ES2325739T3

ES2325739T3 - Medicion enzimatica de mesilato de imatinib.

Info

Publication number: ES2325739T3
Application number: ES05824766T
Authority: ES
Inventors: Salvatore Salamone; Jodi Blake Courtney; Katherine Salamone
Original assignee: Saladax Biomedical Inc
Current assignee: Saladax Biomedical Inc
Priority date: 2004-11-18
Filing date: 2005-11-14
Publication date: 2009-09-15
Anticipated expiration: 2025-11-14
Also published as: EP1824992A1; EP1824992B1; JP2008520239A; EP1824992A4; HK1116517A1; DE602005014270D1; US20080113397A1; JP4664375B2; ATE430317T1; US20060105421A1; WO2006055453A1; US7300768B2

Abstract

Un ensayo enzimático para determinar la cantidad en una muestra de sangre o plasma humanos de un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo constituido por imatinib, sales de imatinib y sus metabolitos quimioterapéuticamente activos, que comprende: a) formar en un medio acuoso una mezcla que contiene dicha muestra de la que se sospecha que contiene dicho agente quimioterapéutico con una proteína tirosina quinasa abl que es inhibida por medio de dicho agente quimioterapéutico y un sustrato polipéptido que contiene NADH, sustrato que es capaz de convertir el NADH en NAD por medio de dicha quinasa, estando presente dicha quinasa en al menos una cantidad efectiva para convertir el NADH del sustrato en NAD; b) incubar dicha mezcla bajo condiciones que hacen que dicho agente quimioterapéutico de la muestra reaccione con dicha quinasa; c) medir a continuación la cantidad del NADH en el sustrato que se ha convertido en NAD; y d) cuantificar la cantidad del agente quimioterapéutico en la muestra en base a la cantidad de NADH convertida en el NAD medido.

Description

Medición enzimática de mesilato de imatinib.

Campo de la invención

La presente invención versa acerca del campo de los ensayos enzimáticos para determinar la presencia y/o cuantificar la cantidad de imatinib o de sus metabolitos farmacológicamente activos en fluidos biológicos humanos para determinar rápidamente las concentraciones óptimas de fármacos durante la quimioterapia.

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Antecedentes de la invención

Cáncer es un término utilizado para describir un grupo de afecciones malignas que comparten todas la característica común de desarrollarse cuando las células en una parte del cuerpo comienzan a desarrollarse de forma descontrolada. La mayoría de cánceres se forman como tumores, pero también pueden manifestarse en la sangre y circular a través de otros tejidos donde crecen. Lo más común es que las afecciones cancerosas malignas sean tratadas con una combinación de cirugía, quimioterapia y/o radioterapia. El tipo de tratamiento utilizado para tratar un cáncer específico depende de varios factores incluyendo el tipo de afección cancerosa maligna y la etapa durante la que fue diagnosticado.

El imatinib tiene la siguiente fórmula:

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y sus sales, particularmente el mesilato de imatinib, son uno de los agentes quimioterapéuticos más comúnmente utilizados que se emplean en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica con cromosoma Filadelfia positivo en fase blástica, en fase acelerada o en fase crónica. Este compuesto ha sido asociado con los efectos secundarios debilitantes como la hepatotoxicidad y la toxicidad hematológica, edemas, náuseas, vómitos, diarreas, calambres musculares, dolor musculoesquelético y sarpullidos. Al monitorizar los niveles de imatinib, sus sales o sus metabolitos farmacológicamente activos en el cuerpo y al ajustar la dosis, se pueden controlar mejor y limitar estos efectos secundarios en los pacientes (prospecto del envase de Gleevec, Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, Nueva Jersey, julio de 2004).

La sal preferida de imatinib es el mesilato de imatinib que tiene la fórmula:

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Dado que se ha asociado el imatinib con efectos secundarios debilitantes, al monitorizar los niveles de este agente quimioterapéutico en el cuerpo y al ajustar la dosis, se pueden controlar mejor y limitar estos efectos secundarios en los pacientes.

Cuando se administran imatinib o sus sales a los pacientes, a menudo hay una relación variable entre la dosis de imatinib o de su sal, y la resultante concentración del fármaco en suero de estos agentes quimioterapéuticos o de sus metabolitos farmacológicamente activos, que afecta el grado de efectividad y toxicidad clínica. Hay cuatro informes sobre el grado de variabilidad farmacocinética intra e interindividual del imatinib y de sus sales (véase el prospecto del envase de Gleevec, Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, Nueva Jersey, julio de 2004, Pindolia et al., Pharmacotherapy, 22: 1249-1265, 2002) y está afectada por muchos factores, incluyendo:

\circ: Función de los órganos

\circ: Regulación genética

\circ: Estado de la enfermedad

\circ: Edad

\circ: Interacción fármaco-fármaco

\circ: Tiempo de ingestión del fármaco

\circ: Cumplimiento

Como resultado de esta variabilidad, dosis iguales del mismo fármaco en distintos individuos pueden resultar en resultados clínicos drásticamente distintos. La efectividad del mismo imatinib o de sus sales varía significativamente en base a la depuración individual del fármaco y a la concentración final del fármaco en suero en el paciente. El tratamiento terapéutico con los fármacos proporcionaría al clínico un entendimiento sobre la variación de los pacientes en la administración de los fármacos. Con el tratamiento terapéutico con fármacos, se podrían individualizar las dosis de fármacos para el paciente, y la probabilidad de tratar el cáncer de manera efectiva sin los efectos secundarios no deseados sería mucho mayor.

