DE69531684T2 - Methode zur prüfung von herbiciden - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Identifizierung potenzieller Herbizide und die Verwendung von Inhibitoren, oder Pro-Inhibitoren, von AMP-Deaminase als Herbizide.
  • Stand der Technik
  • Es wurde bereits von der herbiziden Wirkung von Coformycin und carbocyclischem Coformycin berichtet (Isaac et al (1991), J. Antibiotics 44, 729 bzw. Bush et al (1993), Phytochem. 32, 737).
  • Coformycin ist bekannt als wirkungsvoller Inhibitor des Enzyms Adenosindeaminase, EC 3.5.4.4 (Nakamura et al 1974, J. Am. Chem. Soc. 96, 4327). Coformyin ist ebenfalls ein Inhibitor des verwandten Enzyms AMP-Deaminase, EC 3.5.4.6, wobei jedoch Phosphorylierung in der 5'-Stellung der Ribose erforderlich ist, um eine sehr starke Hemmung zu erreichen (Frieden et al, 1980, Biochem. 19, 5303; Merkler et al, 1990, Biochem., 29, 8358).
  • Inhibitoren von Adenosindeaminase sind von Interesse als Krebs-Chemotherapie, als immunsuppressive Wirkstoffe gegen Autoimmunerkrankungen und wegen ihrer Fähigkeit, die Wirksamkeit von Adeninnukleosid-Analogen zur Behandlung von Viruserkrankungen und Krebs zu verstärken, die durch die Wirkung des Enzyms inaktiviert werden könnten [Gilbertson und Sircar (1990) in Comprehensive Medicinal Chemistry (Hrsg. C. Hansch, P. G. Sammes und J. B. Taylor, Vol. 2, S. 449 ff.)].
  • Es ist allgemein anerkannt, dass Pflanzen keine Adenosindeaminase enthalten [Holloman (1979), Proc. Brit. Crop. Conf. Pests Diseases, 251; Batlers et al (1985), Physiol. Plant Pathol., 27, 65; Brady und Hegarty (1966), Nature, 209, 1027; Staub et al (1985), J. Am. Soc. Hort. Sci., 110, 426; Le Floch et al (1982), Plant. Sci. Lett., 27 309]. Daher kann die herbizide Wirkung von Coformycin nicht auf seine bekannte Fähigkeit zurückzuführen sein, dieses Enzym zu hemmen. Es wurde zwar vorgeschlagen, dass das verwandte Enzym AMP-Deaminase eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der intrazellulären Adenylat-Energieladung in Pflanzen spielt (Raymond et al, 1987, in The Biochemistry of Plants, Vol. II, Kapitel 5, S. 129 ff., Hrsg. D. D. Davis), doch es wurde unseres Wissens kein direkter experimenteller Beweis veröffentlicht, der diese Theorie für Pflanzen erhärtet. Obwohl berichtet wurde, dass Coformycin den Adeninnukleotidgehalt in einer Suspensionskultur von Cathatranthus roseus beeinträchtigt, wurde die Hemmung von AMP-Deaminase nicht direkt nachgewiesen (Yabuki und Ashihara, 1991, Biochim. Biophys. Acta, 1073, 474), und es ist bekannt, dass Coformycin im Vergleich zu seiner Wirkung auf Adenosin-Deaminase und die Wirksamkeit seines 5'-Phosphatderivats gegen AMP-Deaminase eine relativ schwache Hemmung dieses Enzyms verursacht.
  • Wir haben herausgefunden, dass die starke herbizide Wirkung von carbocyclischem Coformycin auf die Phosphorylierung der Verbindung in planta und die anschließende Hemmung des Enzyms AMP-Deaminase (EC 3.5.4.6.) zurückzuführen ist. Diese Wirkweise wurde bisher noch nicht für Herbizide beschrieben.
  • Offenlegung der Erfindung
  • Wir haben gezeigt, dass carbocyclisches Coformycin ein wirkungsvoller Inhibitor von Säuger-Adenosin-Deaminase ist (Testbeispiel 1).
