CS200196B2

CS200196B2 - Method of creatincynasis-mb efficieny determination

Info

Publication number: CS200196B2
Application number: CS767066A
Authority: CS
Inventors: Uwe Wuerzburg; Norbert Hennrich; Hans-Dieter Orth; Hermann Lang
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1975-11-03
Filing date: 1976-11-02
Publication date: 1980-08-29
Also published as: NO148457B; IL50803A; DE2548963B2; FR2330010B1; IL50803A0; SE7612175L; ATA809576A; ES452916A1; NO148457C; DE2548963A1; CH628144A5; BE847905A; JPS5619239B2; JPS5257887A; DK151920B; GB1512328A; AT359205B; FI60720C; NO763722L; US4067775A

Description

Vynález se týká způsobu stanovení účinnosti kreatinkinázy-MB v lidských tělesných tekutinách.

Stanovení účinnosti kreatinkinázy (ATP: kreatin-fosfotransferáza, E. C. 2.7.3.2, zkratka CK] v séru je citlivou laboratorní metodou při diagnostice onemocnění kosterních svalů a srdečního svalu, zejména u infarktu myokardu. Rozlišení při poranění kosterních svalů a srdečního svalu, zvláště při diferenciální diagnóze infarktu myokardu je však obtížné. Stanovením celkové účinnosti CK není možno s jistotou toto odlišení provélst. Rada pokusů proto vedla k tomu, zvýšit jistotu diferenciální diagnostiky při stanovení účinnosti CK, a to tak, že se uvádějí do korelace, například vytvořením kvocientu CK/glutamát-oxalacetát-transamináza. Kvocienty tohoto typu však nedovolují rozlišení mezi srdečním infarktem a důsledky šoku z jiných příčin.

CK se vyskytuje v organismu ve formě tří isoenzymů, a to СК-MM, například ve svalu. CK-BB, například v mozkové itikáni a jako hybrid СК-MB, který sestává z podjednotky M a podjednotky B, například v srdečním svalu. Účinnost CK, tak jak se stanoví v krevním séru je vztažena obvykle na isoenzym СК-MM, protože CK-BB neprochází bariérou mezi mozkomíšním mokem a krví a СК-MB je omezen na určité orgány, například na srdeční sval. Při poškození srdeční svaloviny, například při srdečním infarktu se však СК-MB uvolňuje do krevního séra, kde je možno provést příslušné stanovení.

Kvantitativní stanovení tohoto isoenzymů vedla. СК-MM v krevním séru je nejcitlivější a pro diferenciální diagnostiky nejprokazatelnější laboratorní metodou pro stanovení srdečního infarktu. Kromě srdečního svalu obsahují СК-MB ještě některé další orgány, například slinivka břišní, bránice, aorta, plíce a děloha, avšak účinnost těchto orgánů je přibližně lOOkrát nižší než v srdečním svalu, takže účinnost СК-MB, popřípadě uvolněná v uvedených orgánech leží pod hranicí stanovení.

Až dosud se stanovení účinnosti CK-M.B provádělo v podstatě třemi způsoby:

1. Elektroforézou na různých nosičích. Takto získané výsledky si často odporují a často dochází k výskytu většího počtu pruhů, protože se současně stanoví i isoenzymy. '(Artefakty).

)2. Chromotografií na sloupcích různých materiálů. Tato metoda je zdlouhavá, trvá několik hodin a nehodí se pro běžné stanovení. Výsledky zpráv jednotlivých pracovníků si částečně odporují.

3. Imunologické stanovení pomocí precipitujících protilátek. Tento· způsob byl popsán v NSR přihláškách P 21 28 670 a P 22 58 822 a dává dobré výsledky například při kvantitativním stanovení isoenzymů aldolázy a alkalické fosfatázy. Ke stanovení poměrně nízké účinnosti CK a zejména CK-MB se citlivost této metody nehodí.

Všechny tyto způsoby vyžadují ke svému provedení dlouhou dobu a již z tohoto· důvodu se nehodí k rychlé diagnóze srdečního infarktu.

Vynález si klade za úkol navrhnout jednoduchý a reprodukovatelný rychlý způsob stanovení účinnosti CK-MB ve vzorku tělesných tekutin.

Podle vynálezu je tento· úkol vyřešen tak, Že je navrhován dosud neznámý způsob, který se provádí pomocí specifických protilátek, úplně blokujících enzymatickou účinnost podjednotky M v CK-MM a CK-MB, aniž by přitom došlo k inaktivaci podjednotky B v CK-MB.

Předmětem vynálezu je tedy způsob stanovení účinnosti kreatinkinázy MB ve vzorku tělesné tekutiny, vyznačující se tím, že se tento· vzorek inkubuje s protilátkami, získanými očkováním zvířat kreatinkinázou MM lidskéhio původu, předem aktivovanou použitím látek, stabilizujících a aktivujících skupinu SH—- a/nebo· dvoumocnými kovovými ionty, s výhodou ionty hořčíku, manganu, vápníku a/nebo kobaltu, vzniklé protilátky se izolují, načež se účinnost podjednotky B kreatinkinázy po přidání substrátu pro· kreatinkinázu měří fotometricky.

Tělesnou tekutinou se při provádění způsobu podle vynálezu rozumí především lidské krevní sérum. Je však možno provádět stanovení i v jiných tělesných tekutinách, jako je plná krev, plazma, moč, sputum apod., stanovení je rovněž možno provádět v obdobném vyšetřovacím materiálu ze zvířat. CK-BB ruší provádění způsobu podle vynálezu a z tohoto důvodu nesmí být přítomen v krevních tekutinách, v nichž má být stanovení provedeno.