Además, el tratamiento terapéutico con fármacos de imatinib o de sus sales serviría como una excelente herramienta para garantizar el cumplimiento en la administración de la quimioterapia con la dosis real recetada y el logro de los niveles efectivos de concentración en suero.

El tratamiento terapéutico rutinario con fármacos de imatinib o de sus sales requeriría la disponibilidad de pruebas simples automatizadas adaptables a un equipo general de laboratorio.

Se ha descrito el uso de cromatografía líquida (LC)-espectrometría de masa en tándem para determinar la concentración de imatinib, de sales de imatinib o de sus metabolitos quimioterapéuticos en sangre y plasma humano (Guetens, J Pharm Biomed Anal., 33 (5): 879-89 2003; Bakhtiar, J Chromatography B, 768 (2): 325-340, 2002; Titier, Ther. Drug. Monit., (27) 5: 634-640, 2005). También se ha desarrollado un procedimiento de LC para determinar la pureza del imatinib, de las sales de imatinib o de sus metabolitos quimioterapéuticos (Vivekanand, J Pharm Biomed Anal., 28 (6): 1183-94, 2002) pero no fue utilizado para determinar niveles en fluidos biológicos. Estos procedimientos conllevan mucho trabajo, utilizan equipos caros y no son susceptibles de un uso rutinario del laboratorio
clínico.

Se han descrito condiciones de ensayo para monitorizar la actividad de las proteínas tirosina quinasas utilizando ATP, en las que se marcó el fósforo con un isótopo radioactivo P^{32} en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de proximidad de centelleo, de fase sólida, de filtración y radioautográficos (Evans et al., J Biochem Biophys Methods, 50: 151-161, 2002; Park et al., Anal Biochem., 269: 94-104, 1999; Witt et al., Anal Biochem., 66: 253-258, 1975; Braunwalder et al., Anal Biochem., 234: 23-26, 1996; Schaefer et al., Anal Biochem., 261: 100-112, 1998). También se han desarrollado ensayos no radioisotópicos utilizando formatos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), fluorométricos, de polarización fluorescente (Yamato et al., Anal Biochem., 315: 256-261, 2003; Angles et al., Anal Biochem., 236: 49-55, 1996; Braunwalder et al., Anal Biochem., 238: 159-164, 1996; Seethala et al., Anal Biochem., 255: 257-262, 1998; Barker, Biochem., 34 (45): 14843-51, 1995).

Se desarrollaron estos procedimientos bien para detectar la actividad de la proteína tirosina en extractos biológicos o bien para una detección potencial de nuevos inhibidores de las tirosina quinasas. Además, estos procedimientos no son susceptibles de un uso en analizadores clínicos de rutina. Además, no proporcionan un procedimiento para cuantificar directamente el imatinib, sus sales o sus metabolitos terapéuticamente activos, en el plasma o suero del paciente para el propósito de una monitorización terapéutica del fármaco.

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Resumen de la invención

Se ha descubierto que la actividad de las enzimas tirosina quinasas abl, preferentemente la proteína tirosina quinasa bcr-abl y la proteína tirosina quinasa v-abl, es inhibida mediante ciertos analitos, particularmente imatinib, sus sales y sus metabolitos farmacológicamente activos. Por lo tanto, conforme a la presente invención, se ha descubierto que se pueden utilizar las enzimas tirosina quinasas abl, preferentemente proteína quinasa bcr-abl y la proteína v-abl o mezclas de las mismas, en un sustrato para llevar a cabo un ensayo enzimático eficiente y efectivo para determinar la presencia de analitos y/o cuantificar la cantidad de los mismos que inactivan estas enzimas de proteínas tirosina quinasas abl, particularmente imatinib, sales del mismo o los metabolitos farmacológicamente activos en muestras de paciente humano, en particular, muestras líquidas de paciente humano como suero o plasma
sanguíneo.

Además, se puede utilizar este ensayo enzimático para detectar y cuantificar la presencia de cualquier compuesto farmacológicamente activo, en particular agentes quimioterapéuticos que inhiben las enzimas de proteínas tirosina quinasas abl. El uso de los ensayos enzimáticos proporciona un procedimiento simple y económico que es susceptible de ser usado en un análisis tanto para detectar como para cuantificar estos analitos, particularmente imatinib, sus sales o sus metabolitos en muestras de paciente humano, utilizando experimentos normales de laboratorio para fines de monitorización terapéutica de los fármacos.

También en conformidad con la presente invención, se proporciona un kit para detectar y cuantificar estos analitos tal como imatinib, sus sales o sus metabolitos farmacológicamente activos en muestras de paciente para el propósito de monitorizar farmacéuticamente el fármaco.

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Descripción detallada de la invención

Conforme a la presente invención, se presenta un ensayo enzimático para detectar la presencia de los analitos que inactivan estas enzimas de proteínas tirosina quinasas abl, particularmente analitos como imatinib, sales de imatinib o metabolitos farmacológicamente activos de las mismas, en las muestras de los pacientes mediante el uso de las propiedades de las enzimas de proteínas tirosina quinasas abl, preferentemente proteína tirosina quinasa bcr-abl o proteína tirosina quinasa v-abl, para ser inactivadas por los analitos, particularmente imatinib, sales de imatinib o sus metabolitos farmacológicamente activos. Es por medio de esta propiedad que se consigue el ensayo enzimático para detectar la presencia de estos analitos, en particular los agentes quimioterapéuticos, en torrentes sanguíneos para una monitorización farmacéutica del fármaco.

