DE60008934T2

DE60008934T2 - Verfahren und reagenzien-kit zur bestimmung der 5'-nukleotidase-aktivität

Info

Publication number: DE60008934T2
Application number: DE60008934T
Authority: DE
Inventors: András Bertha; István TULOK
Original assignee: PRONUK BIOTECHNOLOGIAI KFT
Current assignee: PRONUK BIOTECHNOLOGIAI KFT
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2000-07-03
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2020-07-04
Also published as: SK16722002A3; DE60008934D1; CN1454262A; AU2000258358B2; EP1283901B1; CZ20023876A3; EA005164B1; PL359850A1; YU88302A; EA200201281A1; CA2407446A1; AU5835800A; CN1221667C; HRP20020899A2; US6861225B1; ATE261495T1; EP1283901A1; HU0002003D0; HUP0002003A3; AU2000258358A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der 5'-Nukleotidase (5'-Ribonukleotidphosphohydrolase) in Körperflüssigkeiten, Gewebepräparaten und/oder in Zeltelementen. Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Reagenzien-Kit, der in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendbar ist.
Von den metabolischen Störungen, welche gekoppelt sind mit, verbunden sind mit und Faktoren maligner Prozesse unterhalten, spielen ebenfalls Veränderungen im Nukleotidmetabolismus eine herausragende Rolle. Dies erklärt, warum das Beeinflussen der Synthese von DNS/RNS und des Nukleinsäure-Nukleotid-Metabolismus, die mit diesen Prozessen eng verknüft sind, eines der Hauptziele der Interventionen, die in der Tumortherapie verwendet werden, ist.
Die Untersuchung von Prozessen des Nukleinsäure-Nukleotid-Metabolismus hat eine herausragende Wichtigkeit im Nachweis von tumorösen Prozessen und bei der Unterscheidung maligner und benigner Prozesse von einander. Die Untersuchung von Veränderungen in den Prozessen des Nukleinsäuremetabolismus ist ebenfalls unerläßlich von den Aspekten einer Überwachung einer Tumortherapie her, da in der überwältigenden Mehrheit von chemotherapeutischen Behandlungen die therapeutische Wirkung in den artifiziell hervorgerufenen Störungen des Nukleinsäure-Nukleotidmetabolismus erscheint und einer artifiziellen Schädigung der Synthese von DNS. Diese künstlich hervorgerufenen Veränderungen sind entscheidende Faktoren bei der Wirksamkeit der Tumortherapie, sie sind jedoch ebenfalls verantwortlich für fundamentale Schädigungen von gesunden Zellen und Störungen der Zell- und Organfunktionen.
Unter Routinebedingungen ist die Bestimmung der Aktivität der 5'-Nukleotidase (5'-Ribonukleotidphophohydrolase), einem Enzym, das von Reis nachgewiesen wurde (Reis, J.: Über die spezifische Phosphatase der Nervengewebe, Enzymologia 2, 110–115/1937, eine der angemessensten Methoden. Dieses Enzym katalysiert allein die Hydrolyse von Nukleotidpentosemonophosphaten (5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMOP, 5'-TMP, dAMP, dCMP, dUMP etc.) was Nukleotide und anorganisches Phosphat ergibt (Bodansky, O., Schwanz, M. K.: 5'-Nucleotidase; Adv. Clin. Chem. 11, 277–327/1968, und kann als einer der sensitivsten Plasmamembranmarker betrachtet werden. Die Bestimmung der Aktivität von 5'-Nukleotidase wird sowohl für klinische Zwecke als auch in experimentellen Tests verwendet, wobei im ersten Fall die Messung gewöhnlich an nicht hämolysiertem Serum und/oder an einem Hämolysat durchgeführt wird, wohingegen im letzteren Fall die Messung an Körperflüssigkeiten, an Gewebepräparaten, (z.B. an Plasmamembranen) und/oder Zellelementen (z.B. an Mikrosomen, Cytoplasmen, Lysosomen) durchgeführt werden kann (siehe: Solyom, A., Trans., E. G.: Enzyme Markers in Characterization of isolated Plasma Membranes, Enzyme 13, 329–372/1972.
Da die 5'-Nukleotidase ein Enzym ist, welches in einer spezifischen Weise Nukleotidpentosemonophosphate spaltet, ist es ein in weitem Maße angewendetes Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der 5'-Nukleotidase, die biologische Probe mit einem Nukleotidpentosemonophosphatsubstrat zu inkubieren, und dann nach der Zugabe eines geeigneten farbentwicckelnden Reagenzes durch Colorimetrie (Spektrophotometrie) die Menge an anorganischem Phosphat zu bestimmen, welches innerhalb einer Einheitszeit durch den Effekt des Enzyms freigesetzt wurde. Falls die biologische Probe, die untersucht werden soll, ebenfalls Bestandteile umfaßt, welche mit dem Enzym 5'-Nukleotidase interferieren (bei Blut oder bei Serum ist ein solcher Bestandteil die alkalische Phosphatase, bei Lysosomenmembranen sind solche Bestandteile die anderen Zuckerphosphate), wird eine Inkubation in Gegenwart eines Inhibitors durchgeführt, welcher in der Lage ist, deren Effekte zu hemmen. Als ein farbentwickelndes Reagenz wird Amoniummolybdat in Gegenwart eines Reduktionsmittels angewendet, welches gewöhnlich Zinnchlorid ist, wahlweise zusammen mit einem Hydrazinsalz oder Ascorbinsäure, welches mit dem anorganischen Phosphat reagiert, um einen intensiv blauen Komplex zu bilden. Unter der Erwägung, daß Ammoniummolybdat die Proteine, welche in der biologischen Probe vorhanden sind, präzipitiert, werden die Proteine entweder entfernt, bevor die Farbreaktion durchgeführt wird, oder die Proteine werden in Lösung gehalten durch die Zugabe eines geeigneten solubilisierenden Mittels zu der Mischung. Soweit wir bisher wissen, ist letzteres eine der aktuellsten colorimetrischen Methoden. Unter Verwendung dieses Verfahrens können die Anforderungen an die Probe für die Bestimmung sogar auf einige Hundertstel Milliliter reduziert werden und die Genauigkeit des Assays kann in einer bertächtlichen Weise erhöht werden. Die Bestimmung der Aktivität der 5'-Nukleotidase nach dem vorausstehenden Prinzip wird im Detail offenbart unter anderem in den folgenden Publikationen und in weiteren Referenzen, welche hierin zitiert werden: J. Clin Chem. Clin. Biochem. 