CH628144A5

CH628144A5 - Verfahren und mittel zur bestimmung der aktivitaet von creatinkinase-mb.

Info

Publication number: CH628144A5
Application number: CH1380576A
Authority: CH
Inventors: Uwe Dr Wuerzburg; Norbert Dr Hennrich; Hans-Dieter Dr Orth; Hermann Dr Lang
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1975-11-03
Filing date: 1976-11-02
Publication date: 1982-02-15
Also published as: NO148457B; IL50803A; DE2548963B2; FR2330010B1; IL50803A0; SE7612175L; ATA809576A; CS200196B2; ES452916A1; NO148457C; DE2548963A1; BE847905A; JPS5619239B2; JPS5257887A; DK151920B; GB1512328A; AT359205B; FI60720C; NO763722L; US4067775A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB in menschlichen Körperflüssigkeiten.

Die Bestimmung der Aktivität der Creatinkinase (ATP: Creatin-Phosphotransferase, E.C. 2.7.3.2; Abkürzung: CK) im Serum gilt als empfindlichste Labormethode bei der Diagnostik von Erkrankungen der Skelett- und Herzmuskulatur, speziell beim Myokardinfarkt. Die Unterscheidung von Traumatisierungen der Skelett- und Herzmuskulatur, speziell bei der Differentialdiagnose des Myokardinfarkts, ist aber schwierig. Durch die Bestimmung der CK-Gesamtaktivität kann eine Differenzierung nicht mit Sicherheit erfolgen. Es ist deshalb versucht worden, die differentialdiagnostische Aussagekraft der Bestimmung der CK-Aktivität zu erhöhen, indem man die Aktivität weiterer Enzyme im Serum misst und die Messergebnisse miteinander korreliert, z. B. durch Bildung des Quotienten CKI Glutamat-oxalacetat-transaminase. Quotienten dieser Art erlauben jedoch eine Verwendung bei der Differenzierung zwischen Herz- und Lungeninfarkt oder zwischen Herzinfarkt und Schock-Folgen aus anderer Ursache nicht.

CK kommt im Körper in Form von drei Isoenzymen vor, nämlich CK-MM, z. B. im Muskel, CK-BB, z. B. im Gehirn und als Hybrid CK-MB (bestehend aus einer Untereinheit M und einer Untereinheit B), z. B. im Herzmuskel. Die im Blut (Serum) auftretende CK-Aktivität ist normalerweise auf das Isoenzym CK-MM zurückzuführen, da CK-BB nicht durch die Liquor-Blut-Schranke hindurchtritt und CK-MB auf bestimmte Organe (z. B. den Herzmuskel) beschränkt ist. Bei Schädigungen des Herzmuskels (z. B. beim Herzinfarkt) wird CK-MB jedoch in das Blut (Serum) freigesetzt und lässt sich dort nachweisen.

Die quantitative Bestimmung dieses Isoenzyms neben CK-MM im Serum gilt als empfindlichste und differentialdiagnostisch aussagekräftigste Labormethode zum Nachweis des Herzinfarkts. Neben dem Herzmuskel enthalten zwar noch einige weitere Organe CK-MB (z. B. Pankreas, Zwerchfell, Aorta, Lunge und Uterus), jedoch ist die Aktivität in diesen Organen um den Faktor 100 geringer als im Herzmuskel, so dass eventuell aus den genannten Organen freigesetzte CK-MB-Aktivitäten unterhalb der Nachweisgrenze liegen.

Die bisher üblichen Aktivitätsbestimmungen von CK-MB gingen im wesentlichen auf 3 Methoden zurück:

1. Elektrophorese auf verschiedenen Trägern. Die hiermit erhaltenen Ergebnisse sind bisweilen widersprüchlich; oft treten mehr Banden auf, als Isoenzyme vorhanden sind (Artefakte).

2. Chromatographie an verschiedenen Säulenmaterialien. Diese Methode ist langwierig (mehrere Stunden effektiver Arbeitszeit) und nicht für Routineuntersuchungen geeignet. Die Ergebnisse verschiedener Untersucher sind teilweise widersprüchlich.

3. Immunologische Bestimmung mit präzipitierenden Antikörpern. Diese Methode wurde in den deutschen Patentanmeldungen P 21 28 670 und P 22 58 822 beschrieben und liefert z. B. bei der Quantifizierung von Isoenzymen der Aldolase und Alkalischen Phosphatase gute Ergebnisse. Zur Bestimmung von relativ geringen Aktivitäten von CK und insbesondere von CK-MB reicht die Empfindlichkeit der Methode jedoch nicht aus.

Alle diese Verfahren erfordern ausserdem zur Durchführung einen grösseren Zeitaufwand und sind deshalb für die Verwendung bei der Schnelldiagnose des Herzinfarkts nicht geeignet.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, reproduzierbares und schnell durchzuführendes Verfahren und ein Mittel zur Bestimmung der Aktivität von CK-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit zu entwickeln.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass ein bisher nicht bekanntes Verfahren zur Verfügung gestellt wird, das mit spezifischen Antikörpern arbeitet, welche die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB vollständig hemmen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von CK-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Probe mit Antikörpern inkubiert, die die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in den CK-Isoenzymen MM und MB vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren, und die Aktivität der CK-Untereinheit B photometrisch bestimmt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Mittel zur Bestimmung der Aktivität von CK-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es Antikörper enthält, die die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in den Creatinkinasen-MM und -MB vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Mittels ist dadurch gekennzeichnet, dass die darin enthaltenen Antikörper in der zu bestimmenden

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Probe bis zu 2500 U/1 der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB vollständig zu hemmen vermögen.

Gegenstand der Erfindung ist ausserdem die Anwendung des Verfahrens zur Bestimmung der Aktivität von CK-MB neben CK-MM und insbesondere zur Diagnose des Myocardin- 5 farkts und/oder anderer Erkrankungen bzw. Schädigungen des Herzmuskels. Gegenstand der Erfindung ist ferner die Anwendung des Verfahrens zur Simultanbestimmung der CK-Gesamt-aktivität und der CK-MB-Aktivität in einer Probe.

