DE69932427T2 - Verfahren und testen verwendbar bei der behandlung von alkoholabhängigkeit oder -missbrauch - Google Patents

Verfahren und testen verwendbar bei der behandlung von alkoholabhängigkeit oder -missbrauch Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Erfindungsgemäße Ausführungsformen betreffen neue Testsysteme, die in anfänglichen Screenings von Verbindungen mit einer antidipsotropen Wirkung verwendbar sind. Solche Verbindungen sind in therapeutischen Verfahren zum Vermindern eines Alkoholkonsums als eine Behandlung von Alkoholabhängigkeit oder Alkoholmissbrauch verwendbar.
  • 2. Beschreibung des Standes der Technik
  • Alkoholmissbrauch und Alkoholabhängigkeit (d.h. Alkoholismus) sind schwerwiegende öffentliche Gesundheitsprobleme der modernen Gesellschaft. Allein in den Vereinigten Staaten zeigen schätzungsweise 13 Millionen Erwachsene Symptome einer Alkoholabhängigkeit aufgrund von exzessiver Alkoholaufnahme und weitere 7 Millionen betreiben Alkoholmissbrauch, ohne Symptome einer Abhängigkeit zu zeigen, gemäß einer Hochrechnung der US-Regierung nach Studien aus der Mitte der 1980er Jahre. Alkoholabhängigkeit und -missbrauch sind sehr teuer: In wirtschaftlichen und medizinischen Maßstäben wird es die USA weit über 200 Millionen Dollar 1991 kosten ohne Aussicht auf ein Sinken oder eine Abschwächung. Die sozialen und psychologischen Schäden, die Personen als eine Folge eines Alkoholmissbrauchs zugefügt werden, z.B. Kindern, die mit fötalem Alkoholsyndrom (FAS) geboren werden, sowie Opfern von alkoholbedingten Unfällen mit Todesfolge, Totschlag, Selbstmord, usw., sind immens.
  • Obwohl es allgemein anerkannt ist, dass Alkoholismus und Alkoholmissbrauch Krankheiten mit erschütternden internationalen ökonomischen, sozialen, medizini schen und psychologischen Auswirkungen sind, ist der Erfolg bei einer Verminderung oder sonstigen Verbesserung der Konsequenzen dieser Probleme ein schwer fassbares Ziel. Erst kürzlich hat sich die öffentliche Ansicht, dass Alkoholismus und Alkoholmissbrauch einzig durch moralische Imperative heilbar sind, dahingehend geändert, auch die Erkenntnis zu umfassen, dass Alkoholismus und Alkoholmissbrauch als physiologische Störungen anzusehen sind, deren Ätiologie verstanden werden kann und für die man durch wissenschaftliches Streben eine Therapie finden kann. Sowohl Alkoholmissbrauch als auch -abhängigkeit entstehen als ein Ergebnis verschiedener komplexer und bisher unvollständig verstandener Prozesse. Zur Zeit steht die Alkoholforschung in der Hauptströmung wissenschaftlicher Anstrengungen.
  • Unsere Studien über Alkohol (Ethanol oder Ethylalkohol) basierten auf der Hypothese, dass sein Missbrauch letztendlich auf molekularer Ebene verstanden und bewältigt werden kann. Ein solches molekulares Verständnis, wenn erreicht, würde eine Grundlage für die Identifizierung und Entwicklung geeigneter therapeutischer Wirkstoffe sowie von Testsystemen, die beim Screening von Verbindungen als antidipsotrope Wirkstoffe verwendbar sind, bilden.
  • Daidzin ist der Hauptwirkstoff in Extrakten von Radix puerariae, einer traditionellen chinesischen Medizin, die die Alkoholaufnahme bei syrischen Goldhamstern unterdrückt. Vgl. Keung, W. M. und Vallee, B. L. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10008–10012, und Keung, W. M., Klyosov, A. A. und Vallee, B. L. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1675–1679, die jeweils hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen sind. Es ist das erste Isoflavon, bei dem entdeckt wurde, dass es diese Wirkung aufweist und in therapeutischen Verfahren zum Vermindern eines Alkoholkonsums verwendbar ist. Vgl. die US-PS 5,624,910, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen ist. Daidzin ist auch ein potenter und selektiver Inhibitor der menschlichen mitochondrialen Aldehyddehydrogenase (ALDH-2, auch als ALDH-I bekannt), die ein Enzym ist, das am enzymatischen Hauptweg beteiligt ist, der für den Alkoholmetabolismus in Menschen verantwortlich ist. Vgl. Keung, W. M. und Vallee, B. L. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1247–1251. Vgl. ebenfalls die US-PS 5,204,369, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen ist. In dieser Hinsicht kann auch auf die US-PS 5,624,910 und WO 93/00096 Bezug genommen werden.
  • Die Ethanolaufnahme unterdrückende Aktivität ("antidipsotrope Aktivität") von Daidzin wurde auch in Wistar-Ratten, Fawn hooded Ratten und den genetisch gezüchteten P-Ratten unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, einschließlich Zwei-Hebel-Wahl (Ethanol/Stärke), Zwei-Flaschen-freie-Auswahl (Ethanol/Wasser), eingeschränkter Zugänglichkeit und Alkoholentzugsmustern bestätigt. Vgl. Keung, W. M. und Vallee, B. L. (1994), EXS 71, 1254–1260; Heyman, G. M., Keung, W. M. und Vallee, B. L., (1996), Alcohol. Clin. Exp. Res. 20, 1083–1087; Overstreet, D. H., Lee, Y. W., Rezvani, A. H., Pei, Y. H., Criswell, H. E. und Janowsky, D. S. (1996), Alcohol. Clin. Exp. Res. 20, 221–227; Overstreet, D. H., Rezvani, A. H. und Lee, Y. W. (1996), Alcohol. Clin. Exp. Res. 20 16A; Lin, R. C., Guthrie, S., Xie, C.-Y., Mai, K., Lee, D. Y., Lumeng, L. und Li, T.-K. (1996), Alcohol. Clin. Exp. Res. 20, 659–663. Diese Laborergebnisse zeigen auf oder bestätigen, dass Daidzin oder ein oder mehrere seiner Derivate, Analoga und/oder Metabolite wichtige Verbindungen bei der Behandlung von Alkoholmissbrauch und/oder Alkoholismus sind.
