DE1423469A1 - Trockenpraeparat und Verfahren zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum - Google Patents

Trockenpraeparat und Verfahren zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum

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Description

Warner-Lambert Pharmaceutical Company
Trockenpräparat und Verfahren zur Bestimmung der alkalischen Phosphatese Im Serum
Die Erfindung bezieht sich auf ein Diagnosepräparat und insbesondere auf eine stabile Zusammensetzung für die vereinfachte, halbquantitative Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum. Die Bestimmung dieser alkalischen Serumphosphatase ist bei der Diagnose von* Zuständen wie Knochenkrebs, Leberschäden, Gallenverstopfung und Gallensteinstörungen von beträchtlichem Wert.
Ein Erfindungsziel besteht in der Gewinnung eines stabilen Diagnosepräparats in Tablettenform für die Bestimmung der alkalischen Serumphosphatase ·
Ein weiteres Erfindungsziel besteht in der Schaffung einer Bestimmungsmethode für alkalische Serumphosphatase, wo die Verwendung von Lösungen und die Notwendigkeit genauer und zeitraubender Nessungen und Reaktionen ausgeschlossen sind. Weitere Erfindungsziele sind aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.
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Neue Untor!rVV?n «Art. 7 :·!/■.'*. ^ U-. :■;■·"· · v .!MrVjS(ICe-V. 4.9.1967)
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Einer der modernen Teste zur Bestimmung der alkalischen Serumphosphatase wurde von Huggine und Talalay (J.Biol. Chem. 159 (19^5), 399) entwickelt. Bei dieser Probe wird eine 5 % Serum enthaltende, gepufferte Natriumphenolphthaleinphosphatlösung eine Stunde lang bei 370C inkubiert, die Inkubation dann angehalten und das Reaktionsgemisch mit einer Lösung von Natriumpyrophosphat in Glyzin-Puffer alkalisch gemacht. Die von der anwesenden alkalischen Phosphatase freigemachte Phenolphthaleinmenge wird in einem Kolorimeter gemäß und nach einer Standardkurve auf den Gehalt der alkalischen Phosphatase im Serum umgerechnet.
Erfindungsgemäß wird der neuentwickelten Methode entsprechend das Serum, dessen Gehalt an alkalischer Phosphatase bestimmt werden soll, mit einem Natriumphenolphthaleinphosphat enthaltenden, festen Präparat inkubiert, und das so gebildete Reaktionsgemisch alkalisch gemacht. Die Farbtiefe, die sich infolge Freisetzung des Phenolphthaleins durch die Enzymwirkung entwickelt, wird dann mit einer Standardfarbtafel verglichen, an der man bequem halbquantitativ die Konzentration der alkalischen Serumphosphatase ablesen kann. Der angewendete Puffer muß in solcher Menge vorhanden sein, daß er die puffernde Wirkung des Serums überwindet und' die Serum-p„ im Bereich
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von etwa 9 ble 11 hält, In dem das alkalische Serumphoephatasen-Enzym wirksam 1st.
Die angewandte Inkubationszeit ändert sich mit der Temperatur und soll bei 19,40C etwa 30 min, bei 26,70C etwa 20 min und bei 3O,3°C etwa 16 min betragen· In diesem Bereloh 1st die Zelt-Temperatur-Bezlehung Im wesentlichen geradlinig. Bei 33,9°C soll die Inkubationszeit ™ 13 min und bei 370C 12 min betragen. Vorzugswelse wird die Inkubation Im Bereich normaler Baumtemperatur durchgeführt.
Vorzugswelse wird dem alkalischen Phosphatase-Puffer-Gemisoh ein Enzymaktivator wie z.B. Magnesiumsulfat zugesetzt. Er dient zur Beibringung von genügend Magnesiumionen, falls die Magnesiumkonzentration im Serum ungewöhnlich niedrig ist und nicht zur Enzymaktivierung aus- i reicht.
Obwohl sioh trie-(Hydroxymethyl)-Aminomethan im neuen Präparat als brauchbarer Puffer erwiesen hat, können auch andere Puffer von ähnlicher Löslichkeit und Basizität dazu benutzt werden, um die p„ während der Inkubationszeit im bevorzugten Bereich zu halten. Derartige andere Puffer können beispielsweise das Natriumsalz der
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5,5-Diäthylbarbitursäure, Natriumkarbonat und Guanidinkarbonat sein.
Das erfindungsgemäße Festsubstrat-Tablettenpräparat enthält vorzugsweise die aktiven Komponenten im Verhältnis von 1,5 Gewichtsteilen Natriumphenolphthaleinphosphat zu 0,1 Gewichtsteilen Magnesiumsulfat und 98,4 Gewichtsteilen Puffer, z.B. tris-(Hydroxymethy1)-Aminomethan. Zur Tablettenformung kann inertes Bindemittel verwendet werden, ist aber im allgemeinen nicht erforderlich.
Die neuartige Substrattablette ist handlich und stabil. Im Gebrauch braucht das Substratvolumen nicht gemessen zu werden, da die ganze Tablette nur etwa 20 mg wiegt und ihr Volumen daher praktisch Null ist. Da außerdem auch der Test in vollem Serum in Gegenwart überschüssigen Substrats und nicht wie bei der früheren Untersuchungsmethode in einer gepufferten, 5 zeigen Serumlösung durchgeführt wird, braucht auch das Serumvolumen nicht genau gemessen zu werden, Da der Gehalt des Reaktionsgemisches an alkalischer Phosphatase die entstehende Färbtiefe bestimmt und das Serum praktisch das Heaktionsgemischvolumen ausmacht, ist die Konzentration der alkalischen Phosphatase im Reaktionsgemisch praktisch vom Volumen des angewendeten Serums unabhängig. Daher wird eine halbquantitative Messung der alkalischen Phosphatase im Serum erzielt; und
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es bedarf keiner genauen Messungen.
Das vorliegende Verfahren ist einfach und schnell, weil es eine Inkubationszeit von nur 20 Minuten bei 26,?°C verlangt. Fernerhin werden nur geringe Serummengen für den Test benötigt, der vorzugsweise mit 0,1 bis 0,3 cm durchgeführt wird. Bei so kleinen Serumproben genügt 0,5 η wäßrige NaOH-Lösung in der Mengenordnung von 0,04 cm , um die Inkubation zu unterbrechen und, die volle Phenolphthalein-Farbe zu entwickeln. Die Einfachheit der Methode macht es fernerhin unnötig, den Test mit teurer Apparatur und geschultem Personal durchführen zu müssen, und ermöglicht außerdem in Verbindung mit ihrer Schnelligkeit die leichte Erfassung des alkalischen Serumphosphatase-Niveaus großer Bevölkerungsgruppen. Im Hinblick auf den bekannten Wert dieses Diagnosete8tee könnte diese erfindungsgemäße Methode der Bestimmung der alkalischen λ Phosphatase im Serum also von großem Wert für die Frühdiagnose von Krebs und Leber- sowie Gallenblasen-Disfunktionen sein.
Verständlicherweise sind die vorstehend angegebenen Mengenverhältnisse der aktiven Bestandteile nur bevorzugte und können ohne Beeinträchtigung von Benutzungsart und Nutzen zahlreich variiert werden· So kann beispiele-
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weise eine 20 mg-Tablette etwa 0,2 - 0,6 mg Natrium» phenolphthaleinphoephat, bis zu 0,02 mg Magnesiumsulfat und als Best die Puffersubstanz enthalten.
Ersichtlioherweise können auch andere Phenolphthaleinphosphatsalze, z.B. die anderer Alkalimetalle oder der Erdalkalimetalle, also anstelle des Natrium« beispiels-· weise das entsprechende Kalzium- oder Bariumsalz, angewendet werden.
Das nachstehende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung und beschreibt im einzelnen das neuartige Verfahren der Bestimmung der alkalischen Phosphatese im Serum.
Beispiel
Zu ungefähr 0,2 cm-* Serum werden 10 - 30 mg eines festen Präparates in Pulver- oder Tablettenform zugesetzt,das ungefähr 1,5 Teile Natriuaphenolphthaleinphosphat, etwa 0,1 Teil Magnesiumsulfat und ungefähr 98,^ Teile tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan enthält. Die Mischung wird etwa 20 Minuten lang bei 26,7°C inkubiert und danach durch Zusatz eines Tropfens, d.h. etwa 0,04- cm , 0,5 η wäßriger NaOH-Lösung alkalisch gemacht. Der entwickelte Farbton wird wie beschrieben mit einer Standard-Farbtafel
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vergllohen, die empirisch durch Vergleich der Farbtönungen von quantitativ bestimmten alkalischen Serumphosphatasen gegen die nach der neuen Methode gewonnenen Farbtönungen entwickelt wurde. Auf diese Welse wird eine direkte Ablesung der Konzentration der alkalischen Fhosphatase la Serum erreicht.
Verständlicherweise 1st die vorstehende, ins einzelne gehende Beschreibung nur als Beispiel aufgeführt und kann Im Rahmen des allgemeinen Bff lndungsgedankens weitgehend variiert werden·
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Claims (1)