7: 18–25 (1969), 13: 453–459 (1975), 15: 715–718 (1977), 18: 781–788 (1980); Clin. Chem. 23: 2311–2323 (1977), 27: 464–465 (1981); Adv. Clin. Chem. 11: 277–332 (1968).
Eine gemeinsame Eigenschaft aller Routineverfahren, die zuvor angewendet wurden, um die Aktivität der 5'-Nukleotidase auf der vorausstehenden Basis für die Diagnostik oder allgemeine experimentelle Zwecke zu bestimmen, besteht darin, daß die Enzymaktivität nur an einem einzelnen Substrat gemessen wurde. Als das Substrat wurde am häufigsten Adenosin-5'-monophosphat (5'-AMP), weniger häufig Cytidin-5'-monophosphat (5'-CMP) oder Inosi tol-5'-monophosphat oder – in Hämolysaten – Uridin-5'-monophophat (5'-UMP) angewendet.
In unseren Untersuchungen, die durchgeführt wurden, um maligne Prozesse nachzuweisen, und um die Effizienz einer Tumortherapie zu überwachen, ist die Aktivität von 5'-Nukleotidase in ein und derselben Probe parallel an 6 unterschiedlichen Substraten gemessen worden, d.h. an Adenosin-5'-monophosphat (5'-AMP), Cytidin-5'-monophosphat (5'-CMP), Uridin-5'-monophosphat (5'-UMP), Guanosin-5'-monophosphat (5'-GMP), Inositol-5'-monophosphat (5'-IMP) und Thymidin-5'-monophosphat (5'-TMP). Die Aktivität von unspezifischen Phosphatasen in der biologischen Probe wurde gemessen an β-Glycerophosphatsubstraten und dies wurde als eine Korrektur genommen. Wie auf der Basis der vorausstehend zitierten Referenzen zu erwarten war, haben wir beobachtet, daß, obwohl die 5'-Nukleotidase-Aktivitätswerte, welche an verschiedenen Nukleotidpentosemonophosphaten gemessen wurden, quantitativ von einander abweichen, es bei gesunden und an erkrankten Individuen eine strenge Korrelation zwischen den Aktivitätswerten, welche an verschiedenen Substraten gemessen wurden, gibt. Dies ist so, da unter physiologischen Bedingungen ein dynamischer Gleichgewichtszustand der Nukleinsäure-Nukleotidmetabolismus-Prozesse im Serum existiert als einem gemeinsamen metabolischen Pool. Wie wiederum aus der Literatur folgt, haben wir beobachtet, daß die 5'-Nukleotidase-Aktivitätswerte, welche in den vorausstehenden sechs Substraten in den Seren von gesunden und von erkrankten Individuen gemessen wurden von einander in einem solchen Ausmaß abweichen, das nicht den Unterschieden der chemischen Natur der Substrate zugeschrieben werden kann, sondern aus physiologischen Prozessen resultiert. Wir haben jedoch unerwarteterweise gefunden, daß die vorausstehende strenge Korrelation sich unter der Therapie verändert, und beträchtliche Unterschiede auf der Basis, ob die Therapie ihre Wirkung auf den Purinmetabolismus, den Pyrimidinmetabolismus oder auf den Thymidinmetabolismus ausgeübt hat, entstehen. Daher kann basierend auf den Ergebnissen der Aktivitätsmessungen, welche an den vorausstehenden sechs unterschiedlichen Substraten durchgeführt werden, entschieden werden, ob die angewendete Therapie wirksam ist, ob sie ihre Wirkung auf dem beabsichtigten Gebiet, das beeinflußt werden soll ausübt, und ob sie unerwünschte Zellschädigungen induziert oder nicht. Diese Erkenntnis bildet die Basis unserer Erfindung.
Auf dem obigen basierend, betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnostizierung des Vorliegens eines malignen Prozesses und/oder zur Überwachung von Ergebnissen einer bei dessen Behandlung angewandten Therapie durch Bestimmen der 5'-Nukleotidase-Aktivität, wobei eine biologische Probe in einer bestimmten Weise und unter an sich bekannten Bedingungen mit einem Nukleotidpentosemonophosphat als Substrat inkuziert wird, das freigesetzte anorganische Phosphat zu einem Farbkomplex umgewandelt wird durch Behandeln mit Ammoniummolybdat und einem Reduktionsmittel, die Farbintensität durch ein bekanntes Verfahren gemessen wird und aus dem Messwert die Aktivität von 5'-Nukleotidase oder die Menge an anorganischem Phosphat, die innerhalb einer Zeiteinheit freigesetzt wird, als eine Zahl, die proportional zu der Aktivität von 5'-Nukleotidase ist, mit einer bekannten Berechnungsmethode und/oder mit Hilfe einer Kalibrierungskurve berechnet wird. Gemäß der Erfindung werden 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP und 5'-TMP als Nukleotidpentosemonophosphate verwendet, wird die Messung mit allen diesen sechs Substraten durchgeführt, und die erhaltenen Resultate werden miteinander und mit Kontrollwerten verglichen.