Conforme a la presente invención, los ensayos enzimáticos bien para determinar la presencia o bien para cuantificar la cantidad de analitos, en particular los anteriores agentes quimioterapéuticos, que inactivan estas enzimas de proteínas tirosina quinasas abl se consiguen al formar en primer lugar en un medio acuoso una mezcla que contiene una muestra humana para la determinación de los analitos, en particular los agentes quimioterapéuticos mencionados anteriormente, la enzima de proteína quinasa abl, preferentemente proteína tirosina quinasa v-abl para proteína tirosina quinasa bcr-abl o mezclas de las mismas y un sustrato polipéptido que contiene NADH. El sustrato polipéptido, conforme a la presente invención, debería ser capaz de convertir el NADH en NAD mediante el uso de proteína tirosina quinasa abl. Conforme a una realización preferida de la presente invención, el sustrato polipéptido es un sustrato proteínico capaz de convertir el NADH en NAD mediante el uso de enzimas de proteínas tirosina quinasas abl. La mezcla mencionada anteriormente se incuba bajo condiciones que puedan causar que los analitos, particularmente el agente quimioterapéutico, en la muestra, reaccionen con la enzima. Después de la incubación, se mide la cantidad de NADH en el sustrato, que se convierte en NAD. Mediante el uso del ensayo enzimático, se puede detectar y/o cuantificar la presencia y las cantidades de estos analitos en las muestras de fluido corporal, preferentemente muestras de sangre o de plasma. De esta forma, se puede monitorizar un paciente que está siendo tratado con un material farmacológicamente activo que desactiva las enzimas de proteínas tirosina quinasas abl como el imatinib o las sales del mismo durante la terapia con fármacos y ajustarse su tratamiento conforme a los resultados de dicha monitorización. Mediante la presente invención se consigue el tratamiento terapéutico con fármacos de dichos materiales farmacológicamente activos, particularmente imatinib y sus sales en pacientes con cáncer que están siendo tratados con imatinib o sus sales como un agente quimioterapéutico.

Se puede detectar la presencia de los analitos, particularmente imatinib, sales de imatinib y los metabolitos farmacológicamente activos del imatinib o de sus sales, mediante la conversión del NADH en NAD, conversión que es inhibida por la presencia de estos analitos en la muestra del paciente. La presencia de NADH puede ser medida de manera óptica mediante la monitorización del cambio en absorción, preferentemente a una longitud de onda de 340 nm, es decir, la región característica de absorción del NADH, y este cambio en la absorción puede estar correlacionado con la presencia y la cantidad de los agentes quimioterapéuticos mencionados anteriormente en la muestra del paciente que inhiben la reacción enzimática que causa la conversión del NADH en NAD. Por lo tanto, la cantidad de NADH presente después de la incubación será directamente proporcional a la cantidad de los agentes quimioterapéuticos mencionados anteriormente en la muestra. En general, la cantidad de estos agentes quimioterapéuticos, en una muestra, se determina mediante correlación la cantidad medida de NADH en la presencia de estos agentes quimioterapéuticos en la muestra con valores de NADH determinados a partir de muestras de curvas estándar o de calibración que contienen cantidades conocidas de agentes que se encuentran en el intervalo esperado para la muestra que va a ser probada. Estos estudios para producir curvas de calibración se determinan utilizando el mismo procedimiento de ensayo enzimático que el que se utiliza para la muestra.

Conforme a la presente invención, el sustrato polipéptido preferido es un sustrato proteínico que contiene NADH que es capaz de convertir el NADH en un NAD por medio de una proteína tirosina quinasa abl, preferentemente proteína tirosina quinasa v-abl, proteína tirosina quinasa bcr-abl o mezclas de las mismas que contienen trifosfato de adenosina [ATP], un polipéptido que contiene tirosina, preferentemente una proteína, susceptible de fosforilación mediante tirosina quinasa, piruvato de fosfoenol [PYK] y lactato dehidrogenasa [LD]. Conforme a este sustrato preferido, se convierte el ATP en NAD mediante la siguiente serie de reacciones:

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En este sistema de reacciones, TK representa la enzima de proteína tirosina quinasa abl que puede ser preferentemente proteína tirosina quinasa v-abl, o proteína tirosina quinasa bcr-abl cuya actividad es inhibida por el imatinib, su sal o sus metabolitos activos. La ubicación de enlace del ATP de la enzima TK es inhibida mediante la presencia en la muestra del analito de forma que esta secuencia de reacción no produce ADP y a su vez no se convierte el NADH en NAD^{+}.

Conforme a la presente invención, el sustrato polipéptido que contiene NADH, que es capaz de convertir el NADH en NAD por medio de estas enzimas, puede ser utilizado para determinar la presencia en muestras humanas de cualquier agente quimioterapéutico que sea capaz de inactivar las enzimas de proteínas tirosina quinasas abl. Además, estas enzimas se desactivan por medio de los metabolitos farmacológicamente activos producidos por imatinib o por sales de imatinib que pueden estar presentes en las muestras del paciente. Al reaccionar con estos metabolitos, este ensayo enzimático produce un medio preciso y efectivo para monitorizar la terapia con fármacos por medio de la presencia de analitos, particularmente imatinib, sales de imatinib o sus metabolitos farmacológicamente activos en el torrente sanguíneo de los pacientes. La expresión farmacológicamente activo designa aquellos metabolitos de imatinib, o de sales de imatinib que actúan de una forma similar a los agentes quimioterapéuticos como imatinib o sales de imatinib.

