DK151920B - Middel og fremgangsmaade til bestemmelse af creatinkinase-mb samt anvendelse af midlet - Google Patents

Description

/ DK 151920 B

Den foreliggende opfindelse angår et middel og en fremgangsmåde til bestemmelse af aktiviteten af creatinkinase-MB i menneskelige legemsvæsker samt anvendelse af midlet.

Bestemmelsen af aktiviteten af creatinkinase (ATP: creatin-phospho-transferase, E.C. 2.7.3.2? forkortelse: CK) i serum anses for at være den mest følsomme laboratoriemetode ved diagnostikken af sygdomme i skelet- og hjertemuskulaturen, specielt ved myokardinfarkt. Distinktion mellem traumatiseringer i skelet- og hjertemuskulaturen, specielt ved differentialdiagnosen af myokardinfarkt, er imidlertid vanskelig. Ved bestemmelse af CK-totalaktiviteten kan en differentiering ikke opnås med sikkerhed. Det er derfor blevet forsøgt at forbedre CK-aktivitetsbestemmelsens differentialdiagnostiske værdi

2 DK 151920 B

ved, at man måler aktiviteten af andre enzymer i serum og korrelerer måleresultaterne med hinanden, f.eks. ved dannelse af kvotienten CK/glutamat-oxalacetat-transaminase. Kvotienter af denne art muliggør imidlertid ikke en anvendelse ved differentieringen mellem hjerte- og lungeinfarkt eller mellem hjerteinfarkt og shock-følger af andre årsager.

CK forekommer i legemet i form af tre isoenzymer, nemlig CK-MM, f.eks. i muskler, CK-BB, f.eks. i hjernen, og som hybrid CK-MB (bestående af én underenhed M og én underenhed B), f.eks. i hjertemusklen. Den i blodet (serum) optrædende CK-aktivitet kan normalt føres tilbage til isoenzymet CK-MM, da CK-BB ikke trænger igennem væske-blodbarrieren , og CK-MB er begrænset til bestemte organer (f.eks. hjertemusklen).

Ved beskadigelser af hjertemusklen (f.eks. ved hjerteinfarkt) frigøres CK-MB imidlertid i blodet (serum) og kan påvises dér.

Den kvantitative bestemmelse af dette isoenzym ved siden af CK-MM i serum anses for den mest følsomme og differentialdiagnostisk værdifuldeste laboratoriemetode til påvisning af hjerteinfarkt. Ganske vist indeholder foruden hjertemusklen også nogle andre organer CK-MB (f.eks. pankreas, mellemgulv, aorta, lunge og uterus), men aktiviteten i disse organer er med en faktor 100 ringere end i hjertemusklen, således at CK-MB-aktiviteter, der eventuelt frigøres fra de nævnte organer, ligger under påvisningsgrænsen.

De hidtil sædvanlige aktivitetsbestemmelser af CK-MB gik i det væsentlige tilbage til tre metoder: 1. Elektroforese på forskellige bærere. De herned opnåede resultater er undertiden modstridende; ofte optræder der flere bånd, end der er isoenzymer til stede (artefakts).

2. Chromatografi på forskellige søjlematerialer. Denne metode er langsommelig (flere timers effektiv arbejdstid) og ikke egnet til rutineundersøgelser. Resultaterne af forskellige undersøgelser er delvis modstridende.

3. Immunologisk bestemmelse med præcipiterende antistoffer. Denne metode er beskrevet i tyske patentansøgninger nr. DE-OS 21 28 670 og

3 DK 151920 B

DE-OS 22 58 822 og giver f.eks. ved kvantificering af isoenzymerne af aldolase og alkalisk phosphatase gode resultater. Til bestemmelse af relativt ringe aktiviteter af CK og især CK-MB er metodens følsomhed imidlertid ikke tilstrækkelig.

Alle disse metoder kræver desuden til deres gennemførelse et større tidsopbud og er derfor ikke egnet til anvendelse ved hurtigdiagnosen af hjerteinfarkt.!

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes et effektivt middel og en simpel, reproducerbar og hurtig gennemførlig fremgangsmåde til bestemmelse af aktiviteten af CK-MB i en prøve af en legemsvæske.

Dette opnås ved, at der arbejdes med specifikke antistoffer, der fuldstændigt hæmmer den enzymatiske aktivitet af underenhed M i CK-MM og CK-MB uden at inaktivere den enzymatiske aktivitet af underenhed B i eventuelt tilstedeværende CK-MB.

Opfindelsen angår derfor et middel til bestemmelse af aktiviteten af CK-MB i en prøve af en legemsvæske, hvilket middel er ejendommeligt ved, at det indeholder creatinkinase-M-antistoffer med en molekylvægt på 130.000-210.000, som er i stand til fuldstændigt at hæmme den enzymatiske aktivitet af underenheden M i creatinkina-serne-MM og -MB uden at inaktivere den enzymatiske aktivitet af underenhed B i eventuelt tilstedeværende CK-MB. En foretrukken udførelsesform for dette middel er ejendommelig ved, at de deri indeholdte antistoffer er i stand til fuldstændigt at hæmme op til 2.500 U/liter af underenhed M i CK-MM og CK-MB i den prøve, der skal bestemmes.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til bestemmelse af aktiviteten af CK-MB i en prøve af en legemsvæske, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at prøven eventuelt i nærværelse af CK-substra-ter inkuberes med creatinkinase-M-antistoffer med en molekylvægt på 130.000-210.000, som er i stand til fuldstændigt at hæmme den enzymatiske aktivitet af underenhed M i CK-isoenzymerne MM og MB, uden at inaktivere den enzymatiske aktivitet af underenhed B i eventuelt tilstedeværende CK-MB, og at man på i og for sig kendt måde fotometrisk bestemmer aktiviteten af CK-underenhed B.