Da nach einer chemotherapeutischen Behandlung gut beobachtbare Veränderungen in der Aktivität der 5'-Nukleotidase bei allen sechs unterschiedlichen Substraten selbst nach einer kurzen Periode (24 Stunden) auftreten, kann eine gut begründete Entscheidung für die Aufrechterhaltung, für eine Modifikation oder eine Beendigung der Therapie innerhalb einer kürzeren Zeitperiode und mit weniger Unklarheiten gefällt werden. Hier merken wir für den Zweck des Vergleichs an, daß eine Veränderung, welche als eine Basis für eine Entscheidung dienen kann, mit den meisten der Tumormarker nur nach etwa einer Woche der Behandlung beobachtet werden kann.
Wenn die Aktivität der 5'-Nukleotidase parallel bei allen der vorausstehend genannten sechs Substrate gemessen wird, und die Ergebnisse zusammengefaßt werden, kann eine viel verläßlichere Diagnose für den Zustand des Individuums und für das Auftreten von Leber- und Knochen-Prozessen erstellt werden, als sie erhalten werden könnten, wenn die Messung nur an einem einzelnen Substrat durchgeführt werden würde. Dies kann eine wertvolle Hilfe für eine Früherkennung von malignen Prozessen bereitstellen.
Basierend auf den auf einander folgenden Verknüpfungen biochemischer Prozesse, können die Aktivitätsmessungen der 5'-Nukleotidase an den vorausstehenden sechs Substraten die Bestimmungen der Enzymaktivität ersetzen, welche weniger häufig in der experimentellen und klinischen Praxis verwendet werden, da sie viel komplizierter sind und als Routinetest viel schwieriger durchzuführen sind, falls überhaupt. Diese Möglichkeiten des Ersatzes oder des Austausches sind zum Beispiel wie folgt: 5'-CMP-Nukleotidase → Cytidinkinase → Cytidindeaminase → Cytidintriphosphatsynthetase, 5'-GMP-Nukleotidase → Guanosindeaminase, 5'-IMP-Nukleotidase → IMP-Dehydrogenase, 5'-TMP-Nukleotidase → Thymidinkinase ↔ Thymidinsynthetase.
Von den in den Messungen erforderlichen Reaktanden, von den Reaktionsbedingungen und von dem Berechnungsverfahren kann eine detaillierte Information in der Literatur gefunden werden, unter anderem in den vorausstehend zitierten Artikeln. Als ein Beispiel geben wir im folgenden die Zusammensetzung eines Reagenziensystems, welches anwendbar ist für Messungen ohne eine Entfernung von Protein, welches sich als besonders bevorzugt erwiesen hat, und wir beschreiben ebenfalls, wie es in Messungen verwendet werden sollte, die an Serumproben durchgeführt werden, zusammen mit dem Berechnungsverfahren, ohne jedoch die Verwendbarkeit des Verfahrens der Erfindung auf das Reagenziensystem und die nachstehend offenbarten Bedingungen zu beschränken.
Die zu verwendenden Reagenzien sind wie folgt:
(1) Puffer-/Aktivatorlösung
75–400 mMol/l von TRIS, 5,0–10,0 mMol/l MgCl₂ oder 2,0–5,0 mMol/l MnCl₂, 1,0 bis 5,0 mMol/l von KCl, wobei der pH-Wert der Lösung auf 9–9,5 mit einer wäßrigen 3–6 M HCl-Lösung eingestellt wird.
(2) Inhibitor
Ein Inhibitor sollte nur verwendet werden, wenn die biologische Probe eine Substanz umfaßt, welche mit der Bestimmung der Aktivität der 5'-Nukleotidase interferiert. Für Blut und Serum ist eine solche Substanz die alkalische Phosphatase, welche mit einer Lösung, die 10–20 g/l L-Cystein oder L-Glycin oder eine äquivalente Menge von einem L-Cystein oder L-Glycinsalz enthält, oder 50 bis 250 mg/l Conkavalin A, wobei das Lösemittel der vorausstehend beschriebene Puffer ist. Wenn die Messungen an Lysosomenmembranen dwchgeführt werden, wird eine Lösung von 5–50 mMol/l von L(+)-Tartrat in dem vorausstehend gemannten Puffer verwendet, um die vorhandenen Zuckerphosphatasen zu inhibieren.
(3) Substrate
Als Substrate werden 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP und 5'-TMP als 1–10 millimolare Lösungen in entmineralisiertem Wasser verwendet. β-Glycerophosphat oder Dinatriumphenylphosphat sollten ebenfalls als ein Substrat in einer Lösung in derselben Konzentration verwendet werden. Die letzteren beiden Substrate sind bekannte Substrate für die Bestimmung einer unspezifischen Phosphataseaktivität; diese Aktivität sollte ebenfalls bestimmt werden, um die Aktivität der 5'-Nukleotidase in eine akkuraten Weise zu bestimmen.
(4) Protein solubilisierendes Reagenz
Reine (konzentrierte) Ameisensäure oder Propionsäure des höchsten Reinheitsgrades.
(5) Stabilisierungsreagenz
Eine 1:9 oder 4:6 Vol/Vol Mischung von Glycerol und Wasser oder eine 0,5–5 Gew./Gew. -ige wäßrige Sorbitollösung oder eine 0,25–2,5 Gew./Gew. %-ige wäßrige Mannitollösung oder eine 1:2 bis 1:1 Vol/Vol Mischung von n-Propanol und Wasser .
Es ist ratsam, eine kleine Menge (0,001 bis 0,01 Gew./Gew. %) Natriumazid in dem Stabilisierungsreagenz zu lösen, um seine Lagerfähigkeit zu erhöhen.
(6) Farbreagenz
Eine 5–10 g/l Lösung von Ammoniummolybdat in entmineralisiertem Wasser.
(7) Reduktionslösung
Eine 1–5 g/l Lösung von SnCl₂ in 1M wäßriger Chlorwasserstoffsäure oder eine 1–5 g/l Lösung von Ascorbinsäure in entmineralisiertem Wasser.
(8) Phosphorige Standardlösung
Eine 1,61 mMol/l Lösung von anorganischem Phosphat, welches seriell verdünnt wird.
Eine Messung wird wie folgt durchgeführt:
Ein Assay-Reagenz zur Bestimmung der Menge von anorganischm Phosphat wird hergestellt durch das Zumischen des Protein solubilisierenden Reagenzes in einem Volumen/Volumen Verhältnis von