Protilátky k provádění· způsobu podle vynálezu je možno získat očkováním zvířat CK-MM-antigeny. Jako antigen se užije především lidský CK-MM. Je možno užít také CK-MM ze zvířat, a to v případě, že takto získaná antiséra jsou schopna úplně blokovat enzymatickou účinnost podjednotky M M v lidském CK-MM a CK-MB za případné · přítomnosti C^--íu^s^trátů, aniž by přitom došlo k inaktivaci enzymatické účinnosti podjednotky B v přítomném CK-MB. Dárcem antigenu CK-MM jsou především různé druhy opic, především rézus a .šimpanz, · dále domácí zvířata jako vepř, kůň, skot, králík a morče a další zvířata jako krysy, myši a ptáci, například husy, kachny a slepice.

Antigen CK-MM, užitý k výrobě protilátek má být prostý CK-MB a CK-BB. Citlivým kritériem tohoto požadavku na čistotu je imunologická analýza, která se s výhodou provádí difúzí nebo elektroforézou. Mimoto je možno využít i analytické elektroforézy a elektrofokusace při použití polyakrylamidového· gelu. Při použití těchto· metod. je možno provést dobré stanovení na čistotu oproti CK-MB a CK-BB. Mimoto je možno stanovit absolutní čistotu proti jiným bílkovinám, kterou je možno provést například dvěma posledními způsoby, což je však méně důležité. Mikroheterogenita CK-isoenzymatických typů, která spočívá v malých rozdílech složení aminokyselin u jednotlivých isoenzymů nehraje při stanovení čistoty zpravidla žádnou úlohu.

K imunizaci se užívá takových zvířat, která po · očkování aktivovaným CK-MM tvoří · protilátky, které jsou schopné úplně blokovat enzymatickou účinnost podjednotky M v kreatinkinázách MM a MB, aniž by přitom došlo k blokování enzymatické účinnosti podjednotky B v přítomném CK-MB. Zvláště vhodné jsou kozy. Je však možno užít i jiných zvířat, zejména obratlovců, při jejichž použití je možno rovněž získat žádané protilátky. Jde například o různé druhy opic, koně, skot a podobná zvířata, ovce, psa, vepře, králíka, ptáky, například slepice, krocany, husy, a kachny, dále krysy, myši a morčata. Pro indukci protilátek jsou zvláště vhodné kozy, které za přítomnosti C^-sLn^s^t^cátu vytváří protilátky, které účinně brzdí podjednotku M v CK-MM i v CK-MB.

Imunizace pokusných zvířat se provádí aktivovaným lidským nebo zvířecím CK-MM. Aktivace CK-MM se provádí známými reakčními složkami, které stabilizují a aktivují skupiny SH— a/nebo dvojvaznýmí kovovými ionty, s výhodou · kombinací svrchu uvedených činidel a kovových iontů. Reakčními činidly, schopnými stabilizovat a aktivovat SH-skupiny, jsou například N-acetylcystein, merkaptoethanol a dithioerythrit, dále glutathion, cystein, dithiothreit, S-(2-aminoethyl) Jsothiouroniumbromid-hydrobromid (AET) a/nebo kyselina thioglykolová. V případě dvojvazných kovových iontů padají v úvahu odpovídající ve vodě rozpustné soli, například chloridy nebo acetáty, s výhodou hořčíku, mimoto manganu, vápníku a/nebo kobaltu. Uvedená aktivace je zásadně známá z jiných oborů. ’

Další imunizace a zpracování získaného materiálu na antiséra a protilátky se provádí známým způsobem. Také další zpracování a uchovávání antisér a protilátek se provádí způsoby, které jsou z imunologie· známé.

Protilátky, jichž se užívá · k provádění způsobu podle vynálezu spadají do skupiny IgG-i^i^]^ooglO'b’^ilinů (bivalentní protilátky). Jejich molekulová hmotnost se pohybuje v rozmezí 130 až 210 000, s výhodou

16θ 000. Jejich předběžná sedimentační konstanta je v rozmezí 6 S až 8 S, s výho200196

S dou 7 S. Obsah uhlohydrátů je přibližně 3 hmotnostní %. Kromě JgG-protilátek, lze užít také monovalentních JgG-fragmentů (= Fab) a JgM-protilátek.

Protilátky použitelné při provádění způsobu podle vynálezu mají úplně blokovat enzymatickou účinnost podjednotky M v kreatinkináze. Pod pojmem ,,úplně blokovat“ se rozumí průměrný zůstatek nejvýš 5 jednotek/litr, avšak s výhodou méně než 3 jednotky/litr enzymatické účinnosti podjednotky M v СК-MM a CK-MB po uvedení vzorku do styku s protilátkou.

Mimoto nemají protilátky o-vlivříovat enzymatickou účinnost podjednotky В v CK-MB. To znamená, že nemají blokovat více než 10 jednotek/litr s výhodou však méně než 5 jednotek/litr enzymatické účinnosti podjednotky В СК-MB ve zpracovávaném vzorku.

