CZ20023876A3 - Způsob a reagenční kit pro stanovení aktivity 5´-nukleotidázy - Google Patents
Způsob a reagenční kit pro stanovení aktivity 5´-nukleotidázy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20023876A3 CZ20023876A3 CZ20023876A CZ20023876A CZ20023876A3 CZ 20023876 A3 CZ20023876 A3 CZ 20023876A3 CZ 20023876 A CZ20023876 A CZ 20023876A CZ 20023876 A CZ20023876 A CZ 20023876A CZ 20023876 A3 CZ20023876 A3 CZ 20023876A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- activity
- nucleotidase
- substrates
- nucleotide
- measured
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 101
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 102000004008 5'-Nucleotidase Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 56
- RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 14C-Guanosin-5'-monophosphat Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 29
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims abstract description 28
- AEOBEOJCBAYXBA-UHFFFAOYSA-N A2P5P Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1OP(O)(O)=O AEOBEOJCBAYXBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 claims abstract description 27
- IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N cytidine monophosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N Inosinic acid Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 20
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 19
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 claims abstract description 19
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 claims abstract description 8
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 230000005741 malignant process Effects 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- KQROHCSYOGBQGJ-UHFFFAOYSA-N 5-Hydroxytryptophol Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCO)=CNC2=C1 KQROHCSYOGBQGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940122720 Alkaline phosphatase inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 238000005375 photometry Methods 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 21
- -1 nucleotide pentose monophosphate Chemical class 0.000 abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 12
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 12
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 11
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 7
- 230000037360 nucleotide metabolism Effects 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 6
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000004144 purine metabolism Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 230000004147 pyrimidine metabolism Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 3
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 3
- 108010028584 nucleotidase Proteins 0.000 description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 2
- KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N deoxyadenylic acid Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 2
- 239000004052 folic acid antagonist Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 230000007925 protein solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000001799 protein solubilization Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 108700004024 5'-Nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N CTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 108010018956 CTP synthetase Proteins 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026846 Cytidine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010031325 Cytidine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 108030004122 Cytidine kinases Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005440 Guanosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108010087227 IMP Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000006674 IMP dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 101000986989 Naja kaouthia Acidic phospholipase A2 CM-II Proteins 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000405961 Scomberomorus regalis Species 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910021626 Tin(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007410 Uridine kinase Human genes 0.000 description 1
- VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N [4-fluoro-2-(hydroxymethyl)phenyl]methanol Chemical compound OCC1=CC=C(F)C=C1CO VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- TYJOJLOWRIQYQM-UHFFFAOYSA-L disodium;phenyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OC1=CC=CC=C1 TYJOJLOWRIQYQM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000001037 lung lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 235000011150 stannous chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- AXZWODMDQAVCJE-UHFFFAOYSA-L tin(II) chloride (anhydrous) Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Sn+2] AXZWODMDQAVCJE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Způsob a reagenční kit pro stanovení aktivity 5'-nukleotidázy
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu stanovení 5'-nukleotidázy (5'-ribonukleotid-fosfohydroiázy) v tělesných tekutinách, tkáňových preparátech a/nebo buněčných strukturních prvcích. Vynález se též týká soupravy příslušných reagencií v kitu, použitelné ve způsobu podle vynálezu.
Dosavadní stav techniky
Mezi metabolickými poruchami, které jsou spojeny s faktory maligních procesů nebo je doprovázejí nebo podporují, hrají důležitou roli též změny v metabolismu nukleotidů. Tím se vysvětluje, proč je jedním z hlavních cílů lékařových vstupů při léčbě nádorových onemocnění ovlivňování syntézy DNA/RNA a metabolismu nukleové kyseliny a nukleotidů těsně spojených s uvedenými procesy.
Zkoumání metabolických procesů nukleové kyseliny a nukleotidů má velkou důležitost pro detekci vývoje nádorů a pro rozlišení maligních a benigních procesů. Studium změn metabolických procesů nukleové kyseliny je nezbytné i pro sledování nádorové terapie, protože v převažující většině chemoterapeutických přístupů se terapeutický účinek projevuje umele vyvolanými poruchami metabolismu nukleové kyseliny a nukleotidů a v umělém poškození syntézy DNA. Tyto uměle vyvolané změny jsou rozhodujícími faktory pro účinnost terapie nádorových onemocnění, jsou však také odpovědné za podstatné poškození zdravých buněk a poruchy funkcí buněk a orgánů.
V běžných podmínkách je stanovení aktivity 5' -nukleotidázy (5'-ribonukleotid-fosfohydrolázy) , což je enzym zjištěný Reisem (Reis, J.: Uber die spezifische Phosphatase der Nerwengewebe; Enzymologia, sv. 2, ss. 110-115, 1937), jedním z nejvhodnějších způsobů. Tento enzym katalyzuje výhradně hydrolýzu nukleotidpentosamonofosfátů (5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP, 5'-TMP, dAMP, dAMP, dCMP, dUMP atd), přičemž vznikají nukleotidy a anorganické fosfáty (Bodansky, O., Schwartz, M.K.:
• · · · • · · ·« ···<
5'-Nucleotidase; Adv. Clin. Chem., sv. 11, ss. 277-327, 1968), a lze jej považovat za jeden z nejcitlivějších markérů pro plasmatickou membránu. Stanovení aktivity 5' -nukleotidázy se používá jak pro klinické účely, tak pro pokusné testy; v prvním případě se obvykle provádí s nehemolyzovaným sérem a/nebo s hemolyzátem, zatímco ve druhém případě se může měření provádět s tělesným tekutinami, tkáňovými preparáty, (například plazmatickými membránami), nebo se strukturními prvky buněk (například mikrozómy, cytoplazmami a lyzozómy, (viz Solyom, A., Trans., E.G.: Enzyme Markers in Characterization of Isolated Plasma Membranes; Enzyme, sv. 13, ss. 329-372, 1972).
Protože 5'-nukleotidáza je enzym, který specificky štěpí nukleotidpentosamonofosfáty, je široce rozšířeným způsobem stanovení aktivity 5'-nukleotidázy inkubovat biologický vzorek s nukleotidpentosamonofosfátovým substrátem a pak po přidání vhodného reagentu pro barevnou reakci stanovit kolorimetricky nebo spektrofotometricky množství anorganického fosfátu uvolněného účinkem enzymu za časovou jednotku. Pokud zkoušený biologický vzorek obsahuje také složky, jež interferují s enzymem 5'-nukleotidázou (pro krev nebo sérum je takovou látkou alkalická fosfatáza, pro lyzozómovou membránu jsou takovými složkami ostatní fosfáty cukrů), provádí se inkubace v přítomnosti inhibitoru schopného inhibovat jejich účinky. Jako činidlo vyvolávající barevnou reakci se užívá molybdenan amonný v přítomnosti redukčního činidla, jímž je obvykle chlorid cínatý případně spolu s hydrazinovou solí nebo askorbovou kyselinou, reagující s anorganickým fosforečnanem za vzniku jasně modrého komplexu. Vzhledem k tomu, že molybdenan amonný sráží bílkoviny obsažené v biologickém vzorku, odstraňují se bílkoviny buď před provedením barevné reakce, nebo se drží v roztoku přidáním solubilizačního činidla do směsi. Podle našich vědomostí je tento druhý způsob jednou z nejnovějších kolorimetrických metod. Při použití tohoto způsobu lze množství vzorku potřebné pro stanovení zmenšit až na několik setin mililitru a značně zvýšit přesnost zkoušky. Stanovení aktivity 5'-nukleotidázy na základě výše uvedeného principu se podrobně • · popisuje spolu s jinými v následujících článcích a v dalších odkazech tam uváděných: J. Chem. Clin. Biochem., sv. 7, ss. 1825, (1969), sv. 13, ss. 453-459 (1975), sv. 15, s. 715-718 (1977), sv. 18, ss. 781-788 (1980); Clin. Chem., sv. 23, ss. 2311-2323 (1977), sv. 27, ss. 464-465 (1981); Adv. Clin. Chem., sv. 11, ss. 277-332 (1968).