  • Es wurde postuliert, dass die Akkumulation von biogenen Aminen wie Serotonin und Dopamin, gekoppelt mit der Hemmung des Enzyms Aldehyddehydrogenase (ALDH) zu einer Akkumulation von biologisch aktiven biogenen Aldehyden oder aktiven Kondensationsprodukten von biogenen Aminen und Aldehyden wie Tetrahydroisochinolinen und beta-Carbolinen führt und dass diese Produkte das Trinkverhalten beeinflussen können. Vgl. Dietrich, R. A. und Erwin, V. (1980), Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 20, 55–80. Ferner haben Studien nahe gelegt, pharmakologische Wirksubstanzen zu identifizieren, die das Trinkverlangen unterdrücken können, indem sie direkt die Neurotransmitter Serotonin, Dopamin und γ-Aminobuttersäure (GABA) beeinträchtigen, wie Serotonin-Wiederaufnahmeinhibitoren, Dopamin-Agonisten, GABA-Rezeptor-Agonisten und narkotische Antagonisten. Von zahlreichen Serotonin-Wiederaufnahmeinhibitoren wie Zimelidin, Citalpram, Viqualin und Fluvoxamin wird behauptet, dass sie wirksam sind, einen Alkoholkonsum bei Tieren zu vermindern. Vgl. Lawrin, M. O., Naranjo, C. A. und Sellers, E. M. (1986), Psychopharmacology Bulletin 22, 1020–1025. Diese Verbindungen reagieren jedoch direkt mit dem Neurotransmitter.
  • Es wurde ebenfalls postuliert, dass ALDH-2 irgendwie an der Oxidation von Aldehyden, die von biologisch aktiven Monoaminen wie Serotonin und Dopamin im Hirngewebe von Säugern durch die Wirkung der Monoaminoxidase herrühren, beteiligt ist. Axelrod, J., Kopin, I. J. und Mann, J. D. (1959), Biochim. Biophys. Acta 36, 576–585, und Erwin, V. G. und Deitrich, R. A. (1966), J. Biol. Chem. 241, 3533– 3539. Studien über Dopamin-Metabolismus in isolierten Mitochondrien und verschiedenen subzellulären Fraktionen identifizierten ALDH-2 als das Hauptenzym, das die Oxidation von von Dopamin abgeleitetem 3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyd (DOPAL) in Rattenleber katalysiert. Tank, A. W., Weiner, H. und Thurman, J. A. (1981), Biochem. Pharmacol. 30, 3265–3275. Neuere kinetische Analysen haben gezeigt, dass sowohl DOPAL als auch von Serotonin abgeleitetes 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd (5-HIAL) Substrate für ALDH-2 sind. Ambroziak, W. und Pietruszko, R. (1991), J. Biol. Chem. 266, 13011–13018.
  • Jedoch wurde nicht erkannt, ob auf Isoflavon basierende Verbindungen wie Daidzin oder Daidzin-Analoga fähig sind, mit Enzymsystemen von Neurotransmittern wechselzuwirken oder wie solche Verbindungen sogar mit solchen Enzymsystemen in Kontakt kommen können, in Anbetracht der Beschaffenheit und Struktur der auf Isoflavon basierenden Verbindungen. Als solcher liefert der Stand der Technik keine Anleitung, ob auf Isoflavon basierende Verbindungen chemisch dazu fähig sind, mit den Neurotransmitter-Enzymsystemen, wo beispielsweise das Durchqueren der Blut-Hirn-Schranke notwendig sein könnte, wechselzuwirken, oder ob sie fähig sind, irgendeine Wirkung auf Neurotransmitter-Enzymsysteme aufzuweisen, insbesondere in einer Weise, um einen Alkoholkonsum zu vermindern oder anderweitig die Konzentration oder Wirksamkeit von Substraten innerhalb des Enzymsystems, das das Ethanol-Trinkverhalten reguliert, zu beeinflussen. Ein vollständiges Verständnis, ob Daidzin mit Neurotransmitter-Enzymsystemen wechselwirkt, um eine Ethanolaufnahme zu unterdrücken, ist daher notwendig und vorteilhaft. Ein solches weiteres und vollständiges Verständnis des Wirkmechanismus einer antidipsotropen Aktivität von Daidzin und seiner Wechselwirkung mit Neurotransmitter-Enzymsystemen wird andere Verbindungen, die als antidipsotrope Wirkstoffe verwendbar sind, identifizieren als auch neue Testsysteme bereitstellen, um Verbindungen hinsichtlich einer antidipsotropen Aktivität zu screenen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die beim Vermindern eines Alkoholkonsums wirksam sind, wie in einem jeglichen der Ansprüchen 1 bis 6 definiert. Erfindungsgemäße Ausführungsformen basieren auf der Entdeckung, dass die Enzymsysteme bestimmter biologisch aktiver Monoamine wie Serotonin (5-HT) und Dopamin (DA) in Säugergewebe durch Daidzin oder analoge Verbindungen gehemmt werden können und dass diese Hemmung die Konzentration von Substraten verändert, die das Ethanol-Trinkverhalten regulieren. Insbesondere betreffen erfindungsgemäße Ausführungsformen eine Hemmung der Oxidation von Aldehyden, die sich von Neurotransmittern wie Serotonin und Dopamin über die Monoaminoxidase (MAO) ableiten. Es wurde festgestellt, dass Daidzin und Daidzin-Analoga wirksam sind, die Konzentration von Aldehyden, die während des Katabolismus bestimmter Neurotransmitter gebildet werden, zu erhöhen, und dass die Erhöhung der Aldehydkonzentration, die den Neurotransmitter-Enzymsystemen zugerechnet werden kann, beim Vermindern eines Alkoholkonsums wirksam ist.