Las enzimas de proteínas quinasas abl incluyendo la proteína tirosina quinasa bcr-abl y la proteína tirosina quinasa v-abl son enzimas conocidas obtenidas a partir de células de leucemia mieloide crónica como ATCC CCL243. La enzima de proteína tirosina quinasa bcr-abl ha sido descrita en el documento WO 03/031608 y en la publicación de patente U.S. 2003/070851 A1, publicada el 11 de septiembre de 2003. Su purificación y caracterización a partir de células de leucemia mieloide crónica se expone en O'Hare et al., Blood, 108 (8): 2532-2539, 2004 y Corbin et al., J. Biol. Chem., 277 (35): 32214-33219, 2004. La enzima de proteína tirosina quinasa v-abl es una enzima disponible comercialmente en Calbiochem y en New England Biolabs.

El ensayo enzimático de la presente invención se lleva a cabo con muestras de paciente que se sospecha que contienen imatinib, sales de imatinib y/o metabolitos farmacológicamente activos de las mismas. Cualquier muestra de la que se tenga una sospecha razonable de que pueda contener este agente quimioterapéutico puede ser analizada mediante este procedimiento de la presente invención.

Normalmente, la muestra es una disolución acuosa tal como un fluido corporal de un paciente humano, por ejemplo, orina, plasma sanguíneo completo, suero, saliva, semen, deposición, esputo, líquido espinal cerebral, moco o similares, pero preferentemente plasma o suero sanguíneo. Si se desea, se puede tratar y preparar previamente la muestra en cualquier medio conveniente que no interfiera con el ensayo. Se prefiere que la muestra sea suministrada en un medio acuoso dado que este ensayo se lleva a cabo preferentemente en un medio acuoso.

Se lleva a cabo el ensayo enzimático mediante la formación, en un medio acuoso, de la mezcla que contiene la muestra que se sospecha que contiene los agentes quimioterapéuticos mencionados anteriormente con la enzima de proteína tirosina quinasa abl, preferentemente proteína tirosina quinasa v-abl, proteína tirosina quinasa bcr-abl o mezclas de las mismas y un sustrato polipéptido que contiene NADH. El sustrato polipéptido para su uso en la presente invención es uno que es capaz de convertir el NADH en NAD por medio de las anteriores enzimas de proteína tirosina quinasa abl. Se puede utilizar cualquier sustrato polipéptido que sea capaz de convertir el NADH en NAD por medio de estas enzimas conforme a este ensayo.

El sustrato preferido comprende las siguientes coenzimas:

a): lactato dehidrogenasa; y

b): piruvato quinasa;

al igual que un sustrato polipéptido para la coenzima que, junto con las enzimas de proteínas tirosina quinasas abl, particularmente proteína tirosina quinasa bcr-abl y/o proteína tirosina quinasa v-abl, reacciona con ATP para causar la conversión del NADH en NAD. En general, este sustrato comprende el polipéptido que contiene tirosina susceptible de fosforilación mediante tirosina quinasa, piruvato de fosfoenol y trifosfato de adenosina (ATP). Conforme a la presente invención, se puede utilizar cualquier polipéptido que contenga tirosina, que incluye a las proteínas, susceptible de fosforilación mediante tirosina quinasa, como ovalbúmina, "Abl Peptide Substrate" de New England BioLabs, Abltide, de Upstate Biotechnology, caseína, polipéptidos de ácido glutámico y tirosina y albúmina de suero bovino, como el polipéptido que contiene tirosina en el sustrato polipéptido. El polipéptido preferido que contiene tirosina en este sustrato es una proteína que contiene tirosina que es susceptible de fosforilación tal como albúmina de suero bovino y caseína.

En el siguiente paso de la realización del ensayo, se incuba la mezcla acuosa de NADH, la muestra, el sustrato y la enzima de proteína tirosina quinasa abl, junto con las coenzimas en el medio acuoso para permitir que cualquier cantidad del analito en la muestra, particularmente imatinib, sales de imatinib y/o metabolitos farmacológicamente activos de las mismas que pueda estar presente en la muestra reaccione con las enzimas de proteína tirosina quinasa abl. La incubación tiene lugar simplemente al mezclar los reactivos y la muestra en el medio acuoso. En cualquier caso, ni la temperatura y ni la presión son críticas para llevar a cabo el paso de la incubación que permitirá que se detecte la presencia del agente quimioterapéutico en la muestra mediante el uso de los reactivos. Para llevar a cabo esta reacción, generalmente se utilizan temperaturas que varían desde los 10ºC hasta los 40ºC.

El pH al que se lleva a cabo el procedimiento de la presente invención no es crítico y puede variar desde 4 hasta 11, más normalmente en el intervalo de 5 a 10, y más preferentemente en el intervalo desde aproximadamente 6 hasta 8. Se pueden utilizar diversos tampones para conseguir y mantener un pH durante el procedimiento del ensayo. Los tampones representativos incluyen borato, fosfato, carbonato, Tris, barbital y similares. El tampón utilizado en particular no es crítico para la presente invención pero se prefieren los tampones de Tris y de fosfato.