Společným znakem všech rutinních metod používaných dříve pro stanovení aktivity 5'-nukleotidázy na výše uvedeném principu pro účely diagnózy nebo obecných experimentálních výzkumů je, že se aktivita enzymu vždy měřila na jediném substrátu. Jako substrát se nej častěji používá adenosin-5'-monofosfát (5'-AMP), méně často cytidin-5'-monofosfát (5'-CTP), nebo inositol-5'-monofosfát nebo (v hemolyzátech) uridin-5'-monofosfát (5'-UMP).
Při našich pokusech prováděných pro detekci zhoubných procesů a sledování účinnosti protinádorové terapie se měřila aktivita 5'-nukleotidázy v jediném biologickém vzorku současně na šesti rozdílných substrátech, totiž adenosin-5'-monofosfátu (5'-AMP), cytidin-5'-monofosfátu (5'-CMP), uridin-5'-monofosfátu (5'-UMP), guanosin-5'-monofosfátu (5'-GMP), inositol-5'monofosfátu (5'-IMP) a thymidin-5'-monofosfátu (5'-TMP). Aktivita nespecifické fosfatázy v biologickém vzorku se měřila na β-glycerofosfátovém substrátu a byla používána pro korekci. Jak bylo možno očekávat na základě výše citovaných odkazů, pozorovali jsme, že třebaže se hodnoty 5'-nukleotidázové aktivity měřené na různých nukleotidpentosamonofosfátech navzájem kvantitativně liší, u zdravých i nemocných osob existuje přísná korelace mezi hodnotami naměřenými na různých substrátech. Je tomu tak proto, že ve fysiologických podmínkách existuje v séru jako společném metabolickém médiu dynamická rovnováha v procesech metabolismu nukleové kyseliny a nukleotidů. Jak opět vyplývá z literatury, pozorovali jsme, že hodnoty 5'-nukleotidázové aktivity naměřené na výše uvedených šesti substrátech v sérech zdravých a nemocných osob se navzájem liší do takové míry, že je nelze připisovat rozdílům v chemické povaze substrátů, ale jsou výsledkem fysiologických • ·
procesů. Mimo očekávání jsme však zjistili, že výše uvedená přísná korelace se při terapii mění a značně rozdílné hodnoty se vyskytují v souvislosti s tím, zda uvedená terapie ovlivňovala purinový metabolismus, pyrimidinový metabolismus nebo thymidinový metabolismus. Proto lze rozhodnout na základě měření aktivity provedeného s výše uvedenými šesti různými substráty, jestli zvolená terapie je účinná, jestli působí v oblasti, v níž působit má, a zda vyvolává nežádoucí poškození buněk nebo ne. Tyto poznatky jsou základem našeho vynálezu.
Podstata vynálezu
Na základě výše uvedeného se vynález týká způsobu diagnostikování existence maligního procesu a/nebo monitorování výsledků terapie aplikované při její léčbě stanovením aktivity 5'-nukleotidázy, při němž se biologický vzorek inkubuje o sobě známým způsobem a za o sobě známých podmínek s nukleotidpentosamonofosfátem jako substrátem, uvolněný anorganický fosfát se působením molybdenanu amonného a redukčního činidla přemění na barevný komplex, známým způsobem se měří intenzita zbarvení a z naměřené hodnoty se známým výpočtem a/nebo pomocí kalibrační křivky vypočte aktivita 5'-nukleotidázy nebo množství anorganického fosfátu uvolněného za jednotku času jako hodnota úměrná aktivitě 5'-nukleotidázy. Podle vynálezu se jako nukleotidpentosamonofosfáty používají 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP a 5'-TMP, měření se provádí na všech těchto šesti substrátech a získané výsledky se porovnávají mezi sebou navzájem a s kontrolními hodnotami.
Protože při chemoterapeutické léčbě se objevují na všech šesti substrátech dobře pozorovatelné změny v aktivitě 5'-nukleotidázy již po krátké době (24 hodin), lze přijmout dobře odůvodněné rozhodnutí ohledně provádění, modifikací a ukončení terapie za kratší dobu a s menší dvojznačností. K tomu pro srovnání poznamenáváme, že změnu použitelnou jako základ pro taková rozhodnutí lze u většiny markérů nádorových onemocnění pozorovat až po asi 1 týdnu léčby.
Když se aktivita 5'-nukleotidázy měří současně na všech • · • ·
šesti výše uvedených substrátech a výsledky se sumarizují, lze stanovit mnohem spolehlivější diagnózu ohledně stavu pacienta a výskytu procesů v játrech a kostech než by bylo možno stanovit při měření pouze na jediném substrátu. To může být cennou pomocí při včasném rozpoznání zhoubných procesů.
Na základě postupného vzájemného propojení biochemických procesů může měření aktivity 5'-nukleotidázy na výše uvedených šesti substrátech nahradit stanovení enzymové aktivity, jichž se v experimentální a klinické praxi užívá méně často, protože jsou složitější a jako rutinní test se provádějí obtížně, pokud vůbec. Jedná se například o tyto možnosti náhrady nebo substituce: 5'-nukleotidáza —> cytidin-kináza -> cytidin-deamináza —> cytidin-trifosfátsyntetáza; 5'-GMP nukleotidáza —> guanosin-deamináza; 5'-IMP nukleotidáza -> IMP-dehydrogenáza; 5<-TMP nukleotidáza —» thymidin-kináza o thymidin-syntetáza.
Podrobné informace o reakčních činidlech potřebných při měření, reakčních podmínkách a způsobech výpočtu lze nalézt v literatuře, mimo jiné v článcích citovaných výše. Jako příklad v dalším uvádíme složení systému reagentů použitelného pro měření bez předběžného odstranění bílkoviny, což se ukázalo jako zvláště výhodné, a také popisujeme, jak by se měl použít v měřeních prováděných na vzorcích séra, společně se způsobem výpočtu, aniž bychom však omezovali rozsah použití způsobu podle vynálezu na tento systém reagentů a na níže popsané podmínky.
Použitelná reagenční činidla jsou tato:
(1) Roztok pufr/aktivátor:
až 400 mmol/1 TRIS, 5,0 až 10,0 mmol/1 MgCl2 nebo 2,0 až 5,0 mmol/1 MnCl2, 1,0 až 5,0 mmol/1 KCl; pH roztoku se upraví na 9,95 vodným 3M-6M roztokem HCI.
(2) Inhibitor:
Inhibitor se má použít pouze když biologický vzorek obsahuje látku, jež interferuje se stanovením aktivity 5'-nukleotidázy. Takovou látkou je pro krev a sérum alkalická fosfatáza, kterou lze inhibovat roztokem obsahujícím 10 až 20 « · g/1 L-cysteinu nebo L-glycinu nebo ekvivalentní množství soli L-cysteinu nebo L-glycinu, nebo 50 až 250 mg/1 Concavalinu A, přičemž je rozpouštědlem výše popsaný pufr. Když se měření provádí na lyzozómových membránách, používá se pro inhibici přítomných fosfátů cukrů roztoku 5 až 50 mmol/1 L(+)-vinanu ve výše uvedeném pufru.
