DE69733016T2 - Physiologisch aktive tkr1785's substanzen, verfahren zu ihrer herstellung und mikrobe - Google Patents

Physiologisch aktive tkr1785's substanzen, verfahren zu ihrer herstellung und mikrobe Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die bioaktive Substanz TKR1785, die als therapeutischer Wirkstoff bei Mykosen, allergischen Erkrankungen und Immunerkrankungen von Wert ist, ein Verfahren zur Herstellung der bioaktiven Substanz und weiter einen Mikroorganismus, der die bioaktive Substanz TKR1785 erzeugt.
  • STAND DER TECHNIK
  • Es ist bekannt, dass Pilze den Menschen, Tiere und Pflanzen infizieren und dabei verschiedene Erkrankungen verursachen. Beim Menschen zum Beispiel verursachen einige Pilze oberflächliche Mykosen der Haut und der Mundhöhle, während andere eine systemische Mykose der Viszera und des Gehirns bewirken. Pilze verursachen auch gleichartige Infektionskrankheiten bei Haustieren und Vieh. Es gibt auch Pilze, die verschiedene Krankheiten bei Kulturpflanzen, wie beispielsweise Obstbäumen und Gemüse, hervorrufen.
  • Zu diesen pathogenen Pilzen, die eine systemische Mykose beim Menschen verursachen, gehören Pilzarten der Gattung Candida, Cryptococcus und Aspergillus. Mit Bezug auf oberflächliche Mykose werden die Candida-Arten, die die Haut, die Mundhöhle und die Vagina infizieren, Trichophytone, die die Haut der Gliedmaßen infizieren (die ursächlichen Organismen von Fußpilz) und Malassezia-Arten (die ursächlichen Organismen von Kleienflechte) als repräsentative pathogene Pilze angesehen. Zusätzlich zu diesen Pilzen sind auch eine Auswahl anderer Pilze in der Ökologie der Erde zu finden und stehen im Verdacht, Tiere und Pflanzen zu schädigen.
  • In den letzten Jahren gab es einen dramatischen Anstieg bei den Fällen einer allergischen Erkrankung, wie beispielsweise Asthma, atopische Dermatitis und allergische Rhinitis. Die Pathogenese vieler dieser allergischen Erkrankungen wird nachfolgend allgemein erläutert. Wenn der Wirt durch ein eine Krankheit erregendes Antigen sensibilisiert wird, wird ein IgE-Antikörper (Reagin), der für das Antigen spezifisch ist, d.h. ein Allergen, in dem Serum und den Geweben des Wirts erzeugt. Wenn der Wirt erneut dem Allergen ausgesetzt wird, bilden das IgE, das mit den Mastzellen oder Basophilen verbunden ist, und das spezifische Allergen Komplexe und der IgE-Komplex vernetzt sich an der Zelloberfläche und löst physiologische Ereignisse aus, die durch IgE-Antigen-Wechselwirkungen entstehen. Substanzen, die als chemische Vermittler bekannt sind, sind an diesen physiologischen Ereignissen beteiligt.
  • Einige von ihnen sind die chemischen Vermittler, die vorher in den Granula von Mastzellen und Eosinophilen existieren, aber extrazellulär bei Aktivierung durch eine Degranulation freigesetzt werden, wie beispielsweise Histamin, Serotonin und eosinophile Faktoren, während andere de novo durch die Aktivierung von Mastzellen synthetisiert werden. Was letztere Vermittler anbetrifft, bedingt die Aktivierung von Phospholipase A2 die Aktivierung von Lipoxigenase und Cyclooxigenase, die auf die von dem Membran-Phospholipid stammende Arachidonsäure einwirken, um verschiedene Leukotriene und Thromboxane zu erzeugen. Diese chemischen Vermittler verursachen langfristige allergische Entzündungen, wie beispielsweise eine Kontraktion des glatten Bronchialmuskels und ein Schleimhautödem. Diese Ereignisse können entweder systemisch oder lokal auftreten, je nach dem Weg, durch den das Antigen in den Körper gelangt, und dem Ablagerungsmuster von IgE an den Mastzellen oder Basophilen. Die lokalen Symptome treten allgemein an der Epithelsoberfläche an der Eintrittsstelle des Allergens auf. Das systemische Ereignis umfasst den anaphylaktischen Schock, der das Ergebnis einer IgE-Basophilen-Reaktion auf das Antigen im Gefäßsystem ist.
  • Es gibt viele allergische Erkrankungen, bei denen verschiedene Substanzen in der Umgebung, einschließlich Zecken und Pollen, und antigene Substanzen, die in Nahrungsmitteln enthalten sind, als Allergene wirken. Darunter sind allergische Erkrankungen, die durch Pilze verursacht werden, auch zahlreich und Allergene, die von verschiedenen Pilzgattungen stammen, wie beispielsweise Candida, Aspergillus, Alternaria, Cladosporium, Malassezia und Penicillium, wirken als Krankheitsfaktoren.
  • Einige wenige fungizide Wirkstoffe sind heute bekannt, die zur Behandlung und Vorbeugung gegen diese Pilzinfektionen und Kontaminationen, für die solche Pilze verantwortlich sind, verwendet werden können. Von diesen Wirkstoffen können Amphotericin B, Flucytosin, Miconazol und Fluconazol als therapeutische Wirkstoffe für systemische Infektionen bei Mensch und Tier aufgeführt werden. Allerdings sind diese Substanzen nicht voll zufrieden stellend, was ihre Wirksamkeit, Toxizität und/oder ihr antibakterielles Spektrum angeht, und sie haben sich als therapeutische Wirkstoffe nicht hinreichend nützlich erwiesen.