  • Die von Daidzein abgeleiteten Verbindungen werden als Ether der 7-Hydroxylgruppe des Aglycons Daidzein bezeichnet; sie ähneln Daidzin dahingehend, dass sie keine freie Hydroxylgruppe an der 7-Position aufweisen, unterscheiden sich aber darin, dass die Daidzin-glycosidische Gruppe ein Acetal, eher als ein Ether ist. Die Verbindungen können routinemäßig durch etablierte Verfahren, wie die Reaktion von Daidzein mit verschiedenen ω-Halogenfettsäuren, wie Brom- oder Iodfettsäuren, oder mit Ethyliodid, hergestellt werden.
  • Die Analoga von Daidzin können in Verfahren zur Hemmung der Enzymsysteme von Serotonin und Dopamin in einer Weise verwendet werden, um Konzentrationen von in dem Enzymsystem vorhandenen Aldehyden zu erhöhen oder die Bildung von entsprechenden in dem Enzymsystem vorhandenen Säuren zu hemmen. Solche Daidzin-Analoga sind sehr wirksam und weisen ähnlich signifikante in vivo-Wirkungen auf einen Alkoholkonsum in Tiermodellen auf. Folglich sind das Daidzin und die Daidzin-Analoga in Verfahren zum Vermindern eines Alkoholkonsums dadurch nützlich, dass sie die Enzymsysteme von bestimmten Monoaminen wie Serotonin und Dopamin in einer Weise hemmen, um Aldehydkonzentrationen, die vom Katabolismus der Neurotransmitter herrühren, zu erhöhen. Es wurde festgestellt, dass Verbindungen, die Aldehydkonzentrationen in den Serotonin- oder Dopamin-Enzymsystemen erhöhen, ebenfalls als antidipsotrope Wirkstoffe, d.h. Wirkstoffe, die einen Alkoholkonsum vermindern, wirksam sind.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BESTIMMTER BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Erfindungsgemäße Ausführungsformen betreffen Inhibitoren von Aldehyddehydrogenase, die in dem Enzymsystem von Menschen vorhanden ist, das für eine Um wandlung von Aldehyd zu Carbonsäure in den metabolischen Wegen für die Neurotransmitter Serotonin oder Dopamin verantwortlich ist. Erfindungsgemäße Ausführungsformen betreffen weiterhin synthetische Hemmstoffe, die eine Isoflavonstruktur aufweisen und analog zu Daidzin sind.
  • Insbesondere wurde unerwarteterweise herausgefunden, dass Daidzin und Daidzin-Analoga der Formel I direkte, potente, dennoch selektive und reversible Inhibitoren von ALDH-2 sind, die die Umwandlung von Aldehyd zu Carbonsäure in den nachstehenden Enzymsystemen für Serotonin und Dopamin katalysiert.
  • Figure 00060001
  • Gemäß den vorstehend beschriebenen Enzymsystemen wurde für ALDH-2 gezeigt, dass sie an der Oxidation von Aldehyden beteiligt ist, die sich von biologisch aktiven Monoaminen wie Serotonin (5-HT) und Dopamin (DA) in Säugergewebe über die Wirkung der Monoaminoxidase (MAO) ableiten. Die oxidative Desaminierung von Monoaminneurotransmittern, die von der membrangebundenen MAO auf der äußeren Oberfläche von Mitochondrien katalysiert wird, erzeugt reaktive Aldehyd-Intermediate. Diese Aldehyde werden entweder zu ihren entsprechenden Säuremetaboliten durch eine NAD-abhängige ALDH, die in der mitochondrialen Matrix vorhanden ist, oxidiert oder zu ihren entsprechenden Alkoholen durch die cytosolischen Enzyme NADH-abhängige ADH und/oder NADPH-abhängige Aldehydreduktase redu ziert. Da in der Leber und im Gehirn 5-HT und DA primär zu ihren Säurederivaten metabolisiert werden (vgl. Feldstein, A. (1971), in The Biology of Alcoholism, Hrsg. B. Kissin & H. Beleiter (Plenum Press, New York), Seiten 127–159), wird angenommen, dass das Mitochondrium das subzelluläre Hauptkompartiment ist, in dem dieser Metabolismus in vivo stattfindet. Erfindungsgemäß stellen isolierte mitochondriale Präparationen ein einfaches, dennoch physiologisch relevantes System bereit, in dem die Wirkungen von Daidzin und seinen strukturellen Analoga auf den DA- und 5-HT-Metabolismus untersucht werden.
  • Wie in den nachstehenden Beispielen detailliert gezeigt, hemmen Daidzin und strukturelle Analoga von Daidzin der Formel I stark die Bildung von 5-Hydroxyindol-3-essigsäure (5-HIAA) und 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) aus ihren entsprechenden Aminen in isolierten Hamsterleber-Mitochondrien. Eine Hemmung ist konzentrationsabhängig und wird von einer gleichzeitigen Akkumulation von 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd (5-HIAL) und 3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyd (DOPAL) begleitet. Daidzin-Analoga, die eine Ethanolaufnahme bei Hamstern unterdrücken, hemmen auch eine Bildung von 5-HIAA und DOPAC. Ein Vergleich ihrer Wirkungen auf eine von Mitochondrien katalysierte Bildung von 5-HIAA oder DOPAC und eine Ethanolaufnahme bei Hamstern zeigt eine positive Korrelation – je stärker die Hemmung einer Bildung von 5-HIAA oder DOPAC ist, desto stärker ist die Unterdrückung einer Ethanolaufnahme. Des weiteren hemmt Puerarin, ein 8-C-Glycosylderivat von Daidzein, das einen Ethanolkonsum in Ratten, aber nicht in Hamstern unterdrückt, nicht die Bildung von 5-HIAA in Hamsterleber-Mitochondrien, hemmt aber bei dem gleichen untersuchten Konzentrationsbereich eine Bildung von 5-HIAA in Rattenleber-Mitochondrien. Überraschenderweise weisen Daidzin und seine aktiven Analoga bei Konzentrationen, die signifikant eine Bildung von 5-HIAA hemmen, eine geringe oder keine Wirkung auf eine Mitochondrien-katalysierte 5-HT-Erschöpfung auf. Erfindungsgemäß wird die antidipsotrope Wirkung von Daidzin nicht durch Monoamine wie 5-HT (oder DA) vermittelt, sondern durch seine reaktiven Intermediate 5-HIAL (oder DOPAL), die in der Anwesenheit von Daidzin akkumulieren.