(3) Substráty:
Jako substráty se používají 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP a 5'-TMP jako 1-10 mmolární roztoky v demineralizované vodě. β-glycerofosfát nebo dinatriumfenylfosfát se má jako substrát též použít v roztoku s toutéž koncentrací. Tyto posledně uvedené substráty jsou dva známé substráty pro stanovení aktivity nespecifické fosfatázy; tuto aktivitu je též třeba stanovit v zájmu přesného stanovení aktivity 5'-nukleotidázy.
(4) Regencie pro solubilizací bílkovin
Čistá (koncentrovaná) kyselina mravenčí nebo propionová v nejvyšším stupni čistoty.
(5) Stabilizační činidlo:
Směs glycerolu a vody v objemovém složení od 1:9 do 4:6, nebo vodný roztok sorbitolu koncentrace 0,5 až 5 % hmotn., nebo vodný roztok mannitolu koncentrace 0,25 až 2,5 % hmotn., nebo směs propanolu a vody v objemovém poměru od 1:2 do 1:1.
Doporučuje se rozpustit ve stabilizačním činidle v zájmu stálosti a zvýšení trvanlivosti při skladování malé množství (0,001 až 0,01 % hmotn.) azidu sodného.
(6) Reagencie pro barevnou reakci:
Roztok 5 až 10 gl molybdenanu amonného v demineralizované vodě.
(7) Redukční roztok:
Roztok 1 až 5 g/1 SnCl2 v 1M vodném roztoku chlorovodíkové kyseliny, nebo roztok 1 až 5 g/1 askorbové kyseliny v demineralizované vodě.
(8) Roztok fosfátového standardu:
Roztok 1,61 mmol/1 anorganického fosfátu, který se postupně ředí.
« * • ·
Měření se provádí takto:
Zkušební činidlo pro stanovení množství anorganického fosfátu se připraví přimícháním činidla pro solubilizaci proteinu v poměru objem/objem
- 4:1 až 1:1 pro vodný roztok glycerolu, nebo
- 3:1 až 1:1 pro vodný roztok sorbitolu, nebo
- 5:1 až 1:2 pro vodný roztok mannitolu, nebo
- 7:1 až 4:1 pro vodný roztok n-propanolu, a přidá se činidlo pro barevnou reakci v množství 15 až 25 % obj. z celkového objemu finální směsi.
Složky uvedené v prvních pěti řádcích v tabulce 1 se smísí dohromady v množstvích udaných v tabulce a výsledná směs se inkubuje 60 minut při 37 °C. Potom se ke směsi přidají další složky uvedené v tabulce 1 a výsledná směs se míchá, potom se nechá 15 minut stát a pak se měří absorbance roztoku při 620 až 720 nm. Sloupec v tabulce 1 s nadpisem 5'-ND+ALP se týká měření, v němž se měří aktivita 5'-nukleotidázy společně s aktivitou alkalické fosfatázy (to znamená že se nepoužije inhibitoru), zatímco sloupec s nadpisem 5'-ND se týká měření provedeného v přítomnosti inhibitoru pro alkalickou fosfatázu. Aktivita nespecifické fosfatázy se objevuje ve výsledcích obou měření. Aktivita nespecifické fosfatázy se stanoví zvlášť na βglycerofosfátovém substrátu v přítomnosti inhibitoru; získaná hodnota se odečte od předchozích a získá se aktivita 5'-nukleotidázy + alkalické fosfatázy, resp. aktivita 5'-nukleotidázy.
Výpočet se provádí následovně:
(a) Výpočet extinkčních rozdílů (hodnoty ΔΕ):
β“ gl yCe rO f O S f a t . Evzorek — E^ontrola ^Ep_gjyCerofosfát dalSl Substráty . Evzorek — E)<ontrolní vzorek
ΔΕ5 - -AMP, 5 ' -CMP, 5 ’ -UMP, 5 ' -GMP, 5 ' -TMP, 5 ' -IMP
Standard. E3t-_arKjar3 — E^ontrolni činidlo ΔΕ3,&ηάΐίΓά «» ·· • · « · • · » v · * • « « 9 • · • ♦ · • · ··«· ·»·· ♦ · (b) Výpočet aktivit enzymu na bázi výše uvedených hodnot ΔΕ
Vzorek ΔΕ
Aktivita, U/l vzorku =---------------x standard cc. x K
Standard ΔΕ kde standard cc. je koncentrace standardu a
K je konstanta vypočtená z následujícího vzorce:
veškerý inkubovaný objem, ml x 1000 doba inkubace, min. x objem vzorku, ml x tloušťka kyvety (c) Výpočet jednotlivých aktivit enzymů nebo spojených aktivit na základě výše uvedených údajů:
Aktivita nespecifické fosfatázy = aktivita měřená na β-glycerofosfátu
Aktivity 5'-nukleotidázy měřené na různých nukleotidpentosamonofosfátech = 5'-ND aktivita - aktivita nespecifické fosfatázy Aktivita 5'-nukleotidázy + alkalické fosfatázy = 5'-ND+ALP - aktivita nespecifické fosfatázy Aktivita alkalické fosfatázy = 5'-ND+ALP - 5'-ND - aktivita nespecifické fosfatázy
Pokud je biologický vzorek jiný než sérum, provádí se měření stejně s tím rozdílem, že někdy není nutný žádný inhibitor, nebo se používá jiný inhibitor. Výpočty se rovněž provádějí jak uvedeno výše.
*»
0(r • * « « « · • * • ·· ·
Φ * «·* • * · * • » • · * • · • •4 0 ·<*·
Tabulka
| Kontrolní | reagens | 1 | I | 1 | 1 | 1 | 0,750 ml | 0,250 ml | 1 | ι | 1 | 0,125 ml |
| Ό | l—1 | l—1 | r—| | I-1 | ||||||||
| β | β | β | β | β | ||||||||
| ίΰ | ||||||||||||
| Ό | o | m | Ln | LO | ||||||||
| β | lc | 04 | 04 | 04 | ||||||||
| β | r- | rH | x—1 | rH | ||||||||
| 4-) | *» | *» | ||||||||||
| ω | o | o | o | o | ||||||||
| Ή | r-Η | ι—1 | i—l | i—1 | ι—1 | 1—1 | ||||||
| β ld Ο β 4-) β | rek | β m | β Lf) | g o | β m | β m | β Ln | |||||
| ο | 04 | r- | 1 | 1 | Ln | 04 | 04 | 1 | 04 | |||
| Ν | rH | o | r- | o | O | i—1 | ||||||
| > | *» | K | K. | |||||||||
| Ο | o | o | o | o | o | |||||||
| ι—1 | Γ—1 | i—1 | 1-1 | ι-l | 1—1 | <—1 | ||||||
| Q | β | β | β | β | β | β | β | |||||
| S | LO | o | Lf) | LO | Ln | o | m | |||||
| 04 | O) | 04 | 04 | 04 | Ln | 1 | 1 | 04 | ||||
| ίη | ,—1 | O | O | O | O | Γ | rH | |||||
| «*. | »». | |||||||||||
| ο | o | o | o | o | O | o | ||||||
| Οκ | 1-1 | i—| | 1-1 | rH | i—1 | I—1 | ||||||
| á | β | β | β | β | β | β | ||||||
| + Q Ζ | LO | Lf) | Lf) | LO | o | Ln | ||||||
| 04 | θ' | 04 | 04 | m | 04 | |||||||
| <—1 | o | O | O | r- | t—1 | |||||||
| S. | K. | V | K | Ν» | K. | |||||||
| LO | ο | o | o | o | o | o | ||||||
| (t | β | |||||||||||
| m | Ό | |||||||||||
| o | w c | O | ||||||||||
| β | > | > | A4 | |||||||||
| áto | ineralizovaná | β | β β β | 4-1 | age: | ineralizovaná | β β β | 4-J | Ό | roztc | ||
| Α4 Ο | iv | (J 4J | sé | '05 | re | 'Φ tn | rá | ar | ||||
| 4-) Ν Ο (k | /akt | InhibJ | Aí Φ | ubst | bní | Αί Φ | ubst | tand | Redukční | |||
| Pufr | Vzor | cn | Zkuše | Vzor | cn | cn | ||||||
| β | β | |||||||||||
| Φ | o | |||||||||||
| Q | Q |
I
Z hodnot aktivit 5'-nukleotidázy získaných s jednotlivými substráty ve výše uvedených řadách měření lze odvodit následující biologické závěry:
Rozhodnutí o zdravotním stavu: hodnota získaná sečtením šesti naměřených údajů o aktivitě charakterizuje nepřítomnost nemoci až do hodnoty 54 až 65 U/l, za předpokladu že je současně aktivita alkalické fosfatázy 10 až 25 U/l. Pokud je aktivita alkalické fosfatázy nad 50 U/l a zároveň součet údajů o aktivitách 5'-nukleotidázy je 54 až 65 U/l, znamená to indikaci zhoubných procesů v kostech. Je-li součet aktivit 5'-nukleotidázy nad 70 U/l, jde o bezpečnou indikaci chorobného stavu. Je-li zároveň aktivita alkalické fosfatázy nad 35 U/l, jde o spolehlivou indikaci poškození jater. Při zhoubných nádorech jater jsou jak součet hodnot aktivit 5'-nukleotidázy tak i aktivita alkalické fosfatázy 4 až 10 krát vyšší než normální hodnoty.