4 DK 151920 B

Opfindelsen angår endvidere anvendelsen af antistoffer, som er i stand til fuldstændigt at hæmme den enzymatiske aktivitet af underenheden M i creatinkinaserne-MM og -MB uden at inaktivere den enzymatiske aktivitet af underenhed B i eventuelt tilstedeværende CK-MB til bestemmelse af aktiviteten af CK-MB ved siden af CK-MM og især som hjælpemiddel til diagnose af myokardinfarkt og/eller andre sygdomme eller beskadigelser af hjertemusklen. Endvidere angår opfindelsen anvendelsen af disse antistoffer til simultan-bestemmelse af CK-totalaktiviteten og CK-MB-aktiviteten i en prøve.

Som legemsvæske egner sig til fremgangsmåden ifølge opfindelsen først og fremmest humant serum. Man kan imidlertid også anvende andre legemsvæsker såsom helblod, plasma, urin, spyt og sved fra mennesker, men også analogt undersøgelsesmateriale fra dyr til den pågældende bestemmelse. CK-BB forstyrrer udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen og må derfor ikke være til stede i de legemsvæsker, der skal testes.

De til fremgangsmåden ifølge opfindelsen nødvendige antistoffer fremstilles ved vaccination af dyr med CK-MM-antigener. Som antigen anvendes her fortrinsvis humant CK-MM. Det er imidlertid også muligt at anvende CK-MM fra dyr, når de dermed fremstillede antisera er i stand til fuldstændigt at hæmme den enzymatiske aktivitet af underenhed M i menneskeligt CK-MM og CK-MB, eventuelt også i nærværelse af CK-substrater, uden at inaktivere den enzymatiske aktivitet af underenhed B i eventuelt tilstedeværende CK-MB. Dyriske leverandører af CK-MM-antigener er først og fremmest de forskellige abearter, fortrinsvis Rhesusaber og chimpanser, endvidere husdyr såsom svin, heste, okser, kaniner, marsvin og andre dyr såsom rotter, mus og fugle såsom gæs, ænder og høns.

Det til fremstilling af antistofferne anvendte CK-MM-antigen skal være frit for aktiviteterne af CK-MB og CK-BB. Et følsomt kriterium for dette renhedskrav er den immunologiske analyse, som med fordel udføres ved diffusions- eller elektroforeseteknik. Desuden er f.eks. metoder som den analytiske disc-elektroforese og polyacrylamidgel-elek-trofokusering nyttige. Ved anvendelse af disse metoder kommer påvisningen af renheden over for CK-MB og CK-BB i første række. Derimod er den absolutte renhed over for andre proteiner, der f.eks. kan konstateres ved de to sidstnævnte metoder, mindre vigtig. Mikro-

s DK 151920 B

-I

ringe forskelle mellem de enkelte isoenzymers aminosyresammensætning, spiller i reglen ingen rolle som renhedskriterium.

Til immuniseringen anvendes sådanne dyr, som efter vaccination med aktiveret CK-MM danner antistoffer, som er i stand til fuldstændigt at hæmme den enzymatiske aktivitet af underenhed M i creatin-kinaserne MM og MB uden at inaktivere den enzymatiske aktivitet i underenhed B i eventuelt tilstedeværende CK-MB. Fortrinsvis egner sig hertil geder. Der kan imidlertid også komme andre dyr, især hvirveldyr, i betragtning som antistofdannere, f.eks. abearter, heste, okser og okselignende dyr, får, hunde, svin, kaniner, fugle såsom høns, kalkuner, gæs og ænder, samt rotter, mus og marsvin.

Geder anvendes især til induktion af sådanne antistoffer, som -også i nærværelse af CK-substrater - er i stand til at udøve en fuldstændig haamning af M-underenheden i CK-MM og CK-MB.

Immuniseringen af forsøgsdyrene udføres.med aktiveret menneskelig eller dyrisk CK-MM. Aktiveringen af CK-MM kan ske ved hjælp af kendte SH-gruppe-stabiliserende og -aktiverende reagenser og/eller ved hjælp af divalente metalioner, fortrinsvis med en kombination af de nævnte reagenser og metalionerne. Som SH-gruppe-stabiliserende og -aktiverende reagenser anvendes fortrinsvis f.eks. N-acetyl-cystein, mercaptoethanol og dithioerythrit samt glutathion, cys-tein, dithiothreit, S-(2-aminoethyl)-isothiouroniumbromid-hydro-bromid (AET) og/eller thioglycolsyre. De divalente metalioner stammer fra tilsvarende vandopløselige salte (f.eks. chloriderne eller acetaterne) fortrinsvis af magnesium, samt af mangan, calcium og/eller cobalt. Sådanne aktiveringer er i princippet kendte på andre områder og er rutinemæssige for fagmanden.

Den videre udførelse af immuniseringen og oparbejdningen til opnåelse af antisera eller antistoffer sker på kendt måde. Også forarbejdningen og opbevaringen af antisera eller antistoffer sker efter metoder, der er kendte inden for immunologien.

De antistoffer, der skal anvendes til fremgangsmåden ifølge opfindelsen, henregnes fortrinsvis til IgG-immunoglobulinklassen (bivalente antistoffer). Deres molekylvægt ligger mellem ca. 130.000 og 210.000, fortrinsvis ved ca. 160.000f deres omtrentlige sedimenta-tionskonétant ligger mellem 6 S og 8 S, fortrinsvis ved ca. 7 S; deres carbonhydratandel er ca. 3% af deres samlede vægt. Foruden « DK 15192 Ο Β

IgG- antis tof ferne kan også monovalente IgG-fragmenter (=Ρ3^) og IgM-antistoffer anvendes ifølge opfindelsen.

De ifølge opfindelsen anvendte antistoffer skal fuldstændigt hæmme enzymaktiviteten af M-underenheden af creatinkinase. Med "fuldstændig hæmning" menes her en hæmning, ved hvilken der i gennemsnit højst bibeholdes 5 U/liter, fortrinsvis mindre end 3 U/liter, af enzymaktiviteten af underenhed M i CK-MM og CK-MB i en prøve.