  • Untersuchungen des Metabolismus von 14C-Adenosin mit Hilfe von rohen, entsalzten Homogenaten von Erbsensämlingen bestätigten die aus der Literatur bekannten Daten, dass Adenosin-Deaminase nicht vorhanden ist. Das verwandte Enzym, AMP-Deaminase war jedoch deutlich vorhanden (Testbeispiel 2).
  • Die Anwendung von carbocyclischem Coformycin auf Erbsensämlinge über den Transpirationsstrom führte zu einem raschen Rückgang des extrahierbaren Gehalts an AMP-Deaminase (Testbeispiel 3).
  • Während carbocyclisches Coformycin nur eine recht schwache Hemmung von AMP-Deaminase zeigte, erwies sich ein 5'-Phosphatderivat als wirkungsvoller Inhibitor (Testbeispiel 4).
  • Die vorstehenden Beobachtungen wiesen darauf hin, dass carbocyclisches Coformycin in planta phosphoryliert wird und dass dieses phosphorylierte Derivat die beobachtete Reduzierung der Enzymaktivität bewirkt. Weitere Hinweise darauf, dass die Phosphorylierung in vivo erfolgt, erhielt man durch Anwendung von 3H-carbocyclischem Coformycin auf Erbsensämlinge über den Transpirationsstrom und Beobachtung der gebildeten Metaboliten. Es zeigte sich die Bildung einer Verbindung, die zusammen mit authentischem carbocyclischem Coformycin-5'-Phosphat chromatographierte. Diese Verbindung konnte an eine lösliche Proteinfraktion gebunden isoliert werden, die AMP-Deaminase enthält, was stark darauf hinweist, dass das 5'-Phosphatderivat das Enzym in planta hemmt (Testbeispiel 5).
  • Es wurde vermutet, dass AMP-Deaminase eine Rolle dabei spielt, die intrazelluläre Adenylat-Energieladung aufrecht zu erhalten [Raymond et al (1987), in The Biochemistry of Plants, Vol. 11 (Hrsg. D. D. Davis), Kapitel 5, S. 129 ff).
  • Wir haben die Bedeutung dieses Enzyms für das Wohlergehen einer Pflanze anhand der starken herbiziden Wirkungen, die durch Hemmung des Enzyms hervorgerufen werden, klar aufgezeigt. Seine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Adenylat-Energieladung zeigte sich ebenfalls bei der Analyse der Auswirkungen von carbocyclischem Coformycin auf den Adenylat-Gehalt. Wie in Testbeispiel 6 gezeigt wird, zeigt sich ein deutlicher Anstieg des extrahierbaren ATP-Gehalts. Dieser Anstieg der ATP-Spiegel scheint einzigartig für Inhibitoren von AMP-Deaminase zu sein und war z. B. bei dem Standardherbizid Chlorsulfuron nicht festzustellen.
  • Diese Ergebnisse belegen die Hemmung der AMP-Deaminase als Wirkmechanismus von carbocyclischem Coformycin. Dies ist ein neuartiger herbizider Wirkmechanismus, und seine Entdeckung eröffnet die Möglichkeit der Identifizierung neuartiger Chemikalien, die dasselbe Zielenzym entweder direkt oder nach der Metabolisierung in planta zu einem aktiven Inhibitor ("indirekte Inhibitoren") hemmen.
  • Entsprechend stellt die Erfindung auch ein Verfahren zur Identifizierung potenzieller Herbizide bereit, umfassend die Prüfung eines Kandidaten entweder mit einem AMP-Deaminase-Hemmtest für direkte Inhibitoren oder einem Adenosin-Deaminase-Test für Inhibitoren, die in planta verändert werden müssen, sowie die Prüfung auf einen messbaren ATP-Anstieg.