– 4:1 bis 1:1 mit der wäßrigen Glycerollösung, oder
– 3:1 bis 1:1 mit der wäßrigen Sobitollösung, oder
– 5:1 bis 1:2 mit der wäßrigen Mannitollösung, oder
– 7:1 bis 4:1 mit der wäßrigen n-Propanollösung,

Bestandteile, die in den ersten fünf Zeilen von der Tabelle 1 aufgelistet sind, werden mit einander zugemischt in den Verhältnissen wie in der Tabelle angegeben, und die resultierende Mischung wird bei 37°C 60 Minuten lang inkubiert. Dannach werden die weiteren Bestandteile, die in der Tabelle 1 gelistet sind zu der Mischung zugegeben, die resultierende Mischung wird gerührt, dann läßt man sie 15 Minuten lang stehen und danach wird die Absorption der Lösung bei 620 bis 720 nm gemessen.
Die Spalte in der Tabelle 1 mit der Überschrift „5'-ND + ALP" bezieht sich auf Messungen, in denen die Aktivität der 5'-Nukleotidase zusammen mit der Aktivität der alkalischen Phos- Phosphatase (d.h kein Inhibitor wird verwendet) zusammen gemessen wird; wohingegen die Spalte mit der Überschrift „5'-ND" sich auf Messungen bezieht, die in Gegenwart eines Inhibitors für die alkalische Phosphatase durchgeführt wurden. Die Aktivität der unspezifischen Phophatase erscheint in den Resultaten beider Messungen. Unspezifische Phosphataseaktivität wird getrennt bestimmt an dem Substrat β-Glycerophosphat in Gegenwart eines Inhibitors; der resultierende Wert wird von den vorigen abgezogen, um die Aktivität von 5'-Nukleotidase + alkalischer Phosphatase, bzw. die Aktivität von 5'-Nukleotidase zu erhalten.
Die Berechnung wird wie folgt durchgeführt:

(a) Die Berechnung der Extinktionsdifferenzen (ΔE-Werte) β-Glycerophosphat: EProbe – EBlindprobe = ΔEβ-Glycerophosphat andere Substrate: EProbe – EBlindprobe = ΔE5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-TMP, 5'-IMP Standard: EStandard – EReagenzienblindprobe = ΔEStandard
(b) Berechung der Enzymaktivitäten auf der Basis der vorausstehenden ΔE-Werte: Aktivität, U/l der Probe = Probe ΔEStandard ΔE ·Standard cc.·K,worin Standard cc. die Konzentration des Standards ist, und K eine Konstante ist, die berechnet wird mit der folgenden Formel: Gesamtes inkubiertes Volumen, ml·1000Inkubationsperiode,min·Probenvolumen,ml·Küvettendicke
(c) Berechung der einzelnen Enzymaktivitäten oder der kombinierten Aktivitäten aus den vorausstehenden Aktivitätsdaten: Unspezifische Phosphataseaktivität = Aktivität gemessen an β-Glycerophosphat 5'-Nukleotidase-Aktivitäten gemessen an verschiedenen Nukleotidpentosemonophosphaten = 5'-ND-Aktivität – unspezifische Phosphataseaktivität 5'-Nukleotidase + alkalische Phosphatase Aktivität = 5'-ND + ALP – unspezifische Phophataseaktivität Alkalische Phosphatase-Aktivität = 5'-ND + ALP – 5'-ND – unspezifische Phophataseaktivität