Antistofferne må endvidere ikke påvirke den enzymatiske aktivitet af B-underenheden i CK-MB. Dermed forstås, at højst 10 U/liter, fortrinsvis mindre end 5 U/liter, af. enzymaktiviteten af underenhed B i CK-MB i en prøve hæmmes.

Til udførelse'af en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som består i, at den prøve af legemsvæsken, der skal bestemmes, og antistofferne inkuberes i nærværelse af CK-substrater, skal antistofferne endvidere have den egenskab, at de også i nærværelse af CK-substrater er i stand til fuldstændigt at udfolde deres hæmmende virkning over for den enzymatiske aktivitet af underenhed M i CK-MM og CK-MB, uden at de påvirker den enzymatiske aktivitet af underenhed B i eventuelt tilstedeværende CK-MB. Denne egenskab er f.eks. hos antistoffer, der er vundet fra geder ved immunisering med fuldaktiveret CK-MM, til stede udover de ovenfor anførte egenskaber. Denne egenskab er ikke ubetinget nødvendig til den normale udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen (først inkubation med antistofferne, derefter tilsætning af CK-substraterne og fotometrisk måling).

Som CK-substrater kan anvendes alle sædvanligvis anvendte substrater eller effektorer. I den foreliggende sammenhæng er først og fremmest creatin, creatinphosphat, adenosindiphosphat, adenosin-triphosphat og magnesiumioner af betydning.

Bestemmelsen af aktiviteten eller restaktiviteten af CK og dets isoenzymer kan i princippet ske efter alle sådanne fremgangsmåder, som arbejder hurtigt og præcist. Egnede er f.eks. kendte frem- 1 gangsmåder, som gør det muligt efter tilsætning af CK-substrater at måle CK-aktiviteten ved hjælp af en efter hjælpereaktioner følgende

7 DK 151920B

fotometrisk bestemmelse. Hertil kan anvendes colorimetriske metoder, f.eks. sådanne, som er beskrevet i "Methoden der enzyma-tischen Analyse1', udgivet af H.U. Bergmeyer, 3. oplag (1974), bind 1, side 145 ff. Der foretrækkes imidlertid kinetiske metoder, ved hvilke enzymaktiviteten bestemmes ved måling i UV-området ved f.eks. 334, 340 eller 366 nm. Der anvendes især f.eks. en standardmetode, ved hvilken CK bestemmes under anvendelse af creatinphosphat og adenosindiphosphat (Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., bind 8, side 658 ff. (1970) og bind 10, side 182 (1972)). Testpakninger til bestemmelse af CK-aktiviteten efter idenne metode findes i handelen.

Ved en anden kendt bestemmelsesmetode kan CK også bestemmes fluori-metrisk. Med CK kan der fra creatinphosphat frigøres creatin, som efter den af R.B. Conn (Clin. Chem., bind 6, side 537 f (1960)) udarbejdede fremgangsmåde kan måles fluorimetrisk ved omsætning med ninhydrin i kraftigt alkalisk opløsning (jfr. Sax et al., Clin.

Chem., bind 11, side 951 f (1965)).

En typisk udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er som følger:

Den prøve af en legemsvæske, der skal bestemmes, fortrinsvis en prøve af humant serum, tilsættes en sådan mængde CK-MM-antistoffer, som er tilstrækkelig til fuldstændigt at hæmme op til 2.500 U/liter af underenhed M i CK-MM og CK-MB, fortrinsvis ca. 1000 U/liter.

Ved legemsvæsker med højere total-CK-aktiviteter foretages der hensigtsmæssigt før den egentlige bestemmelse en for-fortynding til ca. 1000 U/liter. Ved beregningen skal der tages hensyn til denne for-fortynding. Der blandes og inkuberes i 1 - 30, fortrinsvis ca.

5, minutter, ved temperaturer mellem +10 og +40°C, fortrinsvis omtrentlig ved stuetemperatur, specielt ved 25 eller 30°C. Derefter bestemmes den tilbageværende enzymaktivitet i reaktionsblandingen ved hjælp af en kendt fremgangsmåde, fortrinsvis ved den ovenfor beskrevne UV-metode. Serum-antistof-blandingen sættes til en kendt enzym-coenzym-substrat-blanding, som indeholder alle til udførelse af metoden nødvendige enzymer, coenzymer og substrater, hvorefter der tilsættes en tilstrækkelig mængde af en pufferopløsning (pH-værdi ca. 7). Sædvanlige handelspræparater indeholder f.eks. som enzym/ coenzym-blanding hexokinase, glucose-6-phosphat-dehydrogenase,

8 DK 151920B

adenosindiphosphat og nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat og som substrater creatinphosphat og glucose.

Det er også muligt at sætte serum-antistof-blandingen til en blanding af coenzym og enzym (eller omvendt) og derefter tilsætte en puffer-substratblanding. Som puffer egner sig til omsætningen neutrale puffere, f.eks. fortrinsvis triethanolamin- eller imida-zolacetatpuffer, endvidere bl.a. morpholinpropansulfonsyre- og morpholinethansulfonsyre-puffer. Der blandes, inkuberes i 1 -10, fortrinsvis 5 minutter, ved 15 - 40, fortrinsvis ved 25 eller 30°C, hvorpå der omtrentlig ved stuetemperatur foretages en bestemmelse af ændringen i extinktion. Heraf beregnes derefter aktiviteten af underenhed B i CK-MB.