  • In der Zwischenzeit gibt es verschiedene Arten von therapeutischen Wirkstoffen für allergische Erkrankungen, wie beispielsweise Lipoxigenase-Hemmer, die die Produktion der verschiedenen chemischen Vermittler, Thromboxansynthasehemmer, Antihistaminika, die dem chemischen Vermittler entgegenwirken, und Leukotrienrezeptorantagonisten hemmen. Darüber hinaus hemmen Steroide nicht nur die Erzeugung von chemischen Vermittlern, sondern besitzen verschiedene physiologische Aktivitäten und sind deshalb die wichtigsten antiallergischen Wirkstoffe.
  • Das US-Patent 4 544 289 offenbart eine Anzahl von wasserlöslichen amphoterischen Verbindungen vom Peptid-Typ mit der folgenden allgemeinen Formel:
    Figure 00030001
  • Zwei Verbindungen dieser allgemeinen Formel, namens OF4949-I und OF4949-II, wurden aus Mikroorganismen, die zur Gattung Penicillium gehören und aus Erdproben isoliert wurden, isoliert. Andere Verbindungen der Reihe wurden von diesen beiden isolierten Verbindungen durch verschiedene organchemische Modifikationen, einschließlich Reduktionen, Alkylierungen, Ester- und Amidbildungsreaktionen, abgeleitet.
  • Wie festgestellt wurde, waren die Verbindungen aus der Reihe des US-Patents 4 544 289 immunmodulierende Wirkstoffe. Sie potentierten die zelluläre Immunität im Test mittels verzögerter Überempfindlichkeit, die durch Inokulation von Schaferythrozyten als Antigen injiziert in die Hinterpfote von Mäusen verursacht wurde.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Unter den gegebenen Umständen ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue bioaktive Substanz, die als therapeutischer Wirkstoff bei Mykosen, allergischen Erkrankungen und Immunerkrankungen von Wert ist, zur Verfügung zu stellen.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bei ihrer Erforschung von neuen bioaktiven Substanzen eine große Zahl Mikroorganismen aus der Natur isoliert, nach den von ihnen erzeugten bioaktiven Substanzen durchsucht und deren biologische Eigenschaften untersucht. Als Ergebnis haben sie bioaktive Substanzen, die antifungale Wirksamkeit gegen pathogene Pilze, wie beispielsweise Candida, Aspergillus, Cryptococcus und Malassezia zeigen, in Kulturmedien eines Mikroorganismusstamms, der zur Gattung Penicillium gehört, entdeckt. Dann haben die Erfinder die bioaktiven Substanzen isoliert und deren physikalisch-chemischen Eigenschaften erforscht. Als Ergebnis konnten sie feststellen, dass die Substanz tatsächlich eine neue Substanz mit einigen einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften umfasst und nannten sie TKR1785 (nachfolgend als TKR1785-I bezeichnet) und TKR1785-II (die beiden Substanzen werden nachfolgend insgesamt als TKR1785 bezeichnet). Weiter wurde festgestellt, dass TKR1785 die mit allergischen Reaktionen in Verbindung stehenden Enzyme nicht nur hemmt, sondern auch andere physiologische Wirkungen auf das Immunsystem ausübt. Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage der obigen Befunde entwickelt worden.
  • Die vorliegende Erfindung ist daher gemäß ihrem ersten Aspekt auf die neue bioaktive Substanz TRK1785 gerichtet, die durch die folgende allgemeine Formel (A) dargestellt ist:
    Figure 00050001
    (worin R -CH(CH3)2 oder -CH(CH3)C2H5 darstellt).
  • Die vorliegende Erfindung ist weiter gemäß einem zweiten Aspekt auf ein Verfahren zum Erzeugen der neuen bioaktiven Substanz TKR1785 gerichtet, das das Kultivieren eines Mikroorganismusstamms umfasst, der zur Gattung Penicillium gehört und in der Lage ist, die neue bioaktive Substanz TKR1785 auszuführen und diese Substanz aus dem sich ergebenden Kulturmedium zu isolieren.
  • Gemäß einem dritten Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf einen Mikroorganismus gerichtet, der zur Gattung Penicillium gehört und in der Lage ist, die bioaktive Substanz TKR1785 zu erzeugen.
  • Gemäß einem vierten Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, die die bioaktive Substanz TKR1785 umfasst.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt ein Ultraviolettabsorptionsspektrum der bioaktiven Substanz TKR1785-I. Die Ordinate stellt die Wellenlänge (nm) dar.
  • 2 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum der bioaktiven Substanz TKR1785-I. Die Abszisse stellt die Wellenzahl (cm-1) dar.
  • 3 zeigt ein 1H-NMR-Spektrum der bioaktiven Substanz TKR1785-I. Die Abszisse stellt die chemische Verschiebung (ppm) dar.
  • 4 zeigt ein 13C-NMR-Spektrum der bioaktiven Substanz TKR1785-I. Die Abszisse stellt die chemische Verschiebung (ppm) dar.
  • 5 zeigt ein HPLC-Elutionsmuster der bioaktiven Substanz TKR1785-I. Die Ordinate stellt die Verweilzeit (min) dar und die Abszisse stellt die relative Intensität der Ultraviolettabsorption dar.
  • 6 zeigt ein 1H-NMR-Spektrum der bioaktiven Substanz TKR1785-II. Die Abszisse stellt die chemische Verschiebung (ppm) dar.
  • 7 zeigt ein 13C-NMR-Spektrum der bioaktiven Substanz TKR1785-II. Die Abszisse stellt die chemische Verschiebung (ppm) dar.
