NO122809B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved spektrofotometrisk bestemmelse av kreatinfosfokinase.

Oppfinnelsen angår bestemmelse'av kreatinfosfokinase i serum eller andre væsker, ved fremgangsmåten som er angitt i krav l's innledning.

Ved fremstilling av kreatinfosfokinase og ved fremstilling av reagenser som må være frie for kreatinfosfokinase, såsom f.eks. lactatdehydrogenase og pyruvatkinase som anvendes ved bestemmelse av kreatinfosfokinase, er det viktig å ha en enkel, men effek-tiv, metode til å påvise tilstedeværelse og bestemme mengden av kreatinfosfokinase i dyreserumet eller annet biologisk medium fra hvil-ket kreatinfosfokinase eller annet enzym ekstraheres. Metoder til å ekstrahere kreatinfosfokinase er beskrevet av Noda, Kuby og Lardy i Journal of Biological Chemistry, volume 209, side 291 f.f. og side

Bestemmelsen av CPK (kreatinfosfokinase) er basert på at den er en spesifik katalysator for en reversibel reaksjon ifdlge hvilken adenosin-trifosfat (ATP) og kreatin reagerer under dannelse av adenosin-difosfat ADP) og fosfokreatin:

Likevekten av reaksjon (1) er ytterst pH-avhengig. Den optimale pH for forover-reaksjonen (mot ADP og fosfokreatin) er ca. 9, og for bakover-reaksjonen er den ca. 7,2.

Både forover-reaksjonen og bakover-reaksjonen har vært benyttet i en rekke metoder for bestemmelse av CPK. En av de fdrste metoder som ble benyttet (Ebashi et al, J. Biochem. (Tokyo), 46, 103), gjorde bruk av foroverreaksjonen og målte kolorimetrisk mengden av fritt fosfor fra hydrolysen av det dannede fosfokreatin.Denne metode har vist sig å være ganske enkel, men den har ikke vist sig å være særlig fdlsom. Dessuten fordrer den at forsdkene utfores med serumprdver innen noen få timer efter at provene er tatt, da sogar prover som er lagret i fryst tilstand viser varierende reduk-sjoner i CPK-aktiviteten når de testes efter denne metode.

På grunn av disse ulemper er det foreslått en rekke al-ternative metoder. Således kombinerer Tanzer og Gilvarg (J. Biol. Chem. 234, 3201) forover-reaksjonen (1) med de folgende reaksjoner:

Oxydasjonshastigheten for DPNH (dihydrodifosfopyridin-nucleotid) bestemmes ved hjelp av et UV-spektrofotometer ved bølge-lengde på 340 nm. Noen av vanskelighetene med denne metode er ganske åpenbare. Avlesningene må foretas med ndyaktige tidsinterval-ler. Dessuten krever denne metode 2 ml serum og gir meget små, og folgelig undyaktige, avlesninger for normalt serum.

Andre forskere har brukt bakover-reaksjon (1). Så tid-lig som 1954 beskrev Ennor og Rosenberg (Biochem. J., 57, 203) en rekke eksperimenter hvor såvel forover-reaksjon (1) som bakover-re-aks jon (1) ble benyttet, idet forover-reaksjon (1) ble utfort ved pH 10,5, og bakover-reaksjon (1) ble utfort ved pH 7,2. Efter å ha anvendt renset CPJC fra skjelettmusktLer fra lam og bestemt den gjen-værende eller dannede mengde kreatin, rapporterte de blant annet to viktige oppdagelser. For det fdrste fant de, efter å ha utfort man ge eksperimenter, at der krevdes femti ganger mer CPK for forover-reaks jon (1) enn for bakover-reaksjon (1) for å oppnå en hensikts-messig reaksjonshastighet. For det annet fant de at skjont tilsetningen av cystein forte til akselerering av reaksjonshastigheten for bakover-reaksjon (1), hadde det ingen virkning på hastigheten av forover-reaksjon (1). Senere forskere har fulgt Ennors og Rosenbergs anvisninger. Hughes (Clinica Chemica Acta, 7, 597

(1962) benytter bakover-reaksjon (1), tilsetter en sulfhydrylforbindelse og bestemmer den dannede mengde kreatin. Han har funnet at denne metode gir en lineær sammenheng mellom mengden av CPK og mengden av dannet kreatin og gir reproduserbare resultater, enn-skjont sulfhydrylforbindelsen interfererer med bestemmelsen av kreatin. Nielsen og Ludvigsen (J.Lab. & Clin. Med., 62, 159 (1963) benytter ytterligere en annen metode som krever 1,75 ml serum, og citerer Ennor og Rosenberg angående uttalelsen om at sammenlignbare målinger ved anvendelse av forover-reaksjon (1) krever femti ganger hoyere konsentrasjon av CPK.