Výhodné provedení způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se ke vzorku tělesné tekutiny a protilátky za přítomnosti CK-substrátu při inkubaci přidají protilátky, které mají mimoto mít tu vlastnost, že se jejich blokující účinnost na enzymatickou účinnost podjednotky M v СК-MM a CK-MB má plně rozvíjet i za přítomnosti CK-subs-trátu, aniž by přitom došlo к ovlivnění enzymatické účinnosti podjednotky В v přítomném CK-MB. Tuto vlastnost je možno zajistit zejména u protilátek, které byly získány z koz imunizací plně aktivním CK-MM, a to navíc к ostatním svrchu uvedeným vlastnostem. Tato vlastnost však není bezprostředně nutná к normálnímu provádění způsobu podle vynálezu, při němž se nejprve provádí inkubace protilátky, pak se přidá СК-substrát a provádí se fotometrické měření.

Jako СК-substrátu je možno užít všech * běžných substrátů, popřípadě efektorů. Jde především o kreatin, kreatinfosfát, adenosindifosfát, adenosintrifosfát a hořečnaté ionty.

Stanovení účinnosti, resp. zbytkové účinnosti CK a jeho isoenzymů je možno provádět zásadně všemi rychlými a přesnými způsoby. Vhodné jsou například ty známé způsoby, které dovolují měřit účinnost CK po přidání СК-substrátů pomocí fotometrického stanovení, které navazuje na pomocnou reakci.

Jde například o kolorimetrické metody, popsané např. v „Methoden der enzymatischen Analyse”, vyd. H. U. Bergmeyer, 3. vydání (1974), sv. 1, str. 145 ff. Výhodné jsou kinetické metody, u nichž se stanoví enzymatická účinnost měřením v ultrafialovém světle při 334, 340 neibo 366 nm. Výhodná je nalpříklad standardní metoda, při /níž se stanoví CK při použití kreatínfosfátu a adenojsindifosfátu. [Z. Kliň. Chem. Kliň. Biochem, sv. 8, str. 658 ff (1970) a sv. 10, str. 182 (1972)]. Testovací balíčky ke stanovení účinnosti CK tímto způsobem se běžně dodávají.

Podle dalšího známého způsobu stanovení lze CK stanovit fluorometricky. Pomocí CK je možno¹ uvolnit z kreatin-fosfátu kreatin, který se pak měří fluorometriciky po reakci s ninhydrinem v silně alkalických roztocích způsobem podle publikace R. B. Conn [Clin. Chem., sv. 6, str. 537 f (1960) a Sax a další, Clin. Chem., sv. li, str. 951 f (1965)].

Dále bude uvedeno typické provedení způsobu podle vynálezu:

Vzorek tělesné tekutiny v němž má být stanovení provedeno, s výhodou vzorek lidského séra se smísí s takovým množstvím СК-MM protilátek, které je dostatečné к tomu, aby úplně blokovalo až 2500 jednotek/litr podjednotky M v СК-MM a CK-MB, s výhodou 1000 jednotek/litr. V tělesných tekutinách s vyšší celkovou účinností CK je účelné před vlastním stanovením provést předběžné ředění na účinnost přibližně 1000 jednotek/litr. Toto předběžné ředění je pak nutno vzít v úvahu při výpočtech. Po smísení se vzorek inkubuje 1 až 30, s výhodou 5 minut při teplotě 4-10 až 40 °C, is výhodou při teplotě /místnosti, zejména při teplotě 25 až 30 °C. Pak se stanoví zbývající enzymatická účinnost reakční směsi známým způsobem, s výhodou svrchu popsanou metodou při použití ultrafialového světla. Směs séra a protilátek se přidá ke známé směsi enzymu, koenzymu a substrátu, která obsahuje všechny enzymy, koenzymy a substráty, nutné к provedení uvedené metody, načež se přidá dostatečné množství roztoku pufru o pH 7. Vhodné přípravky obsahují například jako· směs enzymu a koenzymu hexoikinázu, glukózo-6-fosfátdehydrogenázu, adenosindifosfát a nikotinaml·dadenindinukleotidfolsfát a jako substráty kreatinfosfát a glukózu.

Je také možné přidat směs séra a protilátek ke směsi koenzymu a enzymu nebo obráceně a pak teprve přidat směs pufru a substrátu. Vhodným pufrem je například neutrální pufr, který obsahuje s výhodou triethanolamin nebo imidazolacetát, popřípadě kyselinu morfolinpropansulfonovou nebo morfolinethansulfonovou. Po smísení se vzniklá směs inkubuje 1 až 10, s výhodou 5 minut při teplotě 15 až 40 °C, s výhodou 25 až 30 °C, načež se stanoví při teplotě místnosti změna extinkce. Z této změny se pak vypočítá účinnost podjednotky В v CK-MB.

Při výhodném způsobu provedení je možno obměnit způsob podle vynálezu tak, že se vzorek analyzované tělesné tekutiny inkubuje s protilátkami a СК-substráty za přítomnosti pufru a látek, nutných ke stanovení bez předběžné inkubace vzorku z protilátek. Při tomto provedení je nutné, aby protilátky měly ještě tu vlastnost, že jsou schopné brzdit úplně enzymatickou účinnost podjednotky M v СК-MM a CK-MB i za přítomnosti СК-substrátu. Tuto vlastnost mají například protilátky, získané při použití plně účinného' CK-MM z koz. Tyto protilátky umožňují provádět - způsob podle vynálezu jednoduchým a rychlým způsobem.