  • 8 zeigt ein HPLC-Elutionsmuster der bioaktiven Substanz TKR1785-II. Die Ordinate stellt die Verweilzeit (min) dar und die Abszisse stellt die relative Intensität der Ultraviolettabsorption dar.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die bioaktive Substanz TKR1785-I weist die folgenden physikalisch-chemischen Merkmale (1), (2), (3), (4), (5), (6) und (7) auf.
    • (1) Massenspektrum (FAB-MS): m/z 518 [M+H]+
    • (2) Molekülformel: C27H55N3O
    • (3) UV-Spektrum (in Methanol), Endabsorptionen wie in der 1 gezeigt.
    • (4) IR-Spektrum (KBr); dominante Absorptionswellenzahlen: 3410 cm-1, 920 2cm-1, 2850 cm-1, 1670 cm-1, 1540 cm-1, 1470 cm-1, 1210 cm-1, 1140 cm-1, 1050 cm-1, 840 cm-1, 800 cm-1, 720 cm-1
    • (5) löslich in Methanol und Wasser, schwer löslich in Chloroform und Hexan.
    • (6) 1H-NMR-Spektrum: 3 und 13C-NMR-Spektrum: 4.
    • (7) Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie: Elutionsmuster wie in der 5 gezeigt.
  • Eine Strukturanalyse auf der Grundlage der obigen Merkmale zeigte, dass TKR1785-I den chemischen Aufbau der Formel (I) hat.
  • Figure 00070001
  • Die bioaktive Substanz TKR1785-II weist die folgenden physikalisch-chemischen Merkmale (8), (9), (10) und (11) auf.
    • (8) Massenspektrum (FAB-MS): m/z 532 [M+H]+
    • (9) Molekülformel: C28H57N3O
    • (10) 1H-NMR-Spektrum: 6 und 13C-NMR-Spektrum: 7
    • (11) Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie: Elutionsmuster wie in der 8 gezeigt.
  • Eine Strukturanalyse auf der Grundlage der obigen Merkmale zeigte, dass die bioaktive Substanz TKR1785-II die chemische Struktur der Formel (II) aufweist.
  • Figure 00070002
  • Das obige TKR1785 kann durch Kultivieren eines Mikroorganismusstamms, der zur Gattung Penicillium gehört und in der Lage ist, das TKR1785 auszubilden, und Isolieren der Substanz aus dem sich ergebenden Kulturmedium erzeugt werden.
  • Der oben erwähnte Mikroorganismusstamm ist nicht besonders eingeschränkt, vorausgesetzt er gehört zur Gattung Penicillium und ist in der Lage, das TKR1785 zu erzeugen. Daher kann zum Beispiel Penicillium sp. TKR1785 (nachfolgend als TKR1785-Stamm bezeichnet) aufgeführt werden.
  • Der TKR1785-Stamm ist ein neuer Pilzstamm, der aus einer in der Hyogo-Präfektur gesammelten Probe isoliert und charakterisiert wurde. Er hat die Eigenschaft, TKR1785 mit guter Ausbeute zu erzeugen. Die mykologischen Merkmale dieses TKR1785-Stamms werden nun ausführlich beschrieben.
  • Die Koloniefarben des TKR1785-Stamms auf verschiedenen Medien sind in der Tabelle 1 dargestellt. Die Farbbeschreibungen in der Tabelle beruhen auf der Farbnomenklatur, die in JIS Z 8102 (1985) definiert ist, und stellen die Ergebnisse der Beobachtung nach 7 Tagen in der Kultur bei 25°C dar.
  • Tabelle 1
    Figure 00080001
  • Der TKR1785-Stamm wird schnell auf Malzextraktagar, Kartoffeldextroseagar und Czapek-Agar gezüchtet und ergibt Kolonien, die eine samtige Oberflächentextur und ein leicht erhabenes Zentrum zeigen. Das Konidiophor des TKR1785-Stamms misst 90 bis 270 × 1,8 bis 3,0 µm und hat eine kahle Oberfläche und bildet gewöhnlich symmetrische „bivertillate" Penicilli. Die Metula misst 12,0 bis 14,0 × 2,8 bis 3,2 µm, und tritt in Gruppen von 2 bis 4 auf, und die Phialiden werden gewirtelt und messen 9,0 bis 10,0 × 1,8 bis 2,4 µm. Die Konidia sind globos bis subglobos und haben jeweils eine kahle Oberfläche und messen 2,2 bis 3,2 × 2,4 bis 4,0 µm.
  • Unter den mykologischen Charakteristika des TKR1785-Stamms sind seine physiologischen Merkmale wie folgt.
  • Temperaturbereich für das Wachstum: Der Temperaturbereich für das Wachstum beträgt 10 bis 30°C und der optimale Temperaturbereich für das Wachstum ist etwa 25°C.
  • Der pH-Bereich für das Wachstum: Der pH-Bereich für das Wachstum ist pH 3 bis 9 und der optimale pH-Bereich für das Wachstum liegt bei einem pH von etwa 5.
  • Wenn man die obigen mykologischen Charakteristika mit den Beschreibungen der Penicillium-Art unter anderem in Carlos Ramirez, Manual and Atlas of the Penicillia, Elsevier Biomedical Press, 1982 vergleicht, lässt sich feststellen, dass der TKR1785-Stamm ein Stamm ist, der zur Gattung Penicillium gehört.