La cantidad de los ingredientes activos de imatinib en la muestra del paciente puede ser medida mediante la medición de la tasa de conversión del NADH de la muestra convertido en NAD. Se puede utilizar cualquier medio convencional de medición de la conversión del NADH en NAD para llevar a cabo el ensayo. En conformidad con una realización de la presente invención, la tasa de formación de ADP se mide mediante la monitorización de la desaparición del NADH de forma espectrofotométrica a las longitudes de onda mencionadas anteriormente, preferentemente a una longitud de onda de 340 nm que es la región característica de absorción del NADH (Roon et al., Meth Enzymol., 174: 317, 1970; Roon et al., J Biol. Chem., 247: 4107, 1972; Roon et al., J Biol. Chem., 247: 7539, 1972). La concentración de los agentes quimioterapéuticos en esta muestra, que se somete al ensayo mencionado anteriormente, es directamente proporcional a la absorción del NADH. De una forma similar, se puede utilizar el ensayo de la presente invención para determinar los niveles de otros inhibidores de proteína quinasa abl que incluyen otros agentes quimioterapéuticos.

Al llevar a cabo el ensayo conforme a la presente invención, se utiliza una cantidad medida de muestra de la que se sospecha que contiene el analito que inhibe la enzima de proteína tirosina quinasa abl junto con concentraciones conocidas de las enzimas, coenzimas, sustratos péptidos y NADH. De esta manera, se forma la mezcla con cantidades conocidas o predeterminadas de los diversos componentes de forma que se pueda conseguir la calibración y la cuantificación para determinar la cantidad del analito en la muestra. De esta forma, se pueden determinar mediciones precisas de la cantidad del analito en la muestra.

Conforme a una realización preferida de la presente invención, se puede llevar a cabo la determinación de imatinib, de sales de imatinib y de metabolitos quimioterapéuticamente activos de las mismas mediante el ensayo de la presente invención, por medio de un procedimiento de tasa-ensayo en el que se mide el cambio en absorción del NADH por unidad de tiempo o por medio de un procedimiento de punto final en el que se apaga la reacción después de que haya transcurrido un cierto periodo de tiempo. Se puede aplicar fácilmente el procedimiento a analizadores automatizados para un análisis clínico o de laboratorio.

Material de calibración significa cualquier material estándar o de referencia que contiene una cantidad conocida del analito, es decir, imatinib, sales de imatinib o sus metabolitos farmacológicamente activos, para ser medida. Se ensayan bajo condiciones similares la muestra de la que se sospecha que contiene este analito y el material de calibración. Entonces, se calcula la concentración de analito al comparar los resultados obtenidos para la muestra desconocida con los resultados obtenidos para el estándar. Esto se lleva a cabo normalmente mediante la construcción de una curva de calibración que traza la concentración del fármaco con respecto a la absorción a 340 nm.

Se emplearán frecuentemente diversos materiales complementarios en un ensayo conforme a la presente invención. Por ejemplo, normalmente habrá tampones presentes en el medio de ensayo, al igual que estabilizantes para el medio de ensayo y los componentes del ensayo.

Frecuentemente, además de estos aditivos, se pueden incluir proteínas adicionales, como la albúmina, o tensioactivos, particularmente tensioactivos no iónicos, o similares.

Cualquier muestra de la que haya una duda razonable de que pueda contener el analito, es decir, sales de imatinib o metabolitos activos de las mismas u otros inhibidores de las enzimas de proteínas tirosina quinasas abl, preferentemente proteína tirosina quinasa bcr-abl o proteína tirosina quinasa v-abl, puede ser analizada mediante el procedimiento de la presente invención. Normalmente, la muestra es una disolución acuosa tal como un fluido corporal de un huésped, por ejemplo, orina, sangre completa, plasma, suero, saliva, semen, deposición, esputo, líquido espinal cerebral, lágrimas, moco o similares, pero es preferentemente plasma o suero. Si se desea, se puede tratar previamente la muestra y se puede preparar en cualquier medio conveniente que no interfiera con el ensayo. Se prefiere un medio
acuoso.

La medición de la cantidad de analito puede ser mediante procedimientos cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos, al igual que se consideran todos los demás procedimientos de medición procedimientos de medición de la cantidad del analito. Por ejemplo, se considera que un procedimiento que simplemente detecta la presencia o la ausencia del analito en una muestra de la que se sospecha que contiene imatinib, sales o metabolitos activos de las mismas que está incluido dentro del ámbito de la presente invención. Se contempla que los términos "detectar" y "determinar", al igual que otros sinónimos comunes de medición, estén dentro del ámbito de la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención versa acerca de kits conforme a las reivindicaciones 7-12 que son útiles para llevar a cabo de manera conveniente los procedimientos del ensayo de la invención para la determinación de este analito. Para aumentar la versatilidad de la presente invención, se pueden proporcionar los reactivos útiles en los procedimientos de la invención en una combinación de envases, en los mismos envases o aparte, en forma líquida o liofilizada en la que los reactivos están presentes en una cantidad predeterminada que proporciona una optimización sustancial del procedimiento y del ensayo. Los reactivos pueden estar cada uno en envases separados o se pueden combinar diversos reactivos en dos o más envases dependiendo de la reactividad cruzada y de la estabilidad de los reactivos. El kit de la presente invención contiene los reactivos, que son enzimas de proteínas tirosina quinasas abl, PYK y LH, sustratos de ATP polipéptido (receptor de fosfato), de NADH, de piruvato de fosfoenol (PEP) y diversos cofactores que optimizan la reacción. Normalmente, se combinan las enzimas y el sustrato polipéptido con un tampón apropiado y materiales complementarios y luego se envasan y se combinan otros sustratos para fabricar el segundo reactivo. Los reactivos pueden permanecer en forma líquida o liofilizada. Además, el kit puede comprender otros materiales envasados de calibración.