Det er et mål med denne oppfinnelse å tilveiebringe en enkel og ndyaktig metode for å bestemme kreatinfosfokinase.

Stikk imot hva Ennor og Rosenberg, supra, angir, har det vist sig at tilsetning av en sulfhydrylforbindelse under reaksjons-betingelser som benyttes ved fremgangsmåten ifdlge oppfinnelsen, ved en pH-verdi på ca. 9 forer til mangedobling av reaksjonshastigheten og langt mere reproduserbare resultater, selv ved anvendelse av serum som er lagret i et betydelig tidsrom. Således tilveiebringes en meget fdlsom og reproduserbar metode til å bestemme CPK under anvendelse av bare en liten mengde serum.

Det særegne ved fremgangsmåten ifdlge foreliggende oppfinnelse er angitt i patentkrav l's karakteriserende del..

Fremgangsmåten ifdlge oppfinnelsen kan også benyttes ved fremgangsmåten ifdlge Tanzer og Gilvarg, supra, hvorved der fremkommer en modifisert fremgangsmåte som er langt enklere, mere folsom og mere pålitelig enn den umodifiserte fremgangsmåte.

Ved denne fremgangsmåte kombineres fdlgende reaksjoner med forover-reaksjon (1) i nærvær av en sulfhydrylforbindelse.

Ndyaktig kjente mengder av samtlige reagenser anvendes for fremstilling av en oppldsning av kjent volum. Det vil sees at efter en kort inkuberingsperiode gir regenereringen av ATP i reaksjon (4) en konstant konsentrasjon av ATP. Under betingelsene ved den modifiserte fremgangsmåte har det vist sig at reaksjonshastigheten blir lineær efter en kort inkubasjonsperiode. Det er derfor ikke nddvendig å bestemme reaksjonshastigheten ved hyppige avlesninger med et UV-spektrofotometer, men bare en enkelt avlesning efter inkubasjonsperioden og en sluttelig avlesning efter et på for-hånd bestemt tidsrom, f.eks. efter IO minutter. På grunn av ustabi-liteten av enkelte av reagensene når de blandes i oppldsningen, til-beredes der en blindprdve som inneholder samtlige reagenser unntatt kieatinet, og de to spektrofotometeravlesninger ved begynnelse og slutt foretas under anvendelse av denne blindprdve som en standard. På samme måte som ved den umodifiserte fremgangsmåte bestemmes den optiske tetthet ved en bdlgelengde på 340 nm, som er en bølgelengde hvor DPNH har hdy optisk tetthet. Minskningen i den optiske tetthet er proporsjonal med CPK-aktiviteten i serumet.

Den foretrukne modifiserte fremgangsmåte ifdlge oppfinnelsen er som det vil fremgå av nedenstående. Fremgangsmåten utfores mens oppløsningene holdes ved en temperatur av 25°C.

De fdlgehde reagenser anbringes ved hjelp av pipetter i en skål eller kolbe som inneholder 1,0 mg S-DPNH: 0,5 ml fosfo(enol)pyruvatoppldshing (60 mikromol aktivt fosfo(enol)pyruvat, f.eks. tricyclohexylaminsalt, i IO ml Mg-tris buffer, nemlig 0,015 M MgSO^og M tris (hydroxymethylamino)-methan innstillet med CH1 til pH 9,0 ved 25°C)

3,5 ral vann

0,2 ml serum

0,2 ml ATP-glutathionoppldsning (en alikvot oppldsning inneholdende 310 mg ATPjNa2, 3H20, 19L mg glutathion, i redusert form, og 3,7 ml vann)

0,1' ml PK/LDH enzymer, 2 mg krystallinsk pyruvatkinase og 2 mg lactatdehydrogenase pr. ml 2,2 M ammoniumsulfatoppldsning.

Skålen forsynes med lokk og vendes om flere ganger for

å oppldse DPNH. Derefter overfores 2,0 ml av denne oppldsning ved hjelp av en pipette til hver av to cuvetter, med lysbaner på 1 cm.