  • Es gab allerdings keinen Bericht über einen Mikroorganismusstamm, der unter den Pilzen der Gattung Penicillium in der Lage ist, TKR1785 zu erzeugen. Daher haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ihn als einen neuen Stamm angesehen und ihn Penicillium sp. TKR1785 genannt. Der Stamm wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology (Adresse: 1-3, Higashi, 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan (Postleitzahl 305)) unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5788 (ursprüngliches Hinterlegungsdatum: 17. Mai 1995; Datum des Ersuchens zum Überführen zur internationalen Hinterlegung: 17. Januar 1997) hinterlegt.
  • Bei der Anwendung der Erfindung können nicht nur der obige TKR1785-Stamm, sondern auch spontane oder künstliche Mutanten des TKR1785-Stamms sowie andere Stämme der Gattung Penicillium, die in der Lage sind, TKR1785 zu erzeugen, erfolgreich angewendet werden.
  • Die Wirtschaftlichkeit der Herstellung der bioaktiven Substanz TKR1785 durch den oben erwähnten Mikroorganismus in einem geeigneten Kultursystem kann leicht durch Anwendung eines Umkehrphasentrennungs-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographs unter denselben Bedingungen bestimmt werden, wie sie zur Erzeugung der in der 5 aufgetragenen Daten verwendet werden, um die Elutionsposition zu bestätigen, die Ultraviolettabsorptionsspektrometrie mit einer Photodiodenanordnungsvorrichtung zu messen, die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Produkts mit denen für TKR1785 erwähnten zu vergleichen und gegebenenfalls das Molekulargewicht des Eluats von dem Umkehrphasentennungs-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatograph mit einer vernünftigen Molekülmassen-Messvorrichtung zu messen.
  • Gemäß der Erfindung kann TKR1785 durch Inokulieren eines Nährmediums mit dem TKR1785 erzeugenden Mikroorganismusstamm und Inkubieren des inokulierten Mediums erzeugt werden. Mit Bezug auf die verwendbaren Nährstoffe umfasst die Kohlenstoffquelle Glucose, Fructose, Saccharose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Melasse, Malzsirup, Öle und organische Säuren, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Die Stickstoffquelle unter den Nährstoffen umfasst Sojamehl, Baumwollsamenmehl, Maistränkflüssigkeit, Kasein, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Keime, organische oder anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie beispielsweise Harnstoff, Aminosäuren und Ammoniumsalze, ist aber nicht darauf beschränkt. Das Salz, das auch zu den Nährstoffen gehört, umfasst anorganische Salze, wie beispielsweise Salze von Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium und Phosphaten. Diese Nährstoffe können jeweils unabhängig oder in geeigneter Kombination verwendet werden.
  • Gegebenenfalls kann das obige Nährmedium mit Schwermetallen, wie beispielsweise Eisensalzen, Kupfersalzen, Zinksalzen, Kobaltsalzen, Vitaminen, wie beispielsweise Biotin und Vitamin B1, und anderen organischen oder anorganischen Substanzen ergänzt sein, um das Wachstum des Mikroorganismus zu unterstützen und die Erzeugung von TKR1785 zu fördern.
  • Gegebenenfalls kann das Nährmedium weiter mit einem Antischaummittel oder einem oberflächenaktiven Stoff, wie beispielsweise Siliconöl oder Polyalkylenglycolether ergänzt sein.
  • Die Kultivierung des TKR1785 erzeugenden Stamms in dem obigen Nährmedium kann mittels der routinemäßigen Züchtverfahren zum Inkubieren von Mikroorganismen zur Erzeugung von bioaktiven Substanzen durchgeführt werden. Ein flüssiges Züchtverfahren, insbesondere eine Schüttelkultur oder submerse aerobe Kultur, ist bevorzugt.
  • Die Kultivierung wird vorzugsweise im Temperaturbereich von 15 bis 25°C durchgeführt, und der pH-Wert des Mediums ist generell pH 3 bis 8 und vorzugsweise etwa pH 5. Ein ausreichender Ertrag kann allgemein innerhalb von 3 bis 11 Kulturtagen erwartet werden.
  • Wenn der Mikroorganismus so kultiviert wird, sammelt sich TKR1785 sowohl in der überstehenden Fraktion als auch in der zellulären Fraktion des Kulturmediums an. In der vorliegenden Erfindung kann das in dem Kulturmedium angesammelte TKR1785 dadurch erhalten werden, dass es aus dem Medium entfernt wird, indem die physikalisch-chemischen Eigenschaften und biologischen Merkmale dieser bioaktiven Substanz ausgenutzt werden, und gegebenenfalls weiter gereinigt werden.
  • Die obige Trennung kann dadurch erreicht werden, dass das ganze Kulturmedium mit einem nicht hydrophilen organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethylacetat, Butylacetat, Chloroform, Butanol oder Methylisobutylketon extrahiert wird. Als Alternative kann das Medium durch Filtration oder Zentrifugation in einen Überstand und Zellen fraktioniert werden und die bioaktive Substanz dann jeweils aus dem Überstand und den Zellen isoliert werden.
  • Die Abtrennung von TKR1785 aus dem Kulturmedium kann nicht nur durch das obige Extraktionsverfahren mittels eines nicht hydrophilen organischen Lösungsmittels erreicht werden, sondern auch durch das Verfahren, das das Kontaktieren des Mediums mit einem Adsorbens als stationäre Phase umfasst, um TKR1785 adsorbieren zu lassen und die bioaktiven Substanzen von der stationären Phase mit einem Lösungsmittel zu eluieren. Die stationäre Phase umfasst Aktivkohle, Cellulosepulver und Adsorbensharz, ist aber nicht darauf beschränkt. Das Lösungsmittel kann entweder einzeln oder in einer Kombination von zwei oder mehr Arten gemäß dem Typ und den Eigenschaften der gewählten stationären Phase verwendet werden. Daher können zum Beispiel wässrige Lösungen von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise wässriges Aceton und wässrige Alkohole, verwendet werden. Zur Trennung von TKR1785 aus den Zellen kann zum Beispiel ein Extraktionsverfahren, das ein hydrophiles organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Aceton, verwendet, angewendet werden.