  • Weiterhin umfasst die Erfindung die Verwendung einer Verbindung als Herbizid, bei der es sich um einen AMP-Deaminase-Inhibitor in planta handelt, unter der Voraussetzung, dass die Verbindung kein allgemeiner Enzyminhibitor ist, und dass es sich nicht um eine Verbindung handelt, deren herbizide Wirkung bereits bekannt war.
  • Bei dieser Verwendung ist der Inhibitor der AMP-Deaminase ein Inhibitor, der eine messbare Reduzierung der AMP-Deaminase bewirkt, wenn er gegen eine Enzympräparation mit 100 μM oder weniger getestet wird. Unter "messbarer Reduzierung" versteht sich im Allgemeinen eine Reduzierung um mindestens 25% und vorzugsweise mindestens 50% dieser Rate.
  • Bei dieser Verwendung ist ein indirekter Inhibitor ein Inhibitor, der in planta in einen AMP-Deaminase-Inhibitor umgesetzt wird. Einige indirekte Inhibitoren bewirken eine messbare Reduzierung der Adenosin-Deaminase, wenn sie gegen eine Enzympräparation mit 100 μM oder weniger getestet werden. Unter "messbarer Reduzierung" versteht sich im Allgemeinen eine Reduzierung um mindestens 25% und vorzugsweise mindestens 50% bei dieser Rate.
  • Der AMP-Deaminase-Test kann zwar die intrinsische herbizide Wirksamkeit identifizieren, doch anschließend müssen herkömmliche Tests durchgeführt werden, um die herbizide Wirkung in vivo zu bestätigen. Dies ist selbstverständlich bei allen indirekten Inhibitoren erforderlich, die durch die Metabolisierung in planta aktiviert werden müssen. Typische Symptome, die auf die Behandlung mit carbocyclischem Coformycin folgen, sind ein Aufhören des Wachstums, gefolgt von Verblassen und Absterben des Apikalmeristems. Alle diese Symptome sind ähnlich wie die, die von anderen Herbiziden mit einer anderen Wirkweise (z. B. Chlorsulfuron) hervorgerufen werden. Die Bestätigung, dass ein Wirkstoffkandidat seine herbizide Wirkung durch Hemmung der AMP-Deaminase ausübt, kann durch Messung des extrahierbaren ATP-Gehalts erhalten werden. Soweit uns bekannt ist, wird ein Anstieg des ATP-Gehalts ausschließlich von Herbiziden hervorgerufen, deren Wirkung auf die Hemmung der AMP-Deaminase zurückzuführen ist. In diesem Fall ist der Wirkstoff eine Verbindung, die einen messbaren Anstieg des extrahierbaren ATP-Gehalts bewirkt, wenn sie in Konzentrationen von 10 mM oder weniger über den Transpirationsstrom auf Pflanzen angewendet wird. Unter "messbarerem Anstieg" versteht sich im Allgemeinen ein Anstieg auf mindestens das 1,5-fache des Kontrollwerts und vorzugsweise auf mindestens das 2,0-fache des Kontrollwerts.
  • Testbeispiel 1
  • Hemmtest für Adenosin-Deaminase von Säugern
  • Eine geeignete Quelle des Enzyms ist Adenosin-Deaminase aus der Darmschleimhaut von Kälbern, die von Sigma Chemical Company Limited bezogen werden kann. Der verwendete Test folgt den Versuchsanweisungen des Herstellers und misst einen Rückgang der Absorption bei 265 nm, wenn das Substrat Adenosin verbraucht wird. Enzym und Inhibitor wurden vor der Zugabe des Substrats 10 Minuten lang präinkubiert. Unter diesen Bedingungen zeigte carbocyclisches Coformycin mit 25 nM bei einer Substratkonzentration von 60 μM eine 50%-ige Hemmung.