  • BEISPIEL I
  • Verbindungen
  • Daidzin und strukturell verwandte Verbindungen waren entweder käuflich erhältlich oder wurden gemäß Standardtechniken hergestellt. Vgl. die US-PS 5,624,910. Daidzin-Analoga schließen auch Verbindungen ein, bei denen die Glucose des Daidzins durch eine unterschiedliche Zuckergruppe ersetzt ist: zum Beispiel L- und D-Aldo- oder Keto-Tetrosen, -Pentosen, -Hexosen, -Heptosen oder die Amino-, Alkohol- und/oder Säurederivate solcher Tetrosen, Pentosen, Hexosen oder Heptosen; oder wobei die Glucose durch die Desoxyanaloga solcher Tetrosen, Pentosen, Hexosen oder Heptosen ersetzt ist. Alternativ kann die Glucose-(GlcO)Gruppe von Daidzin an der 7-Position durch Alkoxy- oder Acyloxygruppen ersetzt sein, die verschiedene Kettenlängen, beispielsweise bis zu 11 oder mehr, aufweisen, umfassend jegliche geradkettige Alkyl-, Peptid-, Polyethergrundgerüste, usw. und die Grundgerüste können mit verschiedenen neutralen (z.B. Hydroxyl-, Zucker-, usw.) oder geladenen (z.B. Carboxylat-, Phosphat-, Phosphonat-, Sulfat-, Sulfonat-, usw.) Gruppen substituiert sein. Zusätzlich können geeignete Gruppen (z.B. Carboxylat-, Hydroxyl-, usw.) verestert sein.
  • 7-ω-Carboxyalkylether von Daidzein werden wie folgt hergestellt. Daidzein (10 mmol) wurde in 40 ml Aceton suspendiert, 10 ml 2 N KOH wurden hinzugegeben, gefolgt von 10 mmol fester ω-Bromhexansäure, ω-Bromheptansäure, ω-Bromundecansäure oder Ethyliodid. Das Gemisch wurde 3 Tage unter Rückfluss gerührt. Das Kaliumsalz des 7-(ω-Carboxyalkyl)ethers von Daidzein wurde durch Filtration wiedergewonnen, mit Aceton gewaschen und getrocknet; Ausbeute, 20–35%.
  • Die folgenden 7-O-substituierten Daidzein-Derivate, nämlich 7-O-(6-Bromohexyl)daidzein, 7-O-(Triethyl-6-aminohexyl)daidzein, 7-O-(Triethyl-6-aminoethyl)daidzein, 7-O-(6-Aminohexyl)daidzein, 7-O-Daidzein-6-bromheptanoat, 7-O-Daidzein-2-chloracetat, 7-O-Daidzein-2-bromacetat und 7-O-Daidzein-3-dimethylaminopropionat, wurden wie folgt synthetisiert.
  • 7-O-(6-Bromhexyl)daidzein wurde durch Refluxieren von 1,25 g Daidzein, 12,2 g 1,6-Dibromhexan und 2,5 ml 11,2% KOH in 25 ml Aceton über Nacht hergestellt. Das Reaktionsgemisch wurde in Petrolether aus Wasser extrahiert, getrocknet und aus Chloroform kristallisiert.
  • 7-O-(Triethyl-6-aminohexyl)daidzein wurde durch Refluxieren von 3 mmol 7-O-(6-Bromhexyl)daidzein mit 4 ml Triethylamin in 10 ml Dimethylformamid (DMF) für 8 Stunden hergestellt. Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockne verdampft und das Produkt wurde mit Wasser extrahiert.
  • 7-O-(Triethyl-6-aminoethyl)daidzein wurde durch 12-stündiges Refluxieren von 10 g Daidzein, 20 ml 2 N KOH und 8,5 ml 1,2-Dibromethan in 200 ml Aceton synthetisiert. Das Reaktionsgemisch wurde getrocknet, in 150 ml Chloroform wieder gelöst und filtriert, um Daidzein zu entfernen. Lösungsmittel wurde verdampft und das Produkt, 7-O-(2-Bromethyl)daidzein, wurde aus Hexan wieder kristallisiert. 7-O-(2-Bromethyl)daidzein wurde sodann mit 4 ml Triethylamin in 10 ml DMF 8 Stunden refluxiert. Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockne verdampft und das Produkt wurde mit Wasser extrahiert. 7-O-(6-Aminohexyl)daidzein wurde dadurch hergestellt, dass ein Gemisch aus 50 mg 7-O-(6-Bromhexyl)daidzein, 5 ml DMF und 15 ml Ethanol mit gasförmigem Ammoniak 24 Stunden. gesättigt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde verdampft und das Endprodukt wurde aus Wasser wieder kristallisiert.
  • Die 7-O-Daidzeinester von 6-Bromheptansäure (7-O-Daidzein-6-bromheptanoat), Chloressigsäure (7-O-Daidzein-2-chloracetat), Bromessigsäure (7-O-Daidzein-2-bromacetat) und 3-Dimethylaminopropionsäure (7-O-Daidzein-3-dimethylaminopropionat) wurden dadurch hergestellt, dass die entsprechenden Säuren (10 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (10 mmol) zu einer Lösung von Daidzein (10 mmol) in 20 ml Aceton gegeben wurden. Die Lösung wurde über Nacht bei 0°C gerührt. Lösungsmittel in den sich ergebenden Gemischen wurden verdampft und Endprodukte wurden aus Chloroform kristallisiert.