Je například možno protilátky, předem uvedené do lyofilizované formy spolu se směsí koenzymu, enzymu a substrátu, nutnou k provádění dalšího* stanovení, smísit -s určitým množstvím roztoku pufru na roztok, který se přidá ke stanovovanému vzorku tělesné tekutiny, například séra, načež se stanoví účinnost podílu B v CK-MB. Při obměně tohoto postupu je možno přidat protilátky, také se směsí, která sestává z koenzymu a enzymu ve formě lyofilizátu, v tomto případě se zvlášť přidává do- roztoku pufru ještě substrát.

Pohle dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu možno provádět současné stanovení celkové účinnost CK a účinnosti CK-MB pomocí svrchu uvedeného výhodného provedení způsobu podle vynálezu v jediném vzorku. Je možno postupovat například tak, že se nejprve stanoví celková účinnost CK fotometrlcky známým způsobem, načež se přidá -do téhož vzorku ve vodě rozpuštěný lyofilizovaný materiál, sestávající z CK-MM protilátky. Směs se inkubuje 1 až 10, s výhodou 5 minut a pak se stanoví zbytková účinnost vzorku fotometricky. Také při tomto provedení platí požadavek, aby protilátky úplně blokovaly enzymatickou účinost podjednotky M v CK-MM a CK-MB i za přítomnosti CK-substrátu.

Je možno nastavit kapacitu protilátek v antiséru při výhodném provedení způsobu podle vynálezu tak, aby antisérum úplně blokovalo 2500 jednotek/litr, s výhodou 1000 jednotek/litr podjednotky M v CK-MM a CK-MB. V případě, že celková účinnost CK ve stanovovaném vzorku je při této kapacitě protilátek příliš vysoká, je nutno také v tomto případě provádět předběžné ředění, například na účinnost podjednotky M v CK-mM a CK-MB přibližně 1000 jednotek/litr.

Způsob podle vynálezu má oproti dříve známému stavu techniky podstatné výhody, jde zejména o vysokou přesnost výsledků a o rychlost a jednoduchost provedení.

Přesnost způsobu podle vynálezu je založena na tom, že použité protilátky jsou specifické proti podjednotce M v CK-MM a CK-MB -a proto- dovolují stanovit účinnost CK-MB v tělesných tekutinách, například lidském séru přímým způsobem.

V NSR přihláškách P 21 28 670 a P 22 58 822 se naproti tomu popisují imunologická metoda pro kvantitativní stanovení isoenzymu, která má řadu nevýhod. - Podle tohoto- způsobu se sráží -isoenzymy CK pro isoenzym specifickými přecipitujícími protilátkami a pak se stanoví zbytková účinnost, která zůstává v supernatantu nad sraženinou. Bez -ohledu na příliš dlouhou dobu provádění tohoto způsobu, zejména pro nutnost výroby většího- množství specifických antisér, je ještě v každém případě nutno užít alespoň dvou různých zkušebních vzorků, a to· zejména stanovení celkové účinnosti CK a -stanovení zbytkové účinnosti CK po vysrážení. To znamená, že účinnost CK je možno stanovit pouze na -základě rozdílů měření. Proto také je výsledek této metody zpravidla zatížen běžnými chybami z obou měření. Při provádění způsobu podle vynálezu však se provádí jedno měření, čímž -se podstatně snižuje příslušná chyba.

Při srážení je další nevýhodou, že imunologické srážení vyžaduje jako sekundární reakce dlouhou dobu, obvykle 60 minut i několik hodin, takže se pro- rychlé -stanovení nehodí.

V Clin, Chim. Acta, sv. 58, str. 223 až 232 [1975J jsou popsány protilátky proti CK-isoenzymům. Tyto protilátky způsobují kromě 100% blokování účinnosti CK-MM také 80% blokádu CK-MB. To- znamená, že kromě M podjednotky z CK-MB - je blokována také převážná část B podjednotky, přičemž účinnost podjednotek M -a B v CK-MB - k celkové účinnosti -tohoto- isoenzymu je obvykle v - poměru 50 :100. Protože při použití těchto protilátek je zbytková účinnost přibližně 20‘ %, i při - reprodukovatelnoeti se získané hodnoty pro přesné měření CK-MB pro -svou nízkost nehodí, protože celková účinnost CI< v séru je - i tak velmi nízká. Z uvedených důvodů se popsané protilátky nehodí pro stanovení CK-isoenzymů blokádou. Při - provádění způsobu podle vynálezu -zbývá ještě 50 % celkové účinnosti CK-MB, -to znamená téměř veškerá účinnost podjednotky B, -což je pro měření dostatečné. Z -tohoto hlediska znamená způsob podle vynálezu podstatný pokrok.

Rychlá -proveditelnost je podstatnou výhodou způsobu podle vynálezu. Platí to zejména pro výhodný způsob provedení, při němž se blokáda podjednotky M v CK-MM a CK-MB a stanovení zbytkové účinnost! provádí současně. Při tomto provedení je možno v nejknatší době například 5 až 30 minut s výhodou 5 až 15 minut dojít k přesnému výsledku, na němž je možno -stanovit diagnózu.

Významnou výhodou způsobu podle vynálezu je také jednoduché provedení. Způsob podle vynálezu je možno ve velkých ústavech nebo klinikách provádět i při použití běžných mechanizovaných zařízení pro stanovení enzymatické účinnosti, je však možno jej provádět i v malých ústavech a lékařských laboratořích pomocí fotometru.