Falls die biologische Probe eine andere als Serum ist, wird die Messung auf dieselbe Weise durchgeführt mit dem Unterschied, daß manchmal kein Inhibitor notwendig ist oder ein anderer Inhibitor verwendet wird. Die Berechungen werden ebenfalls wie vorausstehend angegeben durchgeführt.
Tabelle 1
Aus den Werten der 5'-Nukleotidase-Aktivität, die mit den einzelnen Substraten in der vorausstehenden Reihe von Messungen erhalten wurden, können die folgenden biologischen Schlüsse gezogen werden:
Entscheidung über einen Zustand: Die nach der Zusammenfassung der sechs gemessenen Aktivitätswerte erhaltene Zahl bezeichnet einen erkrankungsfreien Zustand bis zu 54–65 U/l, unter der Voraussetzung, daß zur selben Zeit die Aktivität der alkalischen Phosphatase 10–-25 U/l beträgt. Falls die Aktivität der alkalischen Phosphatase oberhalb von 50 U/l liegt und zur selben Zeit die Summe der Werte der 5'-Nukleotidase-Aktivität 54–65 U/l ist, ergibt sich eine Indikation für maligne Knochenprozesse. Falls die Summe der 5'-Nukleotidase-Aktivitäten oberhalb von 70 U/l liegt, ist dies eine sichere Indikation für einen erkrankten Zustand. Falls zur selben Zeit die Aktivität der alkalischen Phosphatase oberhalb von 35 U/l liegt, ist dies eine sichere Indikation für das Vorhandensein von Leberschäden. Bei malignen Lebertumoren sind sowohl die Summe der Werte der 5'-Nukleotidase-Aktivität und der Aktivität der alkalischen Phosphatase 4–10 mal höher als die Normalwerte.
Bewertung einer Therapie: Eine Veränderung bei der Aktivität, welche an den Substraten 5'-AMP, 5'-GMP und 5'-IMP gemessen wurde, zeigt an, daß die Tumortherapie im Purin-Metabolismus interveniert hat, wohingegen eine Veränderung bei der Aktivität, die an den Substraten 5'-CMP, 5'-UMP und 5'-TMP gemessen wurden, eine Intervention am Pyrimidin-Metabolismus anzeigt. Unveränderte Werte zeigen an, daß die Therapie nutzlos ist. Eine Abnahme bei der Aktivität zeigt immer an, daß die Therapie eine vorteilhafte Intervention bei den Prozessen ausgeübt hat. Es tritt in zahlreichen Fällen auf, daß nach der angewendeten Chemotherapie, die Abnahme bei den 5'-Nukleotidase-Aktivitäten so deutlich ist, daß sowohl die Aktivitäten, welche getrennt an den einzelnen Substraten gemessen wurden, als auch die Summe dieser Aktivitäten niedriger ist als 10 U/L, sogar mehr, manchmal können sogar auch negative Zahlen für die 5'-Nukleatidaseaktivitäten erhalten werden. Dies ergibt sich aus der Tatsache, daß die Therapie den Nukleotid-Metabolismus angreift, aber beeinflußt nicht die Werte der unspezifischen Phosphataseaktivität; ein negativer Aktivitätswert wird erhalten, wenn ein höherer Aktivitätswert der unspezifischen Phosphatase von einem niedrigeren Wert der 5'-ND Aktivität abgezogen werden soll. Wenn die Aktivitätswerte der 5'-Nukleotidase niedriger sind als diejenigen, welche bei den gesunden Kontrollen erhalten werden, ist dies bereits eine Indikation für die cytotoxischen Schäden an gesunden Zellen mit einem schnellen Nukleotidmetabolismus (in erster Linie der Darmschleimhaut, des Knochenmarks und der Erythrozyten) insbesondere, wenn solche Veränderungen bei allen gemessenen 5'-Nukleotidase-Aktivitäten an allen sechs Substraten auftritt. In solchen Fällen sollte die Therapie modifiziert oder gestoppt werden.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Reagenzien-Kit, welcher für das Verfahren der Erfindung verwendbar ist, welcher 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP und 5'-TMP als die Substrate neben den konventionellen Bestandteilen eines Reagenzien-Kits umfaßt, welcher anwendbar ist, um die 5'-Nukleotidase-Aktivität über die Bildung eines anorganischen Phosphats zu bestimmen, wobei das resultierende Phosphat in einen gefärbten Komplex umgewandelt wird, und die Farbintensität durch Photometrie gemessen wird.
Die konventionellen Bestandteile des Reagenzien-Kits können diejenigen sein, die für die bekannten Verfahren verwendet werden, z.B. für diejenigen, die in den vorausstehenden Publikationen offenbart werden. Ein bevorzugter Reagenzien-Kit kann die folgenden konventionellen Bestandteile umfassen:

– Puffer,
– Protein solubilisierendes Reagenz,
– Stabilisierungsreagenz,
– Farbreagenz,
– Reduktionsmittel,
– Phosphor-Standard weiterhin falls erforderlich,
– Inhibitor, und/oder
– ein anderes Substrat als ein Nukleotidpentosemonophosphat (wie β-Glycerophosphat).