  • Testbeispiel 2
  • Adenylat-Stoffwechselweg in einem rohen Pflanzenhomogenat
  • Erbsen (Pisium sativum L var Onward) wurden 10 Tage lang bei 25°C mit einem Licht-Dunkel-Zyklus von 16 Stunden/8 Stunden in Erde kultiviert. Die Sämlinge wurden nahe an der Erde abgeschnitten, und mittels Homogenisierung in 2 Volumen eiskaltem Puffer mit Tris-HCl (0,1 M, pH-Wert 7,4 mit 5 M NaOH), 0,1 mM Dithiothreitol und 0,4 M Saccharose unter Verwendung eines Waring-Mixers (1 Minute, Höchstgeschwindigkeit) wurde ein Rohhomogenat hergestellt. Das Homogenat wurde durch 6 Schichten Musselin passiert, und 2,5 ml wurden auf einer Sephadex (eingetragenes Warenzeichen) PD10-Säule (1,5 × 8 cm) entsalzt, die zuvor mit dem Homogenisationspuffer äquilibriert worden war. Protein wurde mit demselben Puffer eluiert. Der Test enthielt bei einem Gesamtvolumen von 250 μl 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 6,5), 50 mM KCl, 0,05% (w/v) BSA und 100 mg Protein. ATP (5 mM) wurde ebenfalls zugegeben, wo dies angegeben ist. Der Test begann mit der Zugabe von [14C] Adenosin (500 μM, 0,2 μCi). Nach 10 Minuten Inkubation bei 25°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,25 ml eiskalter HClO4 (0,4 M) gestoppt. Das ausgefällte Protein wurde durch Zentrifugieren (13.000 g, 2 Minuten) entfernt, und 0,4 ml des resultierenden Überstands wurden auf Phenylsilan-gebundene Kieselgelsäulen (500 mg) gegeben, die zuvor mit 2 Volumen Methanol und anschließend 2 ml 0,4 M HClO4 gewaschen worden waren. Die Proben wurden mit 4 ml 0,4 M HClO4 eluiert. Der pH-Wert des Eluats wurde auf Eis mit 5 M KOH auf einen Wert zwischen 5,5 und 7,0 eingestellt. Der neutralisierte Extrakt wurde zentrifugiert (13.000 g, 2 Minuten) und in einem Gyrovap (eingetragenes Warenzeichen) bis zur Trockenheit eingedampft. Die Probe wurde dann vor der HPLC-Analyse in 0,5 ml 10 mM HCl erneut gelöst und zentrifugiert (13.000 g, 2 Minuten). Die Produkte wurden mittels Umkehrphasenchromatographie mit einer Spherisorb (eingetragenes Warenzeichen) Säule (25 cm × 0,46 cm), Lösemittel 1: 95 : 5 10 mM KHP2O4 Methanol, Lösemittel 2: 88 : 12 10 mM KHP2O4 : Methanol, pH-Wert 5,3, Stufenveränderung nach 6 Minuten, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute analysiert.
  • Die in der nachstehenden Tabelle aufgeführten Daten zeigen deutlich, dass keine Adenosin-Deaminase-Aktivität nachweisbar war. In der Tat wurde keinerlei Adenosin-Stoffwechsel festgestellt, solange kein ATP zugegeben wurde. Die Zugabe von ATP führte zur Bildung der phosphorylierten Verbindungen AMP, ADP und ATP, wie es von der Wirkung der entsprechenden Kinasen erwartet würde. Die Bildung von IMP ist wahrscheinlich auf die Wirkung von AMP-Deaminase und die geringe Menge von Inosin auf die anschließende Dephosphorylierung zurückzuführen.