Pro jednotlivá stanovení jsou vhodné testovací balíčky, které obsahují -všechny reakční složky, nutné pro provádění způsobu podle vynálezu, a to vhodnou -směs koenzymu, enzymu a -substrátu, protilátky CK-MM podle vynálezu a roztok pufru. Testovací balíček tohoto nebo podobného -slože200196 ní umožní stanovit v krátké době účinnost CK-MB.

Podle známého· stavu techniky nebylo možno· očekávat, že lze vyřešit stanovení CK-MB tak jednoduchým a rychlým způsobem, jako· je tomu v případě způsobu podle vynálezu. Nebylo· možno· předvídat, že lze získat specifická antiséra, která · budou úplně blokovat enzymatickou účinnost podjednotky M v CK-MM a CK-MB, nebudou však ovlivňovat enzymatickou účinnost podjednotky B v CK-MB. Teprve použití protilátek s těmito dosud neznámými vlastnostmi umožnilo provedení způsobu podle vynálezu.

Je také překvapující, že protilátky, užívané při provádění způsobu podle vynálezu si podržují svůj plný blokující účinek i za přítomnosti substrátů. Tento jev zdaleka není samozřejmý. V literatuře jsou popsány protilátky, které za přítomnosti CK-substrátů již neinaktivují CK-MM na 100 % [Ann. N. Y. Acad. Sci., sv. 103, str. 858 až 889 (1963)]. Protilátky s těmito· vlastnostmi by byly pro výhodné provedení způsobu podle vynálezu, při němž se provádí blokování protilátkami za přítomnosti C^--^i^l^s^t^]?á?tů současně zcela nepoužitelné. Neblokovaný podíl účinnosti podjednotky M by mylně zvyšoval hodnoty měření pro CK-MB, popřípadě by omylem došlo k naměření účinnosti CK-MB v případě, že tento· isoenzym by ve skutečnosti vůbec nebyl přítomen, čímž by došlo i k omylu v diagnóze.

Překvapující vlastnost protilátek, užívaných při provádění způsobu podle vynálezu, tj. úplné blokování enzymatické účinnosti podjednotky M v CK-MM a CK-MB bez ovlivnění enzymatické účinnosti podjednotky B v CK-MB, a to· i za přítomnosti substrátů umožňuje dosud při imunologickém stanovení nedosažitelnou rychlost a · přesnost stanovení účinnosti CK-MB. Tyto protilátky umožňují v praxi rychlé stanovení této· účinnosti.

Je nyní možné stanovit laboratorní zkouškou zvýšení účinnosti CK u nemocných tak, že lze odlišit, zda běží o onemocnění nebo poranění kosterního· svalu nebo· ' svalu srdečního. Uvedeným způsobem je možno získat důležité údaje pro· diferenciální diagnózu srdečního infarktu, například od plicního infarktu a/nebo od následků šoku a o jiných onemocnění, · například poškození srdce.

Specifickým a přesným stanovením účinnosti CK-MB je možno zjistit srdeční poškození při jiných extrakardiálních onemocněních, například otravách a neštěstích, při terapeutických zákrocích, například oživovacích pokusech nebo při diagnostických zkouškách, například srdeční katetrizaci nebo - koronární angiografii.

V následujících příkladech znamenají zkratky „M“ a „mM“ koncentrace v molech a milimolech.

P říklldl

Blokování CK-MM, CK-MB a CK-BB protilátkou proti lidskému · CK-MM

K lidskému séru, jehož vlastní účinnost CK byla potlačena, se přidá čistý CK-MM, CK-MB nebo CK-BB a měří se aktivita jednotlivých vzorků. Pak se 0,1 ml vzorku smísí s 0,1 m.l roztoku s obsahem protilátky proti CK-MM, připravené podle příkladu Ba a po důkladném promísení se směs inkubuje 5 minut při -teplotě 25 °C. Pak se stanoví známým způsobem zbytková účinnost. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

V tabulce je udána zbytková účinnost CK-isoenzymu po· inkubaci s protilátkami proti lidskému CK-MM, a to jako střední hodnota + 1 s vždy z 5 stanovení, přičemž s znamená standardní odchylku.

Isoenzym

Tabulka

Účinnost přidaného isoenzymu (jednotky//lir)

Zbytková účinnost po inkubaci s protilátkou proti CK-MM (jednotky/litr)

CK-MM

CK-MB

CK-BB

98+1,9

1043+22

103+2,0

410+7,8

197+3,8

0,3+2,1

0,5+2,5

53+1,7

206+6,2 199+4,1

V mezích přenosti měření je inhibována účinnost · CK-MM na 100 %, CK-BB na 0 % a CK-MB na 50). % (odpovídají podílu 50 % podjednotky M). Výsledky jsou konstantní v širokém rozmezí účinnosti přidávaného Isoenzymu.

Příklad 2

Test I ke kvantitativnímu stanovení účinnosti CK-MB v tělesných tekutinách

a) Složení zkušebního balíčku

Balíček stačí na 10 stanovení účinnosti.