Als Körperflüssigkeit ist für das Verfahren der Erfindung in 10 erster Linie Human-Serum geeignet. Man kann jedoch auch andere Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Plasma, Harn, Sputum und Schweiss vom Menschen, aber auch analoges Untersuchungsmaterial von Tieren zur Bestimmung heranziehen.

CK-BB stört die Durchführung des erfindungsgemässen Ver- 15 fahrens und darf deshalb in den zu testenden Körperflüssigkeiten nicht vorhanden sein.

Die für das erfindungsgemässe Verfahren benötigten Antikörper werden durch Impfung von Tieren mit CK-MM-Antige-nen gewonnen. Als Antigen wird dafür vorzugsweise mensch- 20 liehe CK-MM herangezogen. Es ist aber auch möglich, CK-MM aus Tieren zu verwenden, wenn die damit hergestellten Antise-ren die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in menschlicher CK-MM und CK-MB, gegebenenfalls auch in Gegenwart von CK-Substraten, vollständig zu hemmen vermögen, ohne 25 die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren. Tierische Spender von CK-MM-Antigenen sind in erster Linie die verschiedenen Affenarten, vorzugsweise Rhesusaffen und Schimpansen, ferner Haustiere wie Schwein, Pferd, Rind, Kaninchen, Meerschweinchen und 30 andere Tiere wie Ratten, Mäuse und Vögel wie Gänse, Enten, Hühner.

Das zur Herstellung der Antikörper verwendete CK-MM-Antigen soll frei sein von den Aktivitäten von CK-MB und CK-BB. Ein empfindliches Kriterium für diese Reinheitsforde- 35 rung ist die immunologische Analyse, die vorteilhafterweise mittels Diffusions- oder Elektrophoresetechnik durchgeführt wird. Daneben sind z. B. die Methoden der analytischen Disk-Elektrophorese und der Polyacrylamid-Gel-Elektrofokussie-rung nützlich. Bei Anwendung dieser Methoden hat der N ach- 40 weis der Reinheit gegenüber CK-MB und CK-BB Vorrang. Dagegen ist die absolute Reinheit gegenüber anderen Proteinen, die z. B. durch die beiden zuletzt genannten Methoden ermittelt werden kann, weniger wichtig. Die Mikroheterogeni-tät von CK-Isoenzymtypen, die sich z. B. in geringen Unter- 45 schieden der Aminosäurezusammensetzung der einzelnen Isoenzyme äussern kann, spielt als Reinheitskriterium in der Regel keine Rolle.

Für die Immunisierung werden solche Tiere herangezogen, die nach Impfung mit aktivierter CK-MM Antikörper bilden, 50 welche die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in den Creatinkinasen MM und MB vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren. Vorzugsweise eignen sich hierfür Ziegen. Es kommen jedoch auch andere Tiere, insbeson-55 dere Wirbeltiere, als Antikörperspender in Frage, z. B. Affenarten, Pferd, Rind und rinderähnliche Tiere, Schaf, Hund,

Schwein, Kaninchen, Vögel wie Hühner, Truthühner, Gänse und Enten, ferner Ratten, Mäuse und Meerschweinchen. Ziegen werden insbesondere zur Induktion solcher Antikörper 60 herangezogen, welche - auch in Gegenwart von CK-Substraten - vollständige Hemmungen der M-Untereinheit in CK-MM und CK-MB auszuüben vermögen.

Die Immunisierung der Versuchstiere wird nach der Erfindung mit aktivierter menschlicher oder tierischer CK-MM 65 durchgeführt. Die Aktivierung der CK-MM kann durch bekannte SH-Gruppen-stabilisierende und -aktivierende Reagenzien und/oder durch zweiwertige Metallionen, vorzugs-

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weise durch eine Kombination der genannten Reagenzien und der Metallionen, erfolgen. Als SH-Gruppen-stabilisierende und -aktivierende Reagenzien werden vorzugsweise z. B. N-Acetyl-cystein, Mercaptoäthanol und Dithioerythrit verwendet, ferner Glutathion, Cy stein, Dithiothreit, S-(2-Aminoäthyl>isothiouro-niumbromid-hydrobromid (AET), und/oder Thioglykolsäure. Die zweiwertigen Metallionen entstammen entsprechenden wasserlöslichen Salzen (z. B. den Chloriden oder Acetaten) vorzugsweise des Magnesiums, ferner des Mangans, Calciums und/ oder Kobalts. Derartige Aktivierungen sind grundsätzlich auf anderen Gebieten bekannt und dem Fachmann geläufig.

Die weitere Durchführung der Immunisierung und die Aufarbeitung zum Erhalt der Antiseren bzw. Antikörper erfolgt in bekannter Weise. Auch die Verarbeitung und Aufbewahrung der Antiseren bzw. Antikörper erfolgt nach in der Immunologie bekannten Methoden.

Die für das erfindungsgemässe Verfahren zu verwendenden Antikörper sind vorzugsweise der IgG-Immunglobulin-klasse (bivalente Antikörper) zuzurechnen. Ihr Molekulargewicht liegt zwischen etwa 130 000 und 210 000, vorzugsweise bei etwa 160 000; ihre angenäherte Sedimentationskonstante liegt zwischen 6 S und 8 S, vorzugsweise bei etwa 7 S; ihr Koh-lenhydratanteil beträgt etwa 3% ihres Gesamtgewichtes.

Neben den JgG-Antikörpern lassen sich auch monovalente JgG-Fragmente (= Fab) und JgM-Antikörper erfindungsgemäss einsetzen.

Die erfindungsgemäss angewandten Antikörper sollen die Enzymaktivität der M-Untereinheit der Creatinkinase vollständig hemmen. Unter «vollständiger Hemmung» wird hier eine Hemmung verstanden, bei der im Mittel höchstens 5 U/1, vorzugsweise weniger als 3 U/1 der Enzymaktivität der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB in einer Probe erhalten bleiben.