Hodnocení terapie: změna aktivit měřených na substrátech 5'-AMP, 5'-GMP a 5'-IMP udává, že protinádorové terapie intervenovala do purinového metabolismu, zatímco změna aktivity měřená na substrátech 5'-CMP, 5'-UMP a 5'-TMP indikuje intervenci do pyrimidinového metabolismu. Nezměněné hodnoty indikují, že terapie je bezvýsledná. Pokles aktivity vždy indikuje blahodárnou intervenci užité terapie do procesu. V mnoha případech se stává, že po aplikované chemoterapii je pokles aktivit 5'-nukleotidázy tak výrazný, že aktivity měřené jednotlivě na individuálních substrátech i součet těchto aktivit jsou nižší než 10 U/l, a že dokonce lze někdy získat pro aktivity 5'-nukleotidázy negativní hodnoty. Je to způsobeno tím že terapie atakuje nukleotidový metabolismus, ale neovlivňuje hodnoty aktivit nespecifické fosfatázy; negativní hodnota aktivity se získá, když se odečtou vyšší hodnoty aktivity nespecifické fosfatázy od nižší hodnoty aktivity 5'-ND. Když jsou hodnoty aktivity 5'-nukleotidázy nižší než hodnoty získané kontrolní zdravé subjekty, je to již indikace cytotoxického poškození zdravých buněk s rychlým nukleotidovým
metabolismem (primárně střevní sliznice, kostní dřeně a erythrocytů), zvláště když k této změně dojde u aktivit všech 5'-nukleotidáz měřených na všech šesti substrátech. V takových případech je třeba terapii buď pozměnit nebo zastavit.
Vynález se též týká soupravy reagencií umístěné v kitu použitelné při způsobu podle vynálezu, jež obsahuje jako substráty 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP a 5'-TMP spolu s obvyklými komponentami kitů pro reagencie použitelnými pro stanovení aktivity 5'-nukleotidázy vytvořením anorganického fosfátu, přeměnou výsledného fosfátu na barevný komplex a fotometrickým měřením barevné intenzity.
Obvyklé komponenty kitu s reagenciemi mohou být ty, jež se používají pro známé metody, například složky popsané ve výše uvedených publikacích. Výhodný kit s reagenciemi může obsahovat následující obvyklé komponenty:
- pufr,
- činidlo pro solubilizaci bílkovin,
- stabilizační činidlo,
- činidlo pro barevnou reakci,
- redukční činidlo,
- fosfátový standard, dále v případě potřeby
- inhibitor a/nebo
- jiný substrát než nukleotidpentosamonofosfát (jako β-glycerofosfát).
Výhodné příklady výše uvedených obvyklých složek představují složky uvedené výše při popisu provedení způsobu podle vynálezu. Kit s reagenciemi může běžné složky obsahovat buď jako roztoky ve výše uvedených koncentracích, nebo jako koncentrovanější roztoky, jež se zředí před použitím, nebo jako čisté chemikálie.
V dalším se jako příklad uvádějí výsledky měření aktivity
5'-nukleotidázy provedeného na vzorcích séra spolu se závěry odvozenými od tohoto měření. Množství jednotlivých látek a podmínky testu vždy odpovídaly množství a podmínkám uváděným v tabulce 1. Přesná složení jednotlivých reagencií použitých při
měřeních jsou tato:
(1) Roztok pufr/aktivátor: 75,0 mmol/l TRIS.HC1, 5,0 mmol/l MgCl2, 5,0 mmol/l Kl, pH 9,3.
(2) Inhibitor: 0,29 g L-cysteinhydrochloridu rozpuštěného ve 20,0 ml roztoku pufr/aktivátor.
(3) Substráty: roztoky 8,0 mmol/l 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP, 5'-TMP a β-glycerofosfátu v demineralizované vodě.
(4) Činidlo solubilizující bílkoviny: čistá (koncentrovaná) kyselina mravenčí v nejvyšším stupni analytické čistoty.
(5) Stabilizační činidlo: 300 ml glycerolu v nejvyšším stupni analytické čistoty + 700 ml demineralizované vody + 0,05 g NaN3.
(6) Činidlo pro barevné reakce: roztok 8,0 g/1 molybdenanu amonného v demineralizované vodě.
(7) Redukční činidlo: 0,20 g SnCl2 rozpuštěného ve 100 ml l,0M vodného roztoku chlorovodíkové kyseliny.
(8) Standardní fosfátový roztok: roztok anorganického fosfátu Dyalab® v koncentraci 1,61 mmol/l (pro další tisícinásobné zředění).
Zkušební činidlo: 200 ml složky (4) smíšené s 200 ml složky (5) a 100 ml složky (6).
Měření se prováděla v těchto případech:
- Na zdravých osobách a na osobách s klinicky diagnostikovanými nádory před léčbou. Výsledky se uvádějí v tabulce 2.
- Pro sledování terapie CMF (cyklofosfamid - methotrexát 5-fluorouracil) pacientek s nádory prsů po chirurgickém zákroku. Výsledky se uvádějí v tabulkách 4 a 5.
- Pro sledování methotrexátové terapie (antagonizující činidlo na bázi listové kyseliny) pacientů s osteosarkomem. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 7.
Pro zjednodušení se v tabulce 2 a dalších uvádějí pouze symboly příslušných substrátů; vždy se však vztahují k hodnotám 5'-nukleotidázy měřeným na daných substrátech.