Bevorzugte Beispiele der vorausstehenden konventionellen Bestandteile sind diejenigen, welche vorausstehend in der exemplarisch dargestellten Beschreibung des Verfahrens der Erfindung aufgelistet sind. Der Reagenzien-Kit kann die konventionellen Bestandteile entweder als Lösungen mit den vorausstehend angegebenen Konzentrationen umfassen, oder als konzentriertere Lösungen, die vor der Verwendung verdünnt werden sollen, oder als reine Chemikalien.
Im folgenden werden als ein Beispiel die Ergebnisse von Messungen der 5'-Nukleotidase-Aktivität gegeben, die an Serumproben durchgeführt wurden, zusammen mit den Schlüssen, welche daraus gezogen werden können. Die Mengen der einzelnen Substanzen und der Bedingungen des Assays waren immer diejenigen, wie sie in der Tabelle 1 angegeben wurden. Die genauen Zusammensetzungen der einzelnen Reagenzien, wie sie in den Messungen verwendet wurden, waren wie folgt:

(1) Puffer/Aktivatorlösung: 75,0 mMol/l von TRIS.HCl, 5,0 mMol/l MgCl₂, 5,0 mMol/l KCl, pH 9,3.
(2) Inhibitor: 0,29 g L-Cytsein HCl, gelöst in 20,0 ml der Puffer/Aktivator-Lösung.
(3) Substrate: 8,0 mMol/l Lösungen von 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP, 5'-TMP und β-Glycerophosphat in entmineralisiertem Wasser.
(4) Protein solubilisierendes Reagenz: Reine (konzentrierte) Ameisensäure vom höchsten analytischen Reinheitsgrad.
(5) Stabilisierungsreagenz: 300 ml von Glycerol vom höchsten analytischen Reinheitsgrad + 700 ml entmineralisiertes Wasser + 0,05 g NaN₃.
(6) Farbreagenz: 8,0 g/l Lösung von Ammoniummolybdat in entmineralisiertem Wasser.
(7) Reduktionslösung: 0,20 g von SnCl₂, gelöst in 100 ml einer 1,0 M wäßrigen Chlorwasserstoffsäure.
(8) Phosphor-Standardlösung: „anorganische Phosphatlösung vom Dyalab"^® – Typ mit einer Konzentration von 1,61 mMol/l (für weitere Tausendfachverdünnung).

Assayreagenz: 200 ml des Bestandteils (4) vermischt mit 200 ml des Bestandteils (5) und 100 ml des Bestandteils (6).
Die Messungen wurden für die folgenden Fälle durchgeführt:

– An gesunden Individuen und an Individuen mit klinisch diagnostizierten Tumoren vor einer Behandlung. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 dargestellt.
– Zur Überwachung einer CMF-(Cyclophosphamid – Methotrexat – 5-Fluoracyl) Therapie an Patienten mit Mammatumoren nach einem chirurgischen Eingriff. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 aufgelistet.
– Für das Überwachen einer Methotrexat – (ein Folsäure antagonisierendes Mittel) Therapie an Patienten mit Osteosarkom. Die Ergebnisse sind in der Tabell 7 aufgelistet.