  • Diese Beispiele sind nicht erschöpfend in ihrem Umfang, aber sie schlagen dem Fachmann Wege zur Identifikation von Daidzin-Derivaten (d.h. Analoga) vor, die eine erhöhte Bioverfügbarkeit und eine verbesserte Wirksamkeit, Selektivität, kontrollierte Freisetzung, Löslichkeit, Absorptionsfähigkeit und/oder Stabilität aufweisen.
  • BEISPIEL II
  • ALDH-hemmende Aktivität
  • ALDH-Aktivität von Daidzin und Daidzin-Analoga wurde wie vorher in der US-PS 5,624,910 und Keung, W. M., Klyosov, A. A. und Vallee, B. L. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1675–1679, beschrieben gemessen, indem die Absorptionszunahme bei 340 nm aufgrund der Bildung von NADH (ε340 = 6,22 mM–1cm–1) in einem Varian Cary 219-Spektrophotometer bei einem pH-Wert von 9,5 überwacht wurde, wenn Acetaldehyd als das Substrat verwendet wurde, oder indem die Zunahme der Fluoreszenz bei 430 nm durch Bildung von 6-Dimethylamino-2-naphthoesäure (λex = 330 nm) in einem Perkin-Elmer MPF3-Spektrofluorimeter überwacht wurde, wenn 6-DMA-2-NA als das Substrat verwendet wurde. Mitochondriale und cytosolische ALDH-Isozyme von Menschen-, Hamster- und Rattenleber wurden wie in Klyosov, A. A., Rashkovetsky, L. G., Tahir, M. K. und Keung, W. M. (1996), Biochemistry 35, 4445–4456 beschrieben aufgereinigt. Stammlösungen aller wasserlöslichen Substrate und Testverbindungen wurden in Milli-Q-Wasser hergestellt und alle anderen waren in Methanol. Die Endkonzentrationen von Methanol in den Testgemischen betrugen ≤ 1% und wiesen keine Wirkung auf die Aktivitäten der ALDH-Isozyme auf. Die kinetischen Parameter Km und Vmax für cytosolische ALDHs wurden anhand von Lineweaver-Burk-Diagrammen bestimmt, die sich aus Doppelbestimmungen der Anfangsgeschwindigkeiten ableiteten, wohingegen diejenigen für die mitochondrialen Isozyme von kinetischen Fortschrittskurven gemäß den Beschreibungen von Rashkovetsky, L. G., Maret, W. und Klyosov, A. A. (1994), Biochim. Biophys. Acta 1205, 301–307, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen wird, bestimmt wurden.
  • BEISPIEL III
  • Antidipsotrope Aktivität
  • Die Ethanolaufnahme unterdrückende Aktivität von Daidzin und seinen strukturellen Analoga wurde mit Alkohol bevorzugenden Syrischen Goldhamstern wie zuvor beschrieben bestimmt. Vgl. Keung, W. M. und Vallee, B. L. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10008–10012.
  • BEISPIEL IV Kompetitive (Ki) und nicht kompetitive (αKi) Hemmungskonstanten von 7-O-substituierten Daidzein-Derivaten mit menschlicher mitochondrialer ALDH TABELLE I
    Figure 00110001
  • Wie in der vorstehenden Tabelle I gezeigt, sind alle 7-O-substituierten Daidzein-Derivate bessere ALDH-2-Inhibitoren als Daidzein und vier von diesen (Verbindungen #3 bis #6) sind sogar besser als Daidzin. Das 7-O-(6-Bromhexyl)- und 7-O-(6-Triethylaminohexyl)daidzein (Verbindungen #10 bzw. #11) sind extrem potente In hibitoren der menschlichen ALDH-2 mit Ki-Werten von 3 bzw. 5 nM. Das 6-Bromheptanoat von Daidzein (Verbindung #14) ist weniger potent als 7-O-(6-Bromhexyl)daidzein. Die 7-O-Daidzeinester von kurzkettigen Säuren, wie z.B. 2-Chloressigsäure, 2-Bromessigsäure und 3-Dimethylaminopropionsäure (Verbindungen #16, #17 bzw. #18), sind weniger potente Inhibitoren hinsichtlich Daidzin. Wie durch die Daten in Tabelle I gezeigt, sind die langkettigen 7-O-(ω-Carboxyalkyl)-Derivate von Daidzein die potentesten Inhibitoren von ALDH-2 (Verbindungen #3 bis #6).
  • BEISPIEL V
  • Antidipsotrope Aktivität von 7-O-substituierten Daidzeinen
  • Die antidipsotrope Wirkung von zwei der stärksten (7-O-[ω-Carboxypentyl]- und 7-O-[ω-Carboxyhexyl]daidzein) und drei der schwächsten (Puerarin, Chrysin und 7,8-Dihydroxyflavon) ALDH-2-Inhibitoren wurde in Ethanol bevorzugenden Goldhamstern getestet und die Ergebnisse sind in der vorstehenden Tabelle I gezeigt. Daidzin und Daidzein wurden ebenfalls bei äquivalenten Dosen zum Vergleich getestet. Eine i.p-Dosis von Daidzin oder Daidzein (70 mäq./Hamster/Tag) unterdrückt eine Ethanolaufnahme bei Hamstern um 64% oder 32%. Bei äquivalenten Dosen zeigen Puerarin, Chrysin und 7,8-Dihydroxyflavon keine signifikante Wirkung auf eine Ethanolaufnahme, wohingegen die beiden 7-O-(ω-Carboxyalkyl)daidzeine etwas besser sind als Daidzin (etwa 70%ige Unterdrückung).