Tabulka
| Aktivita enzymu, U/l + standardní odchylka | Alkali- fosfát | CM šP 00 r-L +1 | 45, 7 ±7,8 | 65, 5 ±11,2 | 57, 6 ±12,3 | 23,4 ±4,4 | 43,3 ±6, 2 | 41,3 ±6, 8 | CM ™ CM 2! LO | 167, 6 |
| Q £ 1 LO w | o; £ +1 | 161,4 ±5, 33 | 287, 8 ±6, 3 | 235,56 ±6, 98 | 144,11 ±5, 13 | 220, 1 ±5, 71 | 88, 01 ±2, 61 | 360,4 ±10,15 | CO ·». LT) sr | |
| cu £ H 1 K LD | LO CO | co ® CM +l | ST tH *«. *» O UD cn +1 | I—1 LO LO CTi sr +1 | LO CM V % co cn T—4 +| | 15,5 ±3,2 | 23,2 ±4,3 | 34 ±4, 5 | co cn | |
| CU £ M 1 K ID | 3, 3 ±0,9 | 10,6 ±3,3 | r- un *» *». cn cn t—i +1 | 17, 8 ±5,2 | rd CM i—1 - CM σι +| | r~ cn v O rU +1 | co K. °° +i | cn (O v CM fO +1 | 3, 3 | |
| CU S 1 LO | r-1 _? Γ-) +1 | č ** —♦« | 33,2 i ±4,4 | 22,3 ±4,4 | 11,6 ±6, 3 | 21,2 ±5,2 | cn r~~ 00 s. LO O +1 | 34 ±5, 9 | sr LQ | |
| cu 1 K LO | ST 00 +1 | 00 r-~ sr sr cn +1 | r—1 ΟΊ *1. r-~ LO +1 | sr cn s. s, LO LO sr ±1 | 34,5 ±5,1 | lo sr θ' ΓΙΟ +| | 15, 8 ±2, 9 | co 10 co 2 r- +1 | 8,2 | |
| CU £ o 1 K LO | 10,1 ±2, 2 | 50, 92 ±9, 8 | 00 ý LO LO li CTl Tl | co r- o cn r~ +1 | oo sr 00 sr +1 | o í co | 23,7 ±3, 8 | sr sr *» cn cn CN t—1 -Η Ή | CO o t—1 | |
| CU 1 LO | LO ™ LO | LO r-L sr v. m 5* CM +l | 47,56 ±7, 8 | í cn | 23, 5 ±5, 6 | lo cn »». sr cn cn +1 | 10, 8 ±2,3 | 67,7 ±13, 4 | 9, 2 | |
| Testované skupiny chorob | Kontrolní zdravé osoby, 1 n = 157 | i | Karcinom prsu, n = 341 | Karcinom vaječníků, n = 189 | Karcinom štítné žlázy n - 76 | Nehodgkinský lymfom, n = 45 | Hodgkinova choroba, n = 36 | Zhoubný melanom n = 1567 | Plicní tumor n = 76 | Lymfom s manifestací na |
• ·
| ±23 | 56, 7 | ±11,2 |
| ΟΊ | ω | γΗ |
| ω | ΚΤ | |
| Γ- σ | VD | |
| +1 | τ—1 ±1 | |
| co | CO | |
| s. | Κ | Κ |
| r*H | ’χΓ | |
| +1 | ω | ±1 |
| Csl | σι | σ |
| ο | CO | |
| +1 | ω | ±1 |
| σ | 00 | ±12 |
| ±0, | L0 χςΤ | |
| VD | ||
| ϊ~Η | κ | ϊ—ί |
| ** | <Ν | η |
| +1 | Ο 5—1 | ±1 |
| Γ- | Γ ·>» | C0 |
| σ | C\] | |
| rH +1 | 00 τΉ | +1 |
| C0 | Γ~ | σ |
| (Μ +1 | cn’ C0 | ±1 |
| <ΰ | ||
| C | ||
| μΗ | ||
| υ | kO | |
| ω | π3 | Γ— |
| CN | Ρ | |
| ω | II | |
| II | ω | |
| Ρ | ΰ | |
| G | •Η | |
| C | ||
| rú | Ρ | |
| Ή | g | υ |
| Ρ | ω | |
| W | (Ό | ρ |
| ο | Ρ | |
| ρ | g | 'ίΰ |
| 0 | *Γ~1 | |
| <w | ||
| Ρ |
♦ » · · · • · • · · • · · · ·
Z údajů v tabulce 2 je zřejmé, že s výjimkou lymfomu + manifestace na kosti byly hodnoty aktivity 5'-nukleotidázy měřené na šesti substrátech značně zvýšené u pacientů trpících vyšetřovaným zhoubným nádorovým onemocněním ve srovnání s kontrolními hodnotami zdravých osob. Součet hodnot aktivity 5'-nukleotidázy (E5'-ND) ukázal nejvýraznější vzrůst v případě plicních nádorů a/nebo lymfomů ve spojení s manifestací na játrech.
Vzrůst aktivity alkalické fosfatázy byl ve srovnání se změnou aktivity 5'-nukleotidázy nejvýraznější pro lymfomy ve spojení s manifestací na kosti.
Tabulka 3
| Srovnávané | dvoj ice | Korelace |
| 5'-AMP | 5'-CMP | 0,9943 |
| 5' -MAP | 5' -UMP | 0,9728 |
| 5'-AMP | 5' -GMP | 0,9234 |
| 5'-AMP | 5' -IMP | 0,9656 |
| 5'-AMP | 5'-TMP | 0,9878 |
| 5'-CMP | 5' -UMP | 0,9456 |
| 5'-CMP | 5' -GMP | 0,9678 |
| 5'-CMP | 5' -IMP | 0,9489 |
| 5'-CMP | 5' -TMP | 0,8978 |
| 5'-UMP | 5' -GMP | 0,8989 |
| 5'-UMP | 5' -IMP | 0,9323 |
| 5' -UMP | 5' -TMP | 0,9562 |
| 5'-GMP | 5' -IMP | 0,8978 |
| 5'-GMP | 5' -TMP | 0,9545 |
| 5'-AMP β-glycerofosfát | 0,8978 |
• 4 • 4 · •4 4444
Z údajů v tabulce 3 je zřejmé, že lze nalézt přesné korelace mezi hodnotami aktivity 5'-nukleotidázy jednotlivých substrátů i mezi aktivitou měřenou na 5'-AMP a aktivitou měřenou na β-glycerofosfátu, indikující aktivitu nespecifické fosfatázy, a to jak u pacientů trpících vyšetřovanými zhoubnými nádorovými onemocněními a připravovaných k léčbě, tak u kontrolních případů zdravých pacientů.
Výsledky měření za účelem monitorování terapie pacientek po odoperování tumoru prsu s následnou chemoterapií jsou uvedeny v tabulkách 4 a 5. Tabulka 4 shrnuje údaje úspěšných případů, zatímco tabulka 5 shrnuje údaje o případech rezistentních vůči terapii CMF. Údaje získané po změně terapie jsou též dány v tabulce 5. Při změně terapie se pacienti podrobili terapii cisplatinou a aktivity 5'-nukleotidázy se měřily 1 den po první léčbě (*) a 1 den po ukončení terapie (**), Ve všech ostatních případech se měření prováděla 24 hodin po reálné chemoterapeutické léčbě. Za účelem srovnání se též uvádějí hodnoty naměřené u zdravých kontrolních osob.