Ved en foretrukken udførelsesform kan denne fremgangsmåde modificeres således, at prøven af den legemsvæske, der skal analyseres, inkuberes sammen med antistofferne og CK-substraterne i nærværelse af en puffer og de til påvisningsreaktionen nødvendige stoffer (uden forinkubation af prøven med antistofferne). Til denne udførelsesform er en yderligere egenskab hos antistofferne en forudsætning: de skal også i nærværelse af CK-substrater fuldstændigt hæmme den enzymatiske aktivitet af underenhed M i CK-MM og -MB. Denne egenskab har f.eks. antistoffer, som er vundet ud fra geder efter vaccination med fuldstændigt aktiveret CK-MM. Disse antistoffer gør det muligt at udføre fremgangsmåden ifølge opfindelsen på en simpel og hurtig måde: Således kan man f.eks. opløse antistofferne, som i forvejen er blevet bragt i en lyofiliseret form sammen med den kendte, til påvisningsreaktionen anvendte coenzym-enzym-substrat-blanding, i en bestemt mængde af en pufferopløsning, tilsætte den legemsvæske, der skal bestemmes (f.eks. serum), og udføre aktivitetsbestemmelsen for B-andelen af CK-MB. Ved en variant af denne fremgangsmåde kan man også indarbejde antistofferne i lyofilisatet sammen med en blanding bestående alene af coenzymer og enzymer og tilsætte substraterne til pufferopløsningen.

Efter en yderligere foretrukken udførelsesform kan en simultanbestemmelse af CK-totalaktiviteten og CK-MB-aktiviteten udføres i

9 DK 151920 B

en enkelt blanding under anvendelse af den umiddelbart ovenfor beskrevne foretrukne udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Man kan f.eks. gå frem på den måde, at man først bestemmer CK-totalaktiviteten i prøven efter en kendt fotometrisk fremgangsmådej derefter sætter man til samme blanding et i vand opløst lyofilisat bestående af CK-MM-antistoffer. Derpå inkuberer man i 1 -10, fortrinsvis 5, minutter og bestemmer prøvens restaktivitet fotometrisk. Også til denne udførelsesform er det en forudsætning, at antistofferne mod CK-MM er i stand til fuldstændigt at hæmme den enzymatiske aktivitet af underenhed M i CK-MM og -MB i nærværelse af CK-substrater.

Antiseraenes antistofkapacitet kan ved disse foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen indstilles således, at de er i stand til fuldstændigt at hæmme op til 2500 U/liter, fortrinsvis ca. 1000 U/liter, af underenhed M i CK-MM og CK-MB.

Hvis CK-totalaktiviteterne i den prøve, der skal bestemmes, er for høje til disse hæmningskapaciteter for antistofferne, skal der også her foretages for-fortyndinger, f.eks. til aktiviteter af underenhed M i CK-MM og -MB på ca. 1000 U/liter.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen har væsentlige fordele i forhold til teknikkens standpunkt. Til disse fordele hører resultaternes høje præcision og udførelsens hurtighed og simpelhed.

Den her omhandlede fremgangsmådes præcision skyldes, at de anvendte antistoffer specifikt virker på M-underenheden i CK-MM og CK-MB og derfor gør det muligt at bestemme CK-MB-aktiviteten i legemsvæsker, f.eks. humant serum, ved en direkte bestemmelse.

I forhold hertil er den i tyske patentansøgninger nr. DE-OS 21 28670 og DE-OS 22 58 822 beskrevne immunologiske fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af isoenzymer behæftet med ulemper. Ved denne fremgangsmåde præcipiterer man CK's isoenzymer med isoenzymspecifikke, præ-cipiterende antistoffer og bestemmer hver gang den i immunpræcipi-tationens overstand tilbageværende restaktivitet. Bortset fra ar-bejdsopbudet ved denne metode, som i reglen gør det nødvendigt at fremstille flere specifikke antisera, skal der i hvert enkelt

10 DK 151920B

tilfælde udføres mindst to forskellige forsøg, nemlig bestemmelsen af CK-totalaktiviteten og bestemmelsen af CK-restaktiviteten efter præcipitationen. CK-MB-aktiviteten kan altså først konstateres ved en differensmåling. Resultatet er derfor i overensstemmelse med reglerne for fejlberegning belastet med begge målingers usikkerhed. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen undgås derimod en fejladdition, og der udføres en direkte måling.

En ulempe ved præcipitationsmetoden er også, at immunpræcipitatio-nen som sekundær reaktion tager relativt megen tid (ca. 60 minutter til flere timer), således at fremgangsmåden ikke egner sig som hurtigtest.

I Clin. Chim. Acta, bind 58, side 223 - 232 (1975) er også allerede beskrevet hæmmende antistoffer mod CK-isoenzymer. Disse antistoffer bevirker foruden en 100%'s haamning af CK-MM også en 80%'s hæmning af CK-MB.. Ud over M-underenheden i CK-MB hæmmes altså en væsentlig andel af B-underenheden af de anvendte antistoffer (aktiviteten af hver af underenhederne M og B i CK-MB forholder sig til dette iso-enzyms totalaktivitet som ca. 50:100). Selv hvis den med disse antistoffer fundne restaktivitet på ca. 20% var reproducerbar, ville de resulterende værdier alligevel være for lave til en præcis, stadig sikkert indicerende, måling af CK-MB, da CK-totalaktiviteten i serum i sig selv allerede er lav. De i dette litteratursted beskrevne hæmmende antistoffer er da heller ikke anvendt til en bestemmelse af CK-isoenzymerne efter hæmningsprincippet. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen forbliver derimod stadig ca. 50% af CK-MB-aktiviteten, dvs. ca. den samlede aktivitet af underenhed B, tilgængelig for målingen. Dette betyder et væsentligt fremskridt.

En hurtig gennemførlighed er en særlig fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Dette gælder især for den foretrukne udførelsesform, ved hvilken hæmningen af M-andelen af CK-MM og CK-MB samt bestemmelsen af restaktiviteten udføres samtidig. Efter denne udførelsesform kan der på meget kort tid, f.eks. i løbet af 5 - 30 minutter, fortrinsvis mellem 5 og 15 minutter, stå et nøjagtigt testresultat til rådighed til stilling af diagnosen.

u DK 151920 Β

En betragtelig fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er også dens simple gennemførlighed. Testmetoden kan udføres i større institutter eller klinikker (f.eks. ved hjælp af sædvanlige mekaniserede apparater til bestemmelse af enzymaktiviteter), men den kan også udføres i mindre institutter eller i et lægelaboratorium ved hjælp af et fotometer.