Aus Zwecken der Vereinfachung werden in der Tabelle 2 und in allen der nachfolgenden Tabellen nur die Symbole der jeweiligen Substrate angegeben; diese beziehen sich jedoch immer auf die 5'-Nukleotidase-Aktivitätswerte, welche an den gegebenen Substraten gemessen wurden.
Aus den Daten der Tabelle 2 erscheint es, daß mit der Ausnahme eines Lymphoms + Knochenmanifestation, die 5'-Nukleotidase-Aktivitätswerte, die an den sechs Substraten gemessen wurden, in einer beträchtlichen Weise bei Patienten anstiegen, welche an den untersuchten Malignomen litten, im Vergleich zu den gesunden Kontrollwerten. Die Summe der 5'-Nukleotidase-Aktivitätswerte (Σ 5'-ND) zeigte den deutlichsten Anstieg bei Lungentumoren und oder Lymphomen gekoppelt mit Lebermanifestationen. Der Anstieg der Aktivität der alkalischen Phosphatase im Vergleich zu Veränderungen bei der 5'-Nukleotidase-Aktivität war am deutlichsten bei Lymphomen gekoppelt mit Knochenmanifestationen.
Tabelle 2
Wie es aus den Daten der Tabelle 3 erscheint, können strenge Korrelationen zwischen den Aktivitätswerten der 5'-Nukleotidase, welche zu den einzelnen Substraten gehören, gefunden werden, sowie zwischen der Aktivität, welche an 5'-AMP gemesen wurde und welche an (3-Glycerophosphat gemessen wurde, welches die unspezifische Phosphataseaktivität anzeigt, sowohl bei den Patienten, welche an den untersuchten Malignomen leiden und die sich vor einer Behandlung befinden, als auch bei den gesunden Kontrollen.
Tabelle 3
Die Ergebnisse der Messungen, welche angewendet wurden, um die Therapie bei Patienten zu überwachen, welche einer Mammatumorektomie unterzogen worden waren, und anschließend einer Chemotherapie, werden in den Tabellen 4 und 5 gegeben. Die Tabelle 4 faßt die Daten von erfolgreichen Fällen zusammen, wohingegen die Tabelle 5 die Daten von Fällen zusammenfaßt, welche gegenüber einer CMF-Therapie resistent waren. Daten, welche nach einer Therapieveränderung erhalten wurden, werden ebenfalls in der Tabelle 5 gegeben. Bei Therapieveränderungen wurden die Patienten einer cis-Platin-Therapie unterzogen, und die 5'-Nukleotidase-Aktivitäten wurden 1 Tag nach der ersten Behandlung (*) und 1 Tag nach der Beendigung der Therapie (**) gemessen. In allen anderen Fällen wurden die Messungen 24 Stunden nach der tatsächlichen chemotherapeutischen Behandlung durchgeführt. Aus Vergleichszwecken werden die an gesunden Kontrollen gemessenen Werte ebenfalls angegeben.
Tabelle 4
Aus den Daten können die folgenden Schlüsse gezogen werden: 5'-Nukleotidaseaktivitäten, die an den Substraten 5'-CMP, 5'-GMP, 5'-IMP und 5'-TMP gemessen wurden, nahmen in einer beträchtlichen Weise bereits nach der ersten Serie von CMF-Behandlungen ab. Nach der dritten Serie von CMF-Behandlungen konnten in beträchtlichem Maße große Abnahmen beobachtet werden bei den 5'-Nukleotidase-Aktivitäten, gemessen an den Substraten 5'-AMP, 5'-GMP und 5'-IMP. Nach der sechsten Serie von CMF-Behandlungen Traten beträchtliche Abnahmen bei den 5'-Nukleotidase-Aktivitäten, die an den Substraten 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-GMP und 5'-IMP gemessen wurden, auf. Für Arzneimittelkombinationen ist die Wirkung, welche auf den Angriffspunkt ausgeübt wird, schwer zu definieren, aufgrund der unterschiedlichen Angriffspunkte der einzelnen Bestandteile. Daher dient in solchen Fällen ein Vergleich mit dem Zustand vor der Behandlung als eine Leitlinie. Die gemessenen Daten zeigen, daß die Arzneimittelkombination, welche angewendet wurde, ihre therapeutische Wirkung in zwei Phasen ausübt, über die Konsequenzen, die auf die Prozesse des Purin- und Pyrimidinmetabolismus ausgeübt werden.
Tabelle 5
Nach einer wirksamen CMF-Behandlung konnten keinen signifikanten Veränderungen bei den 5'-Nukleotidase-Aktivitäten beobachtet werden, welche an den einzelnen Substraten gemessen wurden, Daher wurde die Therapie mit Cis-Platin fortgesetzt. Auf der Basis der Ergebnisse haben wir beobachtet, daß signifikante Veränderungen bei den 5'-Nukleotidase-Aktivitäten, welche zu den einzelnen Substraten gehören, bereits im ersten Stadium einer Behandlung mit Cis-Platin (24 Stunden nach der Behandlung, in der Tabelle durch * gekennzeichnet) auftraten; beträchtliche Abnahmen konnten in erster Linie an den Substraten beobachtet werden, welche am Purin-Metabolismus beteiligt sind. Die am ersten Tag nach der Beendigung der Behandlung mit Cis-Platin gemessenen Werte (mit ** in der Tabelle markiert) zeigen an, daß auf die Veränderungen im Purin-Metabolismus über die Zeit Veränderungen im Pyrimidin-Metabolismus folgen, mit der Bemerkung, daß die Veränderungen in den zwei metabolischen Prozessen sich überlagern. Unser Test enthüllte die Wirkungslosigkeit der CMF-Therapie bereits 5 Tage vor der Messung mit dem diagnostischen Tumormarker CA 15-3 (welcher ebenfalls eine Wirkungslosigkeit anzeigte), daher könnten die Patienten vor einer 5 Tage langen überflüssigen CMF-Behandlung bewahrt werden.
Der Erfolg und die Wirksamkeit der Therapie werden ebenfalls durch die Tatsache widergespiegelt, daß sich die anfängliche strenge Korrelation zwischen den 5'-Nukleotidase-Aktivitätswerten, welche an verschiedenen Substraten gemessen wurde, verändert. Die nach einer erfolgreichen Therapie berechneten Werte sind in der Tabelle 6 nachstehend aufgelistet, wo die Werte vor der Therapie zum Zweck des Vergleichs gegeben werden.
Tabelle 6
Die Daten der Tabelle 6 zeigen, daß die anfängliche strenge Korrelation zwischen den 5'-Nukleotidase-Aktivitäten, welche an den verschiedenen Substraten gemessen wurde, gewichen ist, was ebenfalls widerspiegelt, daß die Messungen an verschiedenen Substraten es ermöglichen, in einer getrennten Weise die einzelnen biologischen Prozesse, welche während der Therapie voranschreiten nachzuweisen und zu bewerten.
Die Bestimmung der 5'-Nukleotidase-Aktivität mit den sechs vorausstehenden Substraten stellt unersetzlich nützliche Informationseinheiten ebenfalls in den Fällen bereit, wenn eine Chemotherapie keinen direkten Einfluß auf den Nukleotidmetabolismus hat. Ein gutes Beispiel für diese Situation ist die Behandlung mit Methotrexat von Osteosarcompatienten. Methotrexat ist eine Substanz mit einer Folsäure antagonisierenden Wirkung, wobei sie keine direkte Wirkung auf den Nukleotidmetabolismus hat und somit jede Veränderung im Nukleotidmetabolismus, welche auf eine Methotrexatbehandlung hin auftritt, eine de novo Nukleo tidsysnthese anzeigt, d, h. ein Schädigen von gesunden Zellen. Jedwede Schädigungen, welche zufällig auf eine Behandlung hin auftreten, haben beständig ernsthafte Konsequenzen. Eine solche Konsequenz kann zum Beispiel eine Verminderung der zellulären und humoralen Immunität sein, was ebenfalls die Bildung eines zweiten Tumors induzieren kann.
Veränderungen bei den 5'-Nukleotidase-Aktivitäten, welche bei Osteosarkompatienten, welche mit Dosen von 12,0 g Methotrexat behandelt wurden, gemesen wurden, sind in der Tabelle 7 zusammengefaßt.
Aus den Daten der Tabelle 7 können die folgenden Schlüsse gezogen werden:
Die Ergebnisse der Bestimmungen der 5'-Nukleotidase-Aktivität, welche an den sechs Substraten durchgeführt wurden, die angewendet wurden, um die Veränderungen am Pyrimidin- und Purinmetabolismus zu untersuchen, zeigen, daß in der ersten Periode die Behandlung einen Einfluß auf den Pyrimidinmetabolismus hat. Die Unterschiede zwischen den zwei metabolischen Wegen sind besonders deutlich 44 Stunden nach der Behandlung. Es erscheint ebenfalls aus den Daten der Tabelle 7, daß beträchtliche Unterschiede beobachtet werden können zwischen den einzelnen Substraten, selbst innerhalb ein und desselben metabolischen Weges. Dieses Phänomen ist eindeutig das Ergebnis der Unterschiede zwischen den biochemischen Funktionen der einzelnen Substrate. Durch die Überwachung der Therapie gemäß den Verfahren der Erfindung wird es möglich, die Therapie zu stoppen oder zu verändern, bevor die nachgewiesenen Störungen zu ernsthafteren Veränderungen als späte Konsequenzen führen würden.
Tabelle 7
Obwohl in dem Vorausstehenden das Verfahren und der Reagenzien-Kit gemäß der Erfindung in Verbindung mit einer diagnostischen Verwendung offenbart wurde, ist der Umfang der Erfindung nicht auf diese Verwendungsart beschränkt. Das Verfahren und der Reagenzien-Kit kann ebenfalls mit ausgezeichneten Ergebnissen für Forschungszwecke verwendet werden, d.h. die Mechanismen bestimmter maligner Prozesse nachzuweisen, bekannte oder neue Mittel gegen Krebs zu testen und die Mechanismen ihrer Wirkungen zu untersuchen.