  • Figure 00060001
  • Testbeispiel 3
  • Wirkung von carbocyclischem Coformycin auf den extrahierbaren Gehalt an AMP-Deaminase
  • Erbsensämlinge wurden nahe an der Erde abgeschnitten, die Stengel rasch mit destilliertem Wasser gewaschen und dann aufrecht in eine 1 ml-Küvette gestellt, die 2 ml gelöste Verbindung oder Wasser (Kontrolle) enthielt. Eine Scheibe (ca. 2 mm) von der Stengelbasis wurde abgeschnitten, während der Stengel sich in der Flüssigkeit befand, um zu verhindern, dass sich Lufteinschlüsse im Xylem bilden. Die Sämlinge wurden im Hellen bei Raumtemperatur (ca. 20°C) in einem bewegten Luftstrom inkubiert. In regelmäßigen Abständen wurden einzelne Setzlinge extrahiert und der AMP-Deaminase-Gehalt mittels Extraktion in 2 Volumen eiskaltem Citratpuffer (0,1 M, pH-Wert 7), 0,5 mM Dithiothreitol mit Hilfe von Mörser und Pistill ermittelt. Das Homogenat wurde durch 6 Schichten Musselin passiert und auf eine Sephadex-Gelfiltrationssäule (1,5 cm × 8 cm) gegeben, die zuvor mit 30 mM Citrat (pH-Wert 7,1), 50 mM KCl und 0,5% (w/v) BSA (Testpuffer) äquilibriert worden war. Das Protein wurde mit dem Testpuffer äquilibriert und direkt für den Enzymtest verwendet. Der Test basiert auf der Freisetzung von Ammoniak (McCullough (1967), Clinica Chimica Acta, 17, 297) und enthielt in 0,5 ml Gesamtvolumen 60 mM Citratpuffer (pH-Wert 7,1 mit 5 M NaOH), 100 mM KCl, 0,1% (w/v) BSA und 5 mM AMP. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl Extrakt gestartet. Von 0 bis 60 Minuten wurde in Abständen von 15 Minuten die Reaktion durch Zugabe von 420 μl Reagenz 1 (0,1 M Phenol, 0,17 mM Natriumnitroprussid) direkt gefolgt von 275 μl Reagenz 2 (0,125 M NaOH, 0,38 M Na2HPO4 und 5 ml HOCl in einem Gesamtvolumen von 500 ml) gestoppt. Nach Inkubation für 60 Minuten bei 55°C wurde die Absorption der Lösungen bei 625 nM ermittelt.
  • Unter diesen Bedingungen und einstündiger Behandlung wurde der Gehalt an extrahierbarer AMP-Deaminase auf 20–30% der Kontrollwerte von 19 μmol Ammoniakfreisetzung pro Gramm Frischgewicht pro Minute reduziert.
  • Testbeispiel 4
  • Hemmtest für AMP-Deaminase von Pflanzen
  • Erbsensämlinge wurden wie in Testbeispiel 2 beschrieben kultiviert. Die Sämlinge wurden nahe an der Erde abgeschnitten und in 2 Volumen eiskaltem Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5) mit 0,1 mM Dithiothreitol und 0,4 M Saccharose unter Verwendung eines Waring-Mixers (1 Minute, Höchstgeschwindigkeit) homogenisiert. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Das Homogenat wurde durch 6 Schichten Musselin passiert und 20 Minuten lang bei 100.000 g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Zu dem resultierenden Überstand wurde 40% (w/v) Ammoniumsulfat unter ständigem Rühren zugegeben. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren (12.000 g, 15 Minuten) gesammelt und in 30 ml Phosphatpuffer (pH-Wen 7,5), 0,1 mM Dithiothreitol gelöst, dann über Nacht gegen 2 Liter desselben Puffers dialysiert. Unlösliche Bestandteile, die sich über Nacht bildeten, wurden mittels Zentrifugation (7.000 g, 10 Minuten) entfernt. Der Überstand wurde auf eine Phosphocellulose-Säule (1,5 × 8 cm) gegeben, die zuvor mit 0,1 M Phosphatpuffer äquilibriert worden war. Nach der Beladung wurde die Säule mit 14 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH-Wen 7,5) gewaschen und das Enzym mit 0,6 M Phosphatpuffer (pH-Wen 7,5) eluiert. Die Wirksamkeit wurde mit dem vorstehend in Testbeispiel 3 beschriebenen Ammoniak-Freisetzungstest ermittelt.