Til enkeltbestemmelser egner sig testpakninger, som indeholder alle til udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen nødvendige reagenser, således f.eks. en sædvanlig blanding af coenzym, enzym og substrat, CK-MM-antistofferne i midlet ifølge opfindelsen og en pufferopløsning. En testpakning af denne eller lignende art muliggør bestemmelsen af CK-MB med meget lille arbejdsopbud.

På grundlag af teknikkens standpunkt kunne det ikke forventes, at problemet med CK-MB-bestemmelsen kunne løses med en så simpel og hurtigt arbejdende fremgangsmåde som fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Således kunne det ikke forudses, at der kunne fremstilles specifikke antisera, som ganske vist fuldstændigt hæmmer den enzymatiske aktivitet af underenhed M i CK-MM og -MB, men som ikke påvirker den enzymatiske aktivitet af underenhed B i CK-MB. Anvendelsen af antistoffer med disse hidtil ukendte egenskaber muliggør for første gang reaktionen ifølge opfindelsen.

Det er også overraskende, at de ifølge opfindelsen anvendte antistoffer også i nærværelse af substrater bibeholder deres fuldstændige hæmningsvirkning. Dette er ikke nogen selvfølge. Således er der i litteraturen (Ann. N.Y. Acad. Sci., bind 103, side 858 - 889 (1963)) beskrevet antistoffer, som i nærværelse af CK-substrater ikke mere inaktiverer CK-MM i et omfang på 100%. Antistoffer med sådanne egenskaber ville være fuldstændig ubrugelige til de foretrukne udførelsésformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen, i henhold til hvilke antistofhæmningen og tilsætningen af CK-substrater sker samtidig. De ikke hæmmede andele af M-aktiviteterne ville give en falsk forhøjelse af CK-MB, ville eventuelt tydes som CK-MB--aktiviteter, der i virkeligheden overhovedet ikke er til stede, og ville på denne måde give falske laboratoriedata til diagnosen.

U DK 151920 B

Den overraskende egenskab ved de ifølge opfindelsen anvendte antistoffer, at de fuldstændigt hæmmer den enzymatiske aktivitet af underenhed M i CK-MM og -MB, uden at de påvirker den enzymatiske aktivitet af underenhed B i CK-MB, og at de oven i købet i nærværelse af substrater udfolder deres fuldstændige hæmningsvirkning over for underenhed M i CK-MM og CK-MB, muliggør en hidtil med immunologiske ! metoder ikke opnåelig hurtighed og præcision ved CK-MB-aktivitetsbestemmelsen. Hermed åbnes for praktikken en vej til bestemmelse af CK-MB-aktiviteten med en hurtigtest.

Det bliver muligt at differentiere en i laboratoriet konstateret forhøjelse af CK-aktiviteten hos en patient derhen/ om der foreligger en sygdom eller traumatisering af skelet- eller hjertemuskulaturen. Herved får man vigtige yderligere data til differentialdiagnosen af hjerteinfarkt (f.eks. fra lungeinfarkt og/eller shockfølger) og andre sygdomme eller beskadigelser i hjertet.

Desuden får man ved den specifikke og nøjagtige bestemmelse af aktiviteten af CK-MB indikationer vedrørende hjertemusklens andel eller beskadigelse ved andre ektracardiale sygdomsprocesser (f.eks. ved forgiftninger eller ulykker), ved terapeutiske indgreb (f.eks. ved genoplivning) eller ved diagnostiske indgreb (f.eks. ved hjertekathe-teriseringer eller coronarangiografier).

I de nedenstående eksempler betyder "M" (henholdsvis "mM" ) koncentrationerne i mol (henholdsvis millimol) pr. liter.

Eksempel 1.

Hæmning af CK-MM, CK-MB og CK-BB ved hjælp af antihuman-CK-MM.

Til et med hensyn til sin CK-egenaktivitet inaktiveret humant serum sættes rent CK-MM, CK-MB eller CK-BB, og de enkelte prøvers CK-akti-viteter bestemmes. Derefter sættes der til 0,1 ml prøve 0,1 ml anti-CK-MM-opløsning (fremstillet ifølge eksempel Ba)), hvorefter der sammenblandes og inkuberes i 5 minutter ved 25°C. Derefter sker en bestemmelse af CK-restaktiviteten på kendt måde. Resultaterne fremgår af følgende tabel: 13

DK 15192QB

Tabel

Restaktiviteter af CK-isoenzymer efter inkubation med inhiberende antihuman-CK-MM (middelværdier - 1 s fra hver gang 5 ganges bestemmelser) (s = standardafvigelse).

Isoenzym Aktivitet af de tilsatte Restaktivitet efter inku- isoenzymer (U/liter) bation med anti-CK-MM (U/liter) CK-MM 98-1,9 0,3 - 2,1 1043 - 22 0,5 - 2,5 CK-MB 103 -2,0 53 - 1,7 410 - 7,8 206 - 6,2 CK-BB 197-3,8 199-4,1

Inden for målenøjagtigheden hæmmes aktiviteten af CK-MM 100%, aktiviteten af CK-BB 0% og aktiviteten af CK-MB (svarende til andelen af 50% M-underenheder) 50%. Resultaterne er konstante over et bredt aktivitetsområde for de tilsatte isoenzymaktiviteter.

Eksempel 2.

Test I til kvantitativ bestemmelse af aktiviteten af CK-MB i legemsvæsker.

a) Testpakningens sammensætning.