Tabulka 4
| Aktivita 5'-nukleotidázy, U/l + standardní odchylka | |||||||
| 5'-AMP | 5'-CMP | 5' -UMP | 5'-GMP | 5'-IMP | 5'-TMP | Σ5'-ND | |
| Kontrolní | 6, 5 | 10,1 | co | 4,1 | 3,3 | 8,9 | 40, 9 |
| test, zdravá osoba | ±1,2 | ±2,2 | ±1, 6 | ±1, 1 | ±0, 9 | ±1, 6 | ±1,43 |
| Nemocný, | 29, 4 | 34,7 | 11,8 | 7,9 | 7,6 | 19, 8 | 112,2 |
| před CMF | ±3,7 | ±7,8 | ±3, 4 | ±1,8 | ±1,1 | ±3,7 | ±3,5 |
| Po 1 řadě | 11, 6 | 3,4 | 4,6 | 2,3 | 3,2 | 4,5 | 29,6 |
| CMF | ±2,1 | ±0,9 | ±1,2 | ±0,8 | ±0, 9 | ±1,4 | ±1,2 |
| Po 3 řadách | 3,4 | 2,3 | 2,1 | -2,4 | -2,8 | 1,1 | 1,28 |
| CMF | ±1,1 | ±0, 9 | ±0, 9 | ±0, 1 | ±0, 8 | ±0,03 | ±0,63 |
| Po 6 řadách | 0,7 | -1,7 | 2,2 | -3, 3 | 1,1 | -3,4 | -4,4 |
| CMF | ±0, 04 | ±0,3 | ±0, 7 | ±0,8 | ±0,1 | ±0,7 | ±0,44 |
• ·
Z těchto údajů lze odvodit následující závěry: aktivity 5'-nukleotidázy měřené na substrátech 5'-CMP, 5'-GMP, 5'-IMP a 5'-TMP značně poklesly již po první řadě podání CMF. Po třetí řadě podání CMF bylo možno pozorovat značné poklesy aktivit 5'-nukleotidázy měřené na substrátech 5'-AMP, 5'-GMP a 5'-IMP. Po šesté řadě podání CMF bylo možno pozorovat značné poklesy aktivit 5'-nukleotidázy měřené na substrátech 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-GMP a 5'-IMP. Při kombinacích léků je obtížné definovat účinek v oblasti působení v důsledku rozdílných oblastí působení jednotlivých komponent. V takových případech slouží jako vodítko srovnání se stavem před léčbou. Změřené údaje ukazují, že použitá kombinace léků projevila svůj terapeutický účinek ve dvou fázích v podobě důsledků vyvolaných v metabolických procesech jednak purinu, jednak pyrimidinu.
Tabulka 5
| Aktivita 5'-nukleotidáz | y, u/1 + | standardní odchylka | |||||
| 5'-AMP | 5'-CMP | 5'-UMP | 5'-GMP | 5'-IMP | 5' -TMP | Σ5'-ND | |
| Kontrolní | 6,5 | 10,1 | CO ►u | 4,1 | 3,3 | 8,5 | 40,9 |
| test, zdravá osoba | ±1,2 | ±2,2 | ±1,6 | ±1,1 | ±0, 9 | ±1, 6 | ±1,43 |
| Nemocný, | 39, 6 | 72, 4 | 45, 8 | 23,7 | 18,9 | 24,7 | 225,11 |
| před CMF | ±8,67 | ±11,3 | ±10, 9 | ±7,8 | ±3, 5 | ±6,2 | ±8,05 |
| Po 1 řadě | 26, 7 | 68, 9 | 40,2 | 19, 8 | 16, 4 | 21,1 | 193,1 |
| CMF | ±5,3 | ±10,2 | ±9, 9 | ±6, 9 | ±4,6 | ±5,2 | ±7,01 |
| Po 3 řadách | 20, 3 | 43,2 | 26, 5 | 4,2 | 2,3 | 8,9 | 115,4 |
| CMF | ±3,4 | ±8,1 | ±5,7 | ±1,1 | ±0, 9 | ±1, 8 | ±3,5 |
| Po 6 řadách | 4,1 | 3, 6 | 4,4 | -1,6 | 1,1 | 1,2 | 12,8 |
| CMF | ±1, 3 | ±0, 9 | ±1, 5 | ±0, 8 | ±0, 6 | ±0, 3 | ±1,2 |
Když byla léčba CMF neúčinná, nebylo možno nalézt žádné změny v aktivitách 5'-nukleotidázy měřené na jednotlivých substrátech; proto pokračovala cisplatinová terapie. Z výsledků jsme zjistili, že již v prvním stádiu • 4 ··
4 4 4
4
4
4 4 4 léčby (24 hodin po léčbě, v tabulce označeno *) došlo k významným změnám v aktivitách 5'-nukleotidázy příslušných k různým substrátům; zejména na substrátech zúčastněných na purinovém metabolismu bylo možno pozorovat značný pokles. Hodnoty naměřené prvního dne po ukončení léčby cisplatinou (v tabulce označeno **) svědčí, že změny purinového metabolismu jsou časem následovány změnami v pyrimidinovém metabolismu, přičemž je třeba poznamenat, že se tyto změny dvou metabolických procesů skládají.
Naše testy zjišťují neúčinnost terapie CMF již 5 dní před měřením diagnostickým indikátorem tumoru CA 15-3 (který též indikuje neúčinnost), takže pacienti mohou být ušetřeni pěti dnů nadbytečné léčby CMF.
Úspěch a účinnost terapie rovněž odráží skutečnost, že se mění původní přísná korelace mezi hodnotami aktivity 5'-nukleotidázy měřenými na změnách různých substrátů. Hodnoty korelace, vypočítané po úspěšné terapii jsou uvedeny níže v tabulce 6, kde jsou pro srovnání zařazeny i hodnoty získané před léčbou.
Tabulka 6
| Korelace | ||
| Srovnávané dvojice | Před chemoterapií | Po chemoterapii |
| 5'-AMP 5'-CMP | 0,9856 | 0,6767 |
| 5'-AMP 5'-UMP | 0,8997 | 0,4561 |
| 5'-AMP 5'-GMP | 0,7845 | 0, 3267 |
| 5'-AMP 5'-IMP | 0, 8967 | 0,4519 |
| 5'-AMP 5'-TMP | 0,7897 | 0, 4687 |
| 5'-CMP 5'-UMP | 0,9897 | 0,5639 |
| 5'-CMP 5'-GMP | 0,7868 | 0,2345 |
| 5'-CMP 5'-IMP | 0,8887 | 0, 2689 |
| 5' -CMP 5'-TMP | 0,6767 | 0,1123 |
| 5'-UMP 5'-GMP | 0,8978 | 0,3493 |
• ·
| 5' -UMP | 5' -IMP | 0,8889 | 0,0567 |
| 5' -UMP | 5'-TMP | 0,8992 | 0,3635 |
| 5' -GMP | 5' -IMP | 0,9981 | 0,4684 |
| 5' -GMP | 5' -TMP | 0,9767 | 0,4781 |
| 5' -IMP | 5' - | 0,8898 | 0,4356 |
Údaje v tabulce 6 ukazují, že původní přesná korelace mezi aktivitami 5'-nukleotidázy měřenými na různých substrátech zmizela, což též znamená, že měření na různých substrátech umožňují samostatně detekovat a vyhodnocovat jednotlivé biologické procesy k nimž během léčby dochází.
Stanovení aktivity 5'-nukleotidázy pomocí výše uvedených šesti substrátů rovněž poskytuje nenahraditelné a užitečné informace v případech, když chemoterapie nemá žádný přímý účinek na metabolismus nukleotidu. Dobrým příkladem takové situace je léčba pacientů s osteosarkomem pomocí methotrexátu. Methotrexát je látka antagonizující působení listové kyseliny, nemá přímý účinek na metabolismus nukleotidu, takže každá změna v metabolismu nukleotidu, k níž dochází při léčbě methotrexátem indikuje novou syntézu nukleotidu, to znamená poškození zdravých buněk. Každé poškození k němuž při léčbě dochází v podobě vedlejšího účinku má trvale vážné následky; takovým následkem může být například snížení buněčné a humorální imunity, jež též může přivodit tvorbu nového tumoru.
V tabulce 7 jsou shrnuty změny aktivit 5'-nukleotidázy měřené na pacientech s osteosarkomem léčených dávkami 12,0 g methotrexátu.