El kit de la presente invención está compuesto, por ejemplo, de los siguientes reactivos:

a): la enzima de proteína quinasa abl;

b): NADH; y

c): el sustrato polipéptido capaz de convertir el NADH en NAD por medio de la proteína quinasa abl.

En este kit, se debería envasar la enzima de proteína quinasa abl en envases separados del compuesto activo necesario en el sustrato que es ATP, en este caso. Sin embargo, el NADH y el sustrato y las coenzimas pueden estar envasados en un envase o en envases separados. De hecho, cada uno de los reactivos del sustrato puede estar envasado en envases separados o con la enzima de proteína quinasa abl siempre que el componente activo del sustrato, ATP, esté envasado aparte del compuesto activo.

El kit comprende los siguientes reactivos:

a): el componente de enzima que contiene proteína quinasa abl;

b): un polipéptido que contiene tirosina susceptible de fosforilación mediante tirosina quinasa;

c): piruvato quinasa;

d): lactato dehidrogenasa;

e): piruvato de fosfoenol;

f): NADH; y

g): ATP.

El compuesto activo en el sustrato es ATP. Por lo tanto, el reactivo ATP debe mantenerse en un envase separado del envase o envases que contienen el reactivo de enzima de proteína quinasa abl. De esta forma, el kit debe contener al menos dos envases separados.

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Cuando un kit contiene dos envases separados, el kit contiene un envase que contiene ATP y el otro envase contiene los reactivos a), b), c), d), e) y f). Conforme a otra realización, el kit contiene tres envases, uno que contiene ATP, el otro envase contiene los reactivos b), c), d), e), f) y g) y el tercer envase contiene el reactivo de enzima de proteína quinasa abl.

Si los envases contienen los reactivos en un medio acuoso líquido, los kits deberían exponer la concentración de cada uno de los reactivos en cada uno de los envases. La concentración de los reactivos, incluyendo las enzimas, las coenzimas, los sustratos de proteína y el NADH, son importantes para cuantificar la cantidad del analito, es decir, preferentemente imatinib, sales de imatinib y/o sus metabolitos activos en la muestra. Si los componentes en los envases están en forma de polvo, entonces se debería exponer el peso de cada uno de los reactivos contenidos en el envase bien en el envase, en el envase o en el prospecto del envase. De esta forma, se suministran con el kit las cantidades y/o las concentraciones predeterminadas de los reactivos necesarias para llevar a cabo el ensayo enzimático de la presente invención. Los reactivos necesarios para llevar a cabo el ensayo enzimático de la presente invención también pueden estar envasados con tampones y estabilizantes convencionales para conseguir y mantener el pH apropiado durante el procedimiento del ensayo. Los tampones representativos incluyen borato, fosfato, carbonato, Tris, barbital y similares. El tampón utilizado en particular no es crítico para la invención pero se prefieren los tampones de Tris y de fosfato. Conforme a la presente invención, los reactivos necesarios para llevar a cabo el ensayo enzimático pueden estar presentes en los envases en forma líquida o liofilizada.

Además, el kit puede comprender otros materiales envasados de calibración y/o de control. Estos materiales de calibración y/o de control son cualquier material estándar o al que se hace referencia que contenga una cantidad conocida de analito. Conforme a la realización preferida de la presente invención, se suministran uno o más envases separados que contienen muestras con cantidades conocidas del analito que va a ser medido. Aunque se puede utilizar una muestra con cantidades conocidas del analito que va a ser medido, en general, se prefiere tener de tres a cinco muestras o materiales distintos de control que contienen cantidades conocidas o predeterminadas del analito, cada uno a concentraciones distintas. De esta forma, se puede obtener una curva. La concentración del analito se calcula al comparar los resultados a partir de la muestra desconocida con los resultados obtenidos del estándar. Al llevar a cabo la calibración del estándar en la cantidad medida del analito, se lleva a cabo el ensayo utilizando las mismas condiciones y cantidades que se utilizan al ensayar la muestra que contiene la cantidad desconocida de
analito.

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Parte experimental

Se obtendrá una comprensión más completa de la presente invención haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

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Abreviaturas experimentales

ATP: Trifosfato de adenosina

BSA: Albúmina de suero bovino

DTT: Ditiotreitol

EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético

LH: Lactato dehidrogenasa

MgSO_{4}: Sulfato de magnesio

NADH: Dinucleótido reducido de nicotinamida y adenina

PEP: Piruvato de fosfoenol

PYK: Piruvato quinasa

KCl: Cloruro de potasio

TK: Tirosina quinasa abl

TRIS: 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol

En los ejemplos a continuación, se prepararon tres reactivos, comprendiendo el primero dos enzimas PYK y LH con albúmina de suero bovino (BSA), PEP y NADH y el segundo TK y comprendiendo el tercer reactivo ATP, PEP, PYK, LH y NADH. En los ejemplos, se combinó BSA con el primer reactivo que contenía PYK y LH debido a los efectos estabilizantes de la BSA sobre las enzimas; sin embargo, de manera alternativa, en vez de ello, se podría incorporar BSA en la botella del reactivo de sustrato. Se pueden postular otras combinaciones y perturbaciones entre los expertos en la técnica.

