JPH02181654A - 抗酵素抗体価の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、抗酵素抗体価の測定方法に関する。

さらに詳細には、抗原抗体反応を利用した抗酵素抗体価
の測定方法に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］酵素は
医薬、生化学試薬等として広く用いられており、酵素は
通常、生体、菌体等から単離、精製される。酵素の純度
の検定、単離手段として抗酵素抗体を使用する方法が知
られているが、抗酵素抗体は酵素で免疫された動物の血
清より得られるので、上記の目的に使用するには、得ら
れた抗酵素抗体の抗体価を求める必要があり、抗原感作
血球を用いた逆受身赤血球凝集反応（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ
Ｐａｓｓｌｖｅ　Ｈｅｓａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｓ
以下ＲＰＨＡ法という）、ラジオイムノアッセイ等によ
り測定されている。さらに詳細に説明すると、例えば、
ウロキナーゼは線溶作用を有する酵素で、医薬として用
いられており、尿や腎細胞培養物からの抽出、遺伝子組
換え技術等により製造されている。ウロキナーゼに対す
る抗体である抗ウロキナーゼ抗体は、ウロキナーゼで免
疫された動物（例えば、馬、ウサギ、羊等）の血清から
得られ、夾雑蛋白等を含むので、その抗体価を求める必
要がある。抗ウロキナーゼ抗体の抗体価の測定方法とし
ては、従来、ＲＰＨＡ法により測定されている。この方
法は、抗体価未知の抗ウロキナーゼ抗体試料液を倍々希
釈して希釈試料液列を調製する。また、既知抗体価の抗
ウロキナーゼ抗体溶液を同様に倍々希釈して希釈陽性コ
ントロール波列を調製する。このようにして調製された
希釈試料液列及び希釈陽性コントロール波列の各々に、
グルタルアルデヒド固定化赤血球にウロキナーゼを感作
させて調製した抗原感作血球の浮遊液を添加し、希釈試
料液と希釈陽性コントロール液との血球の凝集状態を比
較し、対応する希釈陽性コントロール液の抗体価より、
試料液の抗体価を求めるものである。

しかしながら、この方法によると、■感作血球の感度が
一定しないため、抗体価も感作血球の調製毎に変動する
；■測定者の主観が入りやすく、また試料液が倍々希釈
されているので、ルベルの判定の違いにより抗体価が１
／２〜２倍変動する；■試料中の夾雑物の影響を受けや
すいというような問題があり、抗体の収率、純度の正確
な把握が困難である。また、上記のＲＰＨＡ法は、使用
する試薬類の調製及び保存、測定操作等が煩雑であると
いう問題がある。

またラジオイムノアッセイ法は特殊な装置や設備を必要
とし、さらに放射性物質の取扱の問題がある。

本発明は、上記の従来技術の欠点を解消するために創案
されたもので、測定操作及び試料の調製が簡便であると
ともに高精度で測定できる抗酵素抗体価の測定方法を提
供するものである。

［課題を解決するための手段及び作用］上記の課題を解
決すべくなされた本発明の抗酵素抗体価の測定方法は、
抗酵素抗体を含む試料液と酵素との混合液に、酵素の基
質（以下、酵素基質という）を加え、該基質の変化を測
定することを特徴とするものである。

本発明は上記の構成よりなり、抗酵素抗体と酵素とを混
合して抗原抗体反応を起こさせるとき、抗酵素抗体の量
に比例して酵素活性が低下することを利用し、この酵素
活性の低下を酵素基質を用いて測定するもので、一定量
の酵素及び酵素基質を用いることにより、酵素基質の変
化の程度から抗酵素抗体の量が求められる。即ち、試料
液中の抗酵素抗体量が多い場合には、酵素活性が大きく
低下するので基質の変化が少なく、逆に抗酵素抗体量が
少ない場合には、酵素活性の低下が少ないので基質の変
化が大きいことになる。

本発明の測定方法は、抗酵素抗体を含・む被検液を緩衝
液で適当な抗体価となるように希釈して試料液とし、こ
れと所定量の酵素を含有する緩衝液とを混合し、所定時
間放置し、次いで所定量の酵素基質を添加し、所定時間
反応させた後、該酵素基質の変化を測定することにより
行われる。

本発明の測定対象である抗酵素抗体の由来は特に限定さ
れず、対象とする酵素で免疫された動物（例えば、馬、
ウサギ、羊等）の血清から得られた抗酵素抗体が挙げら
れる。また使用される緩衝液は、酵素及び抗酵素抗体の
種類に応じて適宜選択される。

酵素は常法により精製されたものが使用される。

酵素の使用量は、試料液中の抗酵素抗体量よりもやや過
剰とする。酵素量が試料液中の抗酵素抗体量よりも少な
いと酵素活性の殆どが阻害され基質との酵素反応が十分
に起こらず、また抗酵素抗体量より大過剰であると抗酵
素抗体による酵素の阻害が少なくなり測定精度の低下を
もたらす。