Die Antikörper sollen ferner die enzymatische Aktivität der B-Untereinheit der CK-MB nicht beeinflussen. Darunter soll hier verstanden sein, dass höchstens 10 U/1, vorzugsweise weniger als 5 U/1, Enzymaktivität der Untereinheit B der CK-MB in einer Probe gehemmt werden.

Zur Durchführung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens, die darin besteht, dass die zu bestimmende Probe der Körperflüssigkeit und die Antikörper in Gegenwart von CK-Substraten inkubiert werden, sollen die Antikörper ferner die Eigenschaft haben, ihre hemmende Wirkung gegenüber der enzymatischen Aktivität der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB auch in Gegenwart von CK-Substra-ten vollständig entfalten zu können, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu beeinflussen. Diese Eigenschaft ist z. B. bei Antikörpern, die aus Ziegen durch Immunisierung mit vollaktivierter CK-MM gewonnen werden, zusätzlich zu den oben gekennzeichneten Eigenschaften vorhanden. Sie ist für die normale Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens (zuerst Inkubation mit den Antikörpern, dann Zusatz der CK-Substrate und photometrische Messung) nicht unbedingt erforderlich.

Als CK-Substrate können alle üblicherweise verwendeten Substrate bzw. Effektoren eingesetzt werden. Im vorliegenden Zusammenhang sind in erster Linie Creatin, Creatinphosphat, Adenosindiphosphat, Adenosintriphosphat und Magnesiumionen von Bedeutung.

Die Bestimmung der Aktivität bzw. der Restaktivität der CK und ihrer Isoenzyme kann im Prinzip nach allen Verfahren erfolgen, die schnell und präzis arbeiten. Geeignet sind z. B. bekannte Verfahren, die es erlauben, die CK-Aktivität nach Zusatz von CK-Substraten mittels einer an Hilfsreaktionen anschliessenden photometrischen Bestimmung zu messen. Hierfür lassen sich colorimetrische Methoden, wie sie z. B. in «Methoden der enzymatischen Analyse», herausgegeben von H.U. Bergmeyer, 3. Auflage (1974), Band 1, Seite 145 ff. beschrieben sind, heranziehen. Bevorzugt sind jedoch kineti-

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sehe Methoden, bei denen die Enzymaktivität durch Messung im UV bei z. B. 334,340 oder 366 nm ermittelt wird. Man verwendet insbesondere z. B. eine Standardmethode, nach der CK unter Verwendung von Creatinphosphat und Adenosindiphos-phat bestimmt wird (Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., Band 8, Sei- 5 te 658 ff. (1970) und Band 10, Seite 182 (1972). Testpackungen zur Bestimmung der CK-Aktivität nach dieser Methode sind im Handel.

Nach einem anderen bekannten Bestimmungsverfahren kann CK auch fluorometrisch bestimmt werden. Durch CK 10 lässt sich aus Creatinphosphat Creatin freisetzen, welches nach dem von R.B. Conn (Clin. Chem., Band 6, Seite 537 f (I960)) ausgearbeiteten Verfahren durch Reaktion mit Ninhydrin in stark alkalischer Lösung fluorometrisch gemessen werden kann (vgl. Sax et al., Clin. Chem., Band 11, Seite 951 f (1965)). 15

Eine typische Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird im folgenden erläutert:

Die zu bestimmende Probe der Körperflüssigkeit, vorzugsweise eine Probe von Humanserum, wird mit einer Menge von CK-MM-Antikörpern versetzt, welche ausreicht, bis zu 2500 20 U/1 der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB, vorzugsweise etwa 1000 U/1, vollständig zu hemmen. Bei Körperflüssigkeiten mit höheren Gesamt-CK-Aktivitäten wird zweckmässigerweise vor der eigentlichen Bestimmung eine Vorverdünnung auf etwa 1000 U/1 vorgenommen. Diese Vorverdünnung ist bei 25 der Berechnung zu berücksichtigen. Man mischt und inkubiert während etwa 1 bis 30, vorzugsweise etwa 5 Minuten, bei Temperaturen zwischen +10 und +40 °C, vorzugsweise etwa bei Raumtemperatur, speziell bei 25 oder 30 °C. Danach wird die restliche Enzymaktivität des Reaktionsgemisches mit Hilfe 30 eines bekannten Verfahrens, vorzugsweise mit der oben beschriebenen UV-Methode, ermittelt. Man gibt die Serum-Antikörper-Mischung zu einem bekannten Enzym-Coenzym-Substrat-Gemisch, das alle zur Durchführung der Methode erforderlichen Enzyme, Coenzyme und Substrate enthält, und 35 fügt anschliessend eine ausreichende Menge einer Pufferlösung (pH etwa 7) hinzu. Übliche Handelspräparate enthalten z. B. als Enzym/Coenzym-Gemisch Hexokinase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Adenosindiphospat und Nicotin-amid-adenin-dinucleotid-phosphat und als Substrate Creatin- 40 phosphat und Glucose.

Es ist auch möglich, die Serum-Antikörper-Mischung zu einem Gemisch aus Coenzym und Enzym zu geben (oder umgekehrt) und anschliessend ein Puffer-Substratgemisch hinzuzufügen. Als Puffer eignen sich für die Umsetzung Neutralpuffer, 45 wie z. B. bevorzugt Triäthanolamin- oder Imidazolacetatpuffer, ferner u. a. Morpholinpropansulfonsäure- und Morpholin-äthansulfonsäure-puffer. Man mischt, inkubiert etwa 1 bis 10, vorzugsweise 5 Minuten, bei 15-40, vorzugsweise bei 25 oder 30 °C, und ermittelt darauf etwa bei Raumtemperatur die Ände-50 rung der Extinktion. Daraus wird anschliessend die Aktivität der Untereinheit B in CK-MB errechnet.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann dieses Verfahren dahingehend abgewandelt werden, dass die Probe der zu analysierenden Körperflüssigkeit mit den Antikörpern und den 55 CK-Substraten in Gegenwart eines Puffers und den für die Nachweisreaktion erforderlichen Substanzen zusammen inkubiert wird (ohne Vorinkubation der Probe mit den Antikörpern). Für diese Ausführungsform ist eine weitere Eigenschaft der Antikörper Voraussetzung: sie müssen die enzymatische 60 Aktivität der Untereinheit M von CK-MM und -MB auch in Gegenwart von CK-Substraten vollständig hemmen. Diese Eigenschaft besitzen z. B. die Antikörper, die mittels voll aktivierter CK-MM aus Ziegen gewonnen werden. Sie ermöglichen es, das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einfacheres und schneller Art durchzuführen:

So kann man z. B. die Antikörper, die zuvor mit dem bekannten, für die Nachweisreaktion verwendeten Coenzym-

Enzym-Substrat-Gemisch in eine lyophilisierte Form gebracht wurden, in einer bestimmten Menge einer Pufferlösung auflösen, die zu bestimmende Körperflüssigkeit (z. B. Serum) hinzugeben und die Aktivitätsbestimmung des B-Anteils von CK-MB durchführen. In einer Variante dieses Verfahrens kann man die Antikörper auch mit einem Gemisch, bestehend lediglich aus Coenzymen und Enzymen, in das Lyophilisat einarbeiten und die Substrate der Pufferlösung hinzufügen.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann eine Simultanbestimmung der CK-Gesamtaktivität und der CK-MB-Aktivität unter Zuhilfenahme des soeben beschriebenen, bevorzugten Verfahrens der Erfindung in einem einzigen Ansatz durchgeführt werden. Man kann z. B. so vorgehen, dass man zunächst die CK-Gesamtaktivität der Probe nach einem bekannten photometrischen Verfahren bestimmt; anschliessend gibt man zu dem selben Ansatz ein in Wasser gelöstes Lyophilisat, bestehend aus CK-MM-Antikörpern. Dann inkubiert man etwa 1 bis 10, vorzugsweise 5 Minuten und bestimmt die Restaktivität der Probe photometrisch. Auch für diese Ausführungsform ist Voraussetzung, dass die Antikörper gegen CK-MM die enzymatische Aktivität der Untereinheit M von CK-MM und -MB auch in Gegenwart von CK-Substraten vollständig zu hemmen vermögen.

Man kann die Antikörperkapazität der Antiseren bei diesen bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens so einstellen, dass sie bis zu 2500 U/1, vorzugsweise etwa 1000 U/1, der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB vollständig zu hemmen vermögen. Falls die CK-Gesamtaktivitäten der zu bestimmenden Probe für diese Hemmkapazitäten der Antikörper zu hoch sind, müssen auch hier Vorverdünnungen vorgenommen werden, z. B. auf Aktivitäten der Untereinheit M in CK-MM und -MB von etwa 1000 U/1.

Das Verfahren der Erfindung hat gegenüber dem Stand der Technik beträchtliche Vorteile. Dazu zählen die hohe Präzision der Ergebnisse und die Schnelligkeit sowie die Einfachheit der Durchführung.

Die Präzision des Verfahrens der Erfindung ist darauf zurückzuführen, dass die verwendeten Antikörper spezifisch auf die M-Untereinheit von CK-MM und CK-MB ansprechen und es deshalb erlauben, die CK-MB-Aktivität in Körperflüssigkeiten, wie dem Humanserum, in einer Direktbestimmung zu ermitteln.

Demgegenüber besitzt das in den deutschen Patentanmeldungen P 21 28670 und P 22 58 822 beschriebene immunologische Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Isoenzymen Nachteile. Nach diesen Verfahren präzipitiert man die Isoenzyme der CK durch isoenzymspezifische, präzipitierende Antikörper und ermittelt jeweils die im Überstand der Immunpräzi-pitation verbleibende Restaktivität. Abgesehen von dem Aufwand dieser Methode, die in der Regel die Herstellung von mehreren spezifischen Antiseren erforderlich macht, müssen in jedem Falle mindestens zwei verschiedene Testansätze durchgeführt werden, nämlich die Bestimmung der CK-Gesamtaktivität und die Bestimmung der CK-Restaktivität nach Präzipitation. Die CK-MB-Aktivität kann also erst durch eine Differenzmessung ermittelt werden. Das Ergebnis ist daher entsprechend den Regeln der Fehlerrechnung mit der Unsicherheit beider Messungen belastet. Nach der erfindungsgemässen Methode wird die Fehleraddition dagegen vermieden und eine Direktmessung durchgeführt.

Ein Nachteil des Präzipitationsverfahrens ist auch, dass die Immun-Präzipitation als Sekundärreaktion verhältnismässig viel Zeit (ca. 60 Minuten bis mehrere Stunden) beansprucht, so dass sich das Verfahren nicht als Schnelltest eignet.

In Clin. Chim. Acta, Band 58, Seiten 223-232 (1975) wurden auch bereits hemmende Antikörper gegen CK-Isoenzyme beschrieben. Diese Antikörper bewirken neben einer 100%igen Hemmung von CK-MM auch eine 80%ige Hemmung von

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CK-MB. Über die M-Untereinheit von CK-MB hinaus wird also ein wesentlicher Anteil der B-Untereinheit von den verwendeten Antikörpern gehemmt. (Die Aktivitäten der Untereinheit M und B in CK-MB verhalten sich zur Gesamtaktivität dieses Isoenzyms jeweils wie etwa 50:100.) Selbst wenn die mit diesen Antikörpern gefundene Restaktivität von etwa 20% reproduzierbar wäre, so würden die erhaltenen Werte doch für eine präzise Messung von CK-MB zu niedrig liegen, um noch sicher erfassbar zu sein, da die CK-Gesamtaktivität im Serum an sich schon niedrig ist. Die in dieser Literaturstelle beschriebenen hemmenden Antikörper wurden entsprechend auch nicht für eine Bestimmung der CK-Isoenzyme nach dem Hemmprinzip angewendet. Nach dem Verfahren der Erfindung bleiben dagegen noch etwa 50% der CK-MB-Aktivität, d. h. etwa die gesamte Aktivität der Untereinheit B, für die Messung zugänglich. Das bedeutet einen erheblichen Fortschritt.