  • In der vorliegenden Erfindung kann ein unverarbeiteter Extrakt von TKR1785, der so aus dem Kulturmedium entfernt wurde, weiter wie gewünscht gereinigt werden. Diese Reinigung kann mittels der allgemein zur Trennung und Reinigung von fettlöslichen bioaktiven Substanzen verwendeten Technik, zum Beispiel durch Säulenchromatographie oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer solchen stationären Phase, wie beispielsweise Silicagel, aktiviertes Aluminumoxid, Aktivkohle oder Adsorbensharz, durchgeführt werden. Das Elutionsmittel zur Verwendung in der Silicagel-Säulenchromatographie umfasst beispielsweise neben anderen Lösungsmitteln Chloroform, Ethylacetat, Methanol, Aceton und Wasser, und diese Lösungsmittel können jeweils allein oder in Kombination verwendet werden.
  • Im Fall der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie umfasst die stationäre Phase, die verwendet werden kann, chemisch gebundene Silicagele, wie beispielsweise octadecylierte, octylierte oder phenylierte Silicagele, und poröse Polymergele der Polystyrolreihe, ist aber nicht darauf beschränkt. Als mobile Phase können wässrige Lösungen von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise wässriges Methanol und wässriges Acetonitril, verwendet werden.
  • TKR1785 gemäß der Erfindung kann in Arzneianwendungen verwendet werden, und zwar entweder wie es ist oder in Form eines pharmakologisch annehmbaren Salzes. Die pharmazeutische Zusammensetzung, die TKR1785 oder ein pharmakologisch annehmbares Salz davon umfasst, ist nicht besonders eingeschränkt, umfasst aber Antimykotika, Antiallergika und Immunmodulatoren. Obwohl Antiallergika und/oder Immunmodulatoren bevorzugte Anwendungen der Erfindung sind, ist der Umfang der Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf solche Verwendungen beschränkt, sondern es fallen alle Arten von Arzneizusammensetzungen, umfassend TKR1785 oder sein pharmakologisch annehmbares Salz, selbst wenn es für andere Anwendungen gedacht ist, unter den Umfang der Erfindung.
  • Das oben erwähnte Salz ist nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt es ist pharmakologisch annehmbar. Daher umfasst das Salz Salze mit Mineralsäuren, wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Fluorwasserstoffsäure und Bromwasserstoffsäure; Salze mit organischen Säuren, wie beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Weinsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Methanosulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Camphersulfonsäure; und Salze mit Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen, wie beispielsweise Natrium, Kalium und Calcium, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • TKR1785 oder sein pharmakologisch annehmbares Salz gemäß der Erfindung kann entweder wie es ist oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die es in einem Verhältnis von 0,1 bis 99,5 %, vorzugsweise 0,5 bis 90 %, in einem pharmazeutisch annehmbaren, nicht toxischen und inerten Hilfsstoff, typischerweise als Antimykotikum, Antiallergikum oder einem Immunmodulator an Tiere, einschließlich dem Menschen, verabreicht werden.
  • Der oben erwähnte Hilfsstoff umfasst feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und andere Formulierungshilfsmittel, und diese Substanzen können entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden.
  • Die obige pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise in Dosiseinheitsformen verabreicht und kann oral, parenteral, lokal (z.B. transdermal) oder rektal verabreicht werden. Natürlich wird die oben erwähnte pharmazeutische Zusammensetzung in Dosisformen verabreicht, die für jeweilige Verabreichungswege geeignet sind.
  • Bei der Arzneianwendung von TKR1785 oder seines pharmakologisch annehmbaren Salzes gemäß der Erfindung wird die Dosierung als Antimykotikum, Antiallergikum oder Immunmodulator vorzugsweise nach den Patientenfaktoren ausgerichtet, wie beispielsweise Alter und Körpergewicht, Verabreichungsweg und Art und Schwere der Krankheit neben anderen Faktoren, aber die übliche Tagesdosis für einen erwachsenen Patienten beträgt 10 bis 2000 mg als Wirkstoff, nämlich TKR1785 oder ein pharmakologisch annehmbares Salz davon. Während Dosen unterhalb des oben erwähnten Bereichs in einigen Fällen ausreichen können, können in anderen Fällen höhere Dosen erforderlich sein. Bei einer hoch dosierten Verabreichung wird die Tagesdosis vorzugsweise in mehreren einzelnen Dosen gegeben.
  • Die orale Verabreichung kann in festen, pulverförmigen oder flüssigen Dosiseinheitsformen erfolgen, wie beispielsweise Schüttpulver (bulk powders), Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropfen und Sublingualtabletten neben anderen Dosisformen. Zum Beispiel können Schüttpulver durch Zerkleinern von TKR1785 oder seines pharmakologisch annehmbaren Salzes nach der Erfindung in eine fein verteilte Form hergestellt werden. Die oben erwähnten Pulver können durch Zerkleinern von TKR1785 oder seines pharmakologisch annehmbaren Salzes in eine fein verteilte Form und Mischen des sich ergebenden Pulvers mit einem ähnlich zerkleinerten pharmazeutischen Hilfsstoff, z.B. einem essbaren Kohlenhydrat, wie beispielsweise Stärke, Mannit, hergestellt werden. Gegebenenfalls können auch ein Korrigens, Konservierungsmittel, Dispergierungsmittel, Farbmittel, Parfum und/oder ein anderer Zusatzstoff formuliert werden.