Tabulka 7
| Aktivita 5'-nukleotidázy, | U/l | |||||
| Pyrimididinový, metabolismus | Purinový metabolismus | |||||
| Doba | 5'-AMP | 5'-CMP | 5'-UMP | 5'-GMP | 5'-IMP | 5'-TMP |
····
| 0 min. | -8,39 | 5, 33 | 5,05 | 3,34 | 3,77 | 1,56 |
| 15 min. | -3, 12 | 2,21 | 0, 14 | 0, 57 | -0,2 | -6,75 |
| 30 min. | -11,87 | -2,19 | 1,92 | -2,19 | 2,98 | -6, 89 |
| 1 hod. | -5,05 | 2,41 | 1,2 | -2,1 | 1, 34 | -1, 01 |
| 2 hod. | -4,84 | 5, 97 | 2,77 | 2,84 | -3,49 | -2,49 |
| 3 hod. | -0,5 | 8, 6 | 4,05 | 7,61 | 5, 68 | 2,41 |
| 4 hod. | -3, 63 | 6,76 | 4,19 | 0, 92 | -0,28 | -3, 98 |
| 6 hod. | -10,32 | -1,63 | -1,85 | -5,48 | -2,7 | -3,7 |
| 12 hod. | -1,71 | -0,15 | 1,48 | 1, 98 | 3, 69 | -4,49 |
| 21 hod. | -2,56 | 6,04 | 5,83 | -0, 99 | 0,35 | -4,84 |
| 44 hod. | 31,38 | 4,69 | 7,89 | 1, 99 | -12,95 | -9,46 |
| 69 hod. | 7, 96 | 18,42 | 14,93 | 13,16 | 13,01 | 8,6 |
| 90 hod. | 6,83 | 13,09 | 15,16 | 3,49 | 10,1 | 3,63 |
| 162 hod. | -12,6 | 6, 97 | 29,53 | -6,33 | -1,99 | -1,35 |
| 186 hod. | 1,41 | 7,53 | 12,16 | 14,94 | 6,54 | 0, 35 |
| 210 hod. | 5,76 | 4,48 | 7,39 | 3, 91 | -3, 91 | 0,92 |
| 234 hod. | 8,61 | 3,48 | 10,88 | 8,68 | 5,47 | 6,11 |
| 258 hod. | 3, 99 | 2,42 | 2,64 | 0,22 | 0,43 | -5,82 |
| 330 hod. | 9,25 | 7,47 | 2,99 | 8,46 | 10,53 | -2,7 |
| 358 hod. | 9,67 | 5,47 | 4,9 | 5,97 | -2,28 | 2,56 |
| 402 hod. | 5,18 | 8, 03 | 9,59 | 8,24 | 6,04 | 5,4 |
Z údajů v tabulce 7 lze odvodit následující závěry: Výsledky stanovení aktivity 5'-nukleotidázy provedené na šesti substrátech použitých pro studium změn v pyrimidinovém a purinovém metabolismu ukazují, že v první etapě léčba ovlivňuje pyrimidinový metabolismus. Rozdíly mezi oběma cestami metabolismu jsou zvláště výrazné 44 hodin po léčbě. Rovněž se zdá z údajů v tabulce 7, že lze pozorovat značné rozdíly mezi jednotlivými substráty také uvnitř jedné a téže metabolické dráhy. Tento jev je nepochybně způsoben rozdíly mezi biochemickými funkcemi jednotlivých substrátů. Při sledování terapie způsobem podle vynálezu je možno terapii zastavit nebo změnit dříve než by detekovaná porucha mohla vést k vážnějším změnám v podobě pozdějších následků.
Třebaže byly výše popsány způsob a kit s reagenciemi podle vynálezu v souvislosti s diagnostickým využitím, • · · · · · není rozsah vynálezu tímto typem aplikace omezen. Tento způsob i kit s reagenciemi se též může s vynikajícími výsledky používat pro účely výzkumu, například pro detekování mechanismu určitých zhoubných procesů, pro zkoušky známých nebo nových protinádorových léků a pro zkoumání mechanismu jejich působení.
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY9 9 9 9 99 99 9 9 9 9 9 9 99 91. Způsob diagnostikování existence maligního procesu a/nebo monitorování výsledků terapie aplikované při její léčbě stanovením aktivity 5'-nukleotidázy, při němž se biologický vzorek inkubuje o sobě známým způsobem a za o sobě známých podmínek s nukleotidpentosamonofosfátem jako substrátem, uvolněný anorganický fosfát se působením molybdenanu amonného a redukčního činidla přemění na barevný komplex, známým způsobem se měří intenzita zbarvení a z naměřené hodnoty se známým výpočtem a/nebo pomocí kalibrační křivky vypočte aktivita 5'-nukleotidázy nebo množství anorganického fosfátu uvolněného za jednotku času jako hodnota úměrná aktivitě 5'-nukleotidázy, vyznačující se tím, že se jako nukleotidpentosamonofosfáty použijí 5'-AMP, 5'-CMP,5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP a 5'-TMP, měření se provádí na všech těchto šesti substrátech a získané výsledky se porovnávají mezi sebou navzájem a s kontrolními hodnotami.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se biologický vzorek inkubuje se substrátem v pufrovaném médiu případně v přítomnosti inhibitoru a potom se po molybdenanu amonném a redukčním činidle do inkubační směsi přidá činidlo pro solubilizaci bílkovin a stabilizační činidlo.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se nukleotidpentosamonofosfátové substráty používají ve vodných roztocích při koncentracích 1 až 10 mmol/1.
- 4. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se jako tím, • · biologický vzorek používá plná krev, sérum nebo hemolyzát, a inkubace se substrátem se provádí jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti inhibitoru alkalické fosfatázy.»·4 44 ·
- 5. Reagenční kit pro provádění způsobu podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že zahrnuje 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP a 5'-TMP jako substráty společně s běžnými složkami reagenčního kitu použitelného pro stanovení aktivity5'-nukleotidázy cestou uvolnění anorganického fosfátu, přeměnou výsledného fosfátu na barevný komplex a fotometrickým měřením barevné intenzity.
- 6. Reagenční kit podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje jako běžné složky pufr, činidlo solubilizující bílkoviny, stabilizační činidlo, reagens pro barevnou reakci, fosfátový standard a případně inhibitor a/nebo substrát jiný než nukleotidpentosamonofosfát.