  • Bei einer Präinkubationszeit von 10 Minuten und einer Substratkonzentration von 640 μM bewirkte carbocyclisches Coformycin in einer Konzentration von 120 μM eine Hemmung der Aktivität um 50%. Im Gegensatz dazu erhielt man mit 20 nM carbocyclischem Coformycin-5'-Phosphat eine Hemmung von 50%.
  • Testbeispiel 5
  • In planta-Metabolismus von carbocyclischem Coformycin
  • Erbsensämlinge wurden wie in Testbeispiel 2 kultiviert, wie in Testbeispiel 3 geerntet und dann über den Transpirationsstrom mit 10 μM (400 Ci Mol–1) [3H] carbocyclischem Coformycin behandelt. Nach Inkubationszeiten wurden Paare von Sämlingen in flüssigem Stickstoff schockgefroren, zu einem feinen Pulver gemahlen und in 2 ml eiskaltem 0,4 M HClO4 extrahiert. Die Extrakte wurden wie vorstehend in Testbeispiel 2 beschrieben für die HPLC-Analyse behandelt, mit der Ausnahme, dass die abschließende Probe in 0,5 ml Wasser anstelle von 10 mM HCl resuspendiert wurde. [3H] carbocyclisches Coformycin und [3H] carbocyclisches Coformycin-5'-Phosphat wurden mittels Kationenaustäuschchromatographie getrennt. Verwendet wurde eine Partisil (eingetragenes Warenzeichen) SCX Säule (8,0 cm × 0,46 cm), 0,05 M NH4HP2O4, pH-Wert 2,6; Fließgeschwindigkeit = 2 ml/Minute.
  • Nach vierstündiger Inkubation chromatographierte der Hauptmetabolit zusammen mit authentischem carbocyclischem 5'-Phosphat. Ein zusätzlicher Beweis für die Identität des Metaboliten ergab sich aus der Tatsache, dass die Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur vollständigen Rückumwandlung des Metaboliten in carbocyclisches Coformycin führte.
  • Wenn wie vorstehend beschrieben behandelte Pflanzen nach den Enzymextraktionsprotokollen von Testbeispiel 3 extrahiert wurden, wurde auch bei der Proteinfraktion mit AMP-Deaminase Radioaktivität festgestellt. Durch Denaturierung des Proteins und anschließende HPLC-Analyse wurde gezeigt, dass die gesamte Radioaktivität mit carbocyclischem Coformycin-5'-Phosphat assoziiert ist.
  • Testbeispiel 6
  • Messung des extrahierbaren ATP-Gehalts
  • Erbsen wurden wie in Testbeispiel 2 beschrieben kultiviert und wie in Testbeispiel 3 beschrieben über den Transpirationsstrom carbocyclischem Coformycin ausgesetzt. Einzelne Sämlinge wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Das gefrorene Gewebe wurde mit Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver gemahlen, und dann wurde 1 ml eiskalte 0,4 M HClO4 zugegeben. Die gefrorene Säure wurde zu einem feinpulvrigen Gewebe gemahlen, man ließ das Gemisch auftauen und inkubierte es anschließend 15 Minuten auf Eis. Der Extrakt wurde zentrifugiert (4.000 U/min, 5 Minuten).
  • Der ATP-Gehalt wurde unter Verwendung des Luciferasetests und eines LUMAC Biocounter M 2500 (6370 AC Landgraaf Niederlande) gemessen. Proben wurden 1 : 10.000 in Wasser verdünnt, und 100 μl wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers getestet.
  • Nach vierstündiger Behandlung steigerten 100 μM carbocyclisches Coformycin den ATP-Gehalt auf etwa das Zweifache der Kontrollspiegel von 333 nmol ATP pro Gramm Frischgewicht.