Die schnelle Durchführbarkeit ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens. Das gilt besonders für die bevorzugte Ausführungsform, nach der die Hemmung des M-Anteils von CK-MM und CK-MB sowie die Bestimmung der Restaktivität gleichzeitig durchgeführt werden. Nach dieser Ausführungsform kann in kürzester Zeit, z. B. innerhalb von 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise zwischen 5 und 15 Minuten, ein exaktes Testergebnis für die Diagnosestellung zur Verfügung stehen.

Ein beachtenswerter Vorteil des Verfahrens der Erfindung ist auch die einfache Durchführbarkeit. Die Testmethode kann in grösseren Instituten bzw. Kliniken (z. B. mit Hilfe von üblichen mechanisierten Geräten zur Bestimmung von Enzymaktivitäten) durchgeführt werden, ist aber auch in kleineren Instituten bzw. im Arztlabor mit Hilfe eines Photometers durchführbar.

Für Einzelbestimmungen eignen sich Testpackungen, die alle zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens notwendigen Reagenzien enthalten, so z. B. ein übliches Gemisch aus Coenzym, Enzym und Substrat, erfindungsgemässen CK-MM-Antikörpern und einer Puffer-Lösung. Eine Testpackung dieser oder ähnlicher Art ermöglicht die Bestimmung von CK-MB mit geringstmöglichem Aufwand.

Nach dem Stand der Technik war nicht zu erwarten, dass sich das Problem der CK-MB-Bestimmung mittels eines so einfachen und schnell arbeitenden Verfahrens wie dem erfindungsgemässen Verfahren lösen lässt. So war nicht vorauszusehen, dass spezifische Antiseren hergestellt werden können, welche zwar die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in CK-MM und -MB vollständig hemmen, aber die enzymatische Aktivität der Untereinheit B von CK-MB nicht beeinflussen. Der Einsatz von Antikörpern mit diesen bisher nicht bekannten Eigenschaften ermöglicht erst die erfindungsgemässe Reaktion.

Überraschend ist auch, dass die nach der Erfindung eingesetzten Antikörper auch in Gegenwart von Substraten ihre volle Hemmkraft beibehalten. Das ist nicht selbstverständlich. So wurden in der Literatur (Ann. N.Y. Acad. Sei., Band 103, Seiten 858-889 [1963]) Antikörper beschrieben, die in Gegenwart von CK-Substraten CK-MM nicht mehr zu 100% inaktivierten. Antikörper mit derartigen Eigenschaften wären für die bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens, nach denen Antikörperhemmung und Zusatz von CK-Substraten gleichzeitig erfolgen, völlig unbrauchbar. Die nicht gehemmten Anteile der M-Aktivitäten würden den Messwert von CK-MB fälschlicherweise erhöhen, eventuell gar nicht vorhandene CK-MB-Aktivitäten vortäuschen und auf diese Weise falsche Labordaten für die Diagnose liefern.

Die überraschende Eigenschaft der erfindungsgemäss eingesetzten Antikörper, die enzymatische Aktivität der Untereinheit M von CK-MM und -MB vollständig zu hemmen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B von CK-MB zu beeinflussen und zugleich in Gegenwart von Substraten ihre volle Hemmkraft gegenüber der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB zu entfalten, ermöglichen eine bisher mit immunologischen Methoden unerreichbare Schnelligkeit und Präzision der CK-MB-Aktivitäts-Bestimmung. Dadurch eröffnet sich für die Praxis ein Weg, die CK-MB-Aktivität mit einem Schnelltest zu bestimmen.

Es wird möglich, den Laborbefund einer Erhöhung der CK-Aktivität beim Patienten dahingehend zu differenzieren, ob eine Erkrankung bzw. Traumatisierung von Skelett- oder Herzmuskulatur vorliegt. Dadurch erhält man wichtige zusätzliche Daten für die Differentialdiagnose des Herzinfarkts (z. B. vom Lungeninfarkt und/oder von Schockfolgen) und anderer Erkrankungen bzw. Schädigungen des Herzens.

Darüber hinaus erhält man durch die spezifische und exakte Bestimmung der Aktivität von CK-MB Aussagen über die Beteiligung bzw. Schädigung des Herzmuskels bei anderen extracardialen Krankheitsprozessen (z. B. bei Vergiftungen oder Unfällen), bei therapeutischen Eingriffen (z. B. bei der Wiederbelebung) oder bei diagnostischen Eingriffen (z. B. bei Herzkatheterisierungen oder Coronar-Angiographien).

In den folgenden Beispielen bedeuten «M» (bzw. «mM») die Konzentrationen in Mol (bzw. Millimol) pro Liter.

Beispiel 1

Hemmung von CK-MM, CK-MB und CK-BB durch Anti-Human-CK-MM

Zu einem bezüglich seiner CK-Eigenaktivität inaktivierten Humanserum werden reine CK-MM, CK-MB oder CK-BB gegeben, und die CK-Aktivitäten der einzelnen Proben werden bestimmt. Anschliessend wird 0,1 ml Probe mit 0,1 ml Anti-CK-MM-Lösung (erhalten nach Beispiel Ba)) versetzt, es wird gemischt und 5 Minuten bei 25 °C inkubiert. Danach erfolgt eine Bestimmung der CK-Restaktivität auf bekannte Art. Die ,Ergebnisse zeigt folgende Tabelle:

Restaktivitäten von CK-Isoenzymen nach Inkubation mit inhibierendem Anti-Human-CK-MM (Mittelwerte ± 1 s aus jeweils ôfach-Bestimmungen) (s = Standardabweichung)

Tabelle

Isoenzym

Aktivität der zugesetzten Isoenzyme (U/1)

Restaktivität nach Inkubation mit Anti-CK-MM (U/1)

CK-MM

98 ± 1,9

0,3 ± 2,1

1043 ± 22

0,5 ± 2,5

CK-MB

103 ± 2,0

53 ± 1,7

410 ± 7,8

206 ± 6,2

CK-BB

197 ± 3,8

199 + 4,1

Innerhalb der Messgenauigkeit werden die Aktivitäten von CK-MM zu 100%, von CK-BB zu 0% und von CK-MB (entsprechend dem Anteil von 50% M-Untereinheiten) zu 50% gehemmt. Die Ergebnisse sind über einen weiten Aktivitätsbereich der zugesetzten Isoenzym-Aktivitäten konstant.

