DE1623057A1

DE1623057A1 - Calorimetrische Bestimmung von Kreatin-Phosphokinase

Info

Publication number: DE1623057A1
Application number: DE19661623057
Authority: DE
Inventors: Louis Berger; Daniel Broida; Bressler Leo Floyd
Original assignee: Sigma Chemical Co
Current assignee: Sigma Chemical Co
Priority date: 1965-09-29
Filing date: 1966-09-09
Publication date: 1970-10-29
Also published as: DE1623075A1; BE686935A; IL27834A; GB1189825A; NL6613654A; NO117886B; GB1153273A; BE696512A; AT281761B; US3403077A; CH485222A; US3485724A; IL26528A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Messung von Xreatin-Phospho.tinase in 'Serum oder anderen Flüssigkeiten,

Eine Anzahl Forseher hsben berichtet, dass der Kreatin- Phospbo'tinase-Soiegel, der nachfolgend mit CFK bezeichnet wird, i . menschlichen Serum ein bra ichbarer Index für die Differentialdiagnose einer Vielzahl von Störungen darstellt, ns wurde berieh* tet, dass bei Patienten nit Ouehenne-arti.ger ;ius-!:elatrophie (Duchenne type muscular dysirophy) st-rk erhöhte Gehalte an Ζ?ιί "uftreten, während ^ei ?olchen vom Glied-Gürtel—Typ (IiRbgirdle-type) ct,\as '.yeniger erhöhte <erte und bei solchen vom aesichts-Schulterblatt-Typ (focio scapulohhuiaeral types) im wesentlichen normale .Verte festgestellt wurden.

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Vorübergehend erhöhte CFK-Werte wurden weiterhin von milden Herzmuskel-Infarkten berichtet, während bei Lungeninfarkten im wesentlichen normale Werte festgestellt wurden. Sowohl von mäßig starker Muskelanstrengung als auch von Unterfunktion der Schilddrüse sind ebenfalls erhöhte CPK-Spiegel berichtet worden. Bei einer großen Vielfalt von Störungen sind weiterhin im wesentlichen normale Werte festgestellt worden. Die CPK-Bestlmmung basiert auf der Tatsache, daß dasselbe einen spezifischen Katalysator für eine umkehrbare Reaktion darstellt, in der Adenosin-Triphosphat (ATP) und Kreatin unter Bildung von Adenosin-Diphosphat (ADP) und Kreatin-Phosphorsäure miteinander reagieren:

(1) ATP + Kreatin ^ZTADP + Kreatin-Phosphorsäure Das Gleichgewicht der Reaktion (1) ist außerordentlich pH-abhängig. Der optimale pH-Wert für die nach rechts verlaufende Reaktion (Bildung von ADP und Kreatin-Phosphorsäure) liegt bei etwa 9, während er für die umgekehrte Reaktion bei etwa 7,2 liegt.

Sowohl die nach rechts verlaufende als auch die Rückreaktion sind bei einer Vielzahl von Methoden zur Bestimmung von CPK verwendet worden. Sine der zuerst benutzten Methoden (Ebashi et al, J. Biochem. (Tokyo), 46, 105) benutzte die nach rechts verlaufende Reaktion und bestimmte colorimetrisch den freien Phosphor, der durch Hydrolyse der Kreatin-Phosphorsäure gebildet wurde. Diese Methode hat sich als sehr einfach erwiesen; sie ist jedoch nicht sehr empfindlich· Weiterhin ist dabei erforderlich, daß die Serumproben bereits wenige Stunden nach der Probenentnahme für die Tests verwendet werden, weil sogar Proben, die beim Gefrierpunkt gelagert wurden, variierende Verminderungen der CPK-Aktivität zeigten, wenn sie nach dieser Methode geprüft wurden.