I den ene av cuvettene pipetteres l'o ml Mg-tris bufferopplosning (0,015 M MgS04og 0,6 M tris innstillet med HC1 til pH 9,0 ved 25°C).. Denne cuvette betegnes "blindprdve"-cuvetten. I den annen cuvette, som betegnes "test"-cuvetten, pipetteres 1,0 ml kreatinoppldsning som inneholder 0,06 M kreatin i Mg-tris bufferopplosning og som har en pH på 9,0 ved 25°C. Innholdet i hver cuvette blandes ved ven-ding av cuvetten og holdes ved ndyaktig 25°C. Det ideelle er at spektrofotometret som anvendes ved denne fremgangsmåte er forsynt med "thermospacers" for å holde en konstant temperatur på 25°C, og at cuvettene straks anbringes i spektrofotometret. Dersom spektrofotometret ikke er forsynt med "thermospacers", kan cuvettene pla-seres i et bad av konstant temperatur. Efter omtrent 5 minutter innstilles spektrofotometret slik at der avleses en optisk tetthet på 0,400 ved 340 nm, med "blindprdve"-cuvetten i lysbanen. Derefter avleses og noteres den optiske tetthet av "test"-cuvetten. Dette er avlesningen (Tq) for tiden null. Efter en bestemt tid, f.eks. 10 minutter efter null-tidsavlesningen,innstilles spektrofotometret påny slik at der avleses en optisk tetthet på 0,400 når "blindprdve"-cuvetten står i lysbanen, og den optiske tetthet av "test"-cuvetten avleses påny. Dette er avlesningen (T-^q) efter 10 minutter. Differansen mellom Tq og T1Qer direkte proporsjonal med aktiviteten av CPK i serumet..

Skjdnt differansen mellom Tq og i sig selv kan være tilstrekkelig til å indikere graden av aktivitet av CPK i det teste-de serum efter at der er utfort et stort antall bestemmelser, er det dnskelig å definere CPK-aktiviteten i en standard enhet for denne fremgangsmåte. Enheten kan defineres som den CPK-aktivitet som vil fosforylere 1 nm kreatin pr. minutt ved 25°C under betingelsene ved denne fremgangsmåte. Denne definisjon vil gjore det mulig for forskjellige utdvere av fremgangsmåten å sammenligne resultatene, og kan vise sig å være anvendelig som en standard til hvilken andre enheter ved andre fremgangsmåter kan omdannes ved bruk av en enkel om-regningsfaktor. Antall enheter av CPK-åktiviteten ved den foreliggende fremgangsmåte kan regnes ut ved hjelp av fdlgende formel:

Betegnelsen AOD angir differansen mellom Tq og T^q, tallet 3,0 betegner væskevolumet i hver cuvette, tallet lOOO omdan-ner mikromol til nmol, tallet 6,22 er den millimolare ekstensjons-koeffisient for B-DPNH ved 340 nm, tallet 0,089 representerer volu-met av serum i hver cuvette og tallet 10 betegner antall minutter.

Dersom AOD er stdrre enn 0,30, må bestemmelsen gjentas under anvendelse av en passende fortynning av serumet, og det nye resultat multipliseres med fortynningsfaktoren.

Hess og MacDonald har anbefalt å utfore fortynningen med et varmeinaktivert serum (serum oppvarmet ved 56°C i 15 minutter) . Patentinnehaveren har ikke iakttatt noen forskjell av betyd-ning når fortynningen utfores med saltoppldsning (0,9 % NaCl), hen-holdsvis utfores med varmeinaktivert serum.

Ennskjdnt fortolkningen av de oppnådde resultater ikke utgjor noen del av oppfinnelsen, menes det at målt i de enheter som er definert for denne fremgangsmåte, inneholder normalt serum 0-12 enheter pr. ml, mens overgangssonen med hensyn til aktivitet er fra 12 til 20 enheter pr. ml,og forhdyet aktivitet svarer til mere enn

20 enheter pr. ml.

Anvendelsen av blindprdven er nddvendig ved denne fremgangsmåte, fordi der også i fravær av tilsatt kreatin finner sted en reduksjon av den optiske tetthet. Det meste av denne reduksjon forårsakes av den spontane nedbrytning av ATP og DPNH og av tilste-deværelsen av de fdlgende enzymer i serum:

ATPase, DPNH-oxydase og alkalisk fosfatase.

Én fordel ved denne fremgangsmåte er den at det meget

lett kan kontrolleres at reagensene virker tilfredsstillende. Denne kontroll kan utfores nu og da som en del av bestemmelsen. Like for nulltidsavlesningen foretas, avleses den optiske tetthet av "blindprdven" under anvendelse av vann som referanse. Dersom den optiske tetthet av "blindprdven" er lavere enn 0,8, er der enten for meget ADP i ATP, eller der er for meget fritt pyruvat i fosfo(enol)pyru-vatoppldsningen eller der er for lite S-DPNH i skålen. En annen kontroll utfores ved at man avleser (T,.) fem minutter efter nullti-den, i tillegg til den vanlige (T^q)-avlesning efter 10 minutter. Differansen mellom TQog T5bor være praktisk talt den samme som