Beispiel 2

Test I zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von CK-MB in Körperflüssigkeiten a) Zusammensetzung der Testpackung

Die Testpackung ist ausreichend für 10 Aktivitätsbestimmungen. Die Packung enthält 1 Flasche Puffer für 10 Bestimmungen, 10 Flaschen Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch und 1

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Flasche Anti-CK-MM, erhalten nach Beispiel Ba). Die Flasche Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch enthält:

Creatinphosphat-Dinatriumsalz, Hexahydrat 27,24 mg

Glutathion reduziert 6,4 mg

(oder N-Acetyl-cystein 3,4 mg) Adenosindiphosphat-Dinatriumsalz, Hexahydrat 1,25 mg Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat,

Dinatriumsalz 1,7 mg

Adenosin-monophosphat, Dinatriumsalz 8,47 mg

Hexokinase 5 U

Glucose-6-phosphat-dehydrogenase 3 U

Glucose 8,32 mg

Magnesiumacetat 4,52 mg Die Flasche Puffer-Lösung enthält:

Triäthanolamin-acetat(in Wasser) 105 mM

Die lyophilisierten Antikörper werden mit 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die entstehende Antikörperlösung ist so eingestellt, dass bis zu 1000 U/1 Creatinkinase-MM total gehemmt werden. Bei Seren mit extrem hohen Gesamt-Crea-tinkinase-Aktivitäten muss das Serum deshalb auf ca. 1000 U/1 vorverdünnt werden. Die Antikörperlösung ist bei +4 °C min-detens 7 Tage haltbar.

b) Ausführung der Aktivitätsbestimmung der CK-MB bl) Ausführung

In ein Reaktionsgefäss pipettieren:

0,1 ml Serum +0,1 ml Antikörperlösung

Gut mischen, 5 Minuten bei 25° inkubieren. Danach werden 0,1 ml dieses Reaktionsgemisches sowie 2,0 ml Puffer-Lösung in eine Flasche mit dem Gemisch von Coenzym, Enzym und Substrat gegeben.

Mischen, 5 Minuten bei 25 °C inkubieren, danach in eine Küvette giessen, die Extinktion bei 25 °C messen und anschliessend die Extinktionsänderung pro Minute bestimmen. Wellenlänge: 334,340 oder 366 nm; Schichtdicke: 1 cm. b2) Berechnung

Die ermittelte CK-Aktivität der Probe muss a) mit dem Verdünnungsfaktor 2 und b) mit dem CK-MB-Hybridfaktor 2

(im Test werden nur die B-Untereinheiten von CK-MB gemessen) multipliziert werden.

Aus den Extinktionsdifferenzen pro Minute (A E/Minute) wird der Mittelwert gebildet und in die entsprechende Berechnungsformel eingesetzt:

Messung bei 334 nm:

Volumenaktivität-CK-MB = A E/Minute x 4 x 3500 U/1 Messung bei 340 nm:

Volumenaktivität-CK-MB = A E/Minute x 4 x 3376 U/1 Messung bei 366 nm:

Volumenaktivität-CK-MB = A E/Minute x 4 x 6364 U/1

Beispiel 3

Test II zur quantitativen Bestimmung der CK-MB-Aktivität in Körperflüssigkeiten a) Zusammensetzung der Testpackung

Die Testpackung ist ausreichend für 30 Aktivitätsbestimmungen. Die Packung enthält 1 Flasche Puffer-Lösung für 30 Bestimmungen und 30 Flaschen eines lyophilisierten Gemisches bestehend aus Coenzym, Enzym, Substrat und Anti-CK-MM nach Beispiel Ba).

Die in der Flasche Puffer-Lösung enthaltene Menge Tri-äthanolaminacetat entspricht der im Beispiel 2a) angegebenen Menge. Die einzelnen Flaschen mit dem Gemisch aus Coenzym, Enzym, Substrat und Anti-CK-MM nach Beispiel Ba) entsprechen bezüglich der drei zuerstgenannten Komponenten ebenfalls der in Beispiel 2a) angegebenen Zusammensetzung und enthalten zusätzlich Anti-CK-MM, das bis zu 1000 U/1 CK-MM total hemmt.

b) Bestimmung der Aktivität von CK-MB bl) Ausführung

Zum Inhalt einer Flasche Coenzym/Enzym/Substrat/Anti-CK-MM-Gemisch werden 2,0 ml Puffer-Lösung und 0,1 ml Serum pipettiert. Mischen, 5 Minuten bei 25 °C inkubieren, dann in eine Küvette giessen und über 5 Minuten die Extinktionen bei 25 °C messen. Wellenlänge: 334,340 oder 366 nm; Schichtdicke: 1 cm.

b2) Berechnung

Messung bei 334 nm:

Volumenaktivität CK-MB = A E/Minute x 7000 U/1 Messung bei 340 nm:

Volumenaktivität CK-MB = A E/Minute x 6752 U/1 Messung bei 366 nm:

Volumenaktivität CK-MB = A E/Minute x 12728 U/1

Beispiel 4

Simultanbestimmung der CK-Gesamtaktivität und der CK-MB-Aktivität a) Zusammensetzung der Testpackung

Die Zusammensetzung der Testpackung entspricht derjenigen von Beispiel 2a).