Obsahuje 1 láhev pufru na 10 stanovení, 10 nádobek se směsí koenzymu, enzymu a substrátu a 1 nádobku s obsahem antiséra proti CK-MM, získaného podle příkladu Ba,

Nádoba se směsí koenzymu a enzymu a substrátu obsahuje tyto· složky:

disodnou sůl kreatinfosfátu

ve formě hexahydrátu	27,24 mg
redukovatý glutathion .	6,4 mg
(nebo místo . předchozí
složky N-acetylcystein)	3,4 mg
disodná sůl adenosindifosfátu
ve formě hexahydrátu	1,25 mg
m-kotinamidadenindinukleotid-
difosfát ve formě disodné soli	1,7 mg
adenosinmon-ofosfát ve formě
disodné soli	8,47 mg
hexokináza	5 jednotek
glukózo-6-fosfátdehydro-
genáza	3 jednotky
glukóza	8,32 mg
octan hořečnatý	4,52 mg
Nádoba s obsahem roztoku	pufru obsa-
huje:
triethanolaminacetát ve vodě	105 mmolů

Lyofilizované protilátky se rozpustí ve 2 ml destilované vody. Vzniklý roztok protilátky se nastaví tak, aby byl schopen úplně blokovat až 1000 jednotek/litr kreatinkinázy MM. U sér s velmi vysokým obsahem kreatinkinázy je proto nutno tato séra ředit na účinnost přibližně 1000 jednotek/litr. Roztok protilátky je možno skladovat při teplotě 4 °C alespoň 7 dní.

b) Vlastní stanovení účinnosti CK-MB bl) Provedení

Do· reakční nádoby se napipetuje

0,1 ml séra + -0,1 ml roztoku protilátky.

Po dobrém promísení se směs inkubuje 5 minut při teplotě 25 °C. Pak se 0,1 ml této reakční směsi nanese spolu s 2,0' ml roztoku pufru do nádobky, která obsahuje směs koenzymu, enzymu a substrátu.

Po promísení se výsledná směs inkubuje 5 minut při teplotě 25 °C, načež se vlije do kyvety, a stanoví se extinkce při 25 °C a pak změna extinkce za minutu při vlnové délce 334, 340 nebo 3Θ6 nm při tloušťce vrstvy 1 cm.

b2) Výpočet

Zjištěná účinnost CK vzoťku se násobí

a) zřeďovacím faktorem 2 a

b) faktorem pro· CK-M-hybrid 2 z toho důvodu, že při provádění zkoušky se měří pouze podjednotka B z CK-MB.

Z rozdílu extinkce za minutu ΔΕ/minuta se vypočítá střední hodnota a dosadí se do vzorce pro výpočet:

Měření · při 334 nm:

účinnost CK-MB = ΔΕ/minuta X 4 X 3500 jednotek/litr měření při 340 nm: objemová účinnost CK-MB — ΔΕ/minuta X X4 X 3376 jednotek/litr, měření při 366 nm:

objemová účinnost CK-MB = ΔΕ/minuta X X 4 X 6364 jednotek/litr.

Příklad 3

Test II ke kvantitativnímu stanovení· účinnosti CK-MB v tělesných tekutinách

a) Složení · zkušebního balíčku .

Balíček stačí pro 30 stanovení účinnosti. Obsahuje 1 nádobku s obsahem pufru pro 30 stanovení a 30 · nádobek lyofilizované směsi, sestávající z koenzymu, enzymu, substrátu a protilátky proti CK-MM, vyrobené způsobem podle příkladu Ba.

Množství triethanolaminace-tátu obsažené v nádobce v roztokem pufru odpovídá množství udanému v příkladu 2a. Jednotlivé nádobky s obsahem' koenzymu, enzymu, substrátu a protilátky proti CK-MM, získané způsobem podle příkladu Ba odpovídají 3 složkám, svrchu zmíněným v příkladu 2a a mimoto· obsahují protilátky proti CK-MM, která úplně blbkuje až 100 jednotek/litr CK-MM.

b) Stanovení účinnosti CK-MB bl) Provedení . K obsahu nádobky se směsí koenzymu, enzymu, substrátu a protilátky proti CK-MM se pipetou přidá 2,0 ml roztoku pufru a 0,1 ml séra. Směs se promíchá a inkubuje 5 minut · při teplotě 25 °C, načež se vlije do kyvety a 5 m.inut se měří extinkce při 25 °C při vlnové délce 334, 340 nebo 366 nm při tloušťce vrstvy 1 cm.

b2) Výpočet

Z rozdílu extinkce za minutu ΔΕ/minuta se vypočítá střední hodnota a tato hodnota se · dosadí do odpovídajícího vzorce:

měření při 334 nm: objemová účinnost CK-MB = ΔΕ/minuta X X 70Ό0. jednotek/litr měření při 340 nm:

objemová účinnost CK-MB = ΔΕ/minuta X

X 6752 jednotek/litr měření při 366 nm: objemová účinnost CK-MB = ΔΕ/minutaX X12 728 jednotek/litr.

Příklad 4

Současné stanovení celkové účinnosti CK a účinnosti CK-MB

a) Složení Zkušebního balíčku

Složení zkušebního balíčku odpovídá složení balíčku z příkladu 2a.

b) Stanovení celkové účinnosti CK a účinnosti CK-MB bl) Provedení

Do- nádobky se směsí koenzymu, enzymu a substrátu se přidá 2,0 ml roztoku pufru a 0,1 ml séra nebo zředěného séra. Směs se promísí a inkubuje se 5 minut při teplotě 25°C, -načež se vlije do kyvety a 2 minuty se měří změna extlnkce (ΔΕ1) při 25 °C. Pak se přidá 0,1 ml roztoku protilátky, směs se okamžitě promíchá a po 3 minutách se znovu měří změna extinkce - (ΔΕ2) při teplotě 25- °C při vlnové délce 334, 340 nebo 366 nm a tloušťce vrstvy 1 cm.

b-2J Výpočet

Celková účinnost CK se vypočítá následujícím způsobem:

měření při 334 nm:

objemová účinnost CK = -ΔΕΙ/minuta X X 3500 jednotek/litr, měření při 340 nm: objemová účinnost CK = ΔΕΙ/minuta X X 3376 jednotek/litr, měření při 366 nm: objemová účinnost CK — ΔΕΙ/minuta X 6364 jednotek/litr,

Účinnost CK-MB se vypočítá následujícím způsobem:

měření při 334 nm: objemová účinnost CK-MB = AE2/minutaX

X 7350 jednotek/litr, měření při 340- nm: objemová účinnost CK-MB = AE2/ininutaX X 7090 jednotek/litr, měření při 366 -nm: objemová účinnost CK-MB = AE2/minuta X X 13 364 jednotek/litr.