Testpakningen er tilstrækkelig til 10 aktivitetsbestemmelser. Pakningen indeholder i flaske puffer til 10 bestemmelser, 10 flasker coenzym-enzym-substrat-blanding og 1 flaske anti-CK-MM, fremstillet i henhold til eksempel Ba).

!

14 DK 151920B

Flasken med coenzym-enzym-substrat-blanding indeholder:

Creatinphosphat-dinatriumsalt, hexahydrat 27/24 mg Glutathion, reduceret 6,4 mg (eller N-acetylcystein 3,4 mg)

Adenosindiphosphat-dinatriumsalt, hexahydrat 1,25 mg

Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat, dinatriumsalt 1,7 mg

Adenosin-monophosphat, dinatriumsalt 8,47 mg

Hexokinase 5 U

Glucose-6-phosphat-dehydrogenase 3 U

Glucose 8,32 mg

Magnesiumacetat 4,52 mg

Flasken med pufferopløsning indeholder:

Txiethanolaminacetat (i vand) 105 mM.

De lyofiliserede antistoffer opløses med 2 ml destilleret vand.

Den resulterende antistofopløsning er således indstillet, at op til 1000 U/liter creatinkinase-MM hæmmes totalt. Ved sera med ekstremt høje totalaktiviteter af creatinkinase må serummet derfor i forvejen fortyndes til ca. 1000 U/liter. Antistofopløsningen er holdbar i mindst 7 dage ved +4°C.

b) Udførelse af bestemmelsen af aktiviteten af CK-MB. bl) Udførelse.

I en reaktionsbeholder pipetteres: 0,1 ml serum + 0,1 ml antistofopløsning.

Der blandes godt og inkuberes i 5 minutter ved 25°C. Derefter sættes 0,1 ml af denne reaktionsblanding samt 2,0 ml pufferopløsning til en flaske med blandingen af coenzym, enzym og substrat.

Der blandes, inkuberes i 5 minutter ved 25°C og hældes derefter ud i en cuvette. Extinktionen måles ved 25°C, hvorefter extinktionsændrin-gen pr. minut bestemmes. Bølgelængde: 334, 340 eller 366 nm; lagtykkelse : 1 cm.

15 DK 151920 B

b2) Beregning.

Den konstaterede CK-aktivitet i prøven skal a) multipliceres med fortyndingsfaktoren 2 og b) multipliceres med CK-MB-hybridfaktoren 2 (i testen måles kun B-underenhederne af CK-MB).

Ud fra extinktionsdifferencerne pr. minut AE/minut) dannes middelværdien, som sættes ind i den tilsvarende beregningsformel: Måling ved 334 nm: volumenaktivitet-CK-MB = A E/minut x 4 x 3500 U/liter Måling ved 340 nm: volumenaktivitet-CK-MB = A E/minut x 4 x 3376 U/liter Måling ved 366 nm: volumenaktivitet-CK-MB = A E/minut x 4 x 6364 U/liter.

Eksempel 3.

Test II til kvantitativ bestemmelse af CK-MB-aktiviteten i legemsvæsker, a) Testpakningens sammensætning.

Testpakningen er tilstrækkelig til 30 aktivitetsbestemmelser. Pakningen indeholder 1 flaske pufferopløsning til 30 bestemmelser og 30 flasker af en lyofiliseret blanding bestående af coenzym, enzym, substrat og anti-CK-MM i henhold til eksempel Ba).

Den i flasken med puf fer opløsning indeholdte mængde triethanolaminace-tat svarer til den i eksempel 2a) angivne mængde. De enkelte flasker med blandingen af coenzym, enzym, substrat og anti-CK-MM i henhold til eksempel Ba) svarer med hensyn til de tre førstnævnte komponenter ligeledes til den i eksempel 2a) angivne sammensætning og indeholder yderligere anti-CK-MM, som totalt hæmmer op til 1000 U/liter CK-MM.

16 DK 15T920B

b) Bestemmelse af aktiviteten af CK-MB. bl) Udførelse.

Til indholdet af en flaske med coenzym/enzym/substrat/anti-CK-MM--blanding pipetteres 2,0 ml pufferopløsning og 0,1 ml serum. Der blandes og inkuberes i 5 minutter ved 25°C, hvorefter der hældes ud i en cuvette, og extinktionen måles over 5 minutter ved 25°C. Bølgelængde: 334, 340 eller 366 nmj lagtykkelse: 1 cm.

b2) Beregning.

Ud fra extinktionsdifferencerne pr. minut (/\ E/minut) dannes middelværdien, som sættes ind i den tilsvarende beregningsformel: Måling ved 334 nm: volumenaktivitet CK-MB = /\ E/minut x 7000 U/liter Måling ved 340 nm: volumenaktivitet CK-MB = /\ E/minut x 6752 U/liter Måling ved 366 nm: volumenaktivitet CK-MB = /\ E/minut x 12728 U/liter.

Eksempel 4.

Simultanbestemmelse af CK-totalaktiviteten og CK-MB-aktiviteten.

a) Sammensætning af testpakningen.

Testpakningens sammensætning svarer til den i eksempel 2a) beskrevne.

b) Bestemmelse af CK-totalaktiviteten og CK-MB-aktiviteten af CK-MB.

bl) Udførelse.

I flasken med coenzym-enzym-substrat-blanding pipetteres 2,0 ml pufferopløsning og 0,1 ml serum eller serumfortynding. Der blandes

17 DK 151920 B

og inkuberes i 5 minutter ved 25°C, hvorpå der hældes ud i en cuvette, og extinktionsændringen (/\^ El) ved 25°C bestemmes over 2 minutter. Derefter tilsættes 0,1 ml antistofopløsning, og der blandes straks, og efter 3 minutter bestemmes igen extinktionsændringen (AE2) ved 25°C. Bølgelængde: 334, 340 eller 366 nmj lagtykkelse: 1 cm.

b2) Beregning.