  • Die parenterale Verabreichung kann zur subkutanen, intramuskulären oder intravenösen Verabreichung neben anderen Formen mittels einer Flüssigdosisform, zum Beispiel einer Lösung oder Suspension, erfolgen. Diese Dosisformen können durch Suspendieren oder Lösen einer vorbestimmten Menge an TKR1785 oder seines pharmakologisch annehmbaren Salzes nach der Erfindung in einem nicht toxischen flüssigen Träger, der zur Injektion eines wässrigen oder öligen Mediums geeignet ist, und Sterilisieren der Suspension oder Lösung hergestellt werden.
  • Die lokale Verabreichung (z.B. transdermale Verabreichung) kann mittels externer Dosisformen, wie beispielsweise einer Flüssigkeit, einer Creme, eines Pulvers, einer Paste, eines Gels oder einer Salbe, hergestellt werden. Diese Dosisformen können durch Formulieren einer vorbestimmten Menge an TKR1785 oder seines pharmakologisch annehmbaren Salzes nach der Erfindung mit mindestens einem topischen Formulierungsmittel, ausgewählt aus einem Parfum, Farbmittel, Füllstoff, oberflächenaktiven Mittel, Netzmittel, Weichmacher, Geliermittel, Trägersubstanz, Konservierungsmittel und Stabilisator, produziert werden.
  • Die rektale Verabreichung kann mittels Zäpfchen erfolgen, die durch Mischen einer vorbestimmten Menge an TKR1785 oder seines pharmakologisch annehmbaren Salzes nach der Erfindung in eine niedrig schmelzende feste Base hergestellt werden kann, z.B. einen höheren Ester, wie beispielsweise Myristylpalmitatester, Polyethylenglycol, Kakaobutter oder ein Gemisch davon.
  • BESTES VERFAHREN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung ausführlich, sollen aber den Umfang der Erfindung nicht beschränken.
  • Beispiel 1
  • Von einer Schrägkultur des TKR1785-Stamms (FERM BP-5788) wurde eine Schlinge entnommen, um einen 500 ml konischen Kolben, enthaltend 100 ml eines flüssigen Mediums [Difco Hefe-Stickstoff-Basis 0,67 % (w/v) und Glucose 2,0 % (w/v)], zu inokulieren, und unter Schütteln bei 25°C 5 Tage kultiviert, um eine Impfkultur zur Verfügung zu stellen. Eine Menge von 1,0 ml dieser Impfkultur wurde in 18 konische Kolben mit einer Kapazität von jeweils 500 ml inokuliert, jeweils enthaltend 125 ml des obigen flüssigen Mediums, und unter Schütteln (220 min-1) bei 25°C 9 Tage lang kultiviert. Die sich ergebende Kultur wurde zentrifugiert, um einen Überstand und eine Zellfraktion voneinander abzutrennen. Die Zellfraktion wurde gut gemischt und mit 1 l Methanol extrahiert, und der Extrakt wurde bei reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit 300 ml Wasser verdünnt und nach ausreichendem Mischen auf einen pH von 2 eingestellt. Dann wurden 300 ml Ethylacetat zugegeben und zum Waschen gründlich gemischt. Die wässrige Schicht wurde auf einen pH von 9 eingestellt und mit 300 ml Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde bei reduziertem Druck konzentriert, um 52 mg eines Rests zu ergeben.
  • Dieser Rest wurde in 0,4 ml Methanol gelöst und einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterworfen, um zwei antimykotische Fraktionen I und II bereitzustellen. Diese aktiven Fraktionen wurden jeweils bei reduziertem Druck konzentriert, um 16 mg TKR1785-I und 3 mg KTR1785-II, beide als weißes Pulver, zur Verfügung zu stellen. Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
    Vorrichtung: LC8A (Shimadzu)
    Säule: YMCpack C18 (2,0 cm × 25 cm ) Y.M.C.)
    Mobile Phase: 0,05 % Trifluoressigsäure-55 % (v/v) Acetonitril/Wasser
  • Physikalisch chemische Eigenschaften
  • Es wurde das JMS-DX302 Massenspektrometer (Jeol Ltd.) für die Massenspektrometrie verwendet. Das JNM-A500 nuklearmagnetische Resonanzspektrometer (Jeol Ltd.) wurde für die 1H-NMR-Spektrometrie verwendet (in deuteriertem Dimethylsulfoxid; Referenz: deuteriertes Dimethylsulfoxid) und 13C-NMR-Spektrometrie (in deuteriertem Dimethylsulfoxid; Referenz: deuteriertes Dimethylsulfoxid). Für die Ultraviolettabsorptionsspektrometrie (in Methanol) wurde ein UV-250 selbstaufnehmendes Spektrophotometer (Shimadzu) verwendet. Für die Infrarotabsorptionsspektrometrie (KBr) wurde ein 270-30 Infrarot-Spektrophotometer (Hitachi) verwendet. Für die Aminosäureanalyse wurde L-8500 (Hitachi) verwendet.
  • Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von TKR1785-I waren wie folgt.
  • FAB-MS des gereinigten weißen Pulvers der Fraktion-I, erhalten durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und Konzentration bei reduziertem Druck zeigt m/z 518 [M+H]+. Die Aufzeichnung des 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektrums und deren Analyse zeigen, dass diese Substanz 27 Kohlenstoffatome und 3 Stickstoffatome aufweist. Das 1H-NMR-Spektrum und 13C-NMR-Spektrum ist in der 3 bzw. 4 dargestellt. Das Ultraviolettadsorptionsspektrum dieser Substanz in Methanol zeigt die Endabsorptionen, die in der 1 veranschaulicht sind. Die KBr-Infrarot-Absorptionswellenzahlen (KBr) sind nachfolgend aufgeführt. Das IR-Absorptionsspektrum der Substanz ist in der 2 dargestellt.