  • BEISPIEL VI
  • Mitochondrien-katalysierter Monoaminmetabolismus unter Verwendung von 5-HT und DA als den Substraten
  • Gemäß der erfindungsgemäßen Lehre wird ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen auf eine antidipsotrope Aktivität bereitgestellt. Eine Testverbindung wird ausgewählt, z.B. basierend auf der erfindungsgemäßen Lehre hinsichtlich der Struktur von Daidzin oder Daidzin-Analoga, von denen bekannt ist, dass sie eine antidipsotrope Aktivität aufweisen. Jedoch soll verstanden werden, dass sich eine jegliche Verbindung für einen erfindungsgemäßen Test ausgewählt werden kann, da der Zweck dieses Tests darin liegt, Verbindungen mit antidipsotroper Aktivität zu identifizieren oder darauf zu screenen. Die vorliegende Erfindung ist daher nicht auf Verbindungen, die zu Daidzin strukturell analog sind, begrenzt.
  • Eine mitochondriale oder andere Präparation, die Serotonin, Monoaminoxidase und Aldehyddehydrogenase beinhaltet, wird sodann unter Bedingungen bereitgestellt, die ausreichend sind, dass die Monoaminoxidase Serotonin zu 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd umwandelt und dass die Aldehyddehydrogenase 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd zu 5-Hydroxyindol-3-essigsäure umwandelt. Es soll verstanden werden, dass Tests, die auf dem Enzymsystem für Dopamin basieren, ebenfalls bei der Durchführung der Erfindung verwendbar sind. Zum Beispiel kann eine mitochondriale oder andere Präparation, die Dopamin, Monoaminoxidase und Aldehyddehydrogenase beinhaltet, unter Bedingungen bereitgestellt werden, die ausreichend sind, dass die Monoaminoxidase Dopamin zu 3,4-Dihydroxyphenyl-3-acetaldehyd umwandelt und dass die Aldehyddehydrogenase das 3,4-Dihydroxyphenyl-3-acetaldehyd zu 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure umwandelt. Aus Gründen der Einfachheit der Erklärung wird jedoch die nachstehende Beschreibung lediglich auf einen auf Serotonin basierenden Test Bezug nehmen.
  • Das 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd kann sodann ohne Testsubstanz gemessen werden. Gegebenenfalls kann die gebildete 5-Hydroxyindol-3-essigsäure ebenfalls gemessen werden. Einzelne Tests können mit bekannten Verbindungen mit antidipsotroper Aktivität, einschließlich Daidzin und Daidzin-Analoga, durchgeführt werden, um zusätzliche Messwerte von den Mengen an 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd, das in der Anwesenheit einer jeglichen bekannten Substanz produziert wurde, zu erhalten, wodurch eine Datenbank von Werten erzeugt wird, die bekannten antidipsotropen Verbindungen entsprechen, wobei die Fähigkeit der Verbindung, einen Alkoholethanolkonsum zu unterdrücken oder zu vermindern, zuvor bestimmt wurde. Sodann kann ein Vergleich zwischen der Fähigkeit der Verbindung, eine Ethanolaufnahme zu vermindern (d.h. % Unterdrückung einer Ethanolaufnahme), und der Menge an 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd, das von einer mitochondrialen Präparation, die die Verbindung beinhaltet, produziert wird, erfolgen. Auf diese Weise kann die antidipsotrope Aktivität als eine Funktion der Menge an 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd, das von einer mitochondrialen Präparation, die die Verbindung beinhaltet, produziert wird, beschrieben werden.
  • Eine zusätzliche mitochondriale Präparation wird sodann mit der Testverbindung in Kontakt gebracht und das 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd wird sodann gemessen. Gegebenenfalls kann auch 5-Hydroxyindol-3-essigsäure gemessen werden. Die Menge an 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd wird sodann mit der Datenbank verglichen, die die Mengen an 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd einschließt, das in der An wesenheit von bekannten Verbindungen mit antidipsotroper Aktivität gebildet wurde, um die antidipsotrope Wirksamkeit der Testverbindung zu bestimmen. Gemäß diesem Test wird prädiziert, dass Verbindungen, die die Wirkung einer Erhöhung der Menge an 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd hinsichtlich eines Tests, bei dem keine Verbindung vorhanden ist, aufweisen, eine antidipsotrope Aktivität aufweisen.
  • Insbesondere wurden Daidzin und Daidzin-Analoga getestet, um ihre Wirkung auf eine Ethanolaufnahme bei Hamstern und die Aldehyd-Intermediat-Akkumulation während eines Mitochondrien-katalysierten Monoaminmetabolismus unter Verwendung von 5-HT und DA als den Substrate zu bestimmen. Mitochondriale Leberpräparationen von Hamstern wurden durch das bekannte Verfahren von Johnson und Lardy erhalten (vgl. John, D. und Lardy, H. (1967), Meth. Enzymol. 10, 94). Die Integrität dieser mitochondrialen Präparationen, die durch Messen ihrer latenten Glutamatdehydrogenase-Aktivität gemäß den Verfahren von Beaufay, H. und Bendall, D. S., Baudhuin, P. und deDuve, C. (1959), J. Cell Biol. 73, 623–628, vor und nach der metabolischen Studie evaluiert wurden, betrug über 97% bzw. 93%.
