem anorganischem Phosphat nach der Fiske Subbarow-Methode gemessen oder das gebildete Glutamin wird durch Papierchromatographie abgetrennt und durch die Ninhydrin- Farbreaktion bestimmt. 1 Einheit Glutaminsynthetase wird durch die Menge an Enzym ausgedrückt, die 1 µMol anorganisches Phosphat oder Glutamin in 1 Minute in den vorstehend erwähnten Reaktionssystem zu erzeugen vermag.
Die Herstellung einer derartigen Glutaminsynthetase wird in der JP Kokai 33 594/82 beschrieben.
Wie später näher ausgeführt wird, bilden Ammoniak oder ATP in einer Probelösung L-Glutamin, ADP und eine anorganisches Phosphat durch Wirkung von Glutaminsynthetase in Gegenwart von L-Glutamin und ATP oder Ammoniak. Das auf diese Weise gebildete anorganische Phosphat wird dann mit Purinnukleosid- phosphorylase in Gegenwart eines Purinnukleosids (beispielsweise Inosin) unter Bildung eines Purinderivats (beispielsweise Hypoxanthin) reagieren gelassen. Das auf diese Weise gebildete Hypoxanthin kann nach bekannten Methoden bestimmt werden, beispielsweise durch Wirkung von Xanthinoxidase auf Hypoxanthin und anschließende Messung des verbrauchten Sauerstoffs unter Einsatz einer Sauerstoffelektrode oder durch Bestimmung des Wasserstoffperoxids durch die Peroxidasefarbreaktion (beispielsweise Messung des Absorptionsvermögens bei 500 nm durch die 4-Aminoantipyrin-Phenol-Peroxidase-Methode). Alle Typen von Pufferlösungen, die kein Phosphat enthalten, können für diese enzymatischen Reaktionen verwendet werden, jedoch werden in sehr vorteilhafterweise Imidazol, Tris, Glycylglycin sowie Good-Pufferlösungen eingesetzt. Vorzugsweise liegt der pH im Bereich von 6 bis 9, wobei ein pH von 7 am meisten bevorzugt wird. Glutaminsynthetase sollte vorzugsweise in einer Menge von 0,2 bis 20 Einheiten und insbesondere 1 bis 5 Einheiten verwendet werden, Purinnukleosidphosphorylase in einer Menge von 0,05 bis 5 Einheiten und insbesondere 0,2 bis 1 Einheit und Xanthinoxidase in einer Menge von 0,01 bis 10 Einheiten und insbesondere 0,1 bis 1 Einheiten. L-Glutaminsäure sollte vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 50 mM, insbesondere 5 bis 10 mM, verwendet werden. Wird Ammoniak nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt, dann sollte Inosin und ATP in der Probelösung in mehr als äquimolaren Mengen, bezogen auf die Menge an Ammoniak vorliegen. Wird andererseits ATP bestimmt, dann sollte Inosin und Ammoniak in der Probelösung in mehr als äquimolaren Mengen, bezogen auf die Menge an ATP, zugegen sein. Diese Reaktionen werden vorzugsweise bei 20 bis 40°C während 2 bis 20 Minuten durchgeführt. Glutaminsynthetase, Purinnukleosidphosphorylase, Xanthinoxidase und Purinnukleosid können jeweils in dem Reaktionssystem vorliegen.
Im Vergleich zu der in der JP-Anmeldung 1 41 241/′85 beschriebenen Methode besitzt das erfindungsgemäße Verfahren eine zweifach höhere Empfindlichkeit, da zwei Moleküle Wasserstoffperoxid aus einem Molekül Ammoniak oder ATP gebildet werden, wie nachfolgend gezeigt wird: GS : Glutaminsynthetase
PNP: Purinnukleosidphosphorylase
XOD: Xanthinoxidase
POD: Peroxidase
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, wobei in diesen Beispielen auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen wird:
Fig. 1 zeigt eine Eichkurve, welche die Beziehung zwischen der Menge an Ammoniak und dem Unterschied im Absorptionsvermögen bei 500 nm des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens wiedergibt.
Fig. 2 zeigt eine Eichkurve, welche die Beziehung zwischen der Menge an ATP und dem Unterschied des Absorptionsvermögens bei 500 nm bei dem Verfahren des Anspruchs 2 erläutert.
Beispiel 1 (Bestimmung von Ammoniak)
Zu der vorstehenden Mischung (3,0 ml) werden 0,1 ml Ammoniumchloridlösung (in einer Konzentration von 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM und 5 mM) gegeben und jede der erhaltenen Lösungen wird bei 37°C 5 Minuten stehengelassen. Wie aus Fig. 1 hervorgeht, wird eine gute lineare Beziehung zwischen der Menge an zugesetztem Ammoniumchlorid und der Zunahme des Absorptionsvermögens bei 500 nm beobachtet.
Beispiel 2 (Bestimmung von ATP)
Der vorstehenden Mischung (3,0 ml) werden 0,1 ml ATP-Lösung (in einer Konzentration von 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM und 0,5 mM) gegeben und jede der erhaltenen Lösungen bei 37°C 5 Minuten stehengelassen. Wie aus der Fig. 2 hervorgeht, wird eine gute lineare Beziehung zwischen der Menge an zugesetztem ATP und der Zunahme des Adsorptionsvermögens bei 500 nm beobachtet.
Aus den vorstehenden Ausführungen ist zu ersehen, daß das erfindungsgemäße Verfahren in spezifischer Weise Ammoniak oder ATP mit hoher Empfindlichkeit zu bestimmen vermag und daher von großem Wert bei der Durchführung von klinischen Tests ist.

Claims (2)

1. Verfahren zur Bestimmung von Ammoniak oder ATP in einer Probelösung, dadurch gekennzeichnet, daß man Glutaminsynthetase auf die Probelösung in Gegenwart von L-Glutaminsäure und ATP oder Ammoniak einwirken läßt, dann Purinnukleosidphosphorylase auf die auf diese Weise in Gegenwart von Purinnukleosid gebildete Phosphorsäure einwirken läßt und die Menge des erhaltenen Purinderivats mit Xanthinoxidase mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Glutaminsynthetase, Purinnukleosidphosphorylase und Purinnukleosid gleichzeitig in der Probelösung vorliegen.
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