- 7. Použití způsobu nárokovaného v kterémkoliv z nároků 1-4 nebo kitu s reagenciemi nárokovaného v nárocích 5 nebo 6 pro diagnózu zhoubného procesu a/nebo pro monitorování výsledků terapie použité pro léčbu zhoubného procesu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0002003A HUP0002003A3 (en) | 2000-05-24 | 2000-05-24 | Process and reagent-kit for determining of 5'-nucleotidase activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20023876A3 true CZ20023876A3 (cs) | 2003-03-12 |
Family
ID=89978352
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20023876A CZ20023876A3 (cs) | 2000-05-24 | 2000-07-03 | Způsob a reagenční kit pro stanovení aktivity 5´-nukleotidázy |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6861225B1 (cs) |
| EP (1) | EP1283901B1 (cs) |
| CN (1) | CN1221667C (cs) |
| AT (1) | ATE261495T1 (cs) |
| AU (2) | AU5835800A (cs) |
| CA (1) | CA2407446A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20023876A3 (cs) |
| DE (1) | DE60008934T2 (cs) |
| EA (1) | EA005164B1 (cs) |
| HR (1) | HRP20020899A2 (cs) |
| HU (1) | HUP0002003A3 (cs) |
| PL (1) | PL359850A1 (cs) |
| SK (1) | SK16722002A3 (cs) |
| WO (1) | WO2001090403A1 (cs) |
| YU (1) | YU88302A (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1302119C (zh) * | 2004-09-14 | 2007-02-28 | 王尔中 | 5ˊ－核苷酸酶活性测定方法及5ˊ－核苷酸酶诊断试剂盒 |
| DE102006046411A1 (de) * | 2006-09-20 | 2008-03-27 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Arzneimittel zur Prophylaxe oder Behandlung oder Diagnostik von akutem Lungenversagen (ALI) |
| FI20070795A0 (fi) | 2007-10-24 | 2007-10-24 | Faron Pharmaceuticals Oy | Uusi biomarkkeri sairauksien kehittämisen tarkkailuun ja terapioiden tehon arviointiin |
| US8975081B2 (en) | 2007-10-24 | 2015-03-10 | Faron Pharmaceuticals Oy | Biomarker for monitoring development of diseases and assessing the efficacy of therapies |
| CN107250157B (zh) | 2014-11-21 | 2021-06-29 | 百时美施贵宝公司 | 包含修饰的重链恒定区的抗体 |
| SG11201703192SA (en) | 2014-11-21 | 2017-05-30 | Bristol Myers Squibb Co | Antibodies against cd73 and uses thereof |
| CN106967787B (zh) * | 2017-02-13 | 2021-01-22 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒 |
| CN113584125B (zh) * | 2021-07-28 | 2024-06-04 | 德赛诊断系统(上海)有限公司 | 一种液态稳定的5’-核苷酸酶校准品及检测试剂盒及其应用 |
| CN114199844B (zh) * | 2021-12-09 | 2024-02-09 | 吉林大学 | 一种金纳米簇及其在制备检测碱性磷酸酶荧光探针中的应用 |
-
2000
- 2000-05-24 HU HU0002003A patent/HUP0002003A3/hu unknown
- 2000-07-03 EA EA200201281A patent/EA005164B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-07-03 DE DE60008934T patent/DE60008934T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-03 CN CN00819631.1A patent/CN1221667C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-03 CZ CZ20023876A patent/CZ20023876A3/cs unknown
- 2000-07-03 AU AU5835800A patent/AU5835800A/xx active Pending
- 2000-07-03 SK SK1672-2002A patent/SK16722002A3/sk unknown
- 2000-07-03 EP EP00944124A patent/EP1283901B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-03 AT AT00944124T patent/ATE261495T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-07-03 US US10/296,136 patent/US6861225B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-03 PL PL35985000A patent/PL359850A1/xx unknown
- 2000-07-03 CA CA002407446A patent/CA2407446A1/en not_active Abandoned
- 2000-07-03 AU AU2000258358A patent/AU2000258358B2/en not_active Ceased
- 2000-07-03 YU YU88302A patent/YU88302A/sh unknown
- 2000-07-03 WO PCT/HU2000/000069 patent/WO2001090403A1/en active IP Right Grant
-
2002
- 2002-11-14 HR HR20020899A patent/HRP20020899A2/xx not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| YU88302A (sh) | 2006-01-16 |
| EA200201281A1 (ru) | 2003-06-26 |
| CA2407446A1 (en) | 2001-11-29 |
| HU0002003D0 (en) | 2000-07-28 |
| CN1454262A (zh) | 2003-11-05 |
| AU2000258358A1 (en) | 2002-02-21 |
| US6861225B1 (en) | 2005-03-01 |
| WO2001090403A1 (en) | 2001-11-29 |
| CN1221667C (zh) | 2005-10-05 |
| EA005164B1 (ru) | 2004-12-30 |
| AU2000258358B2 (en) | 2005-08-18 |
| DE60008934D1 (de) | 2004-04-15 |
| HUP0002003A3 (en) | 2003-01-28 |
| HUP0002003A2 (en) | 2002-08-28 |
| ATE261495T1 (de) | 2004-03-15 |
| PL359850A1 (en) | 2004-09-06 |
| EP1283901A1 (en) | 2003-02-19 |
| AU5835800A (en) | 2001-12-03 |
| HRP20020899A2 (en) | 2005-10-31 |
| EP1283901B1 (en) | 2004-03-10 |
| DE60008934T2 (de) | 2005-03-10 |
| SK16722002A3 (sk) | 2003-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Giusti | Adenosine deaminase | |
| Smyth et al. | The metabolism of cytosine arabinoside as a predictive test for clinical response to the drug in acute myeloid leukaemia | |
| Isshi et al. | Predicting 5-FU sensitivity using human colorectal cancer specimens: comparison of tumor dihydropyrimidine dehydrogenase and orotate phosphoribosyl transferase activities with in vitro chemosensitivity to 5-FU | |
| Que et al. | Mechanism of selective inhibition of 3'to 5'exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I by nucleoside 5'-monophosphates | |
| HU176133B (en) | Process and reagent for determining mb-creatinase-activity in body-liquid-samples | |
| Goldberg | 5’Nucleotidase: Recent advances in cell biology, methodology and clinical significance | |
| CZ20023876A3 (cs) | Způsob a reagenční kit pro stanovení aktivity 5´-nukleotidázy | |
| BR112013013656B1 (pt) | processo para determinação da sensibilidade de um indivíduo a um agente anticâncer, kit para realização do dito processo bem como processo de triagem para um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade a um agente anticâncer | |
| US5576177A (en) | Bioassay for reverse transcriptase inhibitors | |
| Battisti et al. | Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) and adenosine deaminase (ADA) activities in prostate cancer patients: influence of Gleason score, treatment and bone metastasis | |
| EA001988B1 (ru) | СПОСОБ ИСТОЩЕНИЯ АДЕНОЗИН 5'-МОНОФОСФАТА В МЕТИЛТИОАДЕНОЗИНФОСФОРИЛАЗА (МТАза)-НЕДОСТАТОЧНЫХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО-ХОЗЯИНА | |
| Orfanos et al. | A rapid screening test for Duchenne muscular dystrophy using dried blood specimens | |
| Bachelard | Allosteric activation of brain hexokinase by magnesium ions and by magnesium-ion–adenosine triphosphate complex | |
| US5670331A (en) | Methods for optimizing fluoropyrimidine cancer therapy | |
| Dudzinska et al. | Uridine-an indicator of post-exercise uric acid concentration and blood pressure. | |
| Stachelska-Wierzchowska et al. | Non-typical nucleoside analogs as fluorescent and fluorogenic indicators of purine-nucleoside phosphorylase activity in biological samples | |
| Van Waeg et al. | Purine metabolism in normal and ITP-pyrophosphohydrolase-deficient human erythrocytes | |
| RU2063044C1 (ru) | Способ прогнозирования течения инфекционно-аллергической бронхиальной астмы | |
| Rogler-Brown et al. | Tight binding inhibitors—VIII: Studies of the interactions of 2′-deoxycoformycin and transport inhibitors with the erythrocytic nucleoside transport system | |
| Qiu et al. | IL-6/JAK2-dependent G6PD phosphorylation promotes nucleotide synthesis and supports tumor growth | |
| JP3901860B2 (ja) | 複数の酵素を反応させる物質の定量方法及び酵素組成物 | |
| EP0071087B1 (en) | Improved determination of creatine phosphokinase in body fluids | |
| EP0130030B1 (en) | Diagnostic applications of phosphofructokinase | |
| Wilmanns | Dihydrofolate Reductase: Tetrahydrofolate Dehydrogenase | |
| Moore et al. | Pharmacologic stimulation of erythrocyte 2, 3-diphosphoglycerate production in vivo. |