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Patentansprüche
ί, Präparat zur kolorimetrlschen Bestimmung der alkalischen Serumphosphatase nach der Methode von Huggins und Talalay mit überschüssigem Phenolphthalein-phosphorsäureester als f*rt> gebendem Substrat und einem die Aufrechterhaltung des Serum pH-Wertes im Bereich zwischen etwa 9 bis 11 gewährleistenden Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß es die Form einer Trocken-Dosiseinheit, beispielsweise Tablette, mit im Vergleich zum Serumprobenvolumen methodisch vernachlässigbarem Volumen aufweist.
Zt Präparat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt von etwa 98,4· Gew.# tris-(Hydroxyraethyl)-Aminomethan als Puffersubstanz.
3t Präparat nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch einen Enzymaktivatorgehalt, beispielsweise 0,1 Gew.# Magnesiumsulfat.
^. Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der alkalischen Serumphosphatase nach der Methode von Huggins und Talalay mit Phenolphthalein-phosphorsäureester als farbgebendem Substrat und einem die Aufrechterhaltung
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des Serum-pH-Wertes im Bereich zwischen etwa 9 bis H gewährleistenden Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß die Serumprobe mit einem Trookenpräparat der genannten beiden Beagentien von methodisch vernachlässigbarem Volumen umgesetzt und die entwickelte Färbung nach Alkalischmachen der Probe mit einer in Enzymkonzentrations-Einheiten geeichten Farbtafel verglichen wird.
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