b) Bestimmung der CK-Gesamtaktivität und der CK-MB-Aktivität von CK-MB

bl) Ausführung

In die Flasche Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch werden 2,0 ml Puffer-Lösung und 0,1 ml Serum bzw. Serumverdünnung pipettiert. Mischen, 5 Minuten bei 25 °C inkubieren, danach in eine Küvette giessen und über 2 Minuten die Extinktionsänderung (A El) bei 25 °C bestimmen. Anschliessend wird 0,1 ml Antikörperlösung zugefügt, sofort gemischt und nach 3 Minuten erneut die Extinktionsänderung (A E2) bei 25 °C bestimmt. Wellenlänge: 334,340 oder 366 nm; Schichtdicke: 1 cm. b2) Berechnung

Die CK-Gesamtaktivität errechnet sich wie folgt:

Messung bei 334 nm:

Volumenaktivität CK-Gesamt = A El/Minute x 3500 U/1 Messung bei 340 nm:

Volumenaktivität CK-Gesamt = A El/Minute x 3376 U/1 Messung bei 366 nm:

Volumenaktivität CK-Gesamt = A El/Minute x 6364 U/I

Die CK-MB-Aktivität ergibt sich nachfolgenden Berechnungsformeln:

Messung bei 334 nm:

Volumenaktivität CK-MB = A E2/Minute x 7350 U/1 Messung bei 340 nm:

Volumenaktivität CK-MB = A E2/Minute x 7090 U/1 Messung bei 366 nm:

Volumenaktivität CK-MB = A E2/Minute x 13364 U/1

Beispiel 5

Bestimmung von CK-MB-Aktivitäten bei Patienten mit und ohne Herzinfarkt mit Testpackung nach Beispiel 3

a) CK-Aktivitäten verschiedener Patientenkollektive

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10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

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Fallzahl Mittelwerte

Gesamt-CK CK-MB (U/1) (U/1)

Patienten mit erhöhten CK-Aktivitäten ohne Herzinfarkte 48 480 < 1,7

Patienten mit Herzinfarkten 5 510 44

Die Tabelle zeigt, dass mit Hilfe der erfindungsgemässen Bestimmungsmethode schnell und eindeutig ein Hinweis auf einen Herzinfarkt erhalten werden kann.

b) Verlauf der CK-MB-Aktivitäten bei einem Patienten mit Herzinfarkt

Stunden nach Infarkteintritt

CK-MB (U/1)

3,5

<5

4,5

<5

5,5

6

7,5

22

8,5

23

9,5

29

10,5

50

11,5

46

13,5

56

15,5

55

17,5

64

21,5

62

25,5

50

29,5

42

33,5

25

43,5

18

53,5

<5

61,5

<5

Die Zahlenwerte zeigen den nach dem erfindungsgemässen Verfahren bestimmten Anstieg und Wiederabfall der CK-MB-Aktivität bei einem Herzinfarkt-Patienten.

Herstellung der Ausgangsmaterialien Beispiel A

Herstellung von CK-MM

a) 1,2 kg tiefgefrorener, menschlicher Skelettmuskel werden bei Raumtemperatur aufgetaut und maschinell zerkleinert. Das Gewebe wird in 2,51 kaltem 0,05 M Tris/HCl-Puffer pH 8,0 [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffer], der 0,01 M KCl, 1 mM EDTA [Äthylendiamintetraessigsäure] und 1 mM Dithioerythrit enthält, suspendiert und mit einem Mixer homogenisiert. Das Homogenat wird unter Eiskühlung 45 Minuten gerührt und anschliessend 60 Minuten bei 12000 g zentrifugiert. Der klare Überstand (2,6801) wird einer Ammoniumsuifat-Frak-tionierung bei pH 8,0 in den Grenzen 40-75% Sättigung unterworfen. Der 0,75-s-Niederschlag wird in 0,04 M Tris/HCl-Puffer pH 8,0 aufgenommen und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Zur Adsorption von Myoglobin und sauren Ballastproteinen werden 500 g feuchter basischer Ionenaustauscher auf Basis eines vernetzten Dextrans, äquilibriert gegen den gleichen Puffer, zugesetzt. Nach 30 Minuten wird der Austauscher abgesaugt und zweimal mit je 400 ml 0,04 M Tris/HCl-Puffer pH 8,0, enthaltend 0,02 M NaCl, ausgewaschen. Filtrat und Waschwas-ser werden vereinigt und mit Ammoniumsulfat auf 0,75 s gebracht. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, in 100 ml 0,04 M Tris/HCl-Puffer pH 8,0 gelöst und gegen den selben Puffer dialysiert, bis kein Ammoniumsulfat mehr nachweisbar ist. Das klare Dialysat wird auf einer Säule mit einem basischen Ionenaustauscher auf Basis eines vernetzten Dextrans (6 x 60 cm) mit dem gleichen Puffer äquilibriert. Die Säule wird mit Startpuffer solange gewaschen, bis das Eluat proteinfrei ist. Danach wird das Enzym mit 0,04 M Tris/HCl-Puffer pH 8,0, enthaltend 0,02 M NaCl, 1 mM EDTA uind 1 mM Dithioerythrit, von der Säule eluiert. Fraktionen mit einem Enzymgehalt von mindestens 20 U/ml werden vereinigt, mit Ammoniumsulfat auf 80% gesättigt, und das präzipitierte Enzym wird abzentrifugiert. Zur Endreinigung wird es nochmals einer Chromatographie im selben System unterworfen, jedoch unter Verwendung eines kleineren Säulenvolumens. Aus den vereinigten aktiven Fraktionen wird das Enzym mit 0,8 s Ammoniumsulfat gefällt, in 50 ml 0,04 M Tris/HCl-Puffer pH 8,0, enthaltend 0,02 M NaCl, 1 mM EDTA und 1 mM Dithioerythrit, konzentriert gelöst, steril-fil-triert und wieder mit Ammoniumsulfat auf 0,8 s gebracht. Man erhält so eine bei 4 °C stabile Enzymsuspension von CK-MM mit einer spezifischen Aktivität von 26-30 U/mg, gemessen mit Creatin als Substrat bei 25 °C.