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Ejemplo 1

Expresión y purificación de quinasa GST-abl

Se cultivaron células de una cepa bacteriana, BL21 (DE3) LysS que expresa quinas GST-abl, en 3L de LB, 100 ug/ml de ampicilina de OD600 = 0,5 a 28ºC y se indujo con 0,5 mM de IPTG durante 20 h. (Foulkes et al., J. Biol Chem 260 (13), pp 8070-8077, 1985 al. Oncogene 15, pp 2249-2254, 1997).

Se recogieron las células mediante centrifugado y se volvieron a poner en suspensión en D-PBS sin Ca^{2+}/Mg^{2+} que contenía 0,4% de Triton-X-100 (tampón A). Entonces, se lisaron las células mediante sonicación en la presencia de un cóctel inhibidor de la proteasa completamente libre de EDTA (Rouche). Se clarificó el lisado mediante centrifugado durante 30 min a 35.000 \times g. y una filtración subsiguiente a través de membranas de acetato de celulosa de 0,22 \mum (Corning).

Se purificó la quinasa GST-abl mediante FPLC (Amersham Biosciences) utilizando una columna GSTRAP HP de 1 mL. Después del equilibrio de la columna con el tampón A, se cargó el lisado (\sim 300 ml) durante la noche a un caudal de 0,22 mL/min. Se lavó la columna consecutivamente con 10 volúmenes tanto del tampón A como del tampón B (D-PBS sin Ca^{2+}/Mg^{2+}). Se eluyó la proteína con el tampón C (100 mM de Tris con un pH de 8,0, 150 mM de NaCl, 30 mM de glutationa reducida), suplementada con 1 volumen de 80% glicerol, y almacenada a - 20ºC.

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Ejemplo 2

Detección de la inhibición de mesilato de imatinib de tirosina quinasa utilizando una reacción enzimática acoplada

Para detectar la inhibición de TK mediante mesilato de imatinib en una muestra se mezclaron los siguientes tres reactivos en una microcubeta (1 por repetición de muestra) y se incubaron a 37ºC con la muestra. La adición de reactivos, incubación de cubetas y la monitorización de las reacciones mediante lecturas de absorción a 340 nm se llevaron a cabo con un analizador clínico de sobremesa automatizado (COBAS MIRA, Roche Diagnostics Corp., Indianápolis). Se utilizó este analizador por la comodidad de la automatización. También se podría llevar a cabo el ensayo mediante adición manual a cualquier cubeta, que permita la mezcla, la incubación a 37ºC y que pueda ser medida a 340 nm en un espectrofotómetro.

El primer reactivo que contenía las enzimas PK (141 unidades, 0,024 mg/mL), LH (74,6 unidades, 2,98 unidades/mL) y el sustrato PEP (0,78 mg/mL) en un tampón comprendía 50 mM de Tris, 20,8 mg/mL de BSA, 200 mM de DTT, 144 uM de EDTA, 52 mM de KCl, 9 mM de MgSO_{4}, pH de 8. Se añadieron 150 uL del primer reactivo a la microcubeta. Después de que se incubó el reactivo a 37ºC durante 25 segundos, se añadió la muestra que contenía mesilato de imatinib (disuelto en 50 mM de tampón TRIS con un pH de 8). Para la adición de la muestra se aspiraron 20 uL de diluyente (50 mM de TRIS, pH de 8) en la aguja de muestreo del analizador, seguido de 10 uL de la muestra. Se repartieron juntos la muestra y el diluyente dentro de la microcubeta, y entonces se mezclaron. En este instante no se produce ninguna reacción, ya que no hay TK presente en la mezcla de la reacción. Después de una incubación adicional de 25 segundos a 37ºC se añadieron 25 uL de reactivo TK (0,5 mg/mL de TK en un tampón de TRIS de 50 mM, 1,05 mg/mL de BSA, 100 uM de DTT, 54 uM de KCl, 8,3 uM de MgSO_{4}, 0,14 uM de EDTA, pH de 8) con 25 uL de diluyente (50 mM de TRIS, pH de 8), después de la adición se mezclaron los contenidos de la microcubeta. Se incubó la mezcla durante unos 25 segundos adicionales a 37ºC. Aún no tiene lugar ninguna reacción ya que no hay ATP en la mezcla. Después de la incubación, se añade el reactivo 3: 3,4 mg de ATP en el anterior reactivo 1. Se añadieron 25 uL de reactivo 3 con 25 uL de diluyente seguido de la mezcla. La conversión de ATP a ADP mediante TK se produce en la cubeta de reacción. En presencia de ADP piruvato de fosfoenol se convierte en piruvato mediante PK. En presencia de piruvato generado mediante la reacción enzimática PK la LD reduce el NADH a NAD. El NADH se absorbe a 340 nm, y se monitorizó su desaparición a esta longitud de onda al tomar lecturas cada 25 segundos durante 1,175 segundos. Se calculó la tasa de reacción por minuto como el cambio en absorción de 340 nm por unidad de tiempo a partir de la pendiente de absorción con respecto al
tiempo.