J> rm r» w —

differansen mellom T,. og T1Q. Dersom dette ikke er tilfelle, er det sansynlig at temperaturen ikke har vært konstant eller, eventu-elt, at en av reagensene ikke har foreligge* i den riktige mengde, slik som ved den fdrste kontrollprdve. En tredje kontrollprdve utfores efter de IO minutter ved at man påny avleser den optiske tetthet av "blindprdven" under anvendelse av vann som referanse. En optisk tetthet på mindre enn 0,7 indikerer etav de samme problemer som ved den fdrste kontrollprdve. En fjerde kontrollprdve foretas ved at man tilsetter ca. 0,5 mg ADP til "blindprdven". Efter 2 eller 3 minutter skal den optiske tetthet ha minsket med 0,4 eller mere. Dersom dette fall i optisk tetthet ikke finner sted, og dersom den optiske tetthet for tilsetningen av ADP var 0,7 eller hdye-re, er PK/LDH-enzymoppldsningen inaktiv.

Mange variasjoner i fremgangsmåten ifdlge oppfinnelsen, hvor der anvendes en sulfhydrylforbindelse ved forover-reaksjon (1) og en pH på ca. 9,0, vil være åpenbare for en fagmann på området i lys av den ovenstående beskrivelse. Den fremgangsmåte som er beskrevet mere detaljert, kan også varieres i betydelig grad. Eksem-pelvis kan mengden av fosfo(enol)pyruvatoppldsning dkes betydelig. Videre kan andre buffere, såsom f.eks. en glycinbuffer, benyttes

for å holde pH-verdien på ca. 9,0. Der kan anvendes cuvetter med en lysbane på mere eller mindre enn 1 cm, i hvilke tilfeller de beregnede enheter CPK-aktivitet må divideres med den anvendte lysbane målt i cm, for å oppnå aktiviteten i de her definerte enheter. Oppholdet på omtrent 5 minutter for nulltidsavlesningen foretas til-later reaksjonen å nå en lineær hastighet. Erfaringen kan vise at denne ventetid kan innkortes eller sldyfes med bare ubetydelig virkning på resultatene. Skjdnt temperaturen må holdes konstant, kan en . annen temperatur enn 25°C anvendes. De beregnede aktivitetsenheter må da multipliseres med en egnet temperaturkorreksjonsfaktor.(TC)

som vist i den fdlgende tabell:

Claims (2)

1. Fremgangsmåte ved spektrofotometrisk bestemmelse av kreatinfosfokinase ved omsetning av adenosintrifosfat med kreatin til adenosindifosfat og fosfokreatin i nærvær av en sulfhydrylforbindelse i en vandig testoppldsning inneholdende en ukjent mengde kreatinfosfokinase, karakterisert ved at man til testoppldsningen tilsetter en puffer for å holde oppldsningens pH-verdi på ca. 9,0, fosfo(enol)pyruvat, pyruvatkinase, lactatdehydrogenase og dihydrodifosfopyridin-nucleotid, foretar en fdrste bestemmelse av oppløsningens optiske tetthet ved ca. 340 nm ca. 5 minutter efter at samtlige av testoppldsningens reaktanter er blitt blandet sammen, foretar en ny bestemmelse av oppldsningens optiske tetthet ved samme bdlgelengde, et bestemt tidsrom, f.eks. 10 minutter, efter den fdrste bestemmelse og bestemmer testoppldsningens innhold av kreatinfosfokinase av differansen mellom de målte optiske tettheter.

2. Fremgangsmåte ifdlge krav 1, karakterisert ved at en oppldsning inneholdende adenosintrifosfat, en sulfhydrylforbindelse, en puffer, fosfo(enol)pyruvat, pyruvatkinase, lactatdehydrogenase. og DPNH, i omtrent samme konsentrasjon som i testoppldsningen benyttes som referanseoppldsning ved både den fdrste og den annen bestemmelse av optisk tetthet, at en kontrollbestemmelse av referanseoppldsningen foretas ved samme bdlgelengde som den fdrste og annen bestemmelse av den optiske tetthet, på omtrent samme tidspunkt som den annen bestemmelse av optisk tetthet, og under anvendelse av vann som referanse, at adenosindifosfat derefter tilsettes til referanseoppldsningen, at der foretas ytterligere en kontrollbestemmelse av referanseoppldsningen under anvendelse av vann som referanse, og at disse kontrollbestemmelser sammenlignes med en standard for å bestemme eventuell aktivitet av andre reaktanter enn kreatinfosfokinase.