Příklad 5

Stanovení účinnosti CK-MB u nemocných se srdečním infarktem a bez infarktu při použití zkušebního balíčku podle příkladu 3

a] Účinnost CK u různých skupin nemocných

Počet příDadů

Střední hodnota účinnost CK účinnost CK-MB (jednotky/litr) - (jednotky/litr) nemocný se zvýšenou účinností CK bez srdečního infarktu 48 nemocný se srdečním infarktem 5

480

510 <1,7

Z tabulky ze zřejmé, že způsobem podle vynálezu je možno· rychle a jednoznačně od sebe odlišit případy se srdečním infarktem.

b) Průběh účinnosti СК-MB u nemocných se srdečním infarktem.

Hodiny po vzniku infarktu	CK-MB (jednotky/litr)
3,5	< 5
4,5	< 5
5,5	6
7,5	22
8,5	23
9,5	29
10,5	50
11,5	46
13,5	56
15,5	55
17,5	64
21,5	62
25,5	50
29,5	42
33,5	25
43,5	18
53,5	< 5
61,5	< 5

Údaje ukazují vzestup a opětný pokles účinnosti СК-MB u nemocných se srdečním infarktem, tak jak je možno jej stanovit způsobem podle vynálezu.

Výroba výchozích látek

Příklad A

Výroba CK-MM

a) 1,2 kg na velmi nízkou teplotu zmrazeného lidského kosterního svalu se nechá roztát při teplotě místnosti a homogenizuje. Tkáň se uvede v suspenzi ve 2,5 litrech chladného 0,05 M trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8,0 [pufr s tris-(hydroxymethyl Jaminomethanem a kyselinou chlorovodíkovou], který obsahuje ještě 0,01 M KC1 a 1 mmol kyseliny ethylendiamintetraoctové a 1 rnmolem dithioerythritu, načež se výsledná směs ještě homogenizuje v mixéru. Homogenát se míchá 45 minut za chlazení ledem a pak se odstřeďuje 60 minut při 12 000 g. 2,680 litrů čirého supernatantu se podrobí frakcio<naci síranem amonným při pH 8,0 v rozmezí 40 až 75 % nasycení. Sraženina při 0,75 s se smísí s 0,04 M trispufrem s kyselinou chlorovodíkovou o· pH 8,0 a dialyzuje se proti témuž pufru. К adsorpci mioglobinu a kyselých balastních bílkovin se užije 500 g vlhkého zásaditého iontoměniče na podkladu zesítněného dextranu v tomtéž pufru. Po 30 minutách se iontoměnič oddělí a dvakrát se promyje 400 ml téhož pufru pokaždé s příměsí 0,02 M chloridu sodného. Filtrát a pro mývací kapalina se slijí a nasytí se síranem amonným na 0,75 s. Sraženina se oddělí odstředěním, rozpustí se ve 100 ml 0,04 M trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8,0 a dialyzuje se proti témuž pufru tak dlouho, až není možno zjistit žádný síran amonný.

Čirý dialyzát se nanese na sloupec zásaditého iontoměniče na podkladu zesilněného dextranu o rozměrech 6 X 60 cm v tomtéž pufru. Sloupec se vymývá tímtéž pufrem tak dlouho, až je eluát prostý bílkovin. Pak se vymývá ze sloupce enzym 0,04 M trispufrem s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8 is obsahem 0,02 M NaCl, 1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové a 1 mM ditliioerythritu. Frakce s obsahem enzymu alespoň 20 jednotek/ml se slijí, sytí se síranem amonným na 80 % a vysrážený enzym se oddělí odstředěním. Nakonec se enzym čistí chromatografií na svrchu uvedeném systému, jen použitý sloupec má menší objem. Čištěné aktivní frakce se slijí a enzym se sráží síranem amonným o 0,8 s, načež se rozpustí v 50 ml 0,04 M trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8,0 .s obsahem 0,02 M NaCl, 1 mM kyseliny ethylendiamin-tetraoctové a 1 mM dithioerythritu, zfiltruje se za sterilních podmínek a znovu se sytí síranem amonným na 80 %. Tímto způsobem se získá při 4 °C stálá enzymatická suspenze CK-MM se specifickou účinností 26 až 30 jednotek/mg, měřeno při použití kreatinu jako substrátu při teplotě 25 st. Celsia.

Objem: 86 ml, účinnost: 316 jednotek/ml, obsah bílkovin: 11,8 mg/ml. Výtěžek 30 °/o, vztaženo na extrakt orgánu.

b) Analogicky jako v příkladu Aa) se izoluje CK-MM ze svalové tkáně opice Rhesus, vepře a skotu.