Claims

Verfahren zur Diagnostizierung des Vorliegens eines malignen Prozesses und/oder zur Überwachung von Ergebnissen einer bei dessen Behandlung angewandten Therapie durch Bestimmen der 5'-Nukleotidase-Aktivität, wobei eine biologische Probe in einer bestimmten Weise und unter an sich bekannten Bedingungen mit einem Nukleotidpentosemonophosphat als Substrat inkubiert wird, das freigesetzte anorganische Phosphat zu einem Farbkomplex umgewandelt wird durch Behandeln mit Ammoniummolybdat und einem Reduktionsmittel, die Farbintensität durch ein bekanntes Verfahren gemessen wird und aus dem Messwert die Aktivität von 5'-Nukleotidase oder die Menge an anorganischem Phosphat, die innerhalb einer Zeiteinheit freigesetzt wird, als eine Zahl, die proportional zu der Aktivität von 5'-Nukleotidase ist, mit einer bekannten Berechnungsmethode und/oder mit Hilfe einer Kalibrierungskurve berechnet wird, dadurch gekennzeichnet, dass 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP und 5'-TMP als Nukleotidpentosemonophosphate verwendet werden, die Messung mit allen diesen sechs Substraten erfolgt und die erhaltenen Resultate miteinander und mit Kontrollwerten verglichen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, dass die biologische Probe mit dem Substrat in einem gepufferten Medium wahlweise in Gegenwart eines Inhibitors gepuffert wird und danach über Ammoniummolybdat und Reduktionsmittel ein Protein solubilisierendes Reagens und ein stabilisierendes Reagens ebenfalls der inkubierten Mischung hinzugefügt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidpentosemonophosphat-Substrate als wässrige Lösungen mit Konzentrationen von 1–10 mMol/l verwendet werden.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass Vollblut, Serum oder ein Haemolysat als biologische Probe verwendet wird und die Inkubierung mit dem Substrat sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit eines Inhibitors der alkalischen Phosphatase erfolgt.
Reagens-Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1–4, umfassend 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP und 5'-TMP als Substrate zusammen mit herkömmlichen Komponenten eines Reagens-Kits, das zur Bestimmung der 5'-Nukleotidase-Aktivität durch Bilden eines anorganischen Phosphats, Umwandeln des resultierenden Phosphats in einen Farbkomplex und Messen der Farbintensität durch Photometrie einsetzbar ist.
Reagens-Kit nach Anspruch 5, umfassend als herkömmliche Komponenten einen Puffer, ein Protein solubilisierendes Mittel, ein Stabilisierungsmittel, ein Farbreagens, einen Phosphor-Standard und wahlweise einen Inhibitor und/oder ein von Nukleotidpentosemonophosphat verschiedenes Substrat.