    IR (KBr) (cm-1): 3410, 2920, 2850, 1670, 1540, 1470, 1210, 1140, 1050, 840, 800, 720.
  • Die Löslichkeit dieser Substanz in verschiedenen Lösungsmitteln war derart, dass die Substanz in Methanol und Wasser löslich ist und in Chloroform und Hexan nur schwer löslich ist.
  • Die obigen Analysedaten zeigten, dass das gereinigte weiße Pulver, das durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und anschließende Konzentration der Fraktion I bei reduziertem Druck erhalten wird, TKR1785-I ist. Eine ausführliche Analyse dieses 1H-NMR-Spektrums, das in der 3 dargestellt wird, und des 13C-NMR-Spektrums, das in der 4 veranschaulicht ist, zeigten, dass TKR1785-I den chemischen Aufbau der Formel I hat.
  • TKR1785-I wurde einer Umkehrphasentrennungs-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mittels LC-10A-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatograph (Shimadzu) unterworfen. Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
    Säule: CAPCELL PACK C18 (6 mm × 150 mm) (Shiseido)
    Mobile Phase: 0,05 % Trifluoressigsäure – 50 % (v/v) Acetonitril/Wasser
    Säulentemperatur: 40°C
    Detektions-UV-Wellenlänge: 220 nm
  • Die Analyse zeigte, dass TKR1785-I in der in der 5 gezeigten Position eluiert wird.
  • Die physikalisch-chemischen Konstanten von TKR1785-II sind wie folgt.
  • Das gereinigte weiße Pulver, erhalten durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und Konzentration der Fraktion II bei reduziertem Druck, wurde auf verschiedene physikalisch-chemische Eigenschaften analysiert. FAB-MS dieser Substanz ergab m/z532 [M+H]+, was zeigt, dass es um 14 Masseeinheiten größer als TKR1785-I ist. Diese Substanz wurde mit Salzsäure hydrolysiert und auf Aminosäuren hin analysiert. Es wurde festgestellt, dass während TKR1785-I L-Valin enthält, diese Substanz L-Isoleucin enthält. Es gab nur einen geringen Unterschied zwischen den UV-Absorptionsspektren der beiden Substanzen. Die Löslichkeit dieser Substanz in verschiedenen Lösungsmitteln war auch der von TKR1785-I ähnlich. Eine umfassende Analyse des 1H-NMR-Spektrums (6) und des 13C-NMR-Spektrums (7) dieser Substanz zeigte, dass die Substanz den chemischen Aufbau der Formel (II) aufweist.
  • Es wurde festgestellt, dass auf der Grundlage der obigen Analysedaten das gereinigte weiße Pulver, erhalten durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und Konzentration der aktiven Fraktion II bei reduziertem Druck, TKR1785-II war.
  • TKR1785-II wurde einer HPLC-Analyse mittels LC-10A-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatograph (Shimadzu) unterworfen. Die HPLC-Bedingungen waren dieselben, wie die bei der Analyse von TKR1785-I verwendeten. Die Analyse zeigte, dass TKR1785-II in der in der 8 gezeigten Position eluiert wurde.
  • Biologische Eigenschaften
  • (1) Antimykotische Wirksamkeit
  • Es wurde die antimykotische Wirksamkeit der obigen Substanz TKR1785 gegenüber verschiedenen Mikroorganismen untersucht. Mittels des Flüssigmedium-Verdünnungsverfahrens wurde die Konzentration, die eine im Wesentlichen vollständige Wachstumshemmung verursachte, als minimale inhibitorische Konzentration (µg/ml) angesetzt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 dargestellt. Die Konzentration, die eine teilweise Wachstumshemmung verursachte, wurde auch als 50%ige inhibitorische Konzentration (µg/ml) angesetzt und ist in Klammern in der Tabelle 2 gezeigt. In der Tabelle stellt YNBG ein Medium dar, das 0,67 % Hefe-Stickstoff-Basis (Difco) und 1 % Glucose enthält. BHI stellt ein Medium dar, das 0,5 % Brain-Heart-Infusion-Bouillon (Nissui Pharmaceutical) enthält. YNBG-Tween stellt ein Medium dar, das 0,67 % Hefe-Stickstoff-Basis, 0,5 % Baktocasiton, 2 % Glucose und 1 % Tween 40 enthält.
  • Tabelle 2
    Figure 00190001
  • Es ist aus den Ergebnissen in der Tabelle 2 ersichtlich, dass die bioaktiven Substanzen TKR1785 nach der Erfindung antimykotische Wirksamkeit gegenüber pathogenen Pilzen, wie beispielsweise Candida albicans, Candida kefir, Cryptococcus neoformans und Malassezia furfur, haben.
  • (2) Enzym-Hemmungswirkung
  • Es wurde die Hemmungswirkung von TKR1785-I gegenüber Phospholipase A2 (die von Schweinepankreas stammt) und Leukotriene(LT)-C4-Synthase (die von Meerschweinchenlunge stammt), bei denen es sich um Enzyme handelt, die mit dem Immunsystem in Verbindung stehen, bestimmt. Die Wirksamkeit von Phospholipase A2 wurde für einen Hexanextrakt unter sauren Bedingungen durch Bestimmen der [14C]-Palmitinsäure, die von [14C]Phosphatidylcholin freigesetzt wird, untersucht. Die LTC4-Synthasewirkung wurde durch Bestimmen der Ausbeute von LTC4 von LTA4 mittels des RIA-Verfahrens untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3
    Figure 00200001
  • TKR1785-I hemmte Phosphoplipase A2 und LTC4-Synthase, bei denen es sich um Enzyme handelt, die mit allergischen Reaktionen in Verbindung stehen.