本発明において、酵素基質の変化を測定する方法は、酵
素基質の種類に応じて適宜選択することができ、例えば
、酵素基質の量的変化を測定する方法、酵素基質の変化
時間を測定する方法等が例示される。前者の方法として
は、例えば、酵素基質の変化を酵素基質自身の吸光度変
化にて測定する方法、酵素基質として発色性合成基質を
用い、該酵素基質の変化を酵素反応生成物の吸光度又は
螢光分析により測定する方法等の比色定量法が簡便且つ
定量性に優れるので好ましい。上記の発色性合成基質は
酵素の種類により適宜選択され、例えば、酵素ウロキナ
ーゼにあってはペプチド−メチルクマリルアミド類［例
えば、グルタリルグリシルーＬ−アルギニンー４−メチ
ル−７−クマリルアミド（以下、ｐ−ＭＣＡという）な
ど］、］ペプチドーｐ−ニトロアニリド類例えば、ピロ
グルタミルグリシル−し−アルギニン−ｐ−ニトロアニ
リド（以下、ｐ−ＰＮＡという）など］等が挙げられ、
前者はウロキナーゼとの酵素反応により、螢光発色性を
有する７−アミノ−４−メチルクマリンを生成し、励起
波長３７０ｒｖ　、螢光波長４６０ｎｍにおける螢光強
度を測定することにより基質の変化量が求められる。ま
た後者はウロキナーゼとの酵素反応でｐ−ニトロアニリ
ンを生成し、該化合物の４０５ｒｖの吸光度を測定する
により基質の変化量を求めることができる。螢光強度の
ＭＪ定及び吸光度の測定は慣用の方法にて行なうことが
できる。なお、酵素基質は適宜の緩衝液で適宜の濃度に
調整されたものが使用される。

また、酵素基質の変化時間を１ｆｌｌｌ定する方法とし
ては、酵素基質の溶解時間を測定する方法等が挙げられ
、例えば、ウロキナーゼの場合、基質としてフィブリン
を用いフィブリン溶解の時間を測定することにより酵素
基質の変化を測定することができる。

次に、本発明の測定方法の一例として、抗ウロキナーゼ
抗体価を螢光強度法にて測定する例をもって具体的に説
明する。

まず、検ｆｆｉ線の作成を行なう。それには、抗体価既
知の抗ウロキナーゼ抗体液を緩衝液で希釈し、抗体価の
異なる複数の標準抗ウロキナーゼ抗体液を作製する。こ
の各標準抗ウロキナーゼ抗体液を一定量とり試料液とし
、所定量のウロキナーゼを含有する緩衝液を加えインキ
ュベート（例えば、３７℃、２０分間）する。これに、
所定量のｐ−ＭＣＡを含有する緩衝液を加え、インキュ
ベート（例えば、３７℃、２０分間）する。次いで、１
５％酢酸を添加して反応を停止し、各試料液について、
励起波長３７０ｎｍ　ｓ螢光波長４６０ｎｍにおける螢
光強度を測定する。また抗ウロキナーゼ抗体を含まない
緩衝液を用い、同様な操作を行ないブランクの螢光強度
を求める。縦軸に螢光強度、横軸に抗ウロキナーゼ抗体
の抗体価をとり、各試料液の螢光強度からブランクの螢
光強度を差引いたものをプロットして検ｆｆｉ線を作成
する。

次いで、標準抗ウロキナーゼ抗体の代りに、抗体価未知
の試料液を用い、上記と同様な操作により、螢光強度を
求め、その螢光強度に対応する抗体価を上記検量線より
読取ることにより、試料液の抗ウロキナーゼ抗体価を求
めることができる。

上記で使用される緩衝液としては、ｐＨ８，０〜８．５
程度の緩衝液であればいずれのものも使用することがで
きるが、酵素反応の安定性の点から酸処理ゼラチン（日
周、医薬品各条、第二部「ゼラチン」参照）を約１％程
度含有するトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，４）を用いる
のが好ましい。試料液中の抗ウロキナーゼ抗体量は抗体
価が２５〜１００程度となるように上記緩衝液で調整さ
れたものを用いるのが好ましく、またウロキナーゼは５
００ＩＵ／１ｆ程度の溶液が使用される。

なお、本発明の測定方法は上記の例に限定されるもので
はなく、例えば、上記螢光強度をＤ１定する方法に代え
、ウロキナーゼ基質としてｐ−ＰＮＡを用い、生成する
ｐ−ニトロアニリンの吸光度を測定する方法を用いるな
どの他、抗酵素抗体の種類等に応じて適宜変更すること
ができる。

［実施例コ 以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、以下の実施例において使用するゼラチン緩衝液は下
記の方法により調製されたものである。