  • 5-HT- und DA-Metabolismus in den mitochondrialen Präparationen wurden durch die Überwachung der Bildung ihrer entsprechenden Metaboliten 5-HIAL, 5-HIAA und DOPAL, DOPAC und der Erschöpfung an DA und 5-HT in einem 0,5 ml-Standard pH 7,4-Testmedium mit 10 mM Tris-HCl, 0,3 M Mannitol, 2,5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 10 mM KCl, 10 μM Substrat, 0, 0,09, 0,3, 0,9, 3 oder 9 μM Daidzin oder seinen strukturellen Analoga und 40 μg (Protein) von frisch präparierten mitochondrialen Präparationen untersucht. Reaktionen wurden durch die Zugabe von Mitochondrien gestartet und ihnen ermöglicht, sich 30 min in einem 37°C-Schüttelwasserbad fortzusetzen. Reaktionen wurden durch die Zugabe von jeweils 0,05 ml an eiskaltem 1 M HClO4 und 10 mM EDTA gestoppt. Die Proben wurden 1 Stunde auf Eis gehalten, gefolgt von Zentrifugation (12000 UpM) in einer Mikrozentrifuge (Microspin 24S, Sorvall) für 15 min. DA, 5-HT und ihre Hauptmetabolite im Überstand wurden direkt per HPLC analysiert.
  • Das HPLC-System, das in dieser Studie verwendet wurde, bestand aus einem BAS Sample Sentinel Autosampler mit gekühltem (4°C) Probenkompartiment, PM80-Lösungsmittelzufuhrsystem und einem LC-26-Online-Entgaser. Der Detektor ist eine LC-4C-amperometrische Steuereinheit mit einer CC-5-elektrochemischen Kreuzfluss-Dünnschichtzelle (0,005'') bestehend aus gläsernem Kohlenstoff und einer Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode (Bioanalytical Systems, Inc., West La fayette, IN). Für eine Routineanalyse wurden die Spannung und die Empfindlichkeit auf 650 mV bzw. 20 nA Vollskalierung eingestellt. Die Säulentemperatur wurde mit einem Waters Temperaturkontrollmodul (Waters, Milford, MA) gehalten. DA und 5-HT wurden auf einer BAS Phase II ODS-3,3 μm, 3,2 × 100 mm-Säule analysiert. Die Säule wurde bei 40°C und 1 ml/min in einer mobilen Phase mit 1,23% Monochloressigsäure (Sigma), 0,02% Natrium-1-octylsulfat (Lancaster, Windham, NH), 0,025% EDTA-Na2 und 5% Acetonitril (v/v), pH-Wert von 3 gefahren. Die Retentionszeiten für DA und 5-HT betrugen 7,7 bzw. 20,6 min. DOPAL, DOPAC, 5-HIAL und 5-HIAA wurden auf einer Beckman Ultrasphere ODS-5, 5 μ, 4,6 × 250 mm-Säule analysiert. Die Säule wurde bei 30°C und 1 ml/min in einer mobilen Phase mit 3% Methanol (v/v), 2,5% Acetonitril (v/v), 0,1% TFA, 50 mM NaCl und 0,2 mM EDTA, gefahren. Die Retentionszeiten für diese Metabolite betrugen 8,6, 14,3, 14,6 bzw. 19,9 min. Daten wurden mit einem Nelson-Datensammelsystem (Perkin-Elmer) oder einem Waters 740-Datenmodul gesammelt und analysiert. Die Wirkung einer Testverbindung auf eine Akkumulation von 5-HIAL oder DOPAL, die bei fünf verschiedenen Konzentrationen gemessen wurde, wurde gemittelt und als % der Kontrolle dargestellt.
  • BEISPIEL VII
  • Vergleich einer Unterdrückung einer Ethanolaufnahme vs. 5-HIAL-Akkumulation
  • Die folgenden Verbindungen wurden auf ihre antidipsotrope Aktivität und ihre Fähigkeit, das Enzymsystem für Serotonin zu hemmen, getestet: Daidzin, Daidzein, 7,8-Dihydroxyflavon, Genestein, 5,7-Dihydroxyflavon, Biochanin A und die folgenden Derivate von Daidzin: Carboxydecyl-, Carboxynonyl-, Carboxypentyl-, Carboxyhexyl-, Brombutyl-, 1,3-Dioxanethyl-, Dihydroxypropyl-, Aminobutyl-, Bromhexyl-, Diacetyl-, Aminohexyl-, Allyl-, Ethyl- und Brompropyldaizin. Die Ergebnisse einer Unterdrückung einer Ethanolaufnahme, aufgetragen als eine Funktion der 5-HIAL-Akkumulation, sind in 1 gezeigt. Unter den Verbindungen, die in 1 identifiziert sind, unterdrückten 11 von ihnen eine Ethanolaufnahme bei Hamstern, wobei die langkettigen 7-ω-Carboxyalkyl-Derivate und Daidzin (> 60%ige Unterdrückung) die aktivsten waren, gefolgt von Daidzein, 2-(1,3-Dioxan-2-yl)ethyl-, 7-ω-Brombutyldaidzein-Derivaten (–30%ige Unterdrückung). 7-ω-Bromhexyl-, 7-ω-Aminobutyl- und ein 2,3-Dihydroxypropyldaidzein-Derivat waren lediglich marginal aktiv, wenn sie bei äquivalenten Dosen (0,07 mäq./Hamster/Tag) getestet wurden. Neun der 20 getesteten Verbindungen unterdrückten eine Ethanolaufnahme bei einer äquiva lenten getesteten Dosis nicht. Diese Verbindungen waren Genestein, 7,8-Dihydroxyflavon, 5,7-Dihydroxyflavon und die nachstehenden Derivate von Daidzin: Aminohexyl-, Allyl-, Ethyl- und Brompropyldaidzin. Verbindungen, die eine Ethanolaufnahme unterdrückten, induzierten auch eine 5-HIAL-Akkumulation während eines Mitochondrien-katalysierten 5-HT-Metabolismus: je höher die 5-HIAL-Akkumulation ist, desto größer ist die Unterdrückung einer Ethanolaufnahme. Verbindungen, die keine 5-HIAL-Akkumulation induzierten, unterdrückten eine Ethanolaufnahme nicht. 1 zeigt klar eine positive Korrelation zwischen einer Unterdrückung einer Ethanolaufnahme und einer 5-HIAL-Akkumulation. Wie man in 2 sehen kann, wurde ebenfalls eine Korrelation beobachtet, wenn der mitochondriale MAO/ALDH-Weg mit DA als dem Substrat untersucht wurde: je höher die DOPAL-Akkumulation ist, desto größer ist die Unterdrückung einer Ethanolaufnahme.