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Ejemplo 3

Curva estándar con mesilato de imatinib

Se prepararon estándares que contenían mesilato de imatinib como sigue. Se añadió 1,8 mg de mesilato de imatinib (Sequoia Research Products Ltd, Inglaterra) a 4,5 mL de un tampón de fosfato (50 mM, pH de 5,4). Se diluyó esta disolución a 1:100 (20 \muL en 1,88 mL) en un tampón de tris (50 mM, pH de 8,0) para producir una disolución de 4000 ng/mL. Esta disolución fue diluida subsiguientemente para producir estándares de 4000, 1000, 500, 250 y 125 ng/mL. Se midieron estos estándares como muestras en el ejemplo 2. Se trazó el cambio en absorción (tasa) para cada estándar con respecto a la concentración del fármaco. La cantidad de fármaco es inversamente proporcional a la concentración de NAD^{+} o es directamente proporcional a la concentración de NADH. Se calcularon las concentraciones de mesilato de imatinib al comparar la tasa de reducción del NADH en una muestra desconocida con la tasa de reducción del NADH mediante los estándares que contenían cantidades conocidas de mesilato de imatinib.

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TABLA 1 Curva estándar de mesilato de imatinib

4

Claims

```
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```
1. Un ensayo enzimático para determinar la cantidad en una muestra de sangre o plasma humanos de un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo constituido por imatinib, sales de imatinib y sus metabolitos quimioterapéuticamente activos, que comprende:

a)

formar en un medio acuoso una mezcla que contiene dicha muestra de la que se sospecha que contiene dicho agente quimioterapéutico con una proteína tirosina quinasa abl que es inhibida por medio de dicho agente quimioterapéutico y un sustrato polipéptido que contiene NADH, sustrato que es capaz de convertir el NADH en NAD por medio de dicha quinasa, estando presente dicha quinasa en al menos una cantidad efectiva para convertir el NADH del sustrato en NAD;

b)

incubar dicha mezcla bajo condiciones que hacen que dicho agente quimioterapéutico de la muestra reaccione con dicha quinasa;

c)

medir a continuación la cantidad del NADH en el sustrato que se ha convertido en NAD; y

d)

cuantificar la cantidad del agente quimioterapéutico en la muestra en base a la cantidad de NADH convertida en el NAD medido.
2. Un ensayo enzimático conforme a la reivindicación 1, en el que el sustrato además de NADH contiene:

a)

trifosfato de adenosina;

b)

un polipéptido que contiene tirosina susceptible de fosforilación mediante tirosina quinasa;

c)

piruvato fosfoenilo

d)

lactato dehidrogenasa; y

e)

piruvato quinasa.
3. Un ensayo enzimático conforme a la reivindicación 2, en el que dicho polipéptido que contiene tirosina susceptible de fosforilación es albúmina de suero bovino.
4. Un ensayo enzimático conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas enzimas quinasas abl son proteína tirosina quinasa v-abl, proteína tirosina quinasa bcr-abl o una mezcla de las mismas.
5. Un ensayo enzimático conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente quimioterapéutico es mesilato de imatinib.
6. Un ensayo enzimático conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cantidad de agente quimioterapéutico en dicha muestra está cuantificada mediante la comparación de la cantidad medida de NADH convertida en NAD en la muestra con esa cantidad de NADH convertida en NAD en una o más muestras que contienen cantidades conocidas de dicho agente quimioterapéutico que utiliza el mismo ensayo.
7. Un kit para llevar a cabo un ensayo enzimático para cuantificar en una muestra humana la cantidad de un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo constituido por imatinib, sales de imatinib y sus metabolitos quimioterapéuticamente activos, que comprende

1)

al menos dos envases separados de reactivos que contienen una cantidad predeterminada de los siguientes reactivos:

a)

un primer componente de enzima que contiene una proteína tirosina quinasa abl que es inhibida mediante dicho agente quimioterapéutico;

b)

piruvato quinasa;

c)

un polipéptido que contiene tirosina susceptible de fosforilación mediante tirosina quinasa;

d)

lactato dehidrogenasa;

e)

piruvato de fosfoenol;

f)

NADH; y

g)

ATP;

\quad

en el que el ATP se encuentra en un envase separado de reactivo del envase o envases de reactivo que contienen el primer componente de enzima; y
```
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```
2)

uno o más envases separados de no reactivo, conteniendo cada uno de dichos envases de no reactivo una muestra que tiene una cantidad predeterminada del agente quimioterapéutico que va a ser cuantificado.
8. Un kit conforme a la reivindicación 7, en el que dicho polipéptido que contiene tirosina susceptible de fosforilación es albúmina de suero bovino.
9. Un kit conforme a la reivindicación 7 u 8, en el que dicha proteína abl es proteína tirosina quinasa v-abl, proteína tirosina quinasa bcr-abl o una mezcla de las mismas.
10. Un kit conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que los reactivos están presentes en los envases de reactivo en un medio acuoso que contiene un tampón y un estabilizante.
11. Un kit conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que los reactivos están presentes en dos envases separados de reactivo, conteniendo uno de dichos envases de reactivo ATP, conteniendo el otro envase de reactivo los reactivos b), c), d), e), f), g) y el primer componente de enzima del reactivo a).
12. Un kit conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que los reactivos están presentes en tres envases separados de reactivos, conteniendo un envase de reactivo ATP, conteniendo el segundo envase de reactivo el primer componente de enzima y conteniendo el tercer envase de reactivo los reactivos b), c), d), e) y f).