トリスヒドロキシメチルアミノメタン１２．１ｇ１塩化
ナトリウム５．８ｇ及びアジ化ナトリウム０．５ｇを水
７００　ｘｌに溶解する。別に酸処理ゼラチン（デイフ
コ社製バクトゼラチン）１０、Ｏｓ−を水２００１１に
加温して溶解する。

両液を合わせ、液温を２５℃とし、希塩酸を用いてｐＨ
を８．４に調整し、水を加えて１ｇとする。次いで、１
２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌をする。

実施例１ ゼラチン緩衝液に溶解した抗体価２５．５０及び１００
の標準抗つロキナーゼ馬抗体液０．１ｙｆを夫々試験管
に採取した。ウロキナーゼを含有するゼラチン緩衝液（
精製ウロキナーゼ５００ＩＵ／１！含有）を０．１１ｘ
ずつ添加し、混合した後、３７℃恒温水槽中で２０分間
インキュベートした。

次いで、ｐ−ＭＣＡを含有するゼラチン緩衝液（ｐ−Ｍ
ＣＡ濃度二〇、１２５ｍＭ）を０．８１１ずつ添加し、
混合した後、３７℃恒温水槽中で２０分間インキュベー
トした。１５％酢酸“を２　ｘｉずつ添加し、反応を停
止させた後、各試料について螢光強度（励起波長８７０
ｎ１１％螢光波長４８０ｒｖ　）を測定した。また抗ウ
ロキナーゼ抗体を含まない緩衝液を用い、同様な操作を
行ないブランクの螢光強度を求める。

縦軸に螢光強度、横軸に抗ウロキナーゼ抗体価をとり、
各試料の螢光強度からブランクの螢光強度を差引いたも
のをプロットしたところ、第１図に示されるように、抗
ウロキナーゼ抗体価１００程度までは直線性を有する検
量線が得られた。

実施例２ 常法に従ってウロキナーゼで免疫した馬から抗ウロキナ
ーゼ抗体を含有する血清１００　ｙｌを得た。

この血清を下記の条件下にカラム処理した。

（１）抗原カラム：ウロキナーゼを硬質の不溶性担体に
カップリングしたものを使用（カラムサイズ：φ３　ｃ
ｍ　Ｘ　３　、　５　ｃｍ　）■平衡化：０．５ＭのＮ
ａＣＮを含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０±０
．１）で３〜５ベツド流下 （３）洗浄：０．５ＭのＮａＣｌ２を含む０．１Ｍリン
酸塩緩衝液（ｐＨ７，０±０．１）で５〜１５ベツド流
下 （４）溶出：０，２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３゜
０±０．１）で３〜５ベツド流下 （５）流速：全工程２．５１１７分 （６）温度：５℃冷室 当初の血清並びに上記処理で得られた通過液、洗液及び
溶出液についてゼラチン緩衝液で適宜希釈した後、実施
例１に記載された操作と同様に処理し各試料の螢光強度
及びブランクの螢光強度をｎ］定した。次いで実施例１
で得られた検量線より抗ウロキナーゼ抗体価を求めた。

その結果を第１表に示す。なお、表中、螢光強度は、各
試料の螢光強度からブランクの螢光強度を差引いた値で
あり、２乃至３回の繰返実験の平均値である。第１表に
示されるように、抗ウロキナーゼ抗体の回収率は略妥当
な値であり、受身赤血球凝集反応法で時折認めらる異常
な回収率は認められなかった。従りて、本発明の測定方
法は信頼性の高い測定法であることが判明した。

（以下余白） ［発明の効果］ 以上のように、本発明の抗酵素抗体価の測定方法によれ
ば、操作が簡便であると共に従来法である受身赤血球凝
集法のような凝集像の肉眼判定と異なり、機械的に測定
することができるので客観的な判定が可能となり、測定
精度を高めることができる。また使用される試薬類の調
製も容易であると共にその保存性も良好なので試薬調製
の煩雑さが軽減できる。従って、本発明の方法によれば
、簡便にして且つ高精度で抗酵素抗体価を測定すること
ができるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のｎ１定方法による抗ウロキナーゼ抗
体価測定の検量線を示す。 第 図 特許出願人　　株式会社ミ　トリ十字

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗酵素抗体価の測定方法において、抗酵素抗体を含
   む試料液と酵素との混合液に、酵素の基質を加え、該基
   質の変化を測定することを特徴とする抗酵素抗体価の測
   定方法。 ２、基質の変化の測定方法が、酵素の基質と酵素との酵
   素反応生成物を測定するものである請求項１記載の抗酵
   素抗体価の測定方法。 ３、酵素の基質が、酵素との酵素反応により螢光性物質
   を生成するものである請求項２記載の抗酵素抗体価の測
   定方法。 ４、酵素がウロキナーゼであり、抗酵素抗体が抗ウロキ
   ナーゼ抗体である請求項１乃至３の何れかに記載の抗酵
   素抗体価の測定方法。