Příklad В

Výroba protilátky pro CK-MM

a) CK-MM z lidského svalu se dialyzuje proti fyziologickému roztoku chloridu sodného' o pH 7,0 s přísadou 0,07 M triethanolaminu jako pufru, 10 mM merkaptoethanolu a 10 mM chloridu hořečnatého. Enzymatický roztok se uvolní v ultraodstředivce a obsah bílkovin se upraví dialyzačním pufrem na 2 mg/ml. 1 ml tohoto roztoku se emulguje s 1 ml kompletního Freundova pomocného činidla, které sestává ze suspenze vody a minerálního oleje, která obsahuje ještě 2 mg usmrcených M-tuberkulózních baktérií. Tato emulze se vstřikuje nitrosvalově kozám. Po 3 stejných injekcích v odstupu 3 týdnů a 3 dalších injekcí boosterinu vždy v odstupu 16' týdnů se odebírá 21 dnů po poslední injekci krev. Sérum se získá známým způsobem, směsí 3 % ovčího sérového albuminu a 0,1 % azidu sodíku v 0,1 M borátovém pufru se nastaví na pH 8,4 a zfiltruje se za sterilních podmínek.

Získaný roztok, který obsahuje protilátku proti СК-MM z lidského svalu se plní po 0,5 ml do hnědých skleněných nádobek a lyofilizuje. Protilátky mají molekulovou hmotnost 160 000 až 180 000.

b) СК-MM, získaný podle příkladu Aa z lidského svalu se dialyzuje proti fyziologickému roztoku chloridu sodného o pH 6,8 s obsahem 7,5 mM N-acetylcysteinu a 25 mM octanu horečnatého s přísadou 0,1 M imidazolu jako pufru. Pak se enzymatický roztok uvolní v. ultraodstředivce a obsah bílkoviny se dialyzačním pufrem nastaví na hodnotu 0,2 mig/ml. 1 ml tohoto roztoku se emulguje s 1 ml kompletního Freundova pomocného činidla. Vzniklá emulze se vstřikuje nitrokožně skopcům. Po 3 až 6 týdnech. se vstřikuje ještě druhá a třetí nltrosvalová injekce a pak se vstřikují ještě 3 injekce boosterinu vždy v -odstupu 14 týdnů. 19 dní po poslední injekci se odebírá krev. Zpracování se provádí obdobným způsobem jako v příkladě Ba, čímž se získá protilátka proti СК-MM lidského svalu v lyofilizované f-ormě. Molekulová hmotnost protilátky je 160 000 až 180 000.

c) СК-MM ze svalu opise Rhesus se dialyzuje proti fyziologickému roztoku NaCl o pH 6,8 s přísadou 0,15 M imidazolu jako· pufru, 25 mM dithioerythritu a 15 mM chlo-

Claims

PŘEDMĚT

1. Způsob stanovení účinnosti kreatinkinázy MB ve vzorku tělesné tekutiny, vyznačující se tím, že se tento vzorek inkubuje s protilátkami, získanými očkováním zvířat kreatinkinázou MM lidského původu, předem aktivovanou použitím látek, stabilizujících. a aktivujících skupinu SH- a/nebo dvoumocnými kovovými ionty, s výhodou ionty hořčíku, manganu, vápníku a/nebo kobaltu, vzniklé protilátky se izolují, načež se účinnost podjedno-tky В kreatinkinázy po přidání substrátu pro kreatinkinázu měří foitometricky.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vzorek tělesné tekutiny a protilátky inkubuje za přítomnosti substrátu ridu manganatého. Po odstranění agregátu v ultraodstředivce se upraví obsah bílkovin svrchu uvedeným dialyzačním pufrem na hodnotu 5 mg/ml. 1 ml získaného- roztoku se emulguje s 1 ml kompletního Freundova pomocného prostředku. Fočet injekcí, odběr krve a zpracování získaného materiálu se provádí obdobným způsobem jako v příkladu Ba. Tímto způsobem se získá protilátka proti СК-MM ze svalu opice Rhesus v lyofilizované formě. Sedimentační konstanta této protilátky je 7 S.

d) СК-MM ze svalu vepře se aktivuje obdobným způsobem jako v příkladu Bb a emulze takto získaného· antigenu se vstřikuje králíkům s kompletním Freundovým pomocným činidlem. Po 3 týdnech následuje další podkožní injekce antigenu. Injekce se opakuje po dalších 3 týdnech, 19 dní po· poslední injekci se odebírá frakce. Zpracování se provádí obdobným způsobem jako v příkladu Ba. Získá se protilátka proti СК-MM ze svalu vepře v lyofilizované formě. Molekulová hmotnost takto získané protilátky je 160 000 až 180 000.

Zcela analogickým způsobem je možno získat ze svalu sketu protilátku proti CK-MM ze svalu skotu s molekulovou váhou 160 000 až 180 000.

YNALEZU kreatinkinázy, s výhodou kreatinu, kreatinfosfátu, adenosindifosfátu, adenosintrifosfátu a hořečnatých iontů.
3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se protilátky získají očkováním zvířat kreatinkinázou MM, která byla předem aktivována přidáním N-acetylcysteinu, merkaptoethanolu, glutathionu, dithioerythritu, dithioithreitu a/nebo S-t(2-aminoethyl)isothiouroniumbromidhydrobromidu jako· látek, stabilizujících a aktivujících thioskupinu.
4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se před inkubací vzorku tělesné tekutiny s protilátkou v tomtéž vzorku stanoví celková účinnost kreatinkinázy.