CK-Totalaktiviteten beregnes på følgende måde: Måling ved 334 nm: volumenaktivitet CK-total = A El/minut x 3500 U/liter Måling ved 340 nm: volumenaktivitet CK-total = A El/minut x 3376 U/liter Måling ved 366 nm: volumenaktivitet CK-total = A El/minut x 6364 U/liter.

CK-MB-Aktiviteten beregnes efter følgende formler: Måling ved 334 nm: volumenaktivitet CK-MB = A E2/minut x 7350 U/liter Måling ved 340 nm: volumenaktivitet CK-MB = A E2/minut x 7090 U/liter Måling ved 366 nm: volumenaktivitet CK-MB = A E2/minut x 13364 U/liter.

Eksempel 5.

Bestemmelse af CK-MB-aktiviteter hos patienter med og uden hjerte-infarkt med testpakningen i henhold til eksempel 3.

a) CK-Aktiviteter hos forskellige patientkollektiver.

18 DK 151920B

Antal Middelværdier

tilfælde Total-CK CK-MB

(U/liter) (U/liter)

Patienter med forhøjede CK-aktiviteter uden hjerte- infarkter 48 480 0,7 • i

Patienter med hjerteinfarkter 5 510 44

Tabellen viser, at man ved hjælp af bestemmelsesmetoden ifølge opfindelsen hurtigt og entydigt kan opnå indikation af en hjerte-infarkt.

b) Forløb af CK-MB-aktiviteter hos en patient med hjerteinfarkt.

Timer efter infarktets indtræden CK-MB

U/liter 3.5 15 4.5 <5 5.5 6 7.5 .22 8.5 23 9.5 29 10.5 50 11.5 46 13.5 56 15.5 55 17.5 64 21.5 62 25.5 50 29.5 42 33.5 25 43.5 18 53.5 <5 61.5 <5

19 DK 151920B

Talværdierne viser den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bestemte stigning og derpå følgende aftagen i CK-MB-aktiviteten hos en hjerteinfarkt-patient.

Fremstilling af udgangsmaterialer.

Eksempel A.

Fremstilling af CK-MM.

a) 1,2 kg dybfrossen menneskelig skeletmuskel optøs ved stuetemperatur og findeles maskinelt. Vævet suspenderes i 2,5 liter kold 0,05M tris/HCl-puffer, pH-værdi 8,0 [tris-(hydroxymethyl)-aminomethan--HCl-puffer], som indeholder 0,01M KC1, 1 mM EDTA [ethylendiaminte-traeddikesyre] og 1 mM dithioerythrit, og homogeniseres med en mixer. Homogenatet omrøres under isafkøling i 45 minutter og centrifugeres derefter i 60 minutter ved 12000 g. Den klare overstand (2,680 liter) underkastes en ammoniumsulfatfraktionering ved pH-værdi 8,0 inden for grænserne 40 - 75% mætning. 0,75 s-bundfaldet optages i 0,04M tris/HCl-puffer, pH-værdi 8,0, og dialyseres mod den samme puffer. Til adsorption af myoglobin og sure ballastproteiner tilsættes 500 g fugtig basisk ionbytter på basis af en tværbunden dextran, ækvilibreret mod samme puffer. Efter 30 minutters forløb frasuges ionbytteren, som udvaskes to gange med hver gang 400 ml 0,0 4M tris/HCl-puf fer, pH-værdi 8,0, indeholdende__0,02M NaCl. Filtrat og vaskevand forenes og bringes med ammoniumsulfat på 0,75 s. Bundfaldet fracentrifugeres, opløses i 100 ml 0,04M tris/HCl-puffer, pH-værdi 8,0, og dialyseres mod den samme puffer, indtil der ikke længere kan påvises ammoniumsulfat. Det klare dialy sat ækvilibreres på en søjle med en basisk ionbytter på basis af en tværbunden dextran (6 x 60 cm) med den samme puffer. Søjlen vaskes med startpuffer, indtil eluatet er proteinfrit. Derefter elueres enzymet fra søjlen med 0,04M tris/HCl-puffer, pH-værdi 8,0, indeholdende 0,02M NaCl, 1 mM EDTA og 1 mM dithioerythrit. Fraktioner med et enzymindhold på mindst 20 U/ml forenes og mættes med ammoniumsulfat til 80%, og det præcipiterede enzym fracentrifugeres. Til slutrensningen underkastes det endnu en chromatografi i det samme

20 DK 15192 OB

system, men under anvendelse af et mindre søjlerumfang. Fra de forenede aktive fraktioner fældes enzymet med 0,8 s ammoniumsulfat, opløses koncentreret i 50 ml Q,04M tris/HCl-puffer, pH-værdi 8,0, indeholdende 0,02M NaCl, 1 mM EDTA og 1 mM dithioerythrit, sterilfiltreres og bringes igen med ammoniumsulfat på 0,8 s. Der fås på denne måde en ved 4°C stabil enzymsuspension af CK-MM med en specifik aktivitet på 26 - 30 U/mg, målt med creatin som substrat ved 25°C.

Volumen: 86 ml* aktivitet: 316 U/ml; protein: 11,8 mg/ml. Udbytte: ca. 30% (beregnet på organekstrakten).

b) Analogt med eksempel Aa) isoleres CK-MM fra muskelvæv af følgende dyr: Rhesusabe, svin, okse.

Eksempel B.