Claims (7)

  1. Verfahren zur Identifizierung potenzieller Herbizide, umfassend die Prüfung einer Verbindung in einem AMP-Deaminase-Hemmtest und einem ATP-Test, und wenn eine messbare Reduzierung der AMP-Deaminase-Aktivität und ein messbarer Anstieg von ATP beobachtet wird, wird sie anschließend einem oder mehreren herkömmlichen Tests unterzogen, um die herbizide Wirkung in vivo zu bestätigen, wobei die genannte messbare Reduzierung eine Reduzierung der AMP-Deaminase-Aktivität um mindestens 25% beim Test gegen eine Enzympräparation von 100 μM oder weniger umfaßt.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die genannte messbare Reduzierung beim Test gegen eine Enzympräparation von 100 μM oder weniger eine Reduzierung der AMP-Deaminase-Aktivität um mindestens 50% ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der genannte messbare ATP-Anstieg ein Anstieg auf mindestens das 1,5-fache des Kontrollwertes für den extrahierbaren ATP-Gehalt ist, wenn 10 mM oder weniger über den Transpirationsstrom auf Pflanzen appliziert werden.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der genannte messbare ATP-Anstieg ein Anstieg auf mindestens das 2,0-fache des Kontrollwertes für den extrahierbaren ATP-Gehalt ist, wenn 10 mM oder weniger über den Transpirationsstrom auf Pflanzen appliziert werden.
  5. Verfahren zur Identifizierung potenzieller Herbizide, die in planta zu Inhibitoren der AMP-Deaminase metabolisieren könnten, umfassend die Prüfung einer Verbindung in einem Adenosindeaminase-Hemmtest und einem ATP-Test, und wenn eine messbare Reduzierung der Adenosindeaminase-Aktivität und ein messbarer Anstieg von ATP beobachtet wird, wird sie anschließend einem oder mehreren herkömmlichen Tests unterzogen, um die herbizide Wirkung in vivo zu bestätigen, wobei die genannte messbare Reduzierung beim Test gegen eine Enzympräparation von 100 μM oder weniger eine Reduzierung der Adenosindeaminase-Aktivität um mindestens 25% ist.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die genannte messbare Reduzierung beim Test gegen eine Enzympräparation von 100 μM oder weniger eine Reduzierung der AMP-Deaminase-Aktivität um mindestens 50% ist.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei der genannte messbare ATP-Anstieg ein Anstieg auf mindestens das 1,5-fache des Kontrollwertes für den extrahierbaren ATP-Gehalt ist, wenn 10 mM oder weniger über den Transpirationsstrom auf Pflanzen appliziert werden.
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EP (1) EP0769067B1 (de)
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AU (1) AU2923295A (de)
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9413343D0 (en) * 1994-07-02 1994-08-24 Agrevo Uk Ltd Herbicides
US6630331B1 (en) * 1997-05-31 2003-10-07 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbicides test method
DE19912636A1 (de) * 1999-03-20 2000-09-21 Aventis Cropscience Gmbh Bicyclische Heterocyclen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Herbizide und pharmazeutische Mittel

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5180873A (en) * 1985-04-16 1993-01-19 Dna Plant Technology Corporation Transformation of plants to introduce closely linked markers
US5298421A (en) * 1990-04-26 1994-03-29 Calgene, Inc. Plant medium-chain-preferring acyl-ACP thioesterases and related methods
US5254801A (en) * 1990-12-03 1993-10-19 Monsanto Company Heterologous dominant conditional lethal gene which is a phosphonate monoester hydrolase and use thereof in plants
US5558862A (en) * 1991-09-23 1996-09-24 Monsanto Company Method of controlling insects
US5593874A (en) * 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
GB9413343D0 (en) * 1994-07-02 1994-08-24 Agrevo Uk Ltd Herbicides
DE19912636A1 (de) * 1999-03-20 2000-09-21 Aventis Cropscience Gmbh Bicyclische Heterocyclen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Herbizide und pharmazeutische Mittel

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