Volumen: 86 ml; Aktivität: 316 U/ml; Protein: 11,8 mg/ml. Ausbeute: ca. 30% (bezogen auf den Organextrakt).

b) Analog Beispiel Aa) wird CK-MM aus Muskelgewebe folgender Tiere isoliert: Rhesusaffe, Schwein, Rind.

Beispiel B

Herstellung von Anti-CK-MM

a) CK-MM aus Humanmuskel wird gegen eine mit 0,07 M Triäthanolamin gepufferte, physiologische NaCl-Lösung pH 7,0, die 10 mM Mercaptoäthanol und 10 mM MgCh enthält, dialysiert. Die Enzymlösung wird durch Ultrazentrifugation von Aggregaten befreit und der Proteingehalt mit dem genannten Dialysepuffer auf 2 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird mit 1 ml komplettem Freundschen Adjuvans ( Wasser-Mineral-ölsuspension, die zusätzlich noch 2 mg abgetötete M-Tubercu-losebazillen enthält) emulgiert. Diese Emulsion wird einer Ziege intramuskulär injiziert. Nach 3 Injektionen gleicher Art im Abstand von 3 Wochen und 3 weiteren Boosterinjektionen jeweils im Abstand von 16 Wochen wird dem Tier 21 Tage nach der letzten Injektion Blut entnommen. Das nach bekannten Methoden gewonnene Serum wird mit einer Mischung, enthaltend 3% Schaf-Serumalbumin und 0,1% Natriumazid in einem 0,1 M Boratpuffer, auf pH 8,4 eingestellt und sterilfiltriert. Die erhaltene Lösung, enthaltend Anti-Humanmuskel-CK-MM, wird in 0,5-mI-Portionen in braune Glasflaschen abgefüllt und gefriergetrocknet. Die Antikörper besitzen ein Mol-kulargewicht von etwa 160 000 bis 180 000.

b) Die nach Beispiel Aa) erhaltene CK-MM aus Humanmuskel wird gegen eine mit 0,1 M Imidazol gepufferte, physiologische NaCl-Lösung pH 6,8, die 7,5 mM N-Acetylcystein und 25 mM Magnesiumacetat enthält, dialysiert. Anschliessend wird die Enzymlösung durch Ultrazentrifugation von Aggregaten befreit und der Proteingehalt mit dem genannten Dialysepuffer auf 0,2 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird mit 1 ml komplettem Freundschen Adjuvans emulgiert. Diese Emulsion wird einem Hammel intradermal injiziert. Nach 3 und 6 Wochen folgen 2 intramuskuläre Injektionen und 3 weitere Boosterinjektionen, jeweils im Abstand von 14 Wochen. 19 Tage nach der letzten Injektion wird Blut entnommen. Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel Ba). Man erhält Anti-Humanmuskel-CK-MM in gefriergetrockneter Form. Molekulargewicht der Antikörper etwa 160 000 bis 180 000.

c) CK-MM aus Rhesusaffenmuskel wird gründlich gegen eine mit 0,15 M Imidazol gepufferte, physiologische NaCl-Lösung pH 6,8, die 25 mM Dithioerythrit und 15 mM Man-gan(II)-chlorid enthält, dialysiert. Nach Entfernung der Aggre-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

628144

gate durch Ultrazentrifugation wird der Proteingehalt mit dem genannten Dialysepuffer auf 5 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird mit 1 ml komplettem Freundschen Adjuvans emulgiert. Injektionen, Blutentnahme und Aufarbeitung erfolgen analog Beispiel Ba). Man erhält Anti-Rhesusaffenmuskel-CK-MM in gefriergetrockneter Form. Sedimentationskonstante der Antikörper etwa 7 S.

d) CK-MM aus Schweinemuskel wird analog Beispiel Bb) aktiviert und die Antigen-Emulsion mit komplettem Freundschen Adjuvans Kaninchen injiziert. Nach 3 Wochen erfolgt

8

eine weitere subcutane Antigeninjektion. Die Injektion wird nach weiteren 3 Wochen wiederholt, 19 Tage danach wird Blut entnommen. Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel Ba). Man erhält Anti-Schweinemuskel-CK-MM in gefriergetrockneter 5 Form. Molekulargewicht der Antikörper etwa 160 000 bis 180 000.

In völlig analoger Weise wird aus Rindermuskel Anti-Rin-dermuskel-CK-MM gewonnen (Molekulargewicht etwa io 160 000 bis 180 000).

Claims

628144 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Creatinki-nase-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit Antikörpern inkubiert, die die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in den Crea-tinkinase-Isoenzymen-MM und -MB vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener Creatinkinase-MB zu inaktivieren, und die Aktivität der Creatinkinase-Untereinheit B photometrisch bestimmt.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe der Körperflüssigkeit und die Antikörper in Gegenwart von Creatinkinase-Substraten inkubiert.

3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man vor der Inkubation der Probe mit den Antikörpern in der gleichen Probe zusätzlich die CK-Gesamtaktivität bestimmt.

4. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es Antikörper enthält, die die enzymatische Aktivität der Untereinheit M in den Crea-tinkinasen-MM und -MB vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener Creatinkinase-MB zu inaktivieren.

5. Mittel nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es Antikörper enthält, die auch in Gegenwart von Creatinkinase-Substraten eine vollständige Hemmung zu entfalten vermögen.

6. Mittel nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Ziegen gewonnene Antikörper enthält.

7. Mittel nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es Antikörper enthält, die in der Probe bis zu 2500 U/1 der Untereinheit M in den Creatinkinasen-MM und -MB vollständig zu hemmen vermögen.

8. Anwendung des Verfahrens nach Patentanspruch 1 zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB neben Crea-tinkinase-MM.

9. Anwendung nach Patentanspruch 8 zur Simultanbestimmung der Creatinkinase-Gesamtaktivität und der Creatinki-nase-MB-Aktivität in einer Probe.

10. Anwendung nach Patentanspruch 8 zur Diagnose des Myokardinfarkts.