  • (3) Hemmwirkung der gemischten Lymphozytenreaktion (MLR)
  • Es wurde aus C57BL/6- und BALB/c-Mäusen die Milz isoliert und in einem Medium homogenisiert, um eine Zellsuspension zu erhalten. Die Zellsuspension, die von C57BL/6-Mäusen stammt, wurde durch eine Nylon-Woll-Säule geleitet, um eine Fraktion, die reich an T-Zellen (Responderzellen) war, herzustellen. Die von BALB/c stammende Zellsuspension wurde mit Röntgenstrahlen bestrahlt, um Stimulatorzellen herzustellen. Die Responderzellen und Stimulatorzellen wurden in einem Verhältnis von 1:1 gemischt und für 4 Tage in einem CO2-Inkubator inkubiert. Nach dem Hinzufügen von 3H-Thymidin wurden die Zellen weiter über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden dann aufbereitet und die Menge an 3H-Thymidinaufnahme wurde bestimmt. Die Proben (500, 125, 31,2 und 7,8 µg/ml Lösungen von Dimethylsulfoxid, verdünnt mit dem Medium) wurden jeweils in einem Verhältnis von 0,5 % unter Mischen der Responderzellen mit den Stimulatorzellen zu den Endkonzentrationen von 25 bis 0,039 µg/ml zugesetzt. Die Hemmwirkung wurde durch Vergleich mit der 3H-Thymidinaufnahme in der probenfreien Gruppe bestimmt. TKR1785-I zeigte eine konzentrationsabhängige MLR-Hemmwirkung, und seine 50%ige inhibitorische Konzentration betrug 0,41 µg/ml.
  • Es war daher klar, dass die Substanzen zum Unterdrücken von allergischen und anderen Immunreaktionen wirksam sind.
  • (4) Toxizität
  • Das erhaltene TKR1785-I und TKR1785-II wurden jeweils ICR-Mäusen intraperitoneal in einer Dosis von 50 mg/kg verabreicht, aber es wurde keine toxische Reaktion gefunden. Dosisform Beispiel 1
    TKR1785-I 50 mg
    Lactose 46 mg
    Maisstärke 20 mg
    Hydroxypropylcellulose mit geringer Substitution 8 mg
    Hydroxypropylmethylcellulose 5 mg
    Magnesiumstearat 1 mg
    insgesamt 130 mg
  • Die obigen Komponenten außer der Hydroxypropylmethylcellulose und Magnesiumstearat wurden gleichförmig gemischt und mittels einer 8%igen (w/w) wässrigen Hydroxypropylmethylcelluloselösung als Bindemittel wurde das Gemisch nass granuliert, um eine Granulation zur Kompression zur Verfügung zu stellen. Dann wurde Magnesiumstearat mit der Granuation gemischt und mittels einer Tablettiermaschine wurde die gesamte Zusammensetzung in Tabletten zur oralen Verabreichung komprimiert, von denen jede einen Durchmesser von 7 mm und ein Gewicht von 130 mg hatte. Dosisform Beispiel 2
    TKR1785-I 1 g
    Absorptionsfähige Salbe
    (aufgeführt in The Pharmacopoeia of Japan) 99 g
    insgesamt 100 g
  • TKR1785-I wurde mit einer kleinen Menge an absorptionsfähiger Salbe gründlich geknetet und dann wurde der Rest der Salbe langsam zugesetzt und anschließend gründlich geknetet, um eine homogene Salbe zur Verfügung zu stellen. Diese Salbe sollte 4 – 5-mal täglich auf das betroffene Gebiet aufgetragen werden.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können die bioaktiven Substanzen TRK1785, die von klinischem Wert zum Beispiel als Therapeutika bei Pilzinfektionen, allergischen Erkrankungen und Immunerkrankungen sind, sowie ein Verfahren zur deren Herstellung zur Verfügung gestellt werden.

Claims (8)

  1. Bioaktive Substanz TKR1785 der folgenden allgemeinen Formel (A):
    Figure 00230001
    worin R -CH(CH3)2 oder -CH(CH3)C2H5 darstellt.
  2. Verfahren zur Herstellung der bioaktiven Substanz TKR1785, umfassend das Züchten des Stamms Penicillium sp. TKR1785, der beim National Institute of Bioscience and Human Technology unter der Nummer FERM BP-5788 hinterlegt ist, und das Isolieren der Substanz aus dem sich ergebenden Nährboden.
  3. Mikroorganismus, der zum Stamm Penicillium sp. TKR1785 gehört, der beim National Institute of Bioscience and Human Technology unter der Nummer FERM BP-5788 hinterlegt ist.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die bioaktive Substanz TKR1785 nach Anspruch 1.
  5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, die die bioaktive Subtanz TKR1785 nach Anspruch 1 als Wirkstoff umfasst.
  6. Bioaktive Substanz TKR1785 nach Anspruch 1 zur Verwendung als antiallergenes Mittel.
  7. Bioaktive Substanz TKR1785 nach Anspruch 1 zur Verwendung als Immunmodulator.
  8. Bioaktive Substanz TKR1785 nach Anspruch 1 zur Verwendung als Antipilzmittel.
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