  • BEISPIEL VIII
  • Antidipsotroper Index als ein Maß für eine Unterdrückung einer Ethanolaufnahme
  • Gemäß der erfindungsgemäßen Lehre wird ein Test beschrieben, der auf den Enzymsystemen von Serotonin oder Dopamin basiert. Kandidatenverbindungen wurden auf ihre antidipsotropen Eigenschaften hin gescreent, indem ihre Fähigkeit bestimmt wurde, die Enzymsysteme von Serotonin oder Dopamin in einer Weise zu beeinträchtigen, zu hemmen oder anderweitig damit wechselzuwirken, um die Menge an in dem Enzymsystem vorhandenem Aldehyd zu verändern. Die gemäß dem erfindungsgemäßen Test gescreenten Kandidatenverbindungen waren diejenigen, die in dem vorstehenden Beispiel identifiziert wurden. Die 5-HIAL-Akkumulation, %-Kontrolle, wurde für jede Verbindung bestimmt und sodann auf die 5-HIAL-Akkumulation, %-Kontrolle von Daidzin normalisiert, um einen antidipsotropen Index (5-HIAL) erfindungsgemäß zu erzeugen. Ein ähnlicher antidipsotroper Index kann basierend auf der DOPAL-Akkumulation, %-Kontrolle, wie in 2 gezeigt, erzeugt werden. Der antidipsotrope Index für jede Verbindung wurde sodann als eine Funktion einer Alkoholunterdrückung, die zuvor für jede Verbindung bestimmt wurde, aufgetragen. Die Ergebnisse, die in 3 gezeigt sind, zeigen eine direkte lineare Korrelation zwischen dem antidipsotropen Index und einer Unterdrückung einer Alkoholaufnahme, d.h., je größer der antidipsotrope Index für die Verbindung ist, desto größer ist die Fähigkeit der Verbindung zur Unterdrückung einer Ethanolaufnahme, wodurch zum ersten Mal eine mechanistische Grundlage und ein verlässlicher Index, basierend auf Aldehyd-Intermediaten eines Monoaminmetabolismus, bereitgestellt wird, der als ein schneller in vitro-Test verwendbar ist, der möglicherweise mit konventionellen Mitteln, die dem Fachmann auf dem Gebiet von in vitro-Tests bekannt sind, für ein Hochdurchsatzverfahren zum Medikamenten-Screening automatisiert werden kann.
  • Zum Beispiel können die Aldehyd-Intermediate, die während des Mitochondrien-katalysierten Monoaminmetabolismus akkumulieren, wie in Beispiel VI beschrieben, durch einen biolumineszenten Test gemessen werden, der bakterielle Luciferase verwendet. Im Gegensatz zu dem HPLC-Verfahren ist der biolumineszente Test einfach und kann leicht für ein Hochdurchsatz-Medikamenten-Screening automatisiert werden. Bakterielle Luciferase katalysiert die Oxidation von FMNH2 und einem langkettigen Aldehyd (z.B. n-Decylaldehyd), eine Reaktion, die auch zu einer Lichtemission führt. Bakterielle Luciferase wird verwendet, um die Substrat/Bindungsaktivität mit 5-HIAL oder DOPAL zu bestimmen. Alternativ wird der in Beispiel VI beschriebene mitochondriale Test durch Verwendung eines langkettigen primären Amins anstelle von 5-HT oder DA als dem Substrat modifiziert, um der Substratanforderung der bakteriellen Luciferase gerecht zu werden. Für Monoaminoxidase wurde gezeigt, dass sie die Umwandlung von langkettigen, primären Aminen (z.B. n-Decylamin) in ihre entsprechenden Aldehyde (n-Decylaldehyd) katalysiert.
  • Es soll verstanden werden, dass die erfindungsgemäßen Ausführungsformen, die beschrieben wurden, lediglich beispielhaft für einige der Anwendungen der erfindungsgemäßen Prinzipien sind.

Claims (6)

  1. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die beim Vermindern eines Alkoholkonsums wirksam sind, umfassend ein Auswählen einer Testverbindung, Etablieren eines Enzymsystems, einschließlich eines Monoaminoxidase-Substrats, Ermöglichen einer katalytischen oxidativen Desaminierung eines Monoaminoxidase-Substrats in einen Aldehyd, Ermöglichen eines Katabolismus eines Aldehyds in eine Carbonsäure durch ALDH-2, Messen einer ersten Konzentration an Aldehyd, In-Kontakt-Bringen der Testverbindung mit dem Enzymsystem, Messen einer zweiten Konzentration an Aldehyd, Vergleichen der ersten Konzentration mit der zweiten Konzentration.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Monoaminoxidase-Substrat Serotonin oder Dopamin ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Aldehyd 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd oder 3,4-Dihydroxyphenyl-3-acetaldehyd ist.
  4. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die beim Vermindern eines Alkoholkonsums wirksam sind, umfassend ein Auswählen einer Testverbindung, Etablieren eines Enzymsystems, einschließlich eines Monoaminoxidase-Substrats, Ermöglichen einer katalytischen oxidativen Desaminierung eines Monoaminoxidase-Substrats in einen Aldehyd, Ermöglichen eines Katabolismus eines Aldehyds in eine Carbonsäure durch ALDH-2, In-Kontakt-Bringen der Testverbindung mit dem Enzymsystem, Messen einer Konzentration an Aldehyd und Vergleichen der Konzentration an Aldehyd mit Konzentrationen an Aldehyd, die durch Verbindungen erzeugt werden, die eine bekannte antidipsotrope Aktivität aufweisen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Monoaminoxidase-Substrat Serotonin oder Dopamin ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Aldehyd 5-Hydroxyindol-3-acetaldehyd oder 3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyd ist.
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