0098U/0533 ⁸^ or_(g,_nal

Wegen dieser Nachteile wurde eine Anzahl alternativer Methoden entwickelt. Tanzer und Gilvarg (J. Biöl. Chera. 234, - 3201) verbanden mit der vorgenannten Reaktion (1) die nachfolgenden Reaktionen:

(2) Phosphoenölpyruvat + ADP^±Pyruyat + ATP

O) Pyruvat + DPHH + H^Z^Lactat + DPN" ^;5aiJ ^Jute^ λ: ^

Die Geschwindigkeit der Oxadation von DPMH wird mit einem UV-Spektrophotometer bei 34o rau gemessen. Einige der mit dieser Methode verbundenen Schwierigkelten sind sofort erkennbar. Es ist eine Spektrometereapfindlichkeit im Bereich von 340 - 360 «μ erforderlich* Während der gesaraten Zeit« in der Ablesungen gemacht werden« muß die Tem-, peratur konstant auf 2§0°C (25 ⁰C) gehalten werden. Die Ablesungen müssen innerhalb genauer Zeitintervalle durchgeführt werden. Weiterhin erfordert diese Methode 2 ml Serum und gibt sehr geringe« daher ungenaue Ablesungen für Norraalserum. Trotz dieser Machte!Ie scheint dies jedoch die am meisten verwendete Methode zu sein.

Andere Forscher haben die Rückreaktion (1) verwendet. Bereits im Jahre 1954 haben Bnnor und Rosenberg (Biochem. J. 57 » 203) Über eine Reihe von Experimenten berichtet« bei denen sowohl die nach rechts verlaufende als auch die Rückreaktion (1) bei einem pH-Wert von 10,5 für die nach rechts verlaufende Reaktion (1) und einen pH-Wert von 7,2 für die Rückreaktion (1) verwendet'wurden. Bei der Verwendung von gereinigtem CPK aus Skelettmuskulatur von Schafen und bei der Bestimmung des verbleibenden oder gebildeten Kreatins berichteten sie u.a. üoer swei wichtige Feststellungen. Sie fanden zunächst« daß trotz vieler Experimente fünfzig mal so viel CPK für die nach rechts verlaufende Reaktion (!) als für die Umkehrreaktion erforderlich war« um eine geeignete Reaktionsgeschwindigkeit au erzielen. Weiterhin fanden sie, daß der Zusatz von Cystein« obgleich er eine Beschleunigung der Reaktionsgeschwindigkeit

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der Umkehrreaktion (1) bewirkt, auf die Geschwindigkeit der nach rechts verlaufenden Reaktion keinen Einfluß ausübt. Jüngere Forscher haben die Lehre von Ennor und Rosenberg weiter verfolgt. Hughes (Clinica Chemica Acta, Z» 597» (1962) verwendet die Umkehrreaktion (1), setzt eine SuIfohydryl-Verbindung zu und bestimmt das gebildete Kreatin. Er fand, daß diese Methode ein lineares Verhältnis zwischen der Menge des CPK und der Menge des gebildeten Kreatins ergibt und daß reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden, obgleich die Sulf,ohydryl-Verbindung auf die Berechnung des Kreatins störend einwirkt. Nielsen und Ludvigsen(J. Lab. Jb Clin. Med», 62., 159, (1963) verwenden noch eine andere Methode, die 1,75 ml Serum erfordert und sie zitieren Ennor und Rosenberg bezüglich des Lehrsatzes, daß vergleichbare Messungen unter Verwendung der nach rechts verlaufenden Reaktion (1) eine fünfzig mal so hohe Konzentration an CFK erfordert.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine einfache und genaue Methode zur Messung der Kreatin-Phosphokinase zu schaffen-.

Eine andere Aufgabe besteht darin, eine Methode zu schaffen, bei der die zu prüfenden Sera sowohl frisch als auch gelagert sein können.

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• Die weiteren Ziele der Erfindung erkennt der Fachmann aus der nachfolgenden Beschreibung,

Ganz allgemein wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Verbesserung des Verfahrens zur Bestimmung von Kreatin-Phosphokinase durch Reaktion von ATP mit Kreatin in Gegenwart von CPK unter Bildung von ADP und Phosphokreatin erzielt, wobei eine SuIfhydryi-Verbindung zu der Reaktionsmischung gegeben wird. Im Gegensatz zu den vorstehenden Lehren von Snnor und Rosenberg wurde nämlich gefunden, daß unter den bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Reaktionsbedingungen bei einem pH von etwa 9 der Zusatz einer Sulfhydryl-Verbindung eine mehrfache Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit und weit mehr reproduzierbare Ergebnisse^sogar mit Serum, welches eine beträchtliche Zeit gelagert worden ist, ergibt. Es wird daher ein hoch empfindliches und reproduzierbares Verfahren zur Bestimmung der CPK geschaffen, bei dem nur eine geringe Menge Serum erforderlich ist.

Die erfindungsgemäße Methode kann auf zahlreiche Verfahren angewandt werden, die die nach rechts verlaufende Reaktion (1) und entweder ADP oder Kreatinphosphorsäure messen. Sie ist indessen in besonderem Maße auf das Verfahren anwendbar, bei dem Kreatinphosphat hydrolysiert und der freigesetzte anorganische Phosphor calorimetrisch gemessen wird. Dieses Verfahren besitzt den Vorteil der Einfachheit und der leichten An-

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passungsfähigkeit an vielfältige Bestimmungen.

Bei den üblichen Verfahren werden bekannte Mengen ATP und Kreatin in Gegenwart eines bekannten Volumens einer Lösung, die eine unbekannte Konzentration an CPK enthält, miteinander gemischt. Nach einer genau bestimmten Zeitspanne wird die Reaktion abgestoppt, das Phosphokreatin hydrolysiert und das anorganische Phosphat nach der Methode von Fiske und Subba Row (j. Biol. Chem., 66, yj5* (1925), die nachfolgend rait P Jb S bezeichnet wird, bestimmt. Die P k S-Methode zur Bestimmung des Phosphates schließt die Bildung eines stark gefärbten Molybdat-Komplexes ein. Die optische Dichte oder die Durchlässigkeit dieses Komplexes wird dann bestimmt und die Phosphorkonzentration wird anhand einer einfachen Tabelle festgestellt.

Für die Herstellung einer solchen Tabelle, die eine bloße Eichkurve für ein besonderes Calorimeter und eine besondere Wellenlänge darstellt, wird die optische Dichte oder die optische Durchlässigkeit durch den Komplex bei verschiedenen bekannten Phosphatkonzentrationen innerhalb des erwarteten Bereiches bestimmt und gegen das Phosphorgewicht aufgetragen. Als Beispiel für die Herstellung einer solchen Sichkurve können 6 Proben mit Phosphatlösungen in der in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Weise hergestellt werden:

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-T-

	1	ml.0.00645	. ml	Tabelle 1	Microgramm	entspricht
Te st-	2	molarer	Wasser	O.D.oder	Phosphor	einem Gehalt
röhren-	3	KH^FO₄		% T		an CPft/ml Serum
Nr.	4	0	5r00 -		/ 0	0
5	0,25	4,75	χ Zero OD	f 5	13,3
6	0,50	4,50	\ oder V 100 % T/	10	26,7
	0,75	4,25		15	40,0
1,00	4,00		20	53,3
1,25	3,75		25	66,7

Zu Jeder dieser Teströhren werden 0,50 ml 5 N-SchwefelsRure und 0,50 ml einer standardisierten MoIybdatlösung (2,5St(HHJi) ₆Mo-0_2ip4HgQ in Wasser) gegeben.

Die Lösungen werden durch seitliches Schütteln gemischt. Zu jeder dieser Proben werden 0,25 ml standardisierte F Jb S-Reduktionslösung zugegeben. Die F k. S-Reduktlonslösung wird in der Weise hergestellt, daß 1 g Feststoff aus einem Teil 1-Amino-2-naphthol-4"Sulfonsäure, 120 Teilein Natriumbisulfit und vier Teilen Natriumsulfit zu 6,3 nl Wasser zugegeben wird. Die Proben werden bei Raumtemperatur (25°> 5⁰C) 10 Minuten stehen gelassen. Am Ende dieser Zehnminuten-Periode und innerhalb einer weiteren Zehnminuten-Periode wird die optische Dichte oder der optische Durchtritt einer jeden Probe genessen, und zwar unter Bezugnahme auf die erste Probe. Es wurde festgestellt, daß der Wellenlängenbereich von 66o mu (- 4o au) besonders geeignet ist. Wenn die optische Dichte auf gewöhnlichem

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Koordinatenpapier gegen die Microgramme Phosphor aufgetragen werden, wird eine Eichkurve erhalten, die durch den Koordinatenanfangspunkt geht. Wenn das Calorimeter exakt arbeitet, ist die Eichkurve eine gerade Linie.

Als Beispiel für ein bekanntes Verfahren zur Bestimmung der CPK gemäß der nach rechts verlaufenden Reaktion 1 und anschließende calorimetrische Bestimmung des Phosphats wird das nachfolgende Beispiel angeführt.

Beispiel 1 (bekanntes Verfahren)

Die nachfolgenden Reagenzien werden sorgfältig in 15 ml Teströhren oder Zentrifugenröhren pipettiert:

Tabelle 2 Reagenz gestversuch 1 Blindversuch

Mg-Tripuffer

(0,0144 M.M SO^, 0,23 M.

Tri-hydroxy-methyl- - 1,0 ml

amino-methan, pH 9,0
bei 37°C)

Kreatinlösung (0,0576 N.Kreatin 0,0144 M.MgSOi^, 0,23 M.Tri-hydroxy- methyl-amino-methan, pH 9,0 bei yi °C	1,0	ml	-
Serum	0,4	ml	0,4 ml
Wasser	0,8	ml	0,8 ml

Beide Teströhren werden in einem Wasserbad von 37⁰C angeordnet und auf Temperatur gebracht. Zu jeder werden 0,20 ml standardisierter ATP-Lösung (15 mg ATP pro ml Wasser) zugegeben. Die genaue Zeit wird notiert und die Röhren werden

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leicht geschüttelt und für eine 30 Minuten-Inkubationsperiode wieder in dem Bad angeordnet. Während dieser Inkubationsperiode werden die folgenden drei Teströhren vorbereitetj ·

Tabelle 5

Reagenz Molybdat- Testversuch 4 Blind-

——— Bezugslösung ^ . versuch

Molybdat-Lösung

(2,5 % (NH^)₆Mo₇O₂₄.4H₂O 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml

(in Wasser) '

Schwefelsäure (5N) 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Wasser 7,5 ml 6,5 ml 6,5 ml

Am Snde der 30 Minuten dauernden Inkubationsperiode wird 1,6 ml kalte 2Oj6ige Trichloressigsäure zu jeder der beiden Röhren 1 und 2 zugegeben und beide Lösungen durch Umkehrung gemischt, um die Reaktion zu stoppen. Die Röhren 1 und werden dann etwa 5 Minuten lang zentrifugiert, bis die Lösungen klar sind.

Der anorganische Phosphor wird dann wie folgt bestimmt. 1 ml der Testlösung 1 wird in Teströhre 4 pipettiert. 1 ml der Blindversuchlösung 2 wird in die Blindversuchsröhre 5 pipettiert. Die erhaltenen Test- und Blindversuchlösungen werden gemischt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, damit das bei der Reaktion entstandene Kreatinphosphat hydrolysiert wird. Zu jeder der Röhren 3, 4 und 5 werden 0,50 ml F * S-Reduktions-

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lösung (1.0 g festes P k S-Reduktionsmittel in 6,3 ml Wasser) zugegeben. Die Lösungen werden bei Raumtemperatur 10 Minuten stehen gelassen, damit sich der Farbstoff entwickelt. Am Ende dieser 10 Minuten dauernden Periode und innerhalb weiterer 10 Minuten wird die optische Dichte der Test- und Blindversuchslösungen, bei 660 η»μ unter Verwendung der Molybdat-Bezugslösung als Bezugspunkt bestimmt. FUr die Ablesungen wird das gleiche Instrument verwendet wie für die Herstellung der Eichkurve· Die in der Teströhre und in der Blindversuchsröhre enthaltene Phosphormenge wird anhand der Eichkurve bestimmt. Die Differenz zwischen -der Phosphormenge in der Testlösung und in der Blindversuchslösung ist die Phosphormenge, die in Reaktion (1) umgesetzt wurde, und sie ist proportional der CPK-Aktivität in der Reaktionsmischung.

Die Einheit der CPK-Aktivität wird gewöhnlich als die Menge CPK definiert, welche pro Zeiteinheit unter den besonderen Versuchsbedingungen eine Kreatineinheit phosphoryliert. Eine CPK-Aktivitätseinheit, wie sie nachfolgend verwendet wird, phosphoryliert 1 Millimicromol Kreatin pro Minute unter den Versuchsbedingungen.

Das verbesserte erfindungsgemäße Verfahren wird durch das nachfolgende Beispiel veranschaulicht.

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Beispiel 2

Die folgenden Reagenzien werden sorgfältig in 15 ml Teströhren oder Zentrifugenröhren pipettiert:

Tabelle	4	O ml	Blindversuch 2 1,0 ml	-
Reagenzien (alle Reagenzien sind die gleichen wie in Tabelle 2) Mg-Puffer		3 el		3 ml
Kreatin-Löeung		0 ml	0,	0 ml
Serum	Testversuch 1		1,
Wasser


1*
O,
1.

Beide Röhren werden in einen Wasserbad von 37⁰C angeordnet und auf Temperatur kommen lassen. Zu Jeder Röhre werden 0,10 ml ATP-GlutathionlÖsung (6,2 mg ATP als Dinatriumsalz, Kristallin mit 3 Molekülen Wasser pro mol und 3,8 mg Glutathion in der reduzierten Form) gegeben. Die genaue Zeit wird notiert und die Röhren werden leicht geschüttelt und für eine 30 Minuten dauernde Inkubationsperiode in den Bad angeordnet* Während dieser Inkubationsperiode werden die folgenden drei Röhren hergestellt:

Tabelle 5

Reagenzien (alle MoIybdat- Testversuch 4 Blind-Reagenzien sind die Bezugslösung 3 versuch

gleichen wie in Tabelle 3) ————— '

MoIybdat-Lösung S chwefeis Sure Wasser

ο.	5	al	0,5	ml	0,	5	ml
0,	5	ml	0,5	ml	0	,5	Bl
5,	0	ml	5,0	ml	5	,0	ml

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Am Ende der JO Minuten dauernden Inkubationsperiode werden 1,6 ml kalte 20#ige TrIChloressigsäure zu jeder der Röhren 1 und 2 gegeben und beide Lösungen durch Umkehren gemischt, um die Reaktion abzustoppen. Die Lösungen werden dann etwa 5 Minuten stehen gelassen. Die Röhren 1 und 2 werden dann etwa 5 Minuten lang zentrifugiert, bis die Lösungen klar sind.

Die Menge des in Reaktion (1) umgesetzten Phosphors wird dann in genau der gleichen Weise wie in Beispiel 1 bestimmt, mit der Ausnahme, daß nur 0,25 ml der F * S-Reduktlonslösung erforderlich sind. Bei diesem Verfahren steht jedoch die Menge des übertragenen Phosphors nicht In einen linearen Verhältnis zu der Menge des vorliegenden CPK. Um daher die CPK-Aktivitäten in Einheiten zu erhalten, die direkt mit denjenigen vergleichbar sind, die nach den vorstehenden bekannten Methoden erhalten werden, insbesondere mit der Methode nach Beispiel 1, ist es nptwendlg, anhand von Versuchen mit bekannten CPK-Mengen eine Tabelle oder Kurve herzustellen. Eine solche Kurve wurde angefertigt und in Fig. 1 gezeigt. Obgleich für jedes individuelle Instrument, bit dem Messungen durchgeführt werden, eine Phosphoreichkurve angefertigt werden muß, 1st festzustellen, daß die in Fig. 1 gezeigte Kurve ein absolutes Verhältnis zwischen der übertragenen Phosphor· menge und den CPK-Einheiten pro ml Serum ergibt.

Die Reaktionsgeschwindigkeit und damit die Genauigkeit

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des Verfahrens nach Beispiel 2 ist wenigstens zehnmal so groß wie in Beispiel 1. Dies ist besonders wichtig bei der Messung von realtiv niedrigen'CPK-Spiegeln in der Grenzzone zwischen normalen und erhöhten CPK-Werten. Obgleich bei Sera, die gefroren gelagert und nach der Methode des.Beispiels 1 untersucht werden« variierende Abnahmen der CPK-Aktivität bis etwa 50 Jf in 24 Std. festgestellt werden, ergeben Sera, die zwei Wochen lang gefroren gelagert und nach der Methode des Beispiels 2 geprüft werden, nicht mehr als 10#ige Abnahmen.

Ein anderes Beispiel für ein Verfahren, das unter Verwendung der erfindungsgemäßen Methode arbeitet, ist folgendes:

Beispiel 3

Es wird das gleiche Verfahren angewandt, wie in Beispiel 2 mit der Ausnahme, daß anstelle von ATP-Glutathionlösung eine ATP-Cysteinlösung (6,2 mg ATP und 3 mg Cystein) verwendet wird, -

Beispiel V

Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 durchgeführt mit der Ausnahme, daß anstelle von ATP-Glutathionlösung eine ATP-2-Mercapto-äthanollösung (6,2 mg ATP und 0,95 mg 2-Mercapto-äthanol) verwendet wird.

Beispiel 5
Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 durchge-

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führt mit der Ausnahme, daß in der 0,1 ml ATF-SuIfhydryilösung, die 6,2 mg ATP enthält, die folgenden Mengen an Sulfhydryl-Verbindung in verschiedenen Prüfungen verwendet werden:

a. Glutathion

(i) 7,6 mg (0,01 Molar)

(ii) 3,8 mg (0,005 Molar)

(iii) 1,9 mg (0,0025 Molar)

(iv) 0,^8 mg (0,ooo5 Molar)

b. Cystein

(i) 3,0 mg (0,01 Molar)

(ii) 1,5 mg (0,005 Molar)

(ili) 0,75 mg (0,0025 Molar)

(iv) 0,15 mg (0,0005 Molar)

c. 2-Mercaptoäthanol

(i) 1,9 mg )0,01 Molar)

(ii) 0,95 mg (0,005 Molar)

(iii) 0,48 rag (0,0025 Molar)

(iv) 0,095 mg ' . (0,0005 Molar)

Bei den in Beispiel 5 veranschaulichten Tests wurde gefunden, daß mit dem gleichen Serum,die nach Zugabe der Sulfhydrylverbindung erhaltenen CPK-Aktivitäten in der Nähe der vierfachen Aktivitäten lagen, wie sie in Abwesenheit der Sulfhydrylverbindung gemessen wurden. Die bei allen Tests gemessenen Aktivitäten unter Verwendung der drei Suifhydry!verbindungen in Konzentrationen über 0,0005 Molar waren konstant. Bei einem 0,0005-molaren Gehalt an Sulfhydrylverbindung begannen unter diesen Testbedingungen die bestimmten Aktivitäten zu sinken, so daß also unter diesen

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Testbedingungen die untere Grenze für die Sulfhydryiverbindung, bei der noch genaue Ergebnisse erzielt werden, etwa 0,0005 Molar ist»

Es wurde bereits berichtet, daß der Grad der Aktivitätszerstörung von Serum, welches eine Zeltlang gelagert worden ist, in Abhängigkeit von der Ursache der erhöhten CPK-Werte variiert. Es ist daher anzunehmen, daß dann, wenn Testproben mit identischem Serum gemacht werden und identische Tests mit Ausnahme , daß in einem die Sulfhydrylverbindung ausgelassen worden ist und die auftretende Aktivität dieser Probe mit der anderen Testprobe verglichen wird, der Vergleich der CPK-Aktivitäten dieser beiden Proben ein wertvolles Hilfsmittel für die Unterscheidung möglicher Quellen für die erhöhten CPK-Werte darsteilen kann.

Zahlreiche Abänderungen des erfindungsgemäßsn Verfahrens, die im Bereich der beigefügten Ansprüche liegen, ersieht der Fachmann ohne weiteres aus der vorstehenden Offenbarung. So kann beispielsweise entweder die Länge der Inkubationsperiode oder die Temperatur der Xnkubationsperiode oder beide von der in den beschriebenen bevorzugten Beispielen angegebenen Periode und Temperatur (30 Minuten und 37°C) differieren, solange die Zeit und Temperatur genau vorherbestimmt werden und eine geeignete Kurve hergestellt und verwendet wird. Bei der beschriebenen Zeitdauer und Temperatur handelt es sich um bevorzugte Werte, weil der Aktivitätsbereich der CPK,

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der diesen Bedingungen angepaßt werden kann, hoch ist und der untere Wert normaler Aktivität im Bereich hoher Genauigkeit liegt. Die Reihenfolge, in der die Reaktionsbestandteile vor der Inkubation gemischt werden, kann ebenfalls variieren, Voraussetzung ist allein, daß ein Reaktionsbestandteil, der die Reaktion auslöst, als letzter zugegeben wird, so daß der Augenblick der Ingangsetzung der Reaktionsperiode (Inkubation) genau bestimmt werden kann. Die Reaktion kann daher durch Zugabe des Kreatin als letzten Reaktionsbestandteil oder durch Zugabe des Serums als letzten Reaktionsbestandteil anstelle der ATP-Lösung in Gang gesetzt werden. Andere Verfahren zur Bestimmung des Phosphors können ebenfalls Anwendung finden, beispielsweise die Bestimmung nach Toesky und Shore, obgleich jedoch die F t S-Methode zu bevorzugen ist. Diese Beispiele der Änderungen dienen nur zur Erläuterung.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Bestimmung der Kreatin-Phoephokinase durch Umsetzung von Adenosin-Triphosphat mit Kreatin in Gegenwart einer unbekannten Menge der Kreatin-Phosphokinase

τ»,
unter Bildung von Adenosin-#iphosphat und Kreatinphosphorsäure (Phosphokreatine),dadurch gekennzeichnet,· daß der Reaktionsmischung eine Sulfhydrylverbindung zugesetzt wird und die Mischung auf einem ph-Wert von etwa 9 gehalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Sulfhydrylverbindung Glutathion in reduzierter Form verwendet wird.

J5. Verfahren zur Bestimmung des CPK-Spiegels in Serum, dadurch gekennzeichnet, daß in einer Lösung von bekanntem Volumen eine bekannte Menge eines Puffers, der geeignet ist, einen pH-Wert von etwa 9 aufrechtzuerhalten, mit Serum, Kreatin, ATP und einer Sulfhydrylverbindung in einer reduzierten Form gemischt wird, die Reaktionsbestandteile bei einer konstanten Temperatur eine bestimmte Zeit zur Reaktion gebracht werden und anschließend die Menge der gebildeten Kreatinphosphorsäure bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Sulfhydrylverbindung Glutathion in reduzierter Form verwendet wird.

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5. Verfahren zur Bestimmung der Knatin-Phosphokinase, dadurch gekennzeichnet, daß 1.0 ml Kreatin-Magnesiun-Tripufferlösung, 0,3 ml Kreatin-Phosphokinase enthaltendes Serum und 1.0 ml Wasser gemischt und die Mischung auf eine vorher bestimmte Inkubationstemperatur gebracht wird, zu dieser Mischung 0,1 ml ATP-Glutathionlösung zugesetzt und die Mischung während einer genau vorherbestimmten Periode ausgebrütet, am Ende der Inkubationsperiode die Reaktion gestoppt, die Menge des umgesetzten Phosphors bestimmt und die Menge des umgesetzten Phosphors mit den CPK-Einheiten im Serum in Beziehung gesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5* dadurch geleinzeichnet, daß die Inkubationstemperatur 37°C und die Inkubationsperiode eine halbe Stunde beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des umgesetzten Phosphors unter Verwendung von 0,5 ml MoIybdatlösung, 0,5 nil Schwefelsäure, 5·0 ml Wasser und 0,25 ml P k S-Reduktionslösung calorimetrisch gemessen wird.

8. Verfahren zur Bestimmung der Kreatin-Phosphokinase durch Umsetzung von Adenosin-Triphosphat mit Kreatin in Gegenwart einer unbekannten Menge an Kreatin-Phosphokinase bei einem pH-Wert von etwa 9 unter Bildung von Adenosin-Diphosphat und Kreatinphosphorsäure, dadurch gekennzeichr ne/t, daß zu der Reaktionsmischung eine Sulfhydrylverbindung aus der Gruppe aus Glutathion, Cystein und 2-Mercapto-

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Äthanol zugesetzt wird,

9. Verfahren zur Bestimmung der Kreatin-Phosphokinase, dadurch gekennzeichnet« daß 1,0 ml Kreatln-Magnesium-Tripuffer-LÖsung, 0,3 ml Kreatin-Phosphokinase enthaltendes Serum und 1=0 ml Wasser gemischt und die Mischung auf eine vorherbestimmte Inkubationstemperatur gebracht wird, zu dieser Mischung 0,1 ml einer Lösung einer
ATP-Sulfhydrylverbindung, in der die Sulfhydrylverbindung zumindest in einer 0,0005 molaren Konzentration vorliegt, zugesetzt wird und die Mischung eine genaue vorherbestimmte Feriode gebrütet wird; am Ende der Inkubationsperiode die Reaktion der Mischung gestoppt« die Menge
des umgesetzten Phosphors bestimmt und die Menge des
umgesetzten Phosphors mit den CPK-Einheiten im Serum in Beziehung gesetzt wird.

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