Fremstilling af anti-CK-MM.

a) CK-MM fra human muskel dialyseres mod en med 0,07M triethanol-amin pufret fysiologisk NaCl-opløsning, pH-værdi 7,0, som indeholder 10 mM mercaptoethanol og 10 mM MgC^. Enzymopløsningen befries for aggregater ved ultracentrifugering, og proteinindholdet indstilles på 2 mg/ml med den nævnte dialysepuffer. 1 ml af denne opløsning emulgeres med 1 ml komplet Freund's adjuvans (vand-mineralolie-suspension> som yderligere indeholder 2 mg dræbte M-tuberculosebacil-ler). Denne emulsion injiceres intramuskulært i en ged. Efter tre injektioner af samme art med et interval på 3 uger og tre yderligere boosterinjektioner, hver gang med et interval på 16 uger, tappes der blod fra dyret 21 dage efter sidste injektion. Det efter kendte metoder vundne serum indstilles på pH-værdi 8,4 med en blanding indeholdende 3% fåreserumalbumin og 0,1% natriumazid i en 0,1M borat-puffer og sterilfiltreres. Den resulterende opløsning, indeholdende anti-humanmuskel-CK-MM, fyldes i 0,5 ml-portioner i brune glasflasker og frysetørres. Antistofferne har en molekylvægt på ca.

160.000 - 180.000.

21 DK 151920 B

b) Det i henhold til eksempel Aa) vundne CK-MM fra human muskel dialyseres mod en med 0,1M imidazol pufret fysiologisk NaCl-opløs-ning, pH-værdi 6,8, som indeholder 7,5 mM N-acetylcystein og 25 mM magnesiumacetat. Derefter befries enzymopløsningen for aggregater ved ultracentrifugering, og proteinindholdet indstilles på 0,2 mg/ml med den nævnte dialysepuffer. 1 ml af denne opløsning emulgeres med 1 ml komplet Freund's adjuvans. Denne emulsion injiceres intradermalt i en bede. Efter 3 og 6 uger følger to intramuskulære injektioner og tre yderligere boosterinjektioner, hver gang med et interval på 14 uger. 19 dage efter den sidste injektion tappes der blod. Oparbejdningen sker i analogi med eksempel Ba). Der fås anti-human-muskel-CK-MM i frysetørret form. Antistoffernes molekylvægt er ca.

160.000 - 180.000.

c) CK-MM fra Rhesusabemuskel dialyseres grundigt mod en med 0,15M imidazol pufret fysiologisk NaCl-opløsning, pH-værdi 6,8, som indeholder 25 mM dithioerythrit og 15 mM mangan(II)-chlorid. Efter fjernelse af aggregaterne ved ultracentrifugering indstilles proteinindholdet på 5 mg/ml med den nævnte dialysepuffer. 1 ml af denne opløsning emulgeres med 1 ml komplet Freund's adjuvans. Injektioner, blodtapning og oparbejdning sker i analogi med eksempel Ba). Der fås anti-Rhesusabemuskel-CK-MM i frysetørret form. Antistoffernes sedimentationskonstant er ca. 7 S.

d) CK-MM fra svinemuskel aktiveres i analogi med eksempel Bb), og antigenemulsionen injiceres sammen med komplet Freund's adjuvans i kaniner. Efter 3 uger sker en yderligere subcutan antigeninjektion. Injektionen gentages efter yderligere 3 uger, og 19 dage derefter tappes der blod. Oparbejdningen sker i analogi med eksempel Ba).

Der fås anti-svinemuskel-CK-MM i frysetørret form. Antistoffernes molekylvægt- er ca. 160.000 - 180.000.

På fuldstændig analog måde vindes der fra oksemuskel anti-oksemuskel--CK-MM (molekylvægt ca. 160.000 - 180.000).

Claims (10)

22 DK 151920 B Patentkrav.

1. Middel til bestemmelse af aktiviteten af creatinkinase-MB i en prøve af en legemsvæske, kendetegnet ved, at det indeholder creatinkinase-M-an-tistoffer med en molekylvægt på 130.000-210.000, som er i stand til fuldstændigt at hæmme den enzymatiske aktivitet af underenhed M i creatinkinase-MM og -MB, uden at inaktivere den enzymatiske aktivitet af underenhed B i eventuelt tilstedeværende creatinkinase-MB.

2. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder creatinkinase-M-an-tistoffer, som også i nærværelse af creatinkinase-substrater er i stand til at udfolde en fuldstændig hæmning.

3. Middel ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at det indeholder fra geder vundne creatinkinase-M-antistoffer.

4. Middel ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at det indeholder creatinkinase-M-antis tof fer, som er i stand til i prøven fuldstændigt at hæmme op til 2500 U/liter af underenhed M i creatinkinaserne-MM og -MB.

5. Fremgangsmåde til bestemmelse af aktiviteten af creatinkinase-MB i en prøve af en legemsvæske, kendetegnet ved, at man inkuberer prøven med creatin-kinase-M-antistoffer med en molekylvægt på 130.000-210.000, som er i stand til fuldstændigt at hæmme den enzymatiske aktivitet af underenhed M i creatinkinase-isoenzymerne-MM og -MB, uden at inaktivere den enzymatiske aktivitet af underenhed B i eventuelt tilstedeværende creatinkinase-MB, og bestemmer aktiviteten af creatin-kinase-underenhed B fotometrisk på kendt måde.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at man inkuberer prøven af legemsvæsken og creatinkinase-M-antistofferne i nærværelse af creatinkinase-substrater .

23 DK 151920B

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5 og 6, kendetegnet ved, at man før inkubationen af prøven med creatinkinase-M-antistofferne i den samme prøve yderligere bestemmer creatinkinase-totalaktiviteten.

8. Anvendelse af creatinkinase-M-antistoffer med en molekylvægt på 130.000-210.000, som er i stand til fuldstændigt at hæmme den enzymatiske aktivitet af underenhed M i creatinkinaser-MM og -MB, uden at inaktivere den enzymatiske aktivitet af underenhed B i eventuelt tilstedeværende creatinkinase-MB til bestemmelse af aktiviteten af creatinkinase-MB ved siden af creatinkinase-MM.

9. Anvendelse ifølge krav 8 af antistofferne som hjælpemiddel til diagnose af myokardinfarkt.

10. Anvendelse ifølge krav 8 eller 9 af antistofferne til simultanbestemmelse af creatinkinase-totalaktiviteten og creatinkina-se-MB